Изучение механизмов антиоксидантного действия пептидов и их композиций

На правах рукописи

НИКОЛАЕВ Илья Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ

ПЕПТИДОВ И ИХ КОМПОЗИЦИЙ

специальность 03.01.04 – «биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

МОСКВА – 2012

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ биотрансформаций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор О.В. Королева

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор И.В. Перминова доктор биологических наук К.Б. Шумаев

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства»

Защита состоится «29» марта 2012 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.

Автореферат разослан «28» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Оксидативный стресс является одной из универсальных форм ответа организма на воздействие неблагоприятных экзогенных и эндогенных факторов и играет существенную роль в патогенезе воспалительно-дистрофических, нейродегенеративных, сердечнососудистых и онкологических заболеваний и ускорении процессов старения живых организмов [Arts et al., 2005;

Skulachev, 2007;

Knasmuller et al., 2008]. Оксидативный стресс сопряжен с избыточной продукцией активных форм кислорода (АФК). Основная роль в защите биомолекул от действия АФК принадлежит экзогенным и эндогенным антиоксидантам [Frankel et al., 2008].

В настоящее время известен широкий спектр природных и синтетических экзогенных антиоксидантов, поступающих в организм с пищей. При этом природные антиоксиданты обладают рядом преимуществ по сравнению с синтетическими, включая отсутствие побочных и кумулятивных эффектов, а также более низкую токсичность.

Основными классами природных антиоксидантов являются каротиноиды, тиолы, фенольные соединения и пептиды. В литературе описаны последовательности более 100 антиоксидантных пептидов, выделенных из различных источников, а также полученных при конверсии белков с использованием ферментов и / или микроорганизмов [Dziuba et al., 2007;

Sarmadi et al., 2010]. Наличие остатков редокс активных аминокислот (Tyr, Trp, Met, Cys, His) является важным структурным дескриптором антиоксидантных пептидов [Saito et al., 2003;

Sarmadi et al., 2010].

Однако механизмы их антиоксидантного действия остаются недостаточно изученными.

Для разработки обоснованной стратегии поиска перспективных пептидных антиоксидантов необходимо исследование механизмов их взаимодействия с АФК и модельными свободными радикалами. Несмотря на различия в химической структуре антиоксидантов, ключевыми механизмами их взаимодействия с АФК являются донирование атома водорода (ДАВ) или донирование электрона (ДЭ). Тем не менее, антиоксидантные эффекты большинства соединений реализуются по смешанному механизму: последовательное донирование электрона с депротонированием (ПДЭД) или последовательное депротонирование с донированием электрона (ПДДЭ) [Barclay et al., 2003;

Justino et al., 2010]. Образующиеся интермедиаты зачастую могут вступать во взаимодействие друг с другом и /или во вторичные реакции со свободными радикалами, что вносит вклад в наблюдаемый антиоксидантный эффект и создает дополнительные сложности при анализе экспериментальных данных.

Расчетные квантово-химические методы являются эффективным инструментом для изучения механизмов взаимодействия антиоксидантов со свободными радикалами и позволяют выявить молекулярные (структурные) и электронные дескрипторы, определяющие антиоксидантные свойства различных классов соединений. Благодаря применению полуэмпирических расчетных методов, в последнее время были выявлены структурные особенности флаваноидов, обуславливающие их антиоксидантные свойства, включая степень планарности молекулы, взаимное расположение фенольных гидроксильных групп, стабилизационные эффекты за счет делокализации неспаренного электрона при образовании феноксильных радикалов [Russo et al., 2000;

Lemanska, et al 2001;

Justino et al., 2010]. Однако, исследования такого рода для пептидов отсутствуют, что обуславливает актуальность соответствующих структурно функциональных исследований.

При структурно-функциональном подходе параллельно с расчетом молекулярных и электронных дескрипторов необходимым этапом является характеристика антиоксидантных свойств пептидов in vitro. В настоящее время описано более различных методов для тестирования антиоксидантов in vitro [Huang et al., 2005;

Shibamoto et al., 2009]. Их классификация базируется на ключевом механизме взаимодействия различных радикалов с тестируемыми антиоксидантами. Широко используемыми для характеристики природных антиоксидантов in vitro, являются методы гашения катион-радикала АБТС (2,2’-азино-бис-(3-этил-бензтиазолин-6 сульфонат) (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity - TEAC) и пероксильного радикала (Oxygen Radical Absorbance Capacity - ORAC). Данные методы позволяют проводить количественную характеристику антиоксидантных свойств соединений с различными физико-химическими свойствами и характеризуются высокой воспроизводимостью и надежностью. В то же время, эти методы тестирования антиоксидантов in vitro не позволяют провести интегральной оценки эффективности антиоксидантов в живых системах, поскольку они не учитывают целый ряд факторов, включая биодоступность, распределение и метаболизм антиоксидантов, а также их взаимодействие с системой антиоксидантной защиты [Blair et al., 2006]. Для объективной характеристики антиоксидантов необходима верификация их антиоксидантных эффектов in vivo.

Таким образом, вышесказанное свидетельствует об актуальности структурно функциональных исследований пептидных антиоксидантов для оценки их эффективности и создания стратегии скрининга антиоксидантных пептидов с использованием эмпирических и квантово-химических дескрипторов.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы был структурно функциональный анализ и исследование механизмов антиоксидантного действия пептидов в системах с различными типами радикалов.

В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследование антиоксидантных свойств модельных низкомолекулярных соединений: редокс-активных аминокислот, метионин- и тирозин- содержащих дипептидов, ароматических гидроксикислот (модели тирозина) по отношению к катион-радикалу АБТС и пероксильному радикалу;

2. Исследование геометрии молекул и электронных дескрипторов редокс-активных аминокислот, метионин- и тирозин- содержащих дипептидов и ароматических гидроксикислот полуэмпирическими методами;

3. Анализ механизмов антиоксидантного действия метионин- и тирозин содержащих дипептидов и ароматических гидроксикислот;

4. Исследование антиоксидантных свойств пептидных композиций, полученных при гидролизе коллагеновых и мышечных белков, по отношению к пероксильному радикалу и катион-радикалу АБТС in vitro. Идентификация антиоксидантных пептидов в исследуемых пептидных композициях;

5. Разработка стратегии скрининга антиоксидантных пептидов с использованием набора дескрипторов;

6. Исследование влияния пептидных композиций на антиоксидантный статус in vivo.

Научная новизна.

Впервые проведены квантово-химические расчеты электронных дескрипторов и оптимизация геометрии тирозиновых и метиониновых дипептидов в газовой фазе.

Впервые установлены механизмы антиоксидантного действия метионин- и тирозин содержащих дипептидов. Показано, что взаимодействие метионин-содержащих дипептидов с пероксильным радикалом протекает по механизму донирования электрона, а взаимодействие тирозин-содержащих дипептидов с катион-радикалом АБТС протекает по механизму последовательного депротонирования и отдачи электрона. Впервые на основе экспериментального исследования антиоксидантной емкости тирозиновых и метиониновых дипептидов и результатов квантово-химических расчетов предложена стратегия отбора пептидов с высокой антиоксидантной емкостью.

Практическое значение работы. Выявленные закономерности взаимного влияния остатков аминокислот на антиоксидантные свойства дипептидов могут служить основой для разработки биотехнологических процессов, позволяющих получать пептидные композиции с заданными антиоксидантными свойствами.

Предложенная стратегия скрининга пептидов с высокой антиоксидантной емкостью позволит проводить теоретически обоснованный поиск и отбор перспективных антиоксидантов пептидной природы. Данные, полученные при исследовании антиоксидантных свойств пептидных композиций in vitro и in vivo, могут быть использованы для создания функциональных пищевых продуктов для профилактики нейродегенеративных заболеваний.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 1-м Европейском пищевом конгрессе (2008, Любляна);

14-й Конференции международного Гуминового общества (2008, Москва-Санкт-Петербург);

конгрессе Биотехнология:

состояние и перспективы развития (2009, Москва);

14-м Международном биотехнологическом симпозиуме (2010, Римини), VIII Международной конференции Биоантиоксидант (2010, Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 статей, а также тезисов докладов на конференциях.

Объем и структура работы. Работа изложена на 186 страницах печатного текста, содержит 37 рисунков и 32 таблицы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования.

Аминокислоты и их производные: набор L-аминокислот (Fluka, Германия), 3-N метил-L-His 1-N-метил-L-His, N-Ac-L-Trp-NH2, (Sigma, США), N-Ac-L-Trp, L-Trp-NH2, N-Ac-L-Met-NH2, N-Ac-L-Met, L-Met-NH2, N-Ac-L-Tyr-NH2, N-Ac-L-Tyr, L-Tyr-NH (Bachem, Швейцария).

