Особенности комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных металлов
На правах рукописи
Грошева Валентина Ивановна
ОСОБЕННОСТИ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ
ТЕТРАЦИКЛИНА
С ИОНАМИ РЕДКОЗЕМЕЛЬНЫХ МЕТАЛЛОВ
Специальность 03.00.02
Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук
Москва - 2006
Работа выполнена в Институте радиотехники и электроники РАН.
Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Золин Владислав Фёдорович
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук, профессор Петрова Галина Петровна доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник Нечипуренко Юрий Дмитриевич
Ведущая организация: Центр фотохимии РАН
Защита состоится «19» октября 2006 г. в 17.00 ч. на заседании Специализированного Совета К 501.001.08 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:
119992, ГСП-2, г.Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, физический факультет, аудитория № 519.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.
Автореферат разослан «18» сентября 2006 г.
Ученый секретарь Специализированного Совета К 501.001. при МГУ им. М.В.Ломоносова, доктор физико-математических наук Г.Б.Хомутов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Исследование специфичности связывания ионов металлов с биоорганическими молекулами является актуальным направлением современной биофизики и ряда смежных наук. Комплексные соединения ионов металлов являются непосредственными участниками целого ряда процессов, протекающих в живых организмах. Они играют центральную роль в переносе кислорода и углекислого газа, участвуют в процессе электронного транспорта в хлоропластах и в митохондриях, в ферментативном катализе и во множестве других процессов. Присутствие катионов металлов в водной фазе влияет на физико-химические свойства, фазовое состояние биомембран и их компонент, сказывается на регуляции работы ферментов. Научное обоснование селективности связывания ионов металлов с биологическими молекулами важно для более глубокого понимания закономерностей организации живой материи, разгадки молекулярных механизмов процессов самосборки, самоорганизации и самовоспроизведения структур, характерных для разнообразных биосистем. С другой стороны, результаты исследования селективности связывания биоорганических молекул с ионами металлов в перспективе могли бы быть использованы для разработки чувствительных биосенсоров.
Особый научный и практический интерес представляет исследование молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов.
Фармакологическая активность лекарственных препаратов определяется не только их химической структурой, но и состоянием функциональных групп, определяемым как взаимодействием молекул препарата с растворителем, так и друг с другом. При специфическом связывании этих молекул с клетками мишенями, особую роль играет конформация молекул, которая может изменяться, например, при взаимодействии молекул препарата с двух и трёхзарядными ионами металлов. Одним из традиционных методов исследования конформации молекул является метод кругового дихроизма, который позволяет следить за кинетикой конформационных перестроек молекул в растворе (при наличии полос поглощения в видимой или ультрафиолетовой областях спектра).
Объект исследования Междисциплинарным объектом нашего исследования является молекула тетрациклина. С одной стороны – это биомолекула, оказывающая воздействие на биосинтез белка в бактериальных клетках, и поэтому представляющая интерес для биологов, медиков и фармацевтов. С другой – это достаточно стабильная мезомолекула, имеющая молекулярный размер, промежуточный между размерами малых органических молекул и макромолекул, и уникальное химическое строение, благодаря которому её можно использовать, например, в качестве биосенсора.
Предмет исследования Предметом исследования диссертационной работы является изучение особенностей взаимодействия тетрациклина с ионами лантанидов, приводящего к комплексообразованию. Интерес к комплексным соединениям тетрациклина с ионами редкоземельных металлов связан с тем обстоятельством, что эти катионы обладают сродством к кальций связывающим центрам белков, мембран, протеолипидов, причём константы связывания с лантанидами намного выше, чем с кальцием. Это свойство редкоземельных катионов послужило основанием для разработки ныне широко применяемого на практике метода редкоземельного спектроскопического зондирования биомолекул, базирующегося на гипотезе эквивалентности мест связывания лантанидов и кальция. По изменениям спектральных характеристик комплексных соединений, активированных лантанидами, делаются соответствующие выводы о строении мест связывания с ионами кальция или магния. Ионы лантанидов, несмотря на то, что являются абиотичными, находят применение в медицине в качестве диагностических средств, благодаря своим уникальным оптическим и магнитным свойствам. Катионы европия успешно используются в качестве люминесцентных зондов, катионы гадолиния применяют при магнитно-резонансной томографии в качестве контрастных агентов. Изучается влияние катионов гадолиния на пролиферацию и подвижность некоторых опухолевых клеток. Таким образом, исследование комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных элементов имеет важное научное и прикладное значение.
