Углеводный обмен, неспецифическая резистентность и продуктивность свиней на низкопротеиновых рационах с различными уровнями аминокислот и энергии
На правах рукописи
Гаглошвили Анатолий Анатольевич
Углеводный обмен, неспецифическая резистентность
и продуктивность свиней на низкопротеиновых рационах
с различными уровнями аминокислот и энергии
03.01.04 – биохимия
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Боровск - 2010 2 Диссертационная работа выполнена в лаборатории иммунобиотехноло гии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных»
Научный руководитель- доктор биологических наук, профессор Галочкин Владимир Анатольевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Дудин Виталий Иванович кандидат биологических наук, доцент Саковцева Татьяна Владимировна
Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства
Защита состоится 30 июня 2010 года в 10 часов на заседании диссерта ционного совета Д 006.030.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте физиологии биохимии и питания сельскохозяйственных живот ных.
Адрес института: 249013, Калужская область, г. Боровск, пос.Институт, ВНИИФБиП с.-х. животных. Телефон 8(495)9963415, факс 8(48438) Автореферат диссертации разослан 26 мая 2010 года и раз мещён на официальном сайте института www.bifip2006.narod.ru 25 мая 2010 года Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук В.П.Лазаренко
Общая характеристика работы
1.1. Актуальность работы Специфические особенности свиней в сравнении с другими сельскохо зяйственными животными делают их одним из приоритетных видов в реше нии задач продовольственной безопасности страны. Свиньи - скороспелые, многоплодные, всеядные животные с высокой энергией роста и высокой сте пенью трансформации питательных веществ корма в высококачественную продукцию.
Существующие нормы кормления свиней, при всей глубине проработки, не всегда продолжают удовлетворять возрастающим требованиям – быстро му производству продукции за счет ускорения синтетических процессов в организме растущих, откармливаемых и племенных животных, получению продукции высоких пищевых достоинств и повышению конверсии питатель ных веществ корма в продукцию. В наше время сохраняется актуальность новых разработок, совершенствование норм кормления, уточнение принци пов и способов оценки питательности кормов на основе современных дости жений биохимии питания животных и фундаментальных знаний обмена ве ществ и механизмов его регуляции.
В последние годы усилия многих ученых направлены на совершенство вание системы полноценного питания свиней, в которой важное значение придают обеспечению животных высококачественным белком, содержащим в определенном количестве и соотношении все заменимые и незаменимые аминокислоты (концепция идеального протеина) (Рядчиков В.Г. и др., 2000;
Thong H.T., Liebert F., 2004;
Stein H.H. et al., 2007). На основании этой кон цепции можно существенно снизить уровень сырого протеина в рационах свиней, обогатив их незаменимыми аминокислотами (Ниязов Н.А., 2005;
Аверкиева О., 2007;
Голушко В.М. и др., 2008). Однако на этот счет в литера туре имеются противоречивые данные. Так, (Smith J.W. et al., 1998) зарегист рировали снижение массы мышц и отложения белка в теле у свиней на низ копротеиновом рационе с добавками лимитирующих аминокислот, (Knowles T.A. et al., 1998) не выявили существенных изменений в массе мышц и отло жения белка, а (Каширина М.В. и др., 2005) отметили положительные изме нения.
В наше время заметно возросла роль биохимических тестов в монито ринге физиологического статуса сельскохозяйственных животных, обеспе ченности их в основных элементах питания, адаптации к технологии содер жания. В частности, первостепенное значение имеет изучение особенностей обмена углеводов в организме сельскохозяйственных животных с целью ши рокого использования отдельных показателей углеводного обмена для реше ния практических вопросов животноводства. Интенсивность и направлен ность углеводного обмена имеет прямые взаимосвязи с белково аминокислотным, липидным и энергетическим обменами. Исследование об мена углеводов у свиней заслуживает особого внимания, поскольку они ха рактеризуются повышенной интенсивностью липогенеза, главным образом, за счёт превращений углеводных компонентов.
Другой немаловажный аспект широкого внедрения интенсивных про мышленных технологий производства животноводческой продукции связан с возникновением противоречий между биологическими и технологическими аспектами данной проблемы. Возникает ряд новых стресс-факторов, назы ваемых технологическими. Низкобелковый рацион, в свою очередь, также выступает стрессором (Галочкин В.А. и др., 2007). Интенсификация процес сов перекисного окисления липидов и избыточное образование свободных радикалов является неотъемлемым следствием стрессов любой природы.
Данные нарушения функционирования системы антиоксидантной и иммун ной защиты организма животных отрицательно сказываются на обмене ве ществ, сопротивляемости животных и, как следствие, на их продуктивности и качестве производимой продукции. В связи с этим является актуальным изучение антиоксидантного статуса сельскохозяйственных животных.
1.2. Цели и задачи исследования В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы было изучение особенностей функционирования гликолиза, глюконеогенеза, цикла трикар боновых кислот и их взаимосвязи у молодняка свиней в период интенсивного доращивания и откорма на низкопротеиновых рационах при различных соот ношениях и уровнях заменимых и незаменимых аминокислот и обменной энергии и их влияния на продуктивные качества и неспецифическую рези стентность животных.
В соответствии с указанной целью, в задачи исследования входило:
1. Изучить взаимосвязь интенсивности и направленности метаболизма углеводов с экспериментальными условиями белкового, аминокис лотного и энергетического питания;
2. Выявить взаимосвязь интенсивности углеводного обмена с антиок сидантным статусом и неспецифической резистентностью организма животных;
3. Исследовать взаимосвязь показателей неспецифической резистентно сти с продуктивностью животных;
4. Изыскать возможность недопущения потерь продуктивности расту щими и откармливаемыми свиньями при снижении в рационе уровня протеина, добавках синтетических незаменимых аминокислот и варьировании обменной энергии.