Дипептиды: L-Ala-L-Tyr, L-Tyr-L-Ala, L-Val-L-Met, L-His-L-Tyr, L-Val-L-Tyr (Sigma, США), L-Met-Gly, Gly-L-Met, L-Met-L-Ala, L-Ala-L-Met, L-Met-L-Lys, L-Lys-L Met, L-Met-L-Glu, L-Met-L-Val, L-Met-L-Trp, L-Trp-L-Met, L-Met-L-His, L-His-L-Met, L Met-L-Met, L-Tyr-Gly, Gly-L-Tyr, L-Tyr-L-Lys, L-Lys-L-Tyr, L-Tyr-L-Glu, L-Glu-L-Tyr, L-Tyr-L-Val, L-Tyr-L-Trp, L-Trp-L-Tyr, L-Tyr-L-His, L-Met-L-Tyr, L-Tyr-L-Tyr (Bachem, Швейцария) Гидроксибензойные (ГБ) кислоты: п-гидроксибензойная кислота (п-ГБК) и ванилиновая кислота (ВК) (Aldrich, Германия), сиреневая кислота (СирК, Sigma, США).

Гидроксикоричные (ГК) кислоты: п-кумаровая кислота (КК), феруловая кислота (ФК) и синаповая кислота (СинК, Sigma, США).

Пептидные композиции ФМП1 и ФМП2 с различным пептидным профилем молекулярно-массовым распределением и содержанием свободных аминокислот, полученные при ферментативном гидролизе коллагеновых и мышечных белков мультиферментной композицией, содержащей ферментные препараты Alcalase, Neutrase, Protamex, Flavourzyme (Novozymes, Дания).

Антиоксидантную емкость (АОЕ) по отношению к катион-радикалу АБТС определяли спектрофотометрически на фотометре-флуориметре Synergy 2 (США) при длине волны 734 нм. Катион-радикал АБТС получали согласно [Re et al., 1999].

Реакционная среда содержала 180 мкл 48 мкМ раствора катион-радикала АБТС и мкл раствора исследуемого антиоксиданта в 50 мМ ФСБ, рН 7,40. Кинетику убыли оптической плотности регистрировали при 25С в течение 40 мин. АОЕ выражали в мкмоль эквивалентов тролокса в расчете на мкмоль соединения.

АОЕ по отношению к пероксильному радикалу определяли по методу Оу в модификации Мура [Ou et al., 2001;

Moore et al., 2006]. Кинетику убыли интенсивности флуоресценции флуоресцеина регистрировали при 37С в течение 50 мин. АОЕ выражали в мкмоль эквивалентов тролокса в расчете на мкмоль соединения.

Расчет геометрии молекул и электронных дескрипторов исследуемых антиоксидантов. Квантово-химические расчеты геометрии и электронных дескрипторов аминокислот, пептидов и ароматических гидроксикислот проводили в B3LYP/6-31++G**(d,p) и B3LYP/6-311++G**(d,p) базисах программы Gaussian 3. (США) соответственно. Все расчеты были выполнены в условиях газовой фазы при 298К. Проверку типа минимума проводили по данным анализа колебательных спектров. В случае аминокислот и дипептидов расчеты проводили для форм, суммарный заряд которых соответствовал таковому при физиологических значениях рН. Расчеты были также выполнены для незаряженной, моноанионной и дианионной форм ГБ и ГК кислот и соответствующих им радикалов и катион-радикалов. Для оптимизированных структур рассчитывали распределение Мулликеновских зарядов, энергии молекулярных орбиталей (ВЗМО и НВМО), энергию диссоциации связи в протон-донорной группе (ЭДС), потенциал ионизации (ПИ), электроотрицательность (), электрофильность (), жесткость (), сродство к протону (СП), энтальпию диссоциации протона (ЭПД), энтальпию переноса электрона (ЭПЭ).

Характеристика пептидных композиций. Молекулярно-массовое распределение пептидных композиций определяли методом гельпроникающей хроматографии согласно [Еремеев и др., 2009]. Содержание свободных аминокислот определяли методом ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией (AccQ Tag, Waters, США), а общее содержание аминокислот - тем же методом после предварительного гидролиза пептидных композиций 6М соляной кислотой при 110°С в течение 23 ч.

Общее содержание триптофана определяли спектрофотометрическим методом согласно [Fletouris et al., 1993]. АОЕ пептидных композиций определяли по отношению к пероксильному радикалу и катион-радикалу АБТС как описано выше.

Анализ пептидного профиля композиций. Анализ пептидного профиля композиций проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией ионно-циклотронного резонанса. Пептидные композиции фракционировали на колонке BioSep SEC-S 200 (Phenomex, США) на хроматографе ProStar (Varian Inc., США). Полученные фракции 15-18, 19-22 и 23-28 с максимальной АОЕ разделяли на субфракции на капиллярной колонке Reprosil-Pur Basic C18, 3 мкм (75 мкм (внутренний диаметр) x 12 см) на жидкостном хроматографе Agilent (Agilent Technogies, Paolo Alto, CA, США). Масс-спектрометрический анализ полученных субфракций проводили на масс-спектрометре 7-Tesla Finnigan LTQ-FT Ultra (Thermo Electron, Германия) в диапазоне m/z 100-1600 с разрешением R= при m/z равном 400. Для автоматического поиска по базам данных анализа пептидов использовали программное обеспечение Mascot Daemon 2.2.2 (Matrix Science, Великобритания).

Исследование антиоксидантных свойств пептидных композиций in vivo.

Эксперименты проводили на 4 экспериментальных группах крыс линии Wistar ( самцах, масса 145-150 г). Животных содержали при 20С на полусинтетических рационах, отличающихся источником белка: группа 1 (казеин), группа 2 (ФМП1), группа 3 (ФМП2) и контрольная группа – безбелковый рацион. На 28 день эксперимента проводили забор крови, печени и головного мозга.

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов в сыворотке крови и гомогенатах тканей печени и головного мозга проводили спектрофотометрически (на длинах волн 535 и 572 нм) согласно методу [Sattler et al., 1998] с использованием 1,1,3,3- тетраэтоксипропана в качестве стандарта.

Определение АОЕ тканевых экстрактов по отношению к катион-радикалу АБТС. Экстракцию водорастворимых антиоксидантов проводили 1,15% раствором хлорида калия. АОЕ гидрофильной фракции определяли как описано выше.

Экстракцию жирорастворимых антиоксидантов проводили по методу Фолча с последующим высушиванием и перерастворением экстракта в гексане. Реакционная смесь содержала 2 мл 48 мкМ раствора катион-радикала АБТС в смеси этанол-гексан 10:1 (об./об.) и 100 мкл экстракта. АОЕ определяли по убыли оптической плотности при длине волны 734 нм в течение 3 мин на спектрофотометре Сary 100 Bio (США).

Определение АОЕ тканевых экстрактов по отношению к пероксильному радикалу. Экстракты жиро- и водорастворимых антиоксидантов получали как описано выше. Экстракт жирорастворимых антиоксидантов перерастворяли в 7% растворе метил--циклодекстрина в смеси ацетон-вода 1:1 (об./об). Анализ АОЕ проводили по методу Оу в модификации Мура [Ou et al., 2001;

Moore et al., 2006].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В качестве объектов исследования были выбраны низкомолекулярные модельные соединения, включая свободные аминокислоты, ацетилированные и / или амидированные производные аминокислот как модели образования пептидной связи, метиониновые и тирозиновые дипептиды, ароматические гидроксикислоты как упрощенные модели для исследования антиоксидантных свойств тирозина и его производных. Полученные результаты структурно-функционального исследования антиоксидантных свойств модельных соединений были использованы при характеристике мультикомпонентных смесей - композиций с различным пептидным профилем.

Исследование антиоксидантных свойств аминокислот, метиониновых и тирозиновых дипептидов.

При тестировании АОЕ аминокислот по отношению к пероксильному радикалу и катион-радикалу АБТС было показано, что редокс активными в концентрациях не более 1 мМ в случае пероксильного радикала являются 5 аминокислот - Tyr, Trp, Met, Cys и His (рис. 1), в случае катион-радикала АБТС только 3 аминокислоты - Tyr, Trp и Cys, что объясняется меньшей реакционной способностью катион-радикала АБТС (ОВП 0,68 В) по сравнению с пероксильным радикалом (ОВП 1,00В). АОЕ редокс активных аминокислот по отношению к пероксильному радикалу убывает в ряду TrpTyrMet=CysHis, по отношению к катион-радикалу АБТС – в ряду TyrTrpCys (рис.1).

Рис. 1.

АОЕ, мкмоль ТЭ/мкмоль TEAC 3, Антиоксидантная ORAC емкость аминокислот по 2, отношению к пероксильному 1, радикалу (75 мМ НФБ, рН 7,40) и катион 0, радикаду АБТС (50 мМ ФСБ, рН 7,40).