Степень разработанности научной проблемы Тетрациклин и его производные успешно применяются в медицинской практике в качестве лекарственных препаратов. Тетрациклин хорошо проникает сквозь клеточные мембраны бактерий, связывается с рибосомами, оказывая ингибирующий эффект на синтез бактериальных белков. Установлено, что он может взаимодействовать и с митохондриями бактериальных клеток. Максимум антибактериальной активности гидрохлорид тетрациклина проявляет при слабокислом значении рН, равном 5,5. Остается открытым вопрос – чем всё таки обусловлена селективность действия тетрациклина на клетки микроорганизмов, почему происходит увеличение проницаемости бактериальных мембран для тетрациклина по сравнению с мембранами клеток млекопитающих? По этому поводу существует две точки зрения. Некоторые учёные считают, что проницаемость мембран для тетрациклина напрямую связана с изменением его заряда и конформационных свойств при комплексообразовании с ионами металлов (он становится электрически нейтральным и легче растворяется в липидах). Другие полагают, что перенос тетрациклина через мембраны осуществляется специальными белками-переносчиками. Так или иначе, фармакокинетические исследования плазмы крови показали, что 95% тетрациклина, не связанного с белками, находится в форме комплексных соединений кальция и магния. Поэтому выяснение особенностей комплексообразования тетрациклина с катионами металлов играет большую роль для дальнейшего понимания механизмов транспорта тетрациклина в живых организмах.
В литературе имеются сведения, полученные методами рентгеноструктурного анализа, кругового дихроизма и ЯМР, о том, что связывание тетрациклина с ионами металлов способно изменять конформационное состояние молекул тетрациклина. В результате рентгеноструктурных исследований были получены структурные данные (значения длин ковалентных и водородных связей, валентных и пространственных углов) для многих известных производных тетрациклина, широко применяемых в медицине. Это позволило рассчитать пространственную структуру антибиотика. Потенциометрическим методом было установлено, что константы диссоциации протонов гидрохлорида тетрациклина в водных растворах при 25оС составляют рКa1=3,33;
рКa2=7,75;
рКa3=9,68.
Однако, результаты спектральных исследований комплексных соединений тетрациклина с ионами металлов, полученные с помощью метода кругового дихроизма, противоречивы. Расхождения результатов связаны как с различиями условий проведения экспериментов (рН, ионная сила, концентрации реактивов, состав используемой щёлочи, вид аниона соли комплексообразующего катиона), так и с полным отсутствием информации о кинетических аспектах связывания тетрациклина с ионами металлов.
Кроме того, ряд исследований проводился при физиологически неприемлемых условиях (в диметилсульфоксиде, при крайне высоких рН и т.д).
Работ, посвящённых изучению комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных элементов, крайне мало - они были сделаны методом ЯМР.
Методом кругового дихроизма таких исследований не проводилось.
Цель и задачи исследования Целью нашей работы является выяснение молекулярных механизмов связывания кальция и лантанидов тетрациклином при физиологически активных концентрациях тетрациклина (~ 10-4 M) и оптимальном значении рН~5,2.
Исходя из общей цели, в диссертации решались следующие задачи:
1. Выявление особенностей комплексообразования тетрациклина с рядом одно, двух и трёхзарядных ионов металлов в воде методом кругового дихроизма.
2. Проверка гипотезы об изоморфизме мест связывания кальция и лантанидов (на примере комплексных соединений тетрациклина с кальцием и самарием).
3. Изучение влияния фактора рН на процесс комплексообразования тетрациклина с кальцием и самарием в водных растворах.
4. Кинетическое исследование процесса комплексообразования самария с тетрациклином в водных растворах в изоэлектрической точке (при рН=5,2).
5. Исследование влияния одновалентных катионов на процесс комплексообразования тетрациклина с ионами самария.