1.3. Научная новизна работы Впервые изучены особенности функционирования гликолиза, глюко неогенеза, цикла трикарбоновых кислот и их взаимосвязи с неспецифиче ской резистентностью и продуктивностью у интенсивно растущих и откарм ливаемых свиней в условиях пониженного содержания протеина в рационе с добавками синтетических незаменимых аминокислот и с различными уров нями обменной энергии.
1.4. Практическая значимость работы Полученные данные будут использованы для усовершенствования сис темы питания свиней с целью разработки способов нормализации обмена веществ, повышения неспецифической резистентности, улучшения эффек тивности биоконверсии питательных веществ корма в компоненты мяса и повышения качества производимой продукции.
1.5. Положения выносимые на защиту:
1. С возрастом обмен пировиноградной кислоты в тканях интенсифици руется и усиливается вовлечение её в процессы митохондриального окисления.
2. Величины активности ключевых ферментов глюконеогенеза в печени свиней с возрастом имеют тенденцию к снижению.
3. В возрасте 65 суток наблюдается наивысшая интенсивность гликоли тических процессов. С возрастом роль гликолиза в энергетике мы шечной ткани снижается.
4. В организме свиней прослеживается положительная взаимосвязь функциональной активности системы редукции глутатиона с величи нами каталитической активности ферментов углеводного обмена, и обратная связь интенсивности процессов липопероксидации с про дуктивностью животных.
1.6 Апробация результатов исследований.
Материалы диссертационной работы доложены на:
14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых уче ных «Биология – наука ХХI века».
1.7. Структура диссертации.
Диссертация изложена на 104 стр. компьютерного текста, содержит 10 таб лиц, 7 рисунков. Включает следующие разделы: введение, обзор литературы, объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, предложения практике и список литературы, вклю чающий 150 источников, в том числе 58 иностранных.
2. Объект и методы исследований Для решения поставленных задач был проведен опыт в условиях вива рия института ВНИИФБиП с.-х. животных на помесных поросятах (ландрас крупная белая). В уравнительный период животные получали полнораци онный комбикорм типа СК-5. После уравнительного периода по принципу аналогов с учетом живой массы, пола и возраста были сформированы три группы поросят по 16 голов в каждой, с начальной живой массой 21-22 кг.
Содержание и кормление групповое. Опыт продолжался до достижения жи вой массы свиней 105-110 кг.
Животные 1-й (контрольной) группы в период выращивания получали комбикорма на ячменно-пшеничной основе с содержанием обменной энергии и лимитирующих аминокислот по детализированным нормам (Нормы и ра ционы кормления сельскохозяйственных животных. Под ред. А.П. Калашни кова и др., 2003), но со сниженным уровнем сырого протеина до 120 - г/кг комбикорма (в зависимости от периода выращивания). У поросят 2-й группы количество сырого протеина было на уровне контрольной группы, а концентрация обменной энергии была увеличена на 5% и уровень лимити рующих аминокислот - на 22-33% путем дополнительного введения в рацион синтетических аминокислот - лизина, метионина и треонина. В комбикормах для свиней 3-й группы концентрация сырого протеина была повышена до 150-118 г путем добавки высокобелковых кормов и уровень обменной энер гии повышен на 10% по сравнению с контрольной группой за счёт добавки подсолнечного масла (Табл.1). Количество лимитирующих аминокислот в 3 й группе было выше контроля на 40-52%. Рационы в опытных группах отли чались разными соотношениями лизина и обменной энергии, а также отно шением метионина+цистина и треонина к лизину (Табл. 2). В течение опыта проводили групповой учет потребления комбикорма, контролировали его химический состав и фиксировали расход корма, сырого протеина и обмен ной энергии на единицу прироста живой массы. С целью контроля за ростом подопытных животных проводили взвешивания в начале и в конце каждого возрастного периода.
Таблица Состав комбикормов для свиней, % Период доращи- Первый период Второй период Компоненты вания откорма откорма Группы Группы Группы 1 2 3 1 2 3 1 2 Ячмень 71,5 69,5 60,0 77,5 75,5 66,4 66,5 63,5 53, Пшеница 20,0 20,0 20,0 10,0 10,0 20,0 20,0 20,0 20, Кукуруза - - - - - - 10,0 10,0 15, Шрот соевый 4,6 4,8 13,0 - 0,4 7,5 - 0,7 4, Отруби пшенич- 9,0 9,0 - ные Масло расти- 0,4 2,2 3,5 - 1,65 2,6 - 2,3 3, тельное Трикальций- 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1, фосфат Поваренная соль 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0, Мука известко- 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0, вая Премикс КС-3 1,0 1,0 1,0 - - - - - Премикс КС-4 - - - 1,0 1,0 1,0 - - Премикс КС-5 - - - - - - 1,0 1,0 1, Таблица Содержание питательных веществ и энергии в 1 кг комбикорма Период доращи- Первый период Второй период Компоненты вания откорма откорма Группы Группы Группы 1 2 3 1 2 3 1 2 ЭКЕ 1,24 1,30 1,36 1,19 1,25 1,31 1,22 1,28 1, Обменной энер- 12,4 13,0 13,6 11,9 12,5 13,1 12,2 12,8 13, гии, МДж 2 4 5 5 5 0 1 Сырого протеи- 120 122 152 114 114 135 107 107 на, г Переваримого 92 95 122 77 79 107 85 85,1 96, протеина, г Лизина, г 7,7 9,4 10,8 6,85 8,36 9,61 5,9 7,20 8, Метионин+ 4,6 6,1 7,0 4,45 5,84 6,67 4,0 5,25 6, цистин, г Треонина, г 4,8 6,3 7,2 4,25 5,63 6,47 3,8 5,03 5, Лизин/обменная 0,62 0,72 0,79 0,57 0,67 0,73 0,47 0,55 0, энергия Метионин+ 60 65 65 65 69 69 68 72 цистин / лизин Треонин / лизин 62 67 67 62 66 67 64 69 24,9 43,0 55,7 38,7 39,2 46,6 22,8 45,7 61, Сырого жира, г Сырой клетчат- 41,2 41,3 40,9 47,6 46,3 40,5 39,7 39,8 37, ки, г 8 3 1 Кальция, г 8,48 8,49 8,48 8,58 8,52 8,46 8,28 8,25 8, Фосфора, г 6,04 6,06 6,14 6,48 6,40 6,13 6,06 60,7 6, С целью изучения метаболизма углеводов в плазме крови определяли концентрацию низкомолекулярных метаболитов: пирувата, лактата и глюко зы. Концентрацию пировиноградной кислоты определяли по Фридеману и Хаугену (Прохорова М.И., Тупикова З.Н., 1965) в реакции с динитрофенил гидразином, последующей экстракцией образующихся гидразонов этилаце татом и выявлением гидразона пировиноградной кислоты содовым раство ром и щелочью. Концентрацию молочной кислоты определяли по увеличе нию поглощения при 340 нм раствора образца плазмы крови с НАД и очи щенной лактатдегидрогеназой. Концентрацию глюкозы анализировали с по мощью набора реактивов Глюкоза ФС «ДДС». В основе принципа метода лежит глюкозооксидазная реакция, с последующей цветной реакцией обра зующейся перекиси водорода с фенольным субстратом, катализируемой пе роксидазой.