His 3-N- 1-N- Met Cys Tyr Trp метил- метил His His Были проанализированы антиоксидантные свойства Tyr модифицированных аминокислот, АОЕ, мкмоль ТЭ/мкмоль Trp 5 включая метил-производные His, Met часто встречающиеся в составе 4 антиоксидантных пептидов (ансерин, офидин), и ацетилированные и/ или амидированные производные, моделирующих образование пептидной связи. Метилирование имидазольного кольца His приводит к увеличению АОЕ соответствующих метил-His по отношению к пероксильному aa aa-NH2 Ac-aa Аc-aa радикалу в 1,4-1,7 раза (рис. 1), что, NH а по-видимому, объясняется положительным влиянием Tyr метильной группы на электронную Trp АОЕ, мкмоль ТЭ/мкмоль 2, плотность в имидазольном кольце.

Met Ацетилирование Tyr и Trp в случае катион-радикала АБТС и ацетилирование Trp - в случае с 1, пероксильным радикалом приводило к снижению значений АОЕ производных в 1,5 раза по 0,5 сравнению с таковыми для аминокислот (рис. 2). Амидирование Tyr наоборот приводит к aa aa-NH2 Ac-aa Аc-aa возрастанию АОЕ по отношению к NH б катион-радикалу АБТС в 1,4 раза (рис. 2а). Ацетилирование и Рис. 2. Антиоксидантная емкость амидирование метионина не производных аминокислот по отношению приводит к выраженному изменению к катион-радикалу АБТС (а) и антиоксидантных свойств пероксильному радикалу (б). Ас - соответствующих производных (рис.

ацетилированные, NH2 – амидированные 2б).

аминокислоты. Для подтверждения полученных данных (рис. 2) были исследованы антиоксидантные свойства тирозиновых и метиониновых дипептидов с алифатическими аминокислотами, редокс-активными аминокислотами и остатками аминокислот, содержащих ионогенные группы в боковых радикалах (табл. 1 и 2).

Установлено, что дипептиды, содержащие N-концевой остаток тирозина, характеризуются в среднем в 1,4 раза более высокими значениями АОЕ по отношению к катион-радикалу АБТС по сравнению с тирозином (табл. 1). Аналогичные пептиды с С-концевым положением тирозина характеризуются вдвое меньшими значениями АОЕ по сравнению с тирозином. Средние значения АОЕ дипептидов с N- и С-концевыми остатками тирозина по отношению к катион-радикалу АБТС – 4,81±0,10 и 1,70±0, мкмоль ТЭ/мкмоль соответственно. Дипептид Lys-Tyr характеризовался вдвое большим значением АОЕ по отношению к катион-радикалу АБТС по сравнению с другими дипептидами с С-терминальным положением Tyr остатка (табл. 1). По видимому, это обусловлено взаимодействием фенольного гидроксила Tyr с аминогруппой Lys. Результаты тестирования АОЕ тирозиновых дипептидов по отношению к катион-радикалу АБТС свидетельствуют о важной роли -аминогруппы, наличие которой, по-видимому, определяет механизм взаимодействия остатков тирозина с катион-радикалом АБТС и спектр образующихся продуктов.

Анализ АОЕ тирозиновых дипептидов по отношению к пероксильному радикалу показал, что дипептиды тирозина с алифатическими аминокислотами характеризуются сходными значениями АОЕ по сравнению с тирозином (табл. 1). Средние значения АОЕ дипептидов с N- и С-концевыми остатками тирозина по отношению к пероксильному радикалу составили 0,95±0,11 и 1,04±0,01 мкмоль ТЭ/мкмоль соответственно. Влияние остатков аминокислот с ионогенными группами в боковых радикалах на АОЕ тирозиновых дипептидов по отношению к пероксильному радикалу определяется их взаимным расположением (табл. 1). Наличие на С-конце тирозиновых дипептидов остатка Glu приводит к двухкратному снижению АОЕ по сравнению с тирозином, в то время как наличие остатка Lys - наоборот, к возрастанию АОЕ по сравнению с тирозином в 1,5 раза (табл. 1). Практически обратная тенденция наблюдается в случае дипептидов с С-терминальным тирозиновым остатком: наличие в этом случае соседнего остатка Glu – не оказывает влияния на величину АОЕ, в то время как наличие соседнего остатка Lys приводит к снижению АОЕ в 1,7 раза по сравнению с тирозином (табл. 1).

Таблица 1. Антиоксидантиная емкость тирозиновых дипептидов по отношению к пероксильному радикалу (ORAC) и катион-радикалу АБТС (TEAC).

АОЕ, мкмоль ТЭ/мкмоль Пептид ORAC TEAC Gly-Tyr 1,11±0,05 1,43±0, Ala-Tyr 1,05±0,05 1,70±0, Val-Tyr 1,03±0,06 1,97±0, Glu-Tyr 1,11±0,02 1,45±0, Lys-Tyr 0,60±0,02 3,60±0, Met-Tyr 1,65±0,03 2,48±0, His-Tyr 1,08±0,09 2,03±0, Trp-Tyr 5,07±0,10 5,18±0, Tyr-Gly 0,93±0,04 4,87±0, Tyr-Ala 1,04±0,06 4,70±0, Tyr-Val 0,98±0,03 4,88±0, Tyr-Glu 0,46±0,03 5,00±0, Tyr-Lys 1,47±0,07 4,80±0, Tyr-Tyr 1,97±0,07 5,62±0, Tyr-His 0,94±0,02 5,19±0, Tyr-Trp 3,36±0,11 6,04±0, Анализ АОЕ метиониновых дипептидов по отношению к пероксильному радикалу (табл. 2) показал, что АОЕ дипептидов с С-концевым положением метионина по отношению к пероксильному радикалу (0,45±0,01 мкмоль ТЭ/мкмоль) соответствуют АОЕ свободного метионина (0,49±0,03 мкмоль ТЭ/мкмоль). По сравнению со свободным метионином дипептиды, содержащие N-концевой остаток метионина, характеризовались в среднем на 20% более низкими значениями АОЕ (табл.

2). Таким образом, карбоксильная группа метионина, по-видимому, участвует во взаимодействии соответствующих пептидов с пероксильным радикалом.

Исследование АОЕ дипептидов, содержащих остатки двух редокс-активных аминокислот, по отношению к пероксильному радикалу показало, что в случае Met-Trp, Trp-Met, Tyr-Tyr, Tyr-Trp, Tyr-His, His-Tyr и Tyr-Met наблюдалась аддитивность антиоксидантных эффектов остатков редокс-активных аминокислот (табл. 1 и 2). Для Trp-Tyr показан эффект внутримолекулярного синергизма остатков редокс-активных аминокислот при взаимодействии с пероксильным радикалом (табл. 1). Полученные данные по величине АОЕ Trp-Tyr свидетельствуют, что при взаимодействии данного дипептида с пероксильным радикалом происходит первичное окисление остатка триптофана с последующим внутримолекуляным переносом электрона с фенольного гидроксила тирозина на радикал триптофана. Процессы прямого окисления Tyr остатка пероксильным радикалом и внутримолекулярного переноса электрона с Tyr остатка на триптофильный радикал конкурируют между собой, при этом, исходя из величины АОЕ Trp-Tyr по отношению к пероксильному радикалу, 2/3 Tyr остатков подвергается прямому окислению пероксильным радикалом, в то время как в 1/3 случаев реализуется процесс внутримолекулярного переноса электрона.

Исследование АОЕ дипептидов с Таблица 2. Антиоксидантиная емкость метиониновых дипептидов по двумя остатками редокс-активных аминокислот по отношению катион отношению к пероксильному радикалу АБТС (табл. 1) показало, что в радикалу (ORAC).

случае Met-Tyr, Tyr-His и His-Tyr АОЕ, мкмоль наблюдается эффект внутримолекулярного ТЭ/мкмоль Пептид синергизма, обусловленного, по-видимому, ORAC процессами внутримолекулярного Gly-Met 0,44±0, туннельного переноса электрона с Ala-Met 0,44±0, метионинового или гистидинового остатка Val-Met 0,45±0, на тирозиновый феноксильный радикал.

Lys-Met 0,48±0, Величины АОЕ Met-Trp (2,60±0,06) и Trp His-Met 0,37±0, Met (3,30±0,04 мкмоль ТЭ/мкмоль) по Trp-Met 3,48±0, отношению к катион-радикалу АБТС Met-Gly 0,36±0,01 соответствуют значениям АОЕ N- и С Met-Ala 0,41±0,01 терминальных остатков Trp, что Met-Val 0,36±0,02 свидетельствует о том, что Met остатки не Met-Glu 0,35±0,02 участвуют во взаимодействии данных Met-Lys 0,36±0,01 дипептидов с катион-радикалом АБТС.