6. Регистрация и анализ оптических и ПМР спектров комплексных соединений тетрациклина с ионами лантанидов (для выяснения строения мест связывания ионов металлов).
7. Конформационный анализ пространственной структуры молекул тетрациклина в комплексных соединениях с ионами металлов с помощью ЭВМ и сопоставление результатов расчетов с данными, полученными при исследованиях взаимодействия тетрациклина с ионами металлов методами КД и ЯМР спектроскопии.
Научная новизна работы 1. Обнаружено различие мест связывания ионов кальция и лантанидов молекулой тетрациклина в воде при рН=5,2 (в изоэлектрической точке) в комплексах состава 1:1.
2. В водных растворах при рН=5,2 связывание ионов металлов с молекулами тетрациклина происходит на А-хромофоре при участии трикарбонилметановой группировки.
Для доказательства этих выводов, существенных для выявления механизмов биологического действия антибиотиков ряда тетрациклина, использовались следующие экспериментальные результаты, полученные впервые методами КД, ЯМР и оптической спектроскопии:
1) обнаружены различия спектров кругового дихроизма комплексов тетрациклина с ионами скандия и тяжёлых металлов (стронция, кадмия, лантанидов) и с ионами лёгких металлов (магния, кальция, алюминия) в области длин волн ~380-420нм в комплексных соединениях состава 1:1 при рН=5,2 в воде;
2) получены кинетические кривые образования комплексных соединений тетрациклина с самарием в воде, свидетельствующие о зависимости кинетики комплексообразования при рН=5,2 от типа катиона щелочи (КОН, NaOH, LiOH);
3) продемонстрировано влияние ионной силы и рН на кинетику образования комплексных соединений тетрациклина с самарием в воде в области слабокислых рН (рК1рНрК2);
4) получены и проанализированы электронно-колебательные спектры люминесценции и возбуждения Eu3+ в комплексных соединениях тетрациклина с кальцием, стронцием, иттрием, лантаном, гадолинием, лютецием, активированных европием, которые свидетельствуют о низкой симметрии центров связывания катионов металлов.
Кроме того, произведён расчёт и анализ конформационных состояний тетрациклина на ЭВМ и предложены практические методы оценки чистоты препаратов тетрациклина и определения тяжёлых металлов в природных водоёмах при помощи метода кругового дихроизма.
Научно-практическая значимость исследования Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, важны, поскольку иллюстрируют фундаментальные механизмы образования комплексных соединений полидентатных лигандов в электролитах, содержащих многозарядные ионы металлов. Они могут найти применение в биофизике, координационной химии и медицинской биологии, позволяют приблизиться к пониманию механизмов действия тетрациклина на молекулярном уровне и стимулировать дальнейшие изыскания в этой области.
Исследована кинетика и выявлены физико-химические факторы, влияющие на процесс связывания тетрациклина с ионами лантанидов, проведён анализ конформаций тетрациклина в комплексных соединениях лантанидов на ЭВМ.
Кинетические исследования процесса комплексообразования показали, что при создании новых комплексонов важную роль играют сольватационные факторы:
рН, ионная сила, полярность растворителя. Открытый нами эффект замедления процесса комплексообразования тетрациклина с самарием при замене гидроксида калия на гидроксиды натрия или лития, возможно, является частным проявлением общей тенденции взаимодействия одновалентных катионов с хелатами биологических мезо- и макромолекул и многозарядных ионов металлов, и требует дальнейших исследований.
Результаты диссертационной работы имеют важное практическое значение. На их основе предложены спектральные экспресс-методы измерения содержания катионов тяжёлых металлов в природных водоёмах и определения чистоты препаратов антибиотиков тетрациклинового ряда, что делает эту работу интересной не только для биофизиков, но и для экологов, а также специалистов в области медицинской промышленности.
Результаты работы также представляют практический интерес для специалистов, разрабатывающих новые биосенсоры.