В печени изучали активность фруктозодифосфатазы (КФ 3.1.3.11), пи руваткарбоксилазы (КФ 6.4.1.1) и пируватдегидрогеназы (КФ 1.2.2.2), а в об разцах длиннейшей мышцы спины – активность пируваткиназы (КФ 2.7.1.40) и лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.27). Выбор данных ферментов основывался на идентификации катализируемых ими реакций как неравновесных в про цессах гликолиза и глюконеогенеза, а, следовательно, причастных к регуля ции интенсивности и направленности метаболических потоков по этим цик лам (Ньюсхолм Э., Старт К., 1977).
Активность лактатдегидрогеназы определяли по оптическому тесту с использованием набора регентов ЛДГ-01-ВИТАЛ. В основе определения ле жит детекция понижения светопоглощения раствора НАДН, инкубируемого с образцом и субстратом реакции (пируват). Активность пируватдегидрогена зы определяли с применением красителей тетразолиевого синего и феназин метасульфата (Методы биохимического анализа, 1997). Последний служит акцептором водорода пируватдегидрогеназы и переводит тетразоливый кра ситель в восстановленную форму – формазан, нерастворимый в воде. Далее формазан экстрагируется ацетоном и спекрофотометрируется при 570 нм.
Активность пируваткарбоксилазы определяли с применением кинетической методики с инкубированием пробы с субстратом (пируват натрия) и карбок силирующим агентом (гидрокарбонат калия) в присутствии активаторов и НАДН. В основе метода лежит фиксирование понижения светопоглощения образца вследствие восстановления пиридиннуклеотидами образующейся щавелевоуксусной кислоты. Активность фруктозодифосфатазы анализирова ли по увеличению концентрации неорганического фосфора в растворе при инкубации образца с субстратом гидролиза (фруктозо-1,6-дифосфат). Фосфор определяли с помощью ванадат-молибдатного реактива. Активность пиру ваткиназы мышечной ткани анализировали по убыли НАДН, идущего на вос становление пирувата, образующегося в ходе пируваткиназной реакции из субстрата (фосфоенолпируват).
Для оценки неспецифической резистентности были определены сле дующие показатели: концентрация в плазме крови сульфгидрильных групп низкомолекулярных соединений (глутатион восстановленный + цистеин), ди сульфидных групп низкомолекулярных соединений (глутатион окисленный + цистин) и концентрация малонового диальдегида. Для определения тиоловых групп в плазме крови применяли раствор дитионитробензойной кислоты в фосфатном буфере (ДТНБ, реактив Эллмана) (Соколовский и др., 1997). Об разующийся в ходе восстановления нитротиобензоат (НТБ) определяли фо тометрически при 412 нм. Дисульфидные группы оттитровывали раствором нитротиосульфобензойной кислоты (НТСБ), который готовили по модифи цированной нами методике (Thannhauser et al., 1984) окислением водного дитионитробензоата кислородом воздуха в чашке Петри на свету в присутст вии сульфита натрия. После инкубации раствора нитротиосульфобензойной кислоты с исследуемым образцом фотометрически определяли нитротиобен зоат. Концентрацию малонового диальдегида определяли фотометрически после кипячения с тиобарбитуровой кислотой материала осаждённого из плазмы фосфо-вольфрамовой кислотой (Коробейникова, 1989).
Математическая обработка осуществлена с использованием t-критерия по Плохинскому Н.А. (1980).
Схема Схема эксперимента Возраст 65 суток 120 суток 165 суток 210 суток Группы: 1 2 3 1 2 3 1 2 СП: -29 - 29 -12% -31 -31 -25% -33 -33 -20% ОЭ: +0 +5 +10% - - - - - ЛА: +0 +22-33 +40-52% - - - - - СП – сырой протеин ОЭ – обменная энергия ЛА – лимитирующие аминокислоты 0 - норма 3. Результаты исследований 3.1. Углеводный обмен Исследовали концентрации ключевых низкомолекулярных метаболи тов углеводного обмена: молочной кислоты, пировиноградной кислоты и свободной глюкозы в плазме крови.
Судя по представленным данным (Табл. 3) концентрация глюкозы сни зилась в течение периода доращивания (с 5,88 ммоль/л) и претерпела незна чительный подъём в течение двух последующих периодов откорма. Это го ворит о повышении роли жирных кислот в энергетическом обмене у свиней в позднем постнатальном онтогенезе. Между тем, Ceriello A. et al., 1996 пред положили, что гипергликемия может повышать продукцию свободных ради калов, вызывая клеточную дисфункцию. Показано, что высокий уровень глюкозы может провоцировать окислительный стресс в клетках, повышая продукцию активных форм кислорода.