Met-Met 0,71±0,02 Таким образом, эмпирическими Met-His 0,36±0,01 дескрипторами, определяющими высокую Met-Trp 2,49±0,04 величину АОЕ тирозиновых пептидов по отношению к катион-радикалу АБТС, являются: N-концевое положение остатков Tyr и Trp, наличие соседних с Tyr остатков Met или His, наличие в последовательности пептида предшествующих Tyr остатков Lys и Arg. В случае пероксильного радикала в последовательности пептида наоборот остатки Lys и Arg должны следовать после остатка Tyr, в то время как в этой позиции не должно быть остатков кислых аминокислот (Asp, Glu). Также пептид будет обладать более высокой АОЕ по отношению к пероксильному радикалу при наличии в нем последовательности Trp-Tyr.

Эмпирическим дескриптором, определяющим высокую величину АОЕ метиониновых пептидов по отношению к пероксильному радикалу, является С-концевое положение Met остатка.

Молекулярные и электронные дескрипторы антиоксидантных свойств метионин- и тирозин- содержащих дипептидов.

Выбор анализируемых дескрипторов базировался на существующих данных по электронным и термодинамическим характеристикам процесса электрофильного замещения (SE) в ароматических системах (распределение Мулликеновских зарядов,,, ), а также механизмов ДАВ (ЭДС), ПДЭД (ПИ, ЭПД) и ПДДЭ (СП, ЭПЭ).

Для расчетов молекулярных и электронных дескрипторов антиоксидантных свойств дипептидов с помощью полуэмпирических методов решены трехмерные структуры метионин- и тирозин- содержащих дипептидов в газовой фазе.

Результаты расчетов молекулярных и электронных дескрипторов метиониновых дипептидов показали, что дипептиды с аминокислотами, не содержащими ионогенных групп в боковых радикалах, и С-концевым положением остатка метионина характеризуются более низкими значениями ПИе (6,35-7,75 эВ) по сравнению с их аналогами с N-концевым метиониновым остатком (7,58-8,53 эВ), что свидетельствует о большей устойчивости последних к окислению и согласуется с результатами определения АОЕ (табл. 2). В то же время, наличие в метиониновых дипептидах остатков кислых аминокислот (Glu, Asp) приводит к двухкратному снижению величины ПИе до 3,99—4,15, а остатков Lys и Arg - наоборот, к увеличению ПИе до 9,45-10,42 эВ. Выявленная тенденция обусловлена наличием соответственно отрицательных и положительных зарядов на ионогенных группах, что приводит к закономерным изменения ПИ исследуемых соединений в газовой фазе. Сопоставление результатов квантово-химических расчетов и значений АОЕ метиониновых дипептидов по отношению к пероксильному радикалу позволило установить наличие значимой (p0,05) обратной корреляции величин АОЕ и значений ПИе (r=-0,819), (r=-0,874) и (r=-0,818).

0, 0, 0, 0, 0, 0, АОЕ, ORAC АОЕ, ORAC 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 7 7,5 8 8,5 9 0,6 0,65 0,7 0, ПИе, эВ электрофильность, эВ в а 0, Рис. 3. Сопоставление величин 0, АОЕ метиониновых дипептидов по отношению к пероксильному 0, АОЕ, ORAC радикалу и значений их потенциалов ионизации (ПИе 0, а), электроотрицательности ( 0, б) и электрофильности ( - в).

0, 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3, электроотрицательность, эВ б Результаты расчета Мулликеновского распределения электронной плотности в катион-радикалах метиониновых дипептидов показали, что наиболее высокая плотность отрицательного заряда локализуется на -атоме углерода метионинового остатка. Таким образом, наличие значимой обратной корреляции АОЕ метиониновых дипептидов по отношению к пероксильному радикалу с величиной их ПИе и данные по распределению Мулликеновских зарядов в катион-радикалах метиониновых пептидов, свидетельствуют в пользу механизма одноэлектронного окисления остатков метионина пероксильным радикалом (рис. 4). Донирование электрона атомом серы приводит к образованию пероксид аниона и катион-радикала метионина. Перераспределение электронной плотности в катион-радикале метионина приводит к локализации неспаренного электрона на -атоме углерода с последующим декарбоксилированием при С-терминальном положении остатка метионина (рис. 4). В случае дипептидов с N терминальным метиониновым остатком перераспределение электронной плотности в катион-радикале метионина будет приводить к разрыву пептидной связи. При этом процесс декарбоксилирования, по-видимому, более энергетически выгоден по сравнению с разрывом пептидной связи, что объясняет более высокие значения АОЕ дипептидов с С-концевым остатком метионина по сравнению с аналогичными дипептидами, содержащими N-концевой остаток метионина (табл. 2).

H2O ROOH + OH ROO ROO COO COO CH3 S CH2 CH2 C NH3 CH3 S CH2 CH2 C NH3 CH3 S CH2 CH2 C NH H H H + CO Рис. 4. Механизм взаимодействия метионина с пероксильным радикалом.

Результаты расчетов молекулярных и электронных дескрипторов тирозиновых дипептидов свидетельствуют, что при С-концевом положении остатка тирозина предпочтительным для атаки электрофильными агентами является атом углерода С1 в орто-положении по отношению к фенольному гидроксилу (С6) (рис. 5). При N концевом положении тирозинового остатка в дипептидах максимальная электронная плотность наблюдается на атоме углерода С4, либо значения электронной плотности на атомах углерода С1 и С4 сопоставимы (Tyr-Gln, Tyr-Ser, Tyr-Leu и др.). Таким образом, как механизм взаимодействия дипептидов с N и С-концевым положением тирозина с катион-радикалом АБТС, так и спектр образующихся продуктов может существенно отличаться, что подтверждает выявленные отличия в величинах АОЕ соответствующих тирозиновых дипептидов по отношению к катион-радикалу АБТС (табл. 1). Результаты расчетов Мулликеновского распределения электронной плотности в радикалах и катион-радикалах тирозина и тирозиновых пептидов, свидетельствует о том, что максимальная электронная плотность локализуется на атомах углерода С1 и С4, которые предпочтительны для вторичной атаки электрофильных агентов.

Результаты расчетов термодинамических характеристик реакций окисления тирозиновых дипептидов в газовой фазе COO свидетельствуют о том, что дипептиды тирозина с аминокислотами, не содержащими ионогенных групп в боковых CH H3 N CH радикалах, и С-концевым положением тирозинового остатка характеризуются в среднем на 10% более низкими значениями 2 ПИе (7,20±0,49 эВ) по сравнению с аналогами с N-концевым тирозиновым остатком (7,93±0,38 эВ). В то же время установлено, что дипептиды с N- и C-концевым положением тирозиновых остатков не отличаются по величине ЭДС O-H в фенольном OH гидроксиле (83,2±2,8 и 82,9±5,4 ккал/моль соответственно).

Рис. 5.

Сопоставление данных по величинам АОЕ тирозиновых Структурная дипептидов по отношению к катион-радикалу АБТС и формула пероксильному радикалу (табл 2) и рассчитанных тирозина.

термодинамических и энергетических характеристик не выявило наличия значимых корреляций. Данный факт объясняется существенным отличием структуры тирозиновых пептидов в газовой фазе и в водных растворах, за счет образования в последнем случае цвиттер-ионных форм дипептидов и их взаимодействия с молекулами растворителя. Для ответа на вопрос о механизме антиоксидантного действия тирозиновых дипептидов была проведена характеристика антиоксидантные свойства модельных соединений - ароматических гидроксикислот.

Следует отметить, что тирозин является предшественником п-ГБ и п-ГК кислот в шикиматном путе их биосинтеза, что позволяет рассматривать последние в качестве упрощенных аналогов Tyr.

Характеристика антиоксидантных свойств ГБ и ГК кислот.

Структуры ГБ и транс-ГК кислот представлены на рис. 6. Следует отметить, что п-ГБК, ВК и СирК являются структурными аналогами соответствующих ГК кислот – КК, ФК и СинК (табл. 3).

По аналогии с аминокислотами и дипептидами, АОЕ ГБ и ГК кислот определяли по отношению к катион-радикалу АБТС (ТЕАС) и пероксильному радикалу (ORAC) при рН 7,4 (табл. 4). Сравнение АОЕ ГБ и ГК кислот показало, что ГК кислоты характеризуются в 1,2-2,5 раза более высокими значениями АОЕ по отношению к обоим типам радикалов по сравнению с аналогичными ГБ кислотами (табл. 4). Данный факт может объясняться двумя причинами: стабилизацией феноксильных радикалов ГК кислот за счет делокализации HO O неспаренного электрона при сопряжении C бензольного кольца с С3 цепочкой и O OH C H более высокой электронной плотностью в C H C бензольном кольце ГК кислот по сравнению с ГБ за счет наличия у ГК этенильного мостика между карбоксильной группой и бензольным R1 R5 R1 R5 кольцом.