Защищаемые положения 1. Введение многозарядных ионов металлов в водные растворы гидрохлорида тетрациклина при рН= 5,2 сопровождается появлением в спектрах кругового дихроизма новой консервативной полосы КД в области длин волн ~370-420нм. Порядок чередования знаков КД компонентов консервативной полосы ~370-420нм зависит от типа катионов металлов, взаимодействующих с молекулой тетрациклина:
а) связывание ионов натрия, калия, цезия, а также цинка, железа, гадолиния не приводит к существенным изменениям величины эллиптичности в этой области спектра КД;
б) связывание ионов лёгких металлов: магния, алюминия, кальция сопровождается появлением новой консервативной полосы КД с отрицательным экстремумом при = 410 нм;
в) связывание ионов тяжёлых металлов (иттрия, стронция и лантанидов) приводит к появлению новой консервативной полосы КД с положительным экстремумом при = 415 нм.
2. В группе комплексных соединений тетрациклина с ионами ряда металлов, исследованных нами в воде при рН = 5,2, наибольшие значения амплитуды эллиптичности наблюдаются в случае взаимодействия с ионами самария (полоса КД положительного знака, max = 415 нм) и ионами кальция (полоса КД отрицательного знака, min= 410 нм). Места связывания кальция и лантанидов на А-кольце молекулы тетрациклина различны.
3. Ионная сила водных растворов, рН, а также состав щелочи, используемой для депротонирования гидрохлорида тетрациклина, оказывают воздействие на кинетику комплексообразования гидрохлорида тетрациклина с самарием в воде (1,510-4М). Повышение рН в слабокислой области (рК1рНрК2) не изменяет величину амплитуды полосы эллиптичности в комплексах тетрациклина с кальцием (при min= 410 нм), но оказывает на нее воздействие в случае комплексов с самарием (при max= 415 нм): наибольшие значения эллиптичности достигаются в изоэлектрической точке при рН~5,2.
4. Наблюдаемые эффекты открывают возможность создания датчиков для регистрации концентраций кальция и тяжёлых металлов в водных растворах с помощью дихрографического метода.
Апробация работы Результаты работы были доложены на следующих конференциях, симпозиумах и совещаниях:
1) Х Всесоюзное совещание "Физические методы в координационной химии". (Кишинев, I990);
2) VIII Всесоюзный симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул. (Новосибирск, I990);
3) VI Всесоюзное Совещание "Спектроскопия координационных соединений".- (Краснодар, 1990);
4) Всесоюзная конференция "Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных пpепаратов антибиотиков и антимикробных веществ". (Москва, 1990);
5) V Всесоюзное Совещание "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах". ( Иваново, I99I).
Публикации Результаты работы, описанной в диссертации опубликованы в шести статьях и пяти докладах на Всесоюзных конференциях, симпозиумах и совещаниях. Список работ прилагается в конце автореферата (стр. 19).
СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 127 страницах, иллюстрирована 38 рисунками и 2 таблицами. Список литературы содержит 100 источников.
Во введении дана общая характеристика работы, обоснована актуальность темы, сформулированы цели и определены основные задачи исследования, кратко изложены научная новизна и практическая ценность работы.
Первая глава посвящена обзору литературы по исследованиям взаимодействия тетрациклина с ионами металлов. Проанализированы опубликованные результаты исследований комплексных соединений лантанидов с тетрациклином методами ЯМР и рентгеноструктурного анализа.
Установлено, что систематических исследований спектров КД тетрациклина с ионами редкоземельных металлов в растворах не проводилось. В связи с этим была выбрана цель данной работы: проведение детальных исследований взаимодействий тетрациклина с ионами металлов с помощью спектров кругового дихроизма, спектров люминесценции и спектров ПМР.
Во второй главе описаны материалы, методы синтеза комплексных соединений тетрациклина с ионами металлов, а также методы исследования, использованные в работе. В нашей работе изучалось комплексообразование гидрохлорида тетрациклина с солями натрия, калия, цезия, магния, кальция, стронция, бария, кадмия, меди, цинка, алюминия, железа, скандия, иттрия и лантанидов в воде, этиловом спирте, диметилсульфоксиде и ацетоне.
Спектры поглощения получали на спектрофотометре UV-VIS (ГДР) при температуре 300оС. Спектры кругового дихроизма "Specord" растворов комплексных соединений регистрировались на дихрографе СD фирмы Jouan (Франция) при температуре 300Ко. Образование комплексных соединений регистрировалось по изменению кругового дихроизма в области длин волн ~ 245-470 нм. Спектры люминесценции ионов европия (Eu3+) записывали на спектрометре ИСП-51 с длиннофокусной камерой УФ-90 в D0,1,2 - 7F0,1 переходов люминесценции ионов Eu3+ и затем получали области денситограммы на микрофотометре. Для этого готовили комплексные соединения тетрациклина с ионами металлов, активированные Eu3+. Спектры ПМР получали на спектрометре WM-250 в дейтерированной воде относительно эталона ДСС (диметилсилоксан силапентан натриевая соль сульфокислоты). Математическое моделирование пространственной структуры комплексных соединений тетрациклина с металлами осуществлялось на ЭВМ ЕС 1055М методами молекулярной механики с помощью модифицированной программы В.Г.Дашевского, написанной на Фортране.
В третьей главе описаны результаты исследования спектров кругового дихроизма (КД) гидрохлорида тетрациклина (ТЦ) и его комплексных соединений с ионами металлов.
Связывание молекул ТЦ с ионами ряда металлов в воде сопровождается появлением в длинноволновой области спектра КД ( ~ 360-420нм) дополнительной консервативной полосы. В спектрах растворов свободного тетрациклина такая полоса не наблюдается. С помощью спектров КД было выяснено, что максимальные амплитуды дихроизма консервативной полосы достигаются в случае связывания ТЦ с ионами самария или кальция в водных растворах при рН =5,2. При этом длинноволновые полосы КД для растворов комплексов ТЦ с самарием и кальцием инверсны по отношению друг к другу. В области полосы дихроизма ~410-415 нм наблюдается положительный пик дихроизма для комплекса с самарием и отрицательный – для комплекса с кальцием. Установлено, что депротонирование молекулы ТЦ сопровождается конформационными переходами: в нейтральной и слабокислой областях рН тетрациклин находится в конформации, приближающейся к планарной, а в кислой и слабощелочной области – в «свёрнутой» конформации.
Рис.1. Спектры КД водных растворов гидрохлорида тетрациклина (6) при рН=2, и его комплексов с хлоридами металлов [1:1] при рН=5,2: EuCl3(1), YCl3 (2), CaCl (3), MgCl2 (4), NaCl (5).
При образовании комплексов ТЦ с ионами многозарядных металлов [1:1] в воде при рН=5,2 на фоне КОН в спектрах поглощения происходит батохромное смещение наиболее низкочастотной полосы поглощения с max=360нм до max=400 нм, а в спектрах КД наблюдается появление новой консервативной полосы в области длин волн ~370-420нм (рис.1). Порядок чередования знаков КД компонентов консервативной полосы ~370-420нм, наблюдаемой в указанном диапазоне, зависит от типа катионов металлов, взаимодействующих с молекулой тетрациклина:
1) взаимодействие с ионами натрия, калия, цезия, а также цинка, железа, гадолиния не приводят к существенным изменениям спектра КД тетрациклина в этой области;
2) взаимодействие с ионами лёгких металлов: магнием, алюминием, кальцием приводит к появлению новой полосы КД с существенным отрицательным пиком дихроизма при =410 нм – амплитуда дихроизма максимальна для комплексов тетрациклина с ионами кальция;
3) взаимодействие с ионами скандия и ионами тяжёлых металлов (иттрия, стронция и лантанидов) приводит к появлению новой полосы КД с положительным пиком дихроизма при = 415 нм. По ряду лантанидов дихроизм велик в комплексах ионов, у которых число 4f-электронов меньше семи (цериевая подгруппа) и увеличено координационное число.
Наибольшие значения амплитуды эллиптичности наблюдаются в растворах комплексов ТЦ с самарием (положительный КД max= 415 нм) и с кальцием (отрицательный КД min= 410 нм) (рис.3).
Инверсия длинноволновой полосы КД для комплексов с кальцием и самарием связана с различием мест связывания катионов этих металлов на А кольце молекулы тетрациклина (рис.2).
Рис.2. Места связывания самария и кальция в молекуле гидрохлорида тетрациклина при pH=5,2.
Рис.3. Зависимость значений амплитуды эллиптичности [] для экстремумов КД от стехиометрии комплексов тетрациклина с ионами кальция и самария в воде при рН=5,2.
[М] – концентрация ионов металла, [ТЦ] - концентрация гидрохлорида тетрациклина, n M= [М]/[ТЦ], n ТЦ= [ТЦ] / [М].
а) многоядерные комплексы, образующиеся при взаимодействии тетрациклина:
1 - c ацетатом самария (= 415 нм), 2 - c хлоридом самария на фоне одноядерных комплексов хлорида кальция (= 410 нм), 3 - c хлоридом самария (= 415 нм), 4 - с хлоридом кальция ( = 410 нм);
([ТЦ] = 1,510-4М);
б) многолигандные комплексы, образующиеся при взаимодействии тетрациклина:
1 - c ацетатом самария ( = 410 нм), 2 - c хлоридом самария ( = 410 нм), ([М] =1,510-4М).
Наибольшие значения дихроизма (max= 415 нм) для растворов комплексов ТЦ с самарием в области слабокислых рН: (рК1рНрК2) достигаются вблизи изоэлектрической точки при рН~5,2. Повышение рН не влияет на изменение амплитуды эллиптичности max полосы КД (min= 410 нм) в комплексах с кальцием. Ионная сила водных растворов, рН, а также тип щелочи, используемой для депротонирования гидрохлорида тетрациклина, оказывают существенное влияние на кинетику комплексообразования ТЦ с самарием в воде (1,5.10-4М). По мере увеличения величины ионных радиусов однозарядных катионов (от лития к калию), присутствующих в водной среде, наблюдается возрастание скорости реакции комплексообразования ТЦ с самарием (рис.4).
Рис.4. Кинетика образования комплексов тетрациклина с самарием [1:1] при рН = 5. ( = 415 нм) на фоне различных щелочей:
1- КОН, 2- NaOH, 3- LiOH.
Время образования многолигандных комплексов ТЦ с самарием при рН=5,2 зависит от условий проведения эксперимента и растёт в случае поэтапного титрования лигандом вследствие образования промежуточных комплексов. Соотношение амплитуд эллиптичности 380 ( = 380 нм) и 320 ( = 320 нм) в спектрах КД меняется по ряду лантанидов. В начале ряда 380 320, в середине 380 ~ 320, а к концу ряда 380 320.. В комплексах конца ряда лантанидов исчезает консервативный характер полосы длинноволнового перехода. Интенсивность консервативной полосы КД, соответствующей длинноволновому переходу, находится в прямой зависимости от диэлектрической проницаемости среды и протонодонорной способности молекул растворителя. По мере уменьшения диэлектрической проницаемости (уменьшения полярности растворителя) максимум длинноволновой полосы в спектрах поглощения комплексов тетрациклина с самарием смещается к коротковолновому краю спектра, а в спектрах КД происходит уширение консервативной полосы (рис.5):
Рис.5. Длинноволновая область спектров КД растворов комплексов тетрациклина с ацетатом самария (1,510-4М) [1:1]:
1 - в этиловом спирте, 2 – в диметилсульфоксиде, 3 – в ацетоне.
В четвёртой главе кратко рассмотрены результаты взаимодействия тетрациклина с ионами лантанидов и кальция, полученные по спектрам люминесценции и спектрам ПМР.
Установлено, что для спектров люминесценции комплексов ТЦ с катионами металлов (кальция, стронция, иттрия, лантана, гадолиния, лютеция), активированных ионами европия, характерны большие Штарковские расщепления 7F1 и 7F2 – уровней европия, а также высокая относительная интенсивность 5D0 - 7F0,2 переходов (рис.6).
Рис.6. Денситограммы электронно-колебательных спектров люминесценции комплексного соединения тетрациклина с ионами европия:
1 - в воде;
2 – при связывании с лецитиновыми липосомами.
Эти особенности говорят о низкой симметрии комплексов. Спектр кальциевой соли ТЦ, меченной европием, имеет наиболее четкую структуру и напоминает спектры -дикетонатов европия. Спектры ПМР (протонного магнитного резонанса) комплексных соединений тетрациклина с диамагнитным ионом La3+ и парамагнитным ионом Yb3+ приведены на рис.7 и рис.8.
Рис.7. Спектр ПМР раствора комплекса лантана с тетрациклином в D2О.
Рис.8. Спектр ПМР раствора комплекса иттербия с тетрациклином в D2О.
Данные ПМР качественно согласуются с данными, полученными по спектрам КД, свидетельствующими о том, что при рН=5,2 ионы лантаноидов, а также кальция, стронция, иттрия взаимодействуют с трикарбонилметановой группировкой А-кольца молекулы тетрациклина.
Математическое моделирование пространственной структуры комплексных соединений ТЦ производилось с целью оценки относительной стабильности различных конформаций ТЦ при учёте Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий и внутримолекулярных водородных связей. Оно осуществлялось на ЭВМ ЕС-1055М методами молекулярной механики с помощью модифицированной программы В.Г. Дашевского, написанной на Фортране. Сложность построения структурной модели молекулы ТЦ на компьютере состоит в том, что в ее состав входят четыре замкнутых углеродных кольца. При построении моделей за основу брали плоское кольцо D, а затем последовательно замыкали оставшиеся В, С, А кольца, варьируя значения пространственных углов (через 10), сохраняя неизменными величины валентных углов и длины связей для атомов, находящихся в sp3 гибритизации.
Таким способом было получено 14 потенциально возможных конформаций остова молекулы ТЦ, различающихся по степени «свёрнутости-развёрнутости»
молекулы. Для каждой из полученных конформаций суммировались вклады Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий атомов (моделируемых потенциалами Дашевского) в потенциальную энергию системы и производился расчет длин внутримолекулярных водородных связей. Оптимальной конформации тетрациклина соответствовал минимум потенциальной энергии. Обнаружена прямая связь между степенью развернутости молекулы и энергией Ван-дер Ваальсовых взаимодействий, а также выяснены условия существования «развёрнутых» и «свёрнутых» конформаций молекулы тетрациклина.
В пятой главе обсуждаются возможности применения полученных результатов в медицине, фармакологии и экологии. Наблюдаемые эффекты открывают возможность создания биодатчиков для регистрации концентраций кальция и тяжёлых металлов в водных растворах с помощью портативных дихрографов. Дихрографический метод позволяет определять содержание тяжёлых и легких двухзарядных катионов металлов в воде и может применяться как для проверки жесткости водопроводной питьевой воды, так и для проведения экологического мониторинга содержания катионов кальция и тяжёлых металлов в пресноводных водоёмах, природных карстовых источниках, а также сливах и стоках промышленных предприятий. Этот метод может быть также использован в фармацевтической промышленности для определения чистоты препаратов тетрациклина на основе анализа спектров КД водных растворов антибиотика.
В заключении сформулированы результаты диссертационной работы и подчеркнуто её практическое значение.
ВЫВОДЫ При физиологически активных рН (рН=5,2) образование эквимолярных комплексных соединений гидрохлорида тетрациклина с ионами многозарядных металлов (кальция, магния, алюминия, стронция, иттрия и лантанидов) в воде происходит с участием трикарбонилметановой группировки А-кольца молекулы тетрациклина. При переходе от кальция к лантанидам меняется ориентация карбамидной группы относительно остова молекулы тетрациклина, объясняемая различием мест связывания катионов кальция и лантанидов.
Эти выводы сделаны на основании установленных нами экспериментальных фактов и математического моделирования конформаций тетрациклина, а именно:
1. Комплексообразование гидрохлорида тетрациклина с многозарядными ионами металлов сопровождается появлением в спектрах кругового дихроизма новой консервативной полосы в области длин волн ~370- нм. Порядок чередования знаков компонент этой консервативной полосы КД зависит от типа катионов, взаимодействующих с молекулой тетрациклина:
1) отрицательный пик дихроизма при min= 410 нм (в комплексах с лёгкими металлами: магнием, алюминием, кальцием);
2) положительный пик дихроизма при max= 415 нм (в комплексах со скандием и тяжёлыми металлами: иттрием, стронцием и лантанидами).
Связывание ионов однозарядных катионов, а также ионов цинка, железа, гадолиния не приводит к появлению длинноволновой полосы КД.