Концентрация пировиноградной кислоты оказалась достаточно ста бильной и значимых межгрупповых различий нам выявить не удалось. Auof fen M., 2004 показал, что окислительные повреждения молекулы церуло плазмина, сопровождаемые потерей его ферментативной активности, предот вращаются пировиноградной кислотой. Таким образом, выяснилась роль пи рувата в антиоксидантной системе организма.
Следует обратить внимание на показатель интенсивности гликолитиче ских превращений углеводов (К), равный отношению концентрации молоч ной к пировиноградной кислоте в плазме крови. Обращает на себя внимание высокая интенсивность гликолитических процессов в возрасте 65 суток. Это мы объясняем изменением соотношения с возрастом гликолитических и ли политических процессов в пользу последних и трактуем как биологическую специфику вида. Таблица Концентрации глюкозы, пирувата и лактата в плазме крови у свиней разного возраста, М±m.
Возраст, су- n Глюкоза, Пируват, Лактат, K тки-группы ммоль/л ммоль/л ммоль/л 65-фон 3 5,88±0,28 0,056±0,006 1,39±0,01 24, 120 - 1 4 3,08±0,58 0,11±0,006 1,18±0,20 10, 120 - 2 4 3,43± 0,60 0,11±0,002 1,18± 0,13 10, 120 - 3 4 4,18± 0,33 0,10± 0,006 1,10±0,08 165 - 1 4 4,3± 0,85 0,10± 0,003 0,97± 0,08 9, 165 - 2 4 3,55± 0,83 0,08±0,006 1,10± 0,11 13, 165 - 3 4 5,78± 1,18 0,09±0,004 1,07± 0,06 11, 210 - 1 5 4,63±0,48 0,07±0,005 0,74±0,06 10, 210 - 2 5 4,95± 0,70 0,08±0,008 0,82± 0,06 10, 210 - 3 5 3,75±0,80 0,08±0,007 0,94± 0,11 11, Необходимо отметить, что молочная кислота является более лабиль ным показателем и повышенное содержание лактата в крови и мышечной ткани является типичным признаком стрессового состояния у свиней (Wirtz A. Bickhardt K., 1978). В нашем эксперименте наблюдалась выраженная тен денция возрастного снижения концентрации молочной кислоты в плазме крови животных (Рис.1).
1, 1, 1, ммоль/л 0, 0, 0, 0, 65 120 165 сутки группа 1 группа 2 группа Рис.1 Возрастная динамика концентрации молочной кислоты в плазме крови В основе этого, по-видимому, лежит увеличение использования жир ных кислот в энергообеспечении органов и тканей в сравнении с углеводной компонентой.
Рассматриваемые низкомолекулярные метаболиты, за исключением глюкозы, активно используются в процессе глюконеогенеза. Представляется возможным по активности ключевого фермента данного процесса – фрукто зодифосфатазы, судить о ресинтезе глюкозы (Табл. 4). В основе снижения интенсивности глюконеогенеза, по всей видимости, лежит увеличение ис пользования кетокислот, образуемых в процессе деградации глюкозы, для синтеза аминокислот в органах и тканях свиней, растущих на рационах де фицитных по протеину (Малайдах Ф.П., 1975).
Таблица Возрастные изменения активности фруктозодифосфатазы печени, (М±m).
Возраст, n Фруктозодифосфатаза, Фруктозодифосфатаза, сутки мкмоль/ мин/г ммоль/мин/орган Группы Группы 1 2 3 1 2 65 3 27,3±9,24 - - 15,75± - 5, 120 4 12,33± 10,1±3,73 6,5±1,58 10,69± 6,81± 5,85 5,07 9,67±3,57 1, 165 4 3,65±1,15 3,85±1,39 9,4±2,62 13,63± 4,26±1,34 4,64±1,67 3, 210 5 5,12±1,39 5,16±0,74 3,82± 5,45± 0,92 7,14±1,94 7,11±1,0 1, Возрастное снижение активности выявлено также и для другого клю чевого фермента глюконеогенеза - пируваткарбоксилазы печени (табл. 5, рис.2), на фоне отсутствия значимых межгрупповых различий. Реакция кар боксилирования пирувата обратима, но в физиологических условиях сдвину та вправо, поэтому во многих метаболических ситуациях ПК определяет ли митирующее звено всего процесса глюконеогенеза.
мкмоль/мин/ г 65 120 165 Возраст сутки ПК ФДФ Рис.2 Возрастные изменения усреднённой удельной активности пиру ваткарбоксилазы (ПК) и фруктозодифосфатазы (ФДФ).
Уместно также отметить, что ферменты, связанные с пируваткарбокси лазой в процессе глюконеогенеза у крыс, ассоциированы во временный ком плекс и меняют свою активность согласованно (Fahien L.A. et al., 2006).
Так, физиологические концентрации жирных кислот не оказывают стимулирующего действия на глюконеогенез, хотя в препаратах печени in vi tro длинноцепочечные жирные кислоты стимулируют глюконеогенез, но только в присутствии субстратов для синтеза, поскольку сами жирные кисло ты не служат непосредственными субстратами глюконеогенеза (Кендыш И.Н., 1985).
Таблица Возрастные изменения активности пируваткарбоксилазы печени (М±m).
Возраст, n Пируваткарбоксилаза, мкмоль/ Пируваткарбоксилаза, сутки (мин·г) ммоль/мин/орган Группы Группы 1 2 3 1 2 65 3 6,44± - - 3,72±0,37 - 0, 120 4 5,56± 7,01±0,8 6,76± 7,08± 1,43 1,43 4,82±1,21 6,71±0,80 1, 165 4 4,17± 2,5±1,03 4,06± 5,89± 0,78 0,87 4,87±0,92 3,01±1,23 1, 210 5 1,64± 3,09± 1,36 1,93± 2,76± 0,39 0,75 2,29±0,54 4,26±1,87 1, Метаболизм пирувата зависит преимущественно от соотношения ак тивностей пируватдегидрогеназы и пируваткарбоксилазы, которые опреде ляют степень его превращения в ацетил-коэнзим А либо глюкозу. Так, в опы те на свином сердце с меченными пируватом и лактатом была показана доля карбоксилирования пировиноградной кислоты (3-6%) от потока метаболитов по циклу Кребса (Panchal A.R. et al., 2006). В свою очередь, пируваткарбок силаза и пируватдегидрогеназа проявляют максимальную активность только при восстановленном состоянии своих тиоловых групп. Известно также, что продукт пируватдегидрогеназной реакции – ацетил-КоА является аллостери ческим активатором пируваткарбоксилазы. Таким образом, налицо тесная взаимосвязь концентрации пировиноградной кислоты, активности тиоловых энзимов и антиоксидантного потенциала. В настоящее время идентифициро ваны заболевания, вызванные повышением свободно-радикальных процес сов, в результате чего снижается активность пируватдегидрогеназы (Asanuma N., 2004). Ишемия мозга вызывает повышенное образование свободных ра дикалов, а они снижают активность пируватдегидрогеназного комплекса.
Таблица Возрастные изменения активности пируватдегидрогеназы печени, (М±m) Воз- n Пируватдегидрогеназа, Пируватдегидрогеназа, раст, нмоль/ (мин·г) мкмоль/мин/орган сутки Группы Группы 1 2 3 1 2 65 3 1,92± - - 1,11± - 0,49 0, 120 4 1,04±0,3 1,55± 1,7±0, 0,45 0,9±0,23 1,48±0,52 1,78±1, 165 4 2,12± 2,78± 3,29±0,69 2,48± 0,88 0,68 0,78 3,35±0,43 4,77±0, 210 5 8,62± 7,7±0,37 6,74± 12,02± 0,17 1,37 0,24 10,61±0,5 9,62±2, На основании данных по активности пируватдегидрогеназного ком плекса можно отметить тенденцию к более интенсивному включению пиру вата в цикл трикарбоновых кислот с возрастом (табл.6). Кроме того, в возрас те 120 и 165 суток во второй и третьей группах активность комплекса повы шается в сравнении с контролем, а в возрасте 210 суток зависимость обрат ная.
С другой стороны, необходимо иметь в виду, что жирные кислоты (в этих группах в рацион добавлено подсолнечное масло) обычно тормозят вход пирувата в цикл Кребса посредством торможения пируватдегидрогеназной реакции, которое заключается в ингибировании фермента ацетил-СоА и НАДН (Розанов А.Я., 1973;
Кендыш И.Н., 1985). Поэтому в данном случае, возможно, дополнительное влияние оказывали другие факторы, например, белково-аминокислотного метаболизма и синтез жирных кислот из углевод ных остатков. Также обращают на себя внимание противоположно направ ленные тенденции в возрастном изменении активности пируваткарбоксилазы и пируватдегидрогеназы, что закономерно, так как данные ферменты рабо тают с одним и тем же субстратом - пировиноградной кислотой.
По результатам анализа активности пируваткиназы (Табл.7) в мышечной ткани, можно отметить, что у свиней второй опытной группы в период от корма активность фермента минимальна. Это мы связываем с уменьшением роли гликолиза и увеличением использования жирных кислот в энергетиче ских процессах.
Таблица Возрастные изменения активности пируваткиназы и лактатдегидрогеназы длиннейшей мышцы, (М±m) Воз- n Пируваткиназа, мкмоль/мин/г Лактатдегидрогеназа, моль/мин/г раст, Группы Группы сут 1 2 3 1 2 65 3 4,1±0,87 - - 0,176± - 0, 120 4 3,85±0,91 2,35± 0,71 1,22± 0,158± 0,15± 0,15± 0,64 0,006 0,007 0, 165 4 0,63± 0,49±0,1 0,86± 0,303± 0,318± 0,328± 0,13 0,23 0,006 0,019 0, 210 5 2,18±1,01 0,84± 2,82± 0,232± 0,26± 0,248± 0,18* 0,74* 0,028 0,036 0, Примечание: * Р 0,05 в сравнении с 1-й (контрольной) группой В качестве примечательного факта следует отметить параллельное изме нение активностей пируваткиназы и лактатдегидрогеназы с возрастом во всех группах. Данную динамику мы трактуем как изменение соотношения аэробного и анаэробного гликолиза в онтогенезе. Рост активности пируват киназы и одновременное снижение активности лактатдегидрогеназы (аэроб ный гликолиз) свидетельствует о более интенсивном включении углеводных компонентов в синтез заменимых аминокислот. Обратные отношения вели чин активности этих ферментов (анаэробный гликолиз) указывают на интен сификацию процессов биосинтеза белка.
3.2 Неспецифическая резистентность Основные показатели, в совокупности определяющие статус неспеци фической резистентности организма опытных и контрольных животных представлены в таблице 8.
Таблица Возрастные изменения показателей неспецифической резистентности в плаз ме крови у подопытных свиней (М±m) Возраст, n МДА, SH, SS, ТДС сутки- нмоль/мл мкмоль/мл мкмоль/мл группы 65 - фон 3 2,330± 0,01 0,385±0,09 0,175±0,04 2, 120 - 1 4 2,320±0,172 0,404±0,10 0,192±0,05 2, 120 - 2 4 1,950±0,231 0,462±0,08 0,159±0,04 2, 120 - 3 4 2,135± 0,272 0,425±0,12 0,185±0,07 2, 165 - 1 4 2,068±0,221 0,496±0,11 0,217±0,05 2, 165 - 2 4 1,722±0,419* 0,559±0,11 0,188±0,06 165 - 3 4 1,803±0,108* 0,511±0,09 0,203±0,04 2, 210 - 1 5 2,070±0,362 0,580±0,08 0,233±0,04 2, 210 - 2 5 1,735±0,295* 0,650±0,11 0,215±0,06 210 - 3 5 1,935±0,230* 0,602±0,10 0,220±0,05 2, Примечание: МДА – малоновый диальдегид;
SH – сульфгидрильные группы низкомолекулярных соединений (глутатион восстановленный + цистеин);
SS – дисульфидные группы низкомолекулярных соединений (глутатион окис ленный + цистин);
ТДС – тиол-дисульфидное соотношение (SH / SS).* Р 0, Судя по представленным в таблице данным, при сравнении с 1-й (кон трольной группой) животные второй группы явно лидировали по концен трации SH-групп, имели самое высокое тиол-дисульфидное отношение (Рис.