б R а R6 Анализ АОЕ ГК кислот показал, что значения их АОЕ по отношению к Рис. 6. Структурные формулы пероксильному радикалу убывает в ряду гидроксибензойных (а) и транс- ККФКСинК (табл. 4). Следовательно, гидроксикоричных (б) кислот. введение как одного, так и двух метоксильных заместителей в о положение по отношению к гидроксигруппе приводит к снижению АОЕ ГК кислот по отношению к пероксильному радикалу.

Таблица 3. Заместители в бензольном кольце ГБ и ГК кислот.

Соединение R1 R5 R п-гидроксибензойные кислоты Н Н ОН п-гидроксибензойная (п-ГБК) Н ОСН3 ОН ванилиновая (ВК) ОСН3 ОСН3 ОН сиреневая (СирК) п-гидроксикоричные кислоты п-кумаровая (КК) Н Н ОН феруловая (ФК) Н ОСН3 ОН синаповая (СинК) ОСН3 ОСН3 ОН Значения АОЕ ГК кислот по отношению к катион-радикалу АБТС убывают в ряду ФКСинККК (табл. 4). Отличия в наблюдаемых тенденциях изменения АОЕ ГК кислот с различным числом метоксильных заместителей по отношению к катион радикалу АБТС и пероксильному радикалу обусловлены неконкурентным и конкурентным характером соответствующих методов анализа АОЕ. В случае анализа АОЕ по отношению к катион-радикалу АБТС первичные продукты окисления частично сохраняют способность к гашению радикала, что вносит вклад в определяемое значение АОЕ.

Таблица 4. Антиоксидантная емкость гидроксибензойных и гидроксикоричных кислот по отношению к пероксильному радикалу (ORAC) катион-радикалу АБТС(TEAC).

АОЕ, мкмоль ТЭ/мкмоль Соединение ORAC TEAC п-ГБК 2,17±0,18 2,34±0, ВК 3,44±0,19 2,33±0, СирК 1,52±0,11 1,46±0, КК 5,02±0,26 3,04±0, ФК 4,59±0,31 3,90±0, СинК 2,94±0,19 3,66±0, Величины АОЕ ГБ кислот по отношению к пероксильному радикалу убывают в ряду ВКп-ГБКСирК. В отличие от ГК кислот, введение 1 метоксильного заместителя в о-положение по отношению к гидроксигруппе приводит к увеличению АОЕ ГБ кислот, однако наличие 2-х метоксильных заместителей наоборот приводит к ее снижению (табл. 4). В целом сходная тенденция наблюдается в случае анализа АОЕ ГБ кислот по отношению к катион-радикалу АБТС: АОЕ убывает в ряду ВКп-ГБКСирК.

Результирующее влияние метоксильных заместителей на АОЕ ГБ и ГК кислот определяется суммой трех эффектов: влияния метоксильных заместителей на распределение электронной плотности в ароматических системах, стабилизационных эффектов при делокализации неспаренного электрона образующегося феноксильного радикала и стерических эффектов. Наличие в ГБ и ГК двух метоксильных заместителей вызывает снижение электронной плотности в ароматической системе и возникновение стерических препятствий при взаимодействии с пероксильным радикалом и катион радикалом АБТС, что приводит к снижению АОЕ (табл. 4). В то же время, при наличии одного метоксильного заместителя преобладающим является эффект стабилизации феноксильного радикала, который нивелирует негативное влияние остальных двух факторов на АОЕ ГБ и ГК кислот.

Молекулярные и электронные дескрипторы антиоксидантных свойств ГБ и ГК кислот.

Атомы углерода бензольного кольца с максимальной электронной плотностью наиболее предпочтительны для атаки электрофильных агентов, к которым относятся свободные радикалы. Результаты расчетов молекулярных и электронных дескрипторов моноанионных (с депротонированной карбоксильной группой) форм ГБ и ГК кислот свидетельствуют, что предпочтительными для атаки электрофильными агентами являются атомы углерода, находящиеся в м-положениях (С2, С4) по отношению к фенольному гидроксилу (рис. 5). В случае п-ГБК и ВК введение одного метоксильного заместителя снижает величину Мулликеновского заряда в полрожении С2 в 2,7 раза, однако АОЕ по отношению к пероксильному радикалу для ВК в 1,5 раза выше по сравнению с п-ГБК (табл. 4). В данном случае, по-видимому, более значимым оказывается стабилизационный эффект и отсутствие выраженных пространственных затруднений. В то же время при добавлении еще одного метоксильного заместителя (СирК), Мулликеновский заряд в положении С2 снижается в 3,2 раза и возникают пространственные затруднения для атаки объемных радикалов по С2 атому углерода, что в совокупности приводит к снижению АОЕ по сравнению с п-ГБК в 1,8 и 1,4 раза по отношению к катион-радикалу АБТС и пероксильному радикалу соответственно.

Аналогичная тенденция наблюдалась при сравнении транс-КК и транс-СинК.

Сопоставление данных табл. 4 по АОЕ ГБ и ГК кислот по отношению к пероксильному радикалу и величин Мулликеновких зарядов в положениях С2/С моноанионных форм гидрокси-ароматических кислот показало наличие значимой (p0,05) обратной корреляции (r=-0,889) между данными параметрами (рис. 7а). Также было установлено наличие значимой (p0,05) корреляции между значениями АОЕ ГБ и ГК кислот по отношению к пероксильному радикалу и величиной энергии ВЗМО (r=0,824) и жесткостью (r=-0,871) моноанионных форм данных соединений (рис. 7 б,в).

Таким образом, различия в величинах АОЕ ГБ и ГК по отношению к пероксильному радикалу объясняются более высокими значениями Мулликеноского заряда на предпочтительном для атаки электрофилов атоме углерода и более низкой жесткостью ГК по сравнению с ГБ.

Мулликеновское распределение электронной плотности было также рассчитано для радикалов и катион-радикалов ГБ и ГК в различных состояниях ионизации.

Полученные данные показали, что отдача атома водорода или электрона приводит к образованию соответствующих феноксильных радикалов и катион-радикалов, у которых наиболее высокая электронная плотность отмечается на атомах углерода, находящихся в мета-положениях по отношению к фенольному гидроксилу. Таким образом, именно эти положения являются предпочтительными для вторичной атаки электрофильных агентов.

AOE ORAC, мкмоль ТЭ/мкмоль AOE ORAC, мкмоль ТЭ/мкмоль 0 1, -0,2 0 2 4 1, электронная плотность 1, -0, Мулликеновская жесткость, эВ 1, -0, С2 (С4) 1, -0, 1, - 1, -1, 1, -1, 1, -1, 0 2 4 а в AOE ORAC, мкмоль ТЭ/мкмоль -0, Рис. 7. Сопоставление 0 2 4 величин АОЕ ГБ и ГК по -0, отношению к -0, Е(ВЗМО), эВ пероксильному радикалу и -0, значений Мулликеновской -0, электронной плотности в положении С2/С4 (а), -0, энергии ВЗМО (б) и -0, жесткости ( - в).

-0, б Согласно квантово-химическим расчетам С3 цепочка участвует в делокализации неспаренного электрона у радикалов и катион-радикалах транс-ГК кислот, а также радикалов моноанионной формы цис- ФК и СинК. Полученные данные свидетельствуют, что делокализация неспаренного электрона в феноксильных радикалах ГК кислот возможна при величине угла между плоскостями, в которых находятся атомы углерода бензольного кольца и атомы углерода при двойной связи в С3 цепочке, не более ±10С. По-видимому, именно большая стабильность феноксильных радикалов транс-ГК кислот является причиной того, что в структуре растительных лигнинов преобладают звенья именно транс-ГК кислот и альдегидов.

Таким образом, сравнение результатов квантово-химических расчетов с результатами анализа АОЕ подтвердило сделанный вывод о влиянии С3 фрагмента и этенильного мостика между карбоксильной группой и бензольным кольцом на АОЕ ГК кислот (табл. 4).

Для дискриминации механизма взаимодействия ГБ и ГК кислот с катион радикалом АБТС был проведен анализ корреляций значений АОЕ с термодинамическими характеристиками моноанионных форм ГБ и ГК кислот.

Выявлена значимая (p0,05) корреляция значений АОЕ моно-ГБ и моно-ГК кислот по отношению к катион-радикалу АБТС наблюдается только с величиной ЭПЭ (r= 0,901).

Следовательно, при рН реакционной среды 7,40 основным механизмом реализации антиоксидантных свойств ГБ и ГК кислот по отношению к катион-радикалу АБТС является ПДДЭ. Поскольку п-ГБ и п-ГК кислоты являются структурными аналогами тирозина, следует ожидать, что взаимодействие тирозин-содержащих дипептидов с катион-радикалом АБТС, также протекает по механизму ПДДЭ.

На основе результатов проведенного анализа корреляций величин АОЕ и термодинамических и электронных характеристик предложена схема, описывающая механизм взаимодействия п-ГБ и п-ГК кислот и тирозиновых пептидов с пероксильным радикалом (рис. 8). Первичная атака пероксильного радикала реализуется по многостадийному механизму SE: пероксильный радикал атакует ароматическую систему по атому углерода с наибольшей электронной плотностью с образованием интермедиата 1, распад которого приводит к отрыву атома водорода фенольного гидроксила с образованием гидропероксида и феноксильного радикала. Затем происходит делокализация неспаренного электрона с образованием наиболее термодинамически устойчивой формы феноксильного радикала. В случае ванилиновой кислоты максимальная электронная плотность локализуется на С2 атоме углерода, по которому проходит вторичная атака пероксильным радикалом, приводящая к образованию интермедиата 2, который, в свою очередь, вступает в последующие химические реакции с образованием стабильных продуктов.

делокализация ванилиновая интермедиат феноксильный интермедиат 1 неспаренного электрона кислота радикал O O O O O O O O O O C C C C C ROO ROO ROO ROO H CH CH CH CH CH3 O O O O O ROOH O O O OH OH Рис. 8. Механизм взаимодействия гидроксибензойных и гидроксикоричных кислот с пероксильным радикалом на примере ванилиновой кислоты.

Характеристика композиций с различным пептидным профилем.

Для верификации антиоксидантных свойств пептидов и аминокислот in vivo было проведено исследование влияния пептидных композиций, полученных при ферментативном гидролизе коллагеновых и мышечных белков, на антиоксидантный статус крыс. Пептидная композиция ФМП2 была получена из ФМП1 методом последовательной тангенциальной микро- и ультрафильтрации. Сравнительная характеристика состава и антиоксидантных свойств исследованных пептидных композиций in vitro представлена в табл. 5.

Пептидные композиции ФМП1 и ФМП2 характеризовались сопоставимым общим содержанием аминокислот и белка (табл. 5). В то же время пептидные композиции ФМП1 и ФМП2 отличались по молекулярно-массовому распределению и содержанию свободных аминокислот. В ФМП1 преобладающей (50%) являлась низкомолекулярная фракция (М.в.3 кДа), а в ФМП2 – фракция с молекулярным весом компонентов от 3 до 10 кДа. Кроме того, содержание свободных аминокислот в ФМП было в 1,6 раза ниже по сравнению с ФМП1. Более низкое содержание свободных аминокислот, которые обладают выраженной способностью к гашению пероксильного радикала и катион-радикала АБТС in vitro (рис. 1), обуславливает в 1,3-1,5 раза более низкие величины АОЕ ФМП2 по отношению к обои типам радикалов по сравнению с таковыми для ФМП1 (табл. 5). Для определение вклада компонентов с различными молекулярными массами, входящих в состав пептидных композиций ФМП1 и ФМП2, было проведено их фракционирование методом гель фильтрации с последующим анализом АОЕ полученных фракций (табл. 5, рис. 9). Анализ относительного вклада компонентов с различным М.в. в АОЕ пептидных композиций ФМП1 и ФМП2 показал, что более половины величины АОЕ по отношению к пероксильному радикалу и более 70% - по отношению к катион-радикалу АБТС приходится на долю низкомолекулярной фракции (М.в.3 кДа), включающей короткие пептиды и свободные аминокислоты (табл. 5, рис. 9).

М.в. 10 кДа М.в. 3-10 кДа М.в. 3 кДа  о тнос и тел ь ны й  в кл ад в  АО Е, % O R AC T E AC ФМП 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 20 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 36 3 7 3 8 3 9 4 а номер ф ракци и  относ итель ны й  ФМП в кла д в  АО Е, % O R AC T E AC 1 2 3 4 5 67 8 9 1 0 1 1 1 2 13 14 15 16 1 7 1 8 1 9 2 0 21 22 23 2 4 2 5 2 6 2 7 28 29 30 31 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 37 38 39 б номер ф р акции Рис. 9. – Анализ вклада компонентов с различными молекулярными массами в антиоксидантную емкость пептидных композиций ФМП1 и ФМП2.

Таблица 5. Сравнение пептидных композиций ФМП1 и ФМП2.

Пептидная композиция Параметр ФМП1 ФМП 86,5 85, массовая доля белка (N6,25), % относительное содержание компонентов с М.в.10 кДа 10,6 11, относительное содержание компонентов с М.в. 3-10 кДа 34,4 60, относительное содержание компонентов с М.в. 3 кДа 55,1 28, общее содержание аминокислот, мг/г 873,8±37,4 864,1±33, содержание свободных аминокислот, мг/г 281,2±13,9 173,1±20, АОЕ ORAC, мкмоль ТЭ/г 319±13 209± вклад компонентов с М.в.10 кДа в АОЕ ORAC, % 5,7 8, вклад компонентов с М.в. 3-10 кДа в АОЕ ORAC, % 38,9 32, вклад компонентов с М.в.3 кДа в АОЕ ORAC, % 57,6 59, вклад свободных аминокислот в АОЕ ORAC, % 46,6 35, АОЕ TEAC, мкмоль ТЭ/г 638±13 484± вклад компонентов с М.в.10 кДа в АОЕ TEAC, % 3,5 6, вклад компонентов с М.в. 3-10 кДа в АОЕ TEAC, % 21,0 15, вклад компонентов с М.в.3 кДа в АОЕ TEAC, % 75,5 78, вклад свободных аминокислот в АОЕ TEAC, % 43,9 39, Установлено, что пептидные композиции ФМП1 и ФМП2 характеризовались бимодальным распределением относительного вклада фракций в АОЕ по отношению к пероксильному радикалу, при этом основная часть АОЕ приходилась на фракции 20- (пептиды, Tyr, Met, His, ансерин, карнозин) и 30-33 (свободный Trp) (рис. 9). В случае ФМП1 также наблюдается бимодальное распределение относительного вклада фракций с различным молекулярным весом компонентов в АОЕ по отношению к катион радикалу АБТС, с максимальной относительной долей фракций 23-28 и 30-33. На фоне пониженного содержания свободных аминокислот в ФМП2 отмечалось возрастание относительного вклада низкомолекулярных пептидов в АОЕ по отношению к катион радикалу АБТС и пероксильному радикалу на 8 и 23% соответственно (табл. 5). Анализ распределения относительного вклада фракций в АОЕ ФМП2 по отношению к катион радикалу АБТС показал, что оно существенно отличалось от такового для ФМП1: на долю фракций 27 и 28 приходилось около 40% от общей АОЕ (рис. 9).

Анализ пептидного профиля композиций ФМП1 и ФМП2 методом масс спектрометрии ионно-циклотронного резонанса позволил идентифицировать соответственно 573 и 620 последовательностей пептидов, для которых основными предшественниками являлись саркоплазматические и миофибриллярные белки, коллагены и белки крови. Анализ последовательностей идентифицированных пептидов с учетом данных по редокс-активности различных аминокислот (рис. 1) позволил выявить в ФМП1 296 пептидов, вступающих в реакции с пероксильным радикалом и 164 пептида, вступающих в реакции с катион-радикалом АБТС, а в ФМП2 - 353 и пептидов соответственно. Для решения проблемы обоснованного выбора соединений для последующего анализа была разработана стратегии скрининга антиоксидантных пептидов с использованием набора установленных ранее молекулярных дескрипторов антиоксидантных свойств дипептидов (табл. 6, рис. 10).

Таблица 6. Молекулярные дескрипторы антиоксидантов пептидной природы.

АОЕ по Значение АОЕ по отношению отношению к Дескриптор эффекта к пероксильному катион-радикалу радикалу АБТС Предпочтительное N- или C- N-концевое С-концевое концевое положение остатка +1 положение Tyr и положение Met редокс-активной аминокислоты Trp Наличие в составе пептида последовательностей, Tyr-His обуславливающих эффекты Trp-Tyr His-Tyr внутримолекулярного + Met-Tyr синергизма между соседними остатками редокс-активных аминокислот Наличие в составе пептида последовательностей, в которых соседние остатки аминокислот с -1: Lys-Tyr, ионогенными группами в Arg-Tyr, Tyr-Glu, +1: Lys-Tyr, Arg боковых радикалах оказывают +1 / -1 Tyr-Asp Tyr позитивное или негативное +1: Tyr-Lys, влияние на антиоксидантные Tyr-Arg свойства остатков редокс активных аминокислот Следует отметить, что имеющиеся литературные данные свидетельствуют о снижении АОЕ пептидов с увеличением числа аминокислотных остатков, входящих в их состав [Hernandez-Ledesmа et al., 2007;

Shen et al., 2010]. При этом средняя длина антиоксидантных пептидов, описанных в литературе, составляет порядка аминокислотных остатков. Для оценки АОЕ пептидов был предложен интегральный параметр I, учитывающий размер пептида и количество в нем остатков редокс активных аминокислот, а также позиционные эффекты и эффекты взаимного влияния аминокислотных остатков на антиоксидантные свойства пептидов (уравнение 1). С учетом вышеизложенного для каждого идентифицированного пептида рассчитывали величину интегрального параметра I.

n Ei I i 1 (1), nN где Еi - величина эффекта согласно табл. 6;

n – число остатков редокс-активных аминокислот в составе пептида;

N – общее число аминокислотных остатков в пептиде.