2. Вблизи изоэлектрической точки (рН=5,2) наибольшие значения амплитуды эллиптичности наблюдаются в растворах комплексов тетрациклина с самарием (положительный КД, max= 415 нм) и с кальцием (отрицательный КД, min= 410 нм). Различие знаков дихроизма связано с различием мест связывания кальция и лантанидов на А-кольце молекулы тетрациклина. По ряду лантанидов дихроизм велик в спектрах комплексов ионов цериевой подгруппы (число 4f-электронов меньше семи и велико координационное число).
3. Ионная сила, рН, а также тип щелочи, используемой для депротонирования гидрохлорида тетрациклина, влияют на скорость образования комплексов тетрациклина с самарием, возрастающую по мере увеличения радиусов однозарядных катионов (от Li+ к K+), присутствующих в водном растворе.
Спектры люминесценции примеси Eu3+ в комплексах кальция, стронция, 4.
иттрия, лантана, гадолиния и лютеция с тетрациклином, также, как и спектры ПМР, говорят о низкой симметрии центров связывания многозарядных катионов металлов.
5. На основе анализа моделей конформационных состояний молекулы тетрациклина, полученных в результате машинного эксперимента на ЭВМ ЕС-1055М, обнаружена прямая связь между степенью свёрнутости молекулы и энергией Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий.
Проведенная работа открывает возможность создания фотохемодатчиков для регистрации концентраций катионов кальция и тяжёлых металлов в водных растворах с помощью дихрографического метода, в частности, для определения жесткости питьевой воды, для определения чистоты препаратов тетрациклина и для определения наличия ионов тяжёлых металлов в воде.
СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ СОИСКАТЕЛЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Грошева В.И. Влияние одновалентных катионов на процесс комплексообразования тетрациклина с ионами самария.// Антибиотики и химиотерапия.- 2005.- Т.50.- №10-11.- С.3-7.
2. Грошева В.И. Спектральный контроль содержания примесей металлов в препаратах тетрациклина.//Антибиотики и химиотерапия.- 2006.- Т.51. № 2.- С.3-7.
3. Бабушкина T.A., Грошева В.И., 3олин В.Ф., Коренева Л.Г. Изучение комплексообразования тетрациклина с ионами лантаноидов методами оптической и ЯМР-спектроскопии.// Координационная химия.- 1997.- Т.23. №9.- С.709-711.
4. Грошева В.И., Золин В.Ф. Спектры кругового дихроизма комплексов тетрациклина с ионами металлов.//Координационная химия.- 1994. - Т.20. №5.- С.397-400.
5. Грошева В.И. Влияние депротонирования на конформационное состояние молекулы тетрациклина.//Антибиотики и химиотерапия.- 1992.- Т.37.- № I. С. 11-14.
6. Грошева В.И. Применение метода кругового дихроизма для оценки чистоты препаратов тетрациклина.// Успехи в области изучения и производства антибиотиков. – М.: Труды ВНИИА, 1992.- С.148-154.
7. Грошева В.И. О влиянии природы растворителя на формирование комплексов тетрациклин: самарий.// Тезисы докладов V Всесоюзного Совещания "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах". Иваново, I99I.- С.62.
8. Грошева В. И., Золин B.Ф. Kинeтические исследования процесса комплексообразования тетрациклина с ионами РЗЭ методом кругового дихроизма.//Тезисы докладов Х Всесоюзного совещания "Физические методы в координационной химии".- Кишинев, I990.- С.42.
9. 3олин В.Ф., Грошева В.И., Бабушкина T.A.. ЯМР и оптическая спектроскопия комплексов лантанидов с тетрациклином.// Тезисы докладов VI Всесоюзного Совещания "Спектроскопия координационных соединений".- Краснодар, 1990.- С. 157.
10. Грошева В.И. Конформационный анализ структуры молекулы тетрациклина.//Тезисы докладов VIII Всесоюзного симпозиума по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул. Новосибирск, I990.- Ч.I.- С.II7.
11. Грошева В.И. Применение метода КД для оценки чистоты препаратов тетрациклина.//Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных пpепаратов антибиотиков и антимикробных веществ".- М., 1990.- С.50.