3) и самую низкую концентрацию вторичных продуктов перекисного окис ления липидов (Р 0,05).
По величине показателей полученных у поросят в пределах одной группы можно судить об их изменении в онтогенезе. С возрастом концен трация SH-групп в плазме крови закономерно повышается. Повышается и концентрация SS-групп, но в меньшей степени. В результате этого с возрас том повышается тиол-дисульфидное отношение.
2, 1, 0, группа 1 группа2 группа Рис. 3 Тиол-дисульфидное соотношение плазмы крови свиней в возрасте дней В плазме подопытных животных концентрация ТБК-продуктов изме нялась противоположно динамике концентрации тиоловых групп и тиол дисульфидного отношения (рис.4).
2, 1, 0, группа 1 группа2 группа ТДС МДА Рис.4 Тиол-дисульфидное соотношение и концентрация ТБК-активных продуктов в плазме крови свиней в возрасте 210 дней.
Это можно объяснить повышением с возрастом активности антиокси дантной системы организма, а с другой стороны уменьшением интенсивно сти роста на единицу массы и как следствие, уменьшение концентрации по бочных продуктов метаболизма.
У поросят третьей группы, несмотря на большее содержание в рационе лимитирующих аминокислот, протеина и обменной энергией, вероятно, от мечалась недостаточная его сбалансированность и, как следствие, показатели резистентности несколько занижены в сравнении со второй опытной груп пой. Однако, как и у животных второй группы, у поросят третьей группы в плазме крови (по сравнению с животными контрольной группы) было выше содержание тиоловых групп и выше тиол-дисульфидное отношение, что ха рактеризует несколько более высокий у них антиоксидантный статус.
Известно, что уровень SH групп в крови и тканях организма, обуслов ленный различными факторами, является в большой степени выражением интенсивности обменных процессов. Поэтому представляло интерес сопос тавить показатели состояния тиол-дисульфидной системы с активностью ферментов углеводного обмена, типичным представителем которых является пируваткарбоксилаза печени (табл. 5). В литературе описана взаимосвязь окислительно-восстановительного состояния тиол-дисульфидной системы и активности ферментов. Так, Pamp K., 2005 предложил механизм конформа ционных изменений в активных центрах НАД-зависимых дегидрогеназ. При взаимодействии этих ферментов с НАДН восстанавливаются цистеиновые остатки, меняется структура ферментов и повышается доступность сульф гидрильных групп для окислительной атаки свободными радикалами. Имен но этот механизм в настоящее время связывают с окислительными процесса ми сульфгидрильных групп и, как следствие, с обратимым снижением ката литической активности ферментов.
При анализе данных по трём группам обнаруживается положительная достоверная корреляция этих показателей в возрасте 120 и 210 дней (Рис. 5 и 6 соответственно).
мкмоль/(мин г) Активность ПК, 0,3 0,35 0,4 0,45 0, Концентрация SH-групп, мкмоль/мл Рис. 5. Корреляция концентрации сульфгидрильных групп низкомолекуляр ных соединений и величины активности пируваткарбоксилазы печени в воз расте 120 суток (r = 0,79, Р0,01).
мкмоль/(мин г) Активность ПК, 0,55 0,6 0,65 0, Концентрация SH-групп, мкмоль/мл Рис. 6 Корреляция концентрации сульфгидрильных групп низкомолеку лярных соединений и величины активности пируваткарбоксилазы печени в возрасте 210 суток (r = 0,58, Р0,1).
При сопоставлении данных по неспецифической резистентности с зоо техническими показателями (Табл.9) можно прийти к выводу о синхронном изменении тиол-дисульфидного потенциала и продуктивности животных (рис.7). Так, еще Бойнович М.М. (1970) пришла к выводу, что увеличение среднесуточного прироста идёт параллельно с повышением концентрации SH групп в сыворотке крови свиней.
Таблица Среднесуточный прирост и расход корма на кг прироста у свиней в период доращивания и откорма Показатели Группы 1 2 65-120 суток Среднесуточный прирост, г 407±32 517±26 503± Расход корма на кг прироста, 3,97±0,32 3,13±0,16 3,22±0, кг 120-165 суток Среднесуточный прирост, г 621±34 646±36 630± Расход корма на кг прироста, 3,76 3,61 3, кг 165-210 суток Среднесуточный прирост, г 648±45 687±39 675± Расход корма на кг прироста, 4,51 4,25 4, кг Так, повышение показателей неспецифической резистентности привело к повышению интенсивности роста. Наблюдается самый высокий среднесу точный прирост и самый низкий расход корма на кг прироста у животных второй группы.
группа 1 группа2 группа Прирост SH Рис.7 Среднесуточный прирост (г/сут) и концентрация тиоловых групп низкомолекулярных соединений (нмоль/мл) в возрасте 120 дней.
3.3 Продуктивность и расход корма В конце периода доращивания средняя живая масса поросят 2-й и 3-й групп оказалась выше на 15,1 и 14,2 % (Р0,05) соответственно, чем у жи вотных контрольной группы, а среднесуточные приросты живой массы по росят составили в опытных группах 517±26 (Р0,05) и 503±24 г (Р0,05), а в контрольной 407±32 г (табл. 9). Затраты корма на 1 кг прироста у поросят опытных групп были на 21,1 и 18,9% ниже по сравнению с контрольной. За траты сырого протеина на 1 кг прироста у поросят 2-й группы был на 17, % ниже по сравнению с контролем (табл.10). Поросята 3-й группы тратили несколько больше сырого протеина в сравнении контрольной. Аналогичная картина отмечена и по затратам обменной энергии на кг прироста у живот ных опытных групп и она была ниже на 17,3 и 10,5%, чем у животных кон трольной группы. Таблица Прирост живой массы, расход сырого протеина и обменной энергии на кг прироста Показатели Группы 1 2 Период доращивания (65-120 суток) 25,24±1, 32,06±1,6 31,16±1, Прирост живой массы, кг 98 3* 9* Расход сырого протеина, 476,4 375,0 482, г Расход обменной энер- 49,23 40,69 44, гии, МДж Первый период откорма (120-165 суток) 27,32±2, 28,42±2,9 27,72±2, Прирост живой массы, кг 11 6 Расход сырого протеина, 428 412 г Расход обменной энер- 44,92 45,35 48, гии, МДж Второй период откорма (165-210 суток) 31,12±4, 32,98±4,1 32,43±3, Прирост живой массы, кг 40 8 Расход сырого протеина, 482 459 г Расход обменной энер- 55,0 54,5 58, гии, МДж За весь период откорма (120-210 суток) 58,44±3, 60,41±4,0 60,15±3, Прирост живой массы, кг 87 5 Расход сырого протеина, 459 444 г Расход обменной энер- 50,28 51,07 50, гии, МДж * Р 0,05 при сравнении с 1-й (контрольной группой) К концу откорма (210 суток) разница в живой массе по группам меж ду контрольной и 2-й и 3-й группами составила 9,03 кг (8,6%) и 8,31 кг (7,91%), а между опытными группами разницы не отмечено. Валовой при рост, полученный за период откорма, был высоким у свиней 2-й группы.
Среднесуточные приросты живой массы животных трех подопытных групп составили 635±43;
656±48 и 654±45г соответственно.
Переваримость протеина корма и степень использования животными азота также подтверждает отмеченные изменения в интенсивности роста в зависимости от уровня обеспеченности организма поросят аминокислотами и энергией. Так, у поросят 2-й группы использование азота, как от принятого, так и от переваренного, были выше по сравнению с таковыми у 1-й и 3-й групп (Ниязов Н., 2009), что свидетельствует о более эффективном использо вании у них азотистых веществ. Исходя из этих данных, можно считать, что улучшение обеспеченности организма поросят суммарным количеством аминокислот и обеспечение их оптимального (идеального) соотношения нужно рассматривать как один из важнейших факторов повышения эффек тивности использования азотистых веществ и продуктивности животных. В условиях эксперимента аминокислотная обеспеченность «идеальным» (оп тимальным) соотношением незаменимых аминокислот, а также энергией в полной мере была характерна для поросят 2-й группы. В то же время у поро сят 3-й группы по сравнению с 1-й и 2-й группами имело место повышение переваримости азотистых веществ корма. Повышение переваримости про теина корма в 3-й группе обусловлено, по всей видимости, более высоким содержанием в составе комбикорма высокопереваримого белкового компо нента - соевого шрота. При этом у поросят 3-й группы имело место наиболь шее выведение азота с мочой, что вполне естественно, поскольку они больше потребляли азота корма. Соответственно у них в метаболический пул посту пало избыточное количество аминокислот, не относящихся к лимитирую щим, а это и по биологическим, и по экономическим, и по экологическим соображениям следует рассматривать как отрицательный фактор.
Различия по эффективности использования азота у поросят разных групп нашли отражение в убойных и мясных качествах. Исследование соста ва туши при убое в конце периода доращивания показало, что у свиней опытных групп по сравнению с контролем было большим содержание мяко ти в туше, убойный выход был выше, масса туши, а относительное содержа ние сала было меньше (Родионова О.В., Кальницкий Б.Д., 2010). Отношение количества мякоти к выходу жира в опытных группах было более высоким.
Также, выявлено повышенное содержание белка в длиннейшей мышце у по росят опытных групп по сравнению с контролем.
4. Заключение Подводя итоги всему полученному экспериментальному материалу можно заключить, что все три испытанных рациона с различными уровнями протеина, незаменимых аминокислот и энергии можно отнести к биологиче ски адекватным, удовлетворяющим пластические и энергетические потреб ности поросят и свиней разного возраста, поддерживающим здоровье живот ных и позволяющим на протяжении всего технологического цикла производ ства свинины получать вполне удовлетворительные приросты живой массы животных.
Нами отмечено отсутствие выраженных достоверных различий по вели чинам концентрации метаболитов и каталитической активности изученных в эксперименте ключевых и регуляторных ферментов углеводного обмена ме жду животными контрольной и обеих опытных групп. Это свидетельствует о достаточно высоких биологических качествах всех разработанных и испы танных рецептур комбикормов. Предложенные низкобелковые рационы не выступают стрессорами для растущих и откармливаемых свиней.
Увеличение уровня обменной энергии на 5 %, лизина, метионина и тре онина на 22 – 33 % с одновременным снижением содержания протеина до 12,2 - 10,7 % в рационе животных в период доращивания и откорма проявило себя наиболее оптимальным из испытывавшихся вариантов. Именно группа животных, находившаяся на указанных условиях белково-аминокислотного и энергетического питания продемонстрировала лучшие характеристики не специфической резистентности, продуктивности и использования азотистых веществ, что в совокупности и позволяет наметить реальные перспективы и пути существенного повышения эффективности использования в кормлении свиней зерна злаковых культур, содержащих низкий уровень протеина.
Руководствуясь соображениями о центральной регуляторной роли в ор ганизме системы редукции глутатиона, мы сочли логичным уделить при стальное внимание этому критерию. Тиол-дисульфидное отношение, как нам это представляется, совершенно оправданно и аргументировано может быть отнесено к числу важнейших регуляторных параметров, способных объек тивно, информативно и оперативно характеризовать функциональное состоя ние систем ответственных за общую неспецифическую резистентность, за способность организма преодолевать метаболические стрессы, обусловлен ные взрывом свободнорадикальных реакций и липопероксидации.
Более того, полученные нами экспериментальные данные указывают на связь концентрации сульфгидрильных групп в крови и активности ферментов углеводного обмена в тканях животных, типичным представителем которых является пируваткарбоксилаза печени. При сопоставительном анализе дан ных по трём группам животных нами обнаружена положительная корреляция этих показателей в возрасте животных 120 и 210 дней.
При проецировании данных по неспецифической резистентности на зоо технические показатели можно прийти к выводу о параллельном изменении тиол-дисульфидного потенциала и продуктивности животных. Увеличение среднесуточного прироста идёт достаточно синхронно с повышением кон центрации SH групп. Нами отмечен самый высокий среднесуточный прирост и самый низкий расход корма на кг прироста у животных второй группы, ко торые явно лидировали по концентрации SH-групп, имели самое высокое ти ол-дисульфидное отношение и самую низкую концентрацию вторичных про дуктов перекисного окисления липидов.
У поросят третьей группы, несмотря на большее содержание в рационе лимитирующих аминокислот, протеина и обменной энергией, вероятно, от мечалась недостаточная его сбалансированность и, как следствие, показатели резистентности были несколько занижены в сравнении со второй опытной группой. Однако, как и у животных второй группы, у поросят третьей группы в плазме крови (по сравнению с животными контрольной группы) было выше содержание тиоловых групп и выше тиол-дисульфидное отношение, что ха рактеризует имевшийся у них более высокий антиоксидантный статус.
С нашей точки зрения все сказанное логично вписывается в современ ный контекст понимания неуклонно возрастающей роли и значимости био химических тестов в оценке физиологического статуса сельскохозяйствен ных животных, расшифровке степени обеспеченности их в основных эле ментах питания, адаптации к технологиям выращивания. На настоящем уровне продуктивности сельскохозяйственных животных только новые успе хи в раскрытии глубинных биохимических механизмов регуляции обмена веществ и энергии и в разработке новых способов направленного на них воз действия позволят решить практические проблемы, стоящие перед животно водами по дальнейшей интенсификации отрасли.
5. Выводы 1. Увеличение уровня обменной энергии на 5% и лимитирующих ами нокислот на 22-33% при одновременном снижении содержания про теина до 12,2-10,7% в рационе поросят в период доращивания и от корма обеспечили лучшие характеристики продуктивности и неспе цифической резистентности.
2. Интенсивность гликолитических процессов у свиней максимальна в возрасте 65 суток и затем снижается. Это мы объясняем изменением соотношения с возрастом гликолитических и липолитических про цессов в пользу последних и трактуем как биологическую специфику вида.
3. Величины активности ключевых ферментов глюконеогенеза в пече ни – пируваткарбоксилазы и фруктозодифосфатазы - с возрастом имеют выраженную тенденцию к снижению (Р0,05), что мы связы ваем с повышенным использованием кетокислот для синтеза амино кислот в органах и тканях свиней, растущих на рационах дефицитных по протеину, а не для ресинтеза глюкозы в печени.
4. Каталитическая активность пируватдегидрогеназного комплекса с возрастом повышается, свидетельствуя об усилении вовлечения пи ровиноградной кислоты в процессы митохондриального окисления, метаболизма заменимых аминокислот и липогенеза.
5. Активность пируваткиназы в мышечной ткани, у свиней второй опытной группы в периоды откорма имеет наименьшие значения (Р0,05), что мы связываем со снижением роли гликолиза и увеличе нием использования жирных кислот в энергетических процессах.
6. Активность пируваткиназы и лактатдегидрогеназы с возрастом во всех группах изменяется разнонаправлено и интерпретируется нами как критерий изменения соотношения аэробного и анаэробного гли колиза в онтогенезе.
7. Отсутствие выраженных достоверных различий по величинам ката литической активности ряда изученных ключевых и регуляторных ферментов и концентрации метаболитов между животными кон трольной и обеих опытных групп, свидетельствует о достаточно вы соких биологических качествах разработанных и испытанных рецеп тур комбикормов.
8. Доказано наличие положительной взаимосвязи интенсивности функционирования в организме тиол-дисульфидной системы и об ратной связи процессов липопероксидации, с продуктивностью жи вотных.
9. Полученные экспериментальные данные подтверждают существо вание связи между функциональной активностью систем антиокси дантной защиты организма и величинами каталитической активности ферментов углеводного обмена (Р0,05).
6. Предложения практике Полученные результаты будут использованы в совершенствовании сис темы питания свиней. Оптимальное содержание в 1 кг корма обменной энер гии, протеина и лимитирующих аминокислот в рационе поросят-помесей в периоды доращивания и откорма составляет: 13,02, 12,55 и 12,81 МДж об менной энергии;
122, 114 и 107 г сырого протеина;
9,4, 8,36 и 7,2 г лизина;
5,9, 5,84 и 5,25 метионина+цистина;
6,1, 5,63 и 5,03 г треонина.
Список работ опубликованных по теме диссертации:
1. Гаглошвили А.А. Углеводный обмен у свиней в период интенсив ного доращивания и откорма на низкопротеиновых рационах с различными уровнями обменной энергии и аминокислот [Текст] / А.А. Гаглошвили // Проблемы биологии продуктивных животных.
-2009.- № 4.- С. 46-53.
2. Гаглошвили А.А. Неспецифическая резистентность свиней на фо не низкопротеиновых рационов с различными уровнями энергии и аминокислот [Текст] / А.А.Гаглошвили // Проблемы биологии продуктивных животных.- 2009.- №4.- С. 27-32.
3. Гаглошвили А.А. Неспецифическая резистентность свиней, содер жащихся на низкопротеиновых рационах с добавками синтетиче ских аминокислот [Текст] /А.А.Гаглошвили // Сборник тезисов международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология наука 21 века». Пущино – 2010. том 1 С.116.