Разработанная стратегия отбора пептидов с потенциально высокой антиоксидантной емкостью базируется на подсчете числа остатков редокс-активных аминокислот в пептиде с учетом эффектов взаимного влияния аминокислотных остатков, выявленных при анализе антиоксидантных свройств модельных низкомолекулярных соединений – дипептидов.

На основе данных по числу и качественному составу остатков редокс-активных аминокислот, входящих в состав исследуемого пептида, а также рассчитанных величин характеристического параметра I, из числа антиоксидантных пептидов, идентифицированных в композициях ФМП1 и ФМП2, были отобраны соединения с потенциально высокими величинами АОЕ. В качестве примера в табл. 7 приведены последовательности соответствующих пептидов в ФМП1. Полученные данные свидетельствуют, что основными предшественниками пептидов с потенциально высокими значениями АОЕ в исследованных пептидных композициях являются миофибриллярные (-актин, цепи миозина), сакроплазматические (глицелальдегид-3 фосфатдегидрогеназа, енолазы) белки и белки крови (-субъединица гемоглобина, сывороточный альбумин).

Таблица 7. Пептиды, входящие в состав композиции ФМП1, с потенциально высокой антиоксидантной емкостью по отношению к пероксильному радикалу (ORAC) и катион-радикалу АБТС (TEAC).

Белок предшественник ORAC TEAC Gallus gallus YDEAGPS, YELPDGQVIT, YELPDGQVITIGNER, YELPDGQVITIG, DSGDGVTHNVPIYEGY, DSGDGVTHNVPIYEGY, -актин NVPAMY, WIGGSILA WIGGSILA, TNFVPAMY, YVGDEAQSKRG, YELPDGQVITIGNE TTNPYDYHYVSQ, TTNPYDYHYVSQ, тяжелая цепь миозина TNPYDYHY TNPYDYHY, регуляторная легкая цепь DPEDVIM миозина AINDPFIDLNYMVY, AINDPFIDLNYMVY, VSWYDNEFGYSN, VSWYDNEFGYSN, YDSTHGHFK, глицеральдегид-3-фосфат- SWYDNEFGYSN, SWYDNEFGYSN, дегидрогеназа VSWYDNEFGYSNR, INDPFIDLNYMVY VVAINDPFIDLNYM YPVVSIEDPFDQDDWE, -енолаза YPVVS YGKDATNVGDEGGFAP, -енолаза - YGKDATNVGDEGGFAPN YGKDATNVGDEGGFAPNIL GDDLDPKY, GGDDLDPKY, креатин-киназа М-типа KGGDDLDPKY, NLKGGDDLDPKY DTKYVPPPFNPDM, YVPPPFNPDMFSFDE, сывороточный альбумин MDDMARMM YVPPPFNPDMF YGAETL, YPPTKTYFPHFD, -субъединица гемоглобина А YPPTKTYFPHFD YGAETLERMF, YPPTKTYFP овотрансферрин GWVIPM Пептиды размером до 20 а.о.

Пептиды, Пептиды, содержащие Пептиды, содержащие 4 Пептиды, 3 остатков редокс- содержащие остатков редокс- содержащие активных аминокислот остаток Tyr и / или активных остатка Met или His и 2 остатков Tyr и / Trp аминокислот или Trp I0,3 I0, Пептиды с потенциально высокой антиоксидантной емкостью Рис. 10. Стратегия скрининга антиоксидантных пептидов, входящих в состав пептидных композиций.

Характеристика антиоксидантных свойств пептидных композиций с различным пептидным профилем in vivo.

Исследование антиоксидантных свойств пептидных композиций in vivo проводили на 4 экспериментальных группах крыс. Животных содержали на полусинтетических рационах, отличающихся источником белка: группа 1 (казеин), группа 2 (ФМП1), группа 3 (ФМП2) и контрольная группа – безбелковый рацион.

Величины АОЕ и содержание ТБК-реактивных продуктов в сыворотке крови как у экспериментальных животных, так и в контрольной группе были практически одинаковыми (табл. 8). Данные показатели экстрактов гидрофильных и липофильных компонентов тканей печени также не отличались у экспериментальных животных (группы 1-3). В то же время, у животных контрольной группы значения АОЕ экстрактов гидрофильных и липофильных компонентов из печени по отношению к пероксильному радикалу были соответственно в 1,9 и 3,0 раза ниже по сравнению с остальными экспериментальными группами (табл. 8). Отличия в значениях АОЕ обусловлены различной реакционной способностью пероксильного радикала и катион радикала АБТС.

Наиболее выраженные отличия между экспериментальными группами животных в значениях показателей антиоксидантного статуса выявлены при анализе экстрактов головного мозга. У животных контрольной группы значения АОЕ экстрактов гидрофильных компонентов головного мозга по отношению к пероксильному радикалу были в 1,3 раза ниже по сравнению с таковыми в остальных экспериментальных группах (табл. 8). Таким образом, при безбелковой диете у крыс наблюдается снижение функционального резерва в первую очередь водорастворимых антиоксидантов в печени и головном мозге. Содержание ТБК-реактивных продуктов в гомогенатах головного мозга было достоверно (p0,05) ниже у животных 2 и 3 групп, получавших рационы на основе пептидных композиций (табл. 8). Животные 3 экспериментальной группы также характеризовались достоверно (p0,06) более высокими значениями АОЕ экстрактов гидрофильных компонентов головного мозга по отношению к катион радикалу АБТС по сравнению с таковыми для животных 1 и 4 групп (табл. 8).

Выявленный более выраженный антиоксидантный эффект пептидной композиции ФМП2 с меньшим содержанием свободных аминокислот, обусловлен преобладанием в ее составе низкомолекулярных пептидов. Таким образом антиоксидантный эффект исследованных пептидных композиций in vivo обусловлен не свободными аминокислотами, а пептидами с М.в. 3 кДа.

Таблица 8. Антиоксидантная емкость и содержание ТБК-реактивных продуктов в сыворотке крови и органах экспериментальных животных.

Группа, M±SD 4 (n=10), Объект Параметр 1 (n=11), 2 (n=11), 3 (n=10), безбелковый казеин ФМП1 ФМП рацион TEAC, мМ 10,29±0,70 9,89±0,34 10,08±0,43 9,68±0, сыворотка ORAC, мМ 4,92±0,26 4,81±0,64 5,19±0,36 4,82±0, крови МДА, мкМ 1,22±0,20 1,45±0,28 1,14±0,22 1,23±0, TEAC гидрофильная 89,2±13,6 69,6±4,2 64,6±2,8 64,4±6, фракция, мкмоль ТЭ/г TEAC липофильная 0,34±0,07 0,40±0,09 0,45±0,11 0,38±0, фракция, мкмоль ТЭ/г печень ORAC гидрофильная 17,3±2,6 18,2±1,4 17,2±2,2 9,2±1, фракция, мкмоль ТЭ/г ORAC липофильная 2,73±0,99 2,88±0,79 2,34±0,75 0,88±0, фракция, мкмоль ТЭ/г МДА, нмоль/ г 59,0±8,7 55,2±12,7 57,9±4,1 54,4±10, TEAC гидрофильная 38,1±4,8 43,5±3,1 49,9±3,2 37,2±5, фракция, мкмоль ТЭ/г TEAC липофильная 19±4 25±5 21±3 19± фракция, нмоль ТЭ/г головной ORAC гидрофильная мозг 6,26±1,16 6,72±0,78 6,77±0,85 4,83±1, фракция, мкмоль ТЭ/г ORAC липофильная 2,43±0,70 2,60±0,58 2,99±0,61 2,63±0, фракция, мкмоль ТЭ/г МДА, нмоль/ г 44,8±4,4 32,9±4,2 36,3±4,1 41,2±7, ВЫВОДЫ 1. Показано, что редокс-активными по отношению к пероксильному радикалу являются аминокислоты Tyr, Trp, Met, Cys и His, по отношению к катион-радикалу АБТС - Tyr, Trp и Cys. Включение остатков Tyr и Met в состав дипептидов приводит к разноплановым влияниям на величину их АОЕ, что определяется типом радикала, положением остатка редокс-активной аминокислоты, взаимодействием остатка редокс активной аминокислоты с остатками других редокс-активных аминокислот и аминокислот с ионогенными группами в боковых радикалах. Эффект внутримолекулярного синергизма остатков редокс-активных аминокислот показан при взаимодействии Trp-Tyr с пероксильным радикалом, а также Met-Tyr, Tyr-His и His-Tyr с катион-радикалом АБТС.

2. В результате проведенных структурно-функциональных исследований показано, что наиболее значимыми дескрипторами антиоксидантных свойств тирозина и его упрощенных модельных аналогов (ароматических п-гидроксикислот) по отношению к пероксильному радикалу являются энергия ВЗМО, жесткость () и величина Мулликеновского заряда на атоме углерода в м-положении по отношению к фенольному гидроксилу, а по отношению к катион-радикалу АБТС при рН 7,40 – энтальпия переноса электрона от фенолят иона. Установлено, что наиболее значимыми дескрипторами антиоксидантных свойств метиониновых дипептидов по отношению к пероксильному радикалу являются потенциал ионизации (ПИ), электроотрицательность () и электрофильность ().

3. На основе анализа результатов квантово-химических расчетов и тестирования антиоксидантной емкости установлено, что тирозин и его упрощенные модельные аналоги (ароматические п-гидроксикислоты) взаимодействуют с пероксильным радикалом по механизму электрофильного замещения с донированием атома водорода, а метионин и дипептиды на его основе - по механизму одноэлектронного донирования.

Механизм взаимодействия тирозиновых пептидов и ароматических п-гидроксикислот с катион-радикалом АБТС включает последовательное депротонирование фенольного гидроксила и донирование электрона.

4. Предложен интегральный параметр I для оценки антиоксидантных свойств пептидов с учетом установленных эмпирических дескрипторов. На основании полученных данных разработана стратегия скрининга антиоксидантных пептидов.

5. Установлено, что основной вклад (50%) в АОЕ пептидных композиций in vitro вносят низкомолекулярные компоненты (М.в. 3 кДа), включающие пептиды и свободные аминокислоты. Показано, что антиоксидантный эффект пептидных композиций in vivo в условиях без индукции экзогенного окислительного стресса обусловлен не свободными аминокислотами, а пептидами с М.в. 3 кДа.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Николаев И.В., Степанова Е.В., Еремеев Н.Л., Исмаилова Д.Ю., Зайчик Б.Ц., Ружицкий А.О, Хотченков В.П., Костылева Е.В., Синицын А.П., Волик В.Г., Королева О.В. (2008) Оптимизация процесса ферментативного гидролиза для получения функционального мясного протеина. Биотехнология, 5: 59-67.

2. Николаев И.В., Колобкова Л.Н., Ландесман Е.О., Степанова Е.В., Королева О.В. (2008) Антиоксидантная и пероксидазная активность слюны при воспалительных заболеваниях пародонта и возможность их коррекции. Биомедицинская химия, 54 (4):

454-462.

3. Николаев И.В., Степанова Е.В., Ландесман Е.О., Королева О.В., Митасева Л.Ф.

(2008) Антиоксидантные свойства белковых гидролизатов животного происхождения.

Мясная индустрия, 12: 36-39.

4. Еремеев Н.Л., Николаев И.В., Керученько И.Д., Степанова Е.В., Сатрутдинов А.Д., Зиновьев С.В., Исмаилова Д.Ю., Хотченков В.П., Цурикова Н.В., Синицын А. П., Волик В.Г., Королева О.В. (2009) Ферментативный гидролиз кератинсодержащего сырья для получения белковых гидролизатов. Прикладная биохимия и микробиология, 45(6): 717-725.

5. Николаев И.В., Зайчик Б.Ц. Степанова Е.В., Королева О.В. (2009) Оценка антиоксидантной емкости коньяков. Виноделие и виноградарство, 2: 13-15.

6. Николаев И.В., Степанова Е.В., Митасева Л.Ф., Королева О.В., Машенцева Н.Г., Глазкова И.В. (2009) Многофункциональные продукты с улучшенными свойствами. Мясная индустрия, 9: 66-69.

7. Semjonyscheva A. I., Nikolaew I.W., Maschenzewa N.G., Stepanowa E.W., Mytasewa F. F., Koroljowa O.W. (2010) Methoden der rationellen Verarbeitung eines in der Geflgelverarbeitungsindustrie anfallenden Rohstoffers (Rational processing of a raw material generated in the poultry processing industry). Fleischwirtschaft 3: 122-125.

8. Николаев И.В., Степанова Е.В., Королева О.В., Попов В.О. (2011) Биологически активные пептидные композиции из вторичных продуктов переработки птицы – обзор. Fleischwirtschaft International - Россия, 1: 61-64.

Тезисы докладов:

1. Nikolaev I.V., Stepanova E. V., Keruchenko I.D., Keruchenko J.S., Khotchenkov V.P., Koroleva O.V. (2008) Influence of hydrolysis degree on antioxidant properties of peptide hydrolysates. Proceedings of the First European Food Congress.Ljubljana, Slovenia, р 191.

2. Ilya Nikolaev, Olga Klein, Natalia Kulikova, Elena Stepanova, Olga Koroleva (2008) Development and validation of antioxidant capacity assessment protocol for humic and humic-like substances. Proceedings of the 14-th meeting of International Humic Substances Society. Moscow-Saint-Petersburg, Russia, p. 441-444.

3. Зайчик Б.Ц., Николаев И.В., Ружицкий А.О., Хотченков В.П., Королева О.В.

(2009) Исследование качества и безопасности крепких алкогольных напитков.

Биотехнология: состояние и перспективы развития. Москва, ч. 1 c. 449-450.

4. Nikolaev I.V., Lambertini F., Khotchenkov V.P., Sforza S., Koroleva O.V. (2010) Antioxidant constituents of functional animal protein. 14-th International Biotechnology Symposium and exhibition. Rimini, Italy, J. Biotechnol. 150, Suppl. 1, p. 336-337.

5. Popov V.O., Dossena A., Nikolaev I.V., Lambertini F., Sforza S., Volik V.G., Koroleva O.V. (2010) Biocatalytic approach for poultry meat&bone; residues conversion. 14 th International Biotechnology Symposium and exhibition. Rimini, Italy, J. Biotechnol. 150, Suppl. 1, p. 570.

6. Кляйн О.И., Николаев И.В., Куликова Н.А., Степанова Е.В., Королева О.В.

(2010) Оценка антиоксидантной емкости гуминовых и гуминоподобных веществ.

Сборник тезисов докладов VIII Международной конференции Биоантиоксидант, Москва, с. 205-207.

7. Николаев И.В., Храмеева Е.Е., Степанова Е.В., Королева О.В. (2010) Структурно-функциональная характеристика антиоксидантных свойств гидроксибензойных и гидроксикоричных кислот. Сборник тезисов докладов VIII Международной конференции Биоантиоксидант. Москва, с. 205-207.

Работа выполнена при финансовой поддержке Государственных контрактов №16.512.11.2272 от 14 сентября 2011 года «Разработка биокаталитических подходов получения биоразлагаемых полимеров из малоценного кератин содержащего сырья», №02.522.11.2143 от 01 марта 2011 года «Разработка методов создания функциональных продуктов и кормов для домашних животных из малоценного сырья животного происхождения», № 02.740.11.0878 от «28» июня 2010 г «Разработка подходов биокаталитической конверсии малоценных отходов переработки птицы и создание аналитической платформы для тестирования многокомпонентных белковых гидролизатов».

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ТЕКСТЕ АБТС – 2,2’-азинобис-(3-этил-бензотиазолинсульфонат) АОЕ – антиоксидантная емкость АФК – активные формы кислорода ВЗМО – высшая заполненная молекулярная орбиталь ВК – ванилиновая кислота ГБ – гидроксибензойные кислоты ГК- гидроксикоричные кислоты ДАВ – донирование атома водорода КК – п-кумаровая кислота М.в. – молекулярный вес НВМО – низшая вакантная молекулярная орбиталь НФБ – натрий-фосфатный буфер п-ГБК - п-гидроксибензойная кислота ПДДЭ – последовательное депротонирование с донированием электрона ПДЭД - последовательное донирование электрона с депротонированием ПИ – потенциал ионизации СинК – синаповая кислота СирК – сиреневая кислота СП – сродство к протону ТБК – 2-тиобарбитуровая кислота ФК – феруловая кислота ФСБ – фосфатно-солевой буфер ЭДС – энтальпия диссоциации связи ЭПД – энтальпия диссоциации протона ЭПЭ – энтальпия переноса электрона ORAC – антиоксидантная емкость по отношению к пероксильному радикалу TEAC - антиоксидантная емкость по отношению к катион-радикалу АБТС