Использование люминесцирующих бактерий при оценке фагоцитарной активности нейтрофилов
На правах рукописи
КАРИМОВ Ильшат Файзелгаянович
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
ПРИ ОЦЕНКЕ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ
03.00.07 Микробиология
14.00.36 Аллергология и иммунология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пермь – 2009
Работа выполнена на кафедре микробиологии ГОУ ВПО «Оренбургский государственный университет», Оренбург
Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Дерябин Дмитрий Геннадьевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна доктор медицинских наук, доцент Гейн Сергей Владимирович
Ведущая организация:
ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет», Челябинск
Защита состоится «» _ 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета ДМ004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: г. Пермь, ул. Голева, Факс: (342) Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Автореферат разослан «» _ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна
Общая характеристика работы
Актуальность темы Биолюминесценция – ферментативный процесс, сопровождающийся потреблением кислорода и выделением света (Hastings, Nealson, 1977). У микроорганизмов центральным звеном подобной реакции является люцифераза – флавинзависимая монооксигеназа, катализирующая окисление ФМН-H2 и длинноцепочечного альдегида в присутствии кислорода до ФМН, H2O и соответствующей жирной кислоты с испусканием кванта света в видимой сине зеленой области спектра (Hastings et al., 1985).
Высокая степень сопряженности биолюминесценции с основными энергетическими потоками в бактериальной клетке (Meighen, 1991) явилась условием для использования светящихся микроорганизмов при тестировании различных природных сред, биотоксичность которых может быть интегрально оценена через изменение интенсивности биолюминесценции (Kaiser, 1998).
Клонирование генов люминесценции в широком круге патогенных и условно-патогенных микроорганизмов создало условия для существенного расширения сферы биолюминесцентного анализа, в том числе в направлении исследования живых систем (Contag et al., 1995;
Virta et al., 1998). При этом в подобных условиях интенсивность биолюминесценции рассматривается как отражение числа бактериальных клеток, сохранивших свою жизнеспособность после взаимодействия с бактерицидными системами человека или животных.
В частности, на данной основе базируется широкая группа методов «биолюминесцентного имеджинга» (Rice et al., 2001), позволяющего осуществлять фотонную детекцию патогенных микроорганизмов непосредственно в органах и тканях лабораторных животных при экспериментальной инфекции. Другой подход ориентирован на оценку бактерицидных свойств гуморальных и клеточных факторов противоинфекционной резистентности при проведении исследований in vitro (Forde et al., 1998;
Kampmann et al., 2000). При этом среди подобных методов достаточно перспективным представляется биолюминесцентная оценка фагоцитоза, основанная на использовании в качестве фагоцитируемых объектов светящихся микроорганизмов (Barak et al., 1983, 1984;
Ширшев с соавт., 2007).
Однако до настоящего времени не определены многие условия для использования люминесцирующих бактерий в системе оценки фагоцитоза, отсутствуют данные о возможности совместного определения интегрально характеризующих фагоцитарную реакцию феноменов биолюминесценции и хемилюминесценции, а также не разработаны технические устройства, специализированные именно для биохемилюминесцентного исследования фагоцитарной системы.
Цель работы – разработка методических подходов к оценке фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека с использованием рекомбинантных люминесцирующих бактерий.
Задачи исследования 1. Определение оптимальных условий для использования люминесцирующих бактерий в качестве объектов фагоцитоза.
2. Разработка биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитарной активности нейтрофилов крови человека.
3. Создание устройства для осуществления технологии оценки фагоцитоза с использованием люминесцирующих бактерий.
Научная новизна Определены оптимальные условия для использования люминесцирующих бактерий в качестве объектов фагоцитоза. Разработан оригинальный вариант опсонизации рекомбинантных люминесцирующих бактерий нормальным иммуноглобулином человека в конечной концентрации 10 мг/мл в течение 10 мин при 37 C, что исключает не связанные с фагоцитозом киллинговые эффекты и определяемое этим подавление интенсивности биолюминесценции, одновременно обеспечивая достаточный уровень последующей активации фагоцитов. Показана предпочтительность использования в качестве фагоцитируемых объектов рекомбинантных люминесцирующих бактерий Escherichia coli с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi, демонстрирующих пропорциональность между остаточными значениями свечения и количеством сохранивших жизнеспособность бактериальных клеток-мишеней. Установлено опережающее по отношению к развитию бактерицидного эффекта подавление биолюминесценции, в качестве одной из причин которого определено воздействие на ферментную систему генерации свечения продуктов пероксидации бактериальных жирных кислот.
Установлены различия в спектрах бактериальной биолюминесценции и люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов, определяющие возможность их раздельной регистрации на неперекрывающихся длинноволновом ( 540 нм) и коротковолновом ( 420 нм) участках спектра.
На данной основе разработан биохемилюминесцентный метод оценки фагоцитоза, позволяющий проводить одновременную оценку активации кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов и выраженности обусловленного их действием киллингового эффекта в отношении бактериальных клеток-мишеней, приоритет которого подтвержден патентом на изобретение №2366953 «Биохемилюминесцентный способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов».
Для реализации данного способа разработан и создан опытный образец двухканального биохемилюминометра, позволяющего проводить регистрацию анализируемых параметров в режиме реального времени (Патент РФ на полезную модель № 49998). Новизна этого устройства определяется наличием в его конструкции двух независимых регистраторов (фотоэлектронных умножителей) и двух сменных кюветных отделений, использование которых позволяет проводить одновременное кинетическое измерение интенсивности свечения смесей «бактерии : фагоциты» в одной пробе в двух диапазонах длин волн, либо в двух параллельных пробах различного компонентного состава во всем спектральном диапазоне (Патент РФ на полезную модель № 64373).
Теоретическая и практическая значимость Разработанный метод оценки фагоцитарной активности нейтрофилов с использованием в качестве фагоцитируемых объектов рекомбинантных люминесцирующих микроорганизмов существенно сокращает длительность и трудоемкость исследований, а также позволяет в режиме реального времени получать комплексную информацию как об уровне активации кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов, так и об интенсивности обусловленного этим бактерицидного эффекта. Апробация разработанной биохемилюминесцентной технологии при оценке фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови у лиц, больных сахарным диабетом 2-го типа позволила констатировать сочетанное изменение регистрируемых показателей (Акт внедрения МСЧ ГОУ ОГУ от 10.06.2009 г.) Техническая документация на двухканальный биохемилюминометр и комплект сменных кюветных отделений к нему передана Специальному конструкторско-технологическому бюро «Наука» Красноярского научного центра Сибирского отделения Российской Академии наук, где реализована в серии устройств линии «БЛМ 8802 МК» (Акт внедрения от 29.11.2007 г.). При этом данное устройство, наряду с его прямым использованием при оценке фагоцитоза, может применяться и для совершенствования иных технологий люминесцентного анализа, оценивающих свободнорадикальные и ферментативные процессы в живых организмах (перекисное окисление липидов, биотестирование и др.).
Основные положения, выносимые на защиту 1. В качестве объекта для биолюминесцентной оценки фагоцитоза рекомендуется рекомбинантный люминесцирующий штамм Escherichia coli с клонированным lux-опероном Photobacterium leiognathi, опсонизированный нормальным иммуноглобулином человека.
2. Раздельная оценка бактериальной биолюминесценции и люминолзависимой хемилюминесценции в фагоцитарной системе возможна на неперекрывающихся ( 540 нм и 420 нм) участках спектров их световой эмиссии.
3. Реализация биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитоза возможна с использованием двухканального биохемилюминометра, снабженного располагаемыми между анализируемой пробой и фотоэлектронными умножителями светофильтрами.
Связь автора с научными программами и собственный вклад автора в исследования Исследования выполнены в рамках ГБ НИР № «Использование природных и генно-инженерных люминесцирующих бактерий для тестирования абиотических сред и биологических жидкостей», а также при поддержке гранта РФФИ 06-04-96906-р_офи «Разработка биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитоза в режиме реального времени и создание устройства для его осуществления».
Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006), IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (СПб, 2008), III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь – Н. Новгород, 2008), Российской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009), V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (СПб, 2009).
Разработка «Двухканальный биохемилюминометр и технологии его использования для оценки бактерицидных систем крови человека» награждена золотой медалью VIII Московского международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2008).
Основные результаты проведенных исследований представлены в печатных работах, в том числе 4 статьях в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований. По материалам исследований получен патент РФ на изобретение и 2 патента РФ на полезные модели.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, включая обзор литературы, описание материалов и методов, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 102 источника отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и рисунками.
Содержание работы Материалы и методы исследований При проведении исследований использован рекомбинантный штамм E.coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi 54D10 (Данилов, 2002), выпускаемый в виде лиофилизированного препарата под коммерческим названием «Эколюм-9» (НВО «Иммунотех», Москва);
тот же реципиент, несущий lux-оперон Photorhabdus luminescens Zm1 «Эколюм-8»;
а также разработанный в Институте биофизики СО РАН рекомбинантный штамм + + - – r E.coli Z905 (hsdR hsdM gal met recA tet ) с многокопийной плазмидой pPHL7, созданной на основе вектора pUC18 и lux-оперона P.leiognathi (Илларионов, 1985). В ряде экспериментов использован природный изолят морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum, производимый под коммерческим названием «Микробиосенсор В-17 677f» (Институт биофизики СО РАН, Красноярск). Перед проведением исследований названные микроорганизмы восстанавливали из лиофилизированного состояния добавлением холодной дистиллированной воды и выдерживали в течение минут при 4C для реактивации биолюминесценции. Для воспроизведения люминесцентной реакции in vitro использовали «Комплект реактивов для анализа биолюминесценции» (Институт биофизики СО РАН, Красноярск), включающий смесь лиофильно высушенных ферментов - люциферазы и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы - изолированных из рекомбинантного штамма E. coli c клонированными luxAB генами морской светящейся бактерии P. leiognathi, а также субстраты реакции – миристиновый альдегид («Merck», Германия), восстановленный НАДН («AppliChem», Германия) и ФМН («Sigma», США).
В качестве биологических сред, содержащих потенциальные опсонизирующие факторы, использовали плазму, интактный и термоинактивированный (56 C, 10 мин) пулы сывороток 20 здоровых доноров;
С3- и С5-дефицитные сыворотки (НИИ гематологии и переливания крови, Киров), а также коммерческий препарат нормального иммуноглобулина человека (НПО «Микроген», Екатеринбург). При проведении опсонизации бактериальную суспензию с содержанием 109 КОЕ/мл в равных объемах смешивали с названными выше факторами в широком диапазоне концентраций, после чего выдерживали при 37 C в течение 10 мин.
Нейтрофилы периферической крови человека выделяли при центрифугировании на двойном градиенте фиколл-верографин с плотностями 1,077 г/мл и 1,094 г/мл (Хейфец, 1973), собирали с нижней интерфазы, отмывали холодным физиологическим раствором и ресуспендировали в среде 199 до концентрации 5·106 кл/мл.
Фагоцитарную систему формировали путем смешивания 1 объема опсонизированных бактерий с концентрацией 5·108 КОЕ/мл и 9 объемов нейтрофилов с концентрацией 5·106 кл/мл, так что достигаемое соотношение «бактерии : нейтрофилы» составляло 10:1. Смесь инкубировали в течение минут при 37 C в термостатируемой измерительной ячейке двухканального биохемилюминометра БЛМ8802М2К (СКТБ «Наука», Красноярск). Измерение интенсивности свечения в пробе осуществляли в непрерывном режиме, после чего итоговый расчет биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней (Iбл) проводили по формуле I бл = 100 ( X 0 - X n ) / X 0, где Х0 – интенсивность биолюминесценции на 0 секунде, Хn – интенсивность биолюминесценции на n ой секунде существования фагоцитарной системы. При исследовании хемилюминесценции фагоцитарную систему формировали аналогичным образом, добавляя в нее люминол (Sigma, США) до конечной концентрации 10 М, а в качестве фагоцитируемых объектов используя бактериальные клетки мишени с термоинактивированной (42 C, 10 мин) ферментной системой генерации свечения.
Оценку жизнеспособности микроорганизмов на этапах опсонизации и фагоцитоза оценивали путем высева на BCP-агар (Bio-Merieux, Франция) с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг/мл (селективный маркер для использованных рекомбинантных штаммов E.coli). Для устранения эффекта агглютинации на этапе опсонизации бактериальные суспензии перед высевом обрабатывали трипсином (0,05 ТЕ, 10 мин);
на этапе фагоцитоза перед высевом осуществляли предварительное разрушение нейтрофилов 0,2 % сапонином.
Учет количества колониеобразующих единиц проводили после дополнительной 18-24 часовой инкубации при 37 С.
Анализ спектров световой эмиссии, формирующихся при бактериальной биолюминесценции и люминолзависимой хемилюминесценции проводили с использованием серии интерференционных полосовых светофильтров (НПП «Фотоооптик», Обнинск, Россия), с максимумами пропускания 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540 и 560 ± 5 нм. При этом на одном канале осуществлялась регистрация суммарной интенсивности свечения в пробе, а на втором – части спектра световой эмиссии, проходящей через соответствующий светофильтр.
Итоговый расчет интенсивности свечения (I) проводился по формуле I = I опр / T S, где Т – индивидуальная характеристика светофильтра, описывающая степень его пропускания при соответствующей длине волны, S – относительная спектральная чувствительность ФЭУ на данной длине волны.
Анализ спектров жирных кислот исследованных микроорганизмов проводили методом хемодифференциации (Stead, 1992), для чего 4-6 мг сухой клеточной биомассы подвергали кислому метанолизу в 0,4 мл раствора 1 М HCl в течение 1 ч при 80 °C, проводили двукратную экстракцию в 200 мкл гексана и упаривали раствор до 60 мкл. Полученную порцию экстракта исследовали с использованием газового хроматографа Sharelock Microbial Identification System («MIDI Inc.», США).
При апробации биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитоза в группе больных сахарным диабетом 2-го типа активность последнего оценивали по уровню гликозилированного гемоглобина (HbA1), определенного ионообменным методом с использованием тест-системы «Glycohemoglobin HbA1 – Test» («Human», Германия).
Все эксперименты выполнены в трех-шести повторностях. Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием компьютерной программы “Statistica”.
Результаты исследований Решение задачи обоснования оптимальных условий для исследования фагоцитарной активности нейтрофилов с использованием в качестве объекта фагоцитоза рекомбинантных люминесцирующих микроорганизмов было начато с разработки адаптированной процедуры их опсонизации. При этом важность опсонизации определялась тем, что она существенно повышает уровень последующей активации фагоцитов за счет взаимодействия расположенных на их поверхности рецепторов с соответствующими сывороточными компонентами, фиксированными на поверхности бактериальных клеток.
Однако, принадлежность доступных в настоящее время рекомбинантных люминесцирующих микроорганизмов к виду E.coli определяет их высокую чувствительность к прямому бактерицидному действию ряда присутствующих в нативных плазме и сыворотке крови гуморальных факторов, что делает невозможным использование традиционных методов опсонизации.
При выполнении данного фрагмента исследований изучен ряд содержащих потенциальные опсонизирующие факторы биологических сред, а именно: плазма крови, интактная и термоинактивированная сыворотки крови, С3- и С5-дефицитные сыворотки, а также нормальный иммуноглобулин человека. В качестве критериев адекватности опсонизации были использованы:
а) отсутствие выраженного ингибирующего влияния на бактериальную биолюминесценцию;
б) отсутствие киллингового эффекта в отношении бактериальных клеток-мишеней;
в) способность индуцировать последующую активацию фагоцитов.
Полученные результаты, обобщенные в таблице 1, свидетельствовали о том, что большинство изученных факторов оказывали на уровень биолюминесценции и жизнеспособность рекомбинантных клеток E.coli выраженные ингибирующие эффекты, негативно влияющие на результат их последующего взаимодействия с фагоцитами. В наибольшей степени сказанное относилось к цельной плазме и сыворотке крови, использование которых вело к гибели до 78,2 ± 7,4 - 85,8 ± 8,6 % бактериальных клеток с соответствующим подавлением интенсивности их свечения на 77,7 ± 7,3 - 80,8 ± 6,5 % от исходного уровня. В свою очередь ведущая к инактивации системы комплемента термообработка сыворотки крови, а также использование исключающих полноценную активацию данной бактерицидной системы С3- и С5-дефицитных сывороток крови, существенно (в 4 - 9 раз) снижало, но полностью не снимало подобные эффекты. На этом фоне единственным применимым для заявленной цели фактором оказывался нормальный иммуноглобулин человека, инкубация в контакте с которым вела к умеренно выраженной ( 20 % от исходного уровня) стимуляции биолюминесценции, не сопровождалась развитием бактерицидного эффекта, одновременно при последующем контакте с нейтрофилами периферической крови человека позволяя достичь их достаточной активации.
Таблица Сравнительная характеристика биологических сред, использованных для опсонизации рекомбинантных люминесцирующих бактерий E.coli Критерии их оценки (от исходного уровня, %) Опсонизирующие факторы Ингибиция уровня Развитие собствен- Активация свечения на этапе ного (не связанного фагоцитов опсонизации с фагоцитозом) киллингового эффекта 1. Контроль (без - - 140,0±6, опсонизирующих агентов) 2. Плазма крови 77,7±7,3 78,2±7,4 191,8±8, 3. Сыворотка крови 80,8±6,5 85,8±8,6 160,7±11, 4. Термоинактивированная 22,7±3,7 9,1±6,4 216,6±13, сыворотка крови 5. С3-деффицитная - 35,5±3,1 145,6±18, сыворотка крови 6. С5-деффицитная 33,5±4,2 35,2±2,5 155,7±9, сыворотка крови 7. Нормальный иммуноглобулин - - 556,2±54, человека Развивающаяся при взаимодействии с подобным образом опсонизированными бактериями люминолзависимая хемилюминесценция фагоцитов имела характерную динамику с максимумом на 5 - 6 минуте существования фагоцитарной системы. Реализованная возможность предположительно определялась присутствием в составе препарата нормального иммуноглобулина антител к липополисахаридам энтеробактерий, после связывания с поверхностью рекомбинантных клеток E.coli способных опосредовать взаимодействие последних с Fc-рецепторами на мембране нейтрофилов периферической крови человека. При этом опсонизация использованных бактериальных клеток-мишеней нормальным иммуноглобулином человека в диапазоне концентраций 1 - 10 мг/мл вела к пропорциональному увеличению интенсивности «окислительного взрыва»
фагоцитов, в своем максимуме в 5,5 раз превышающего фоновый уровень хемилюминесценции и почти в 4 раза превосходящего таковой при контакте с интактными неопсонизированными бактериями. В сравнении же с другими объектами для фагоцитоза: C3b-зимозаном и опсонизированными цельной сывороткой крови клетками Staphylococcus aureus 209P, предложенная процедура обеспечивала интенсивность хемилюминесценции на уровне 194,2 ± 10,4 % и 60,3 ± 5,2 % от таковых соответственно.
Таким образом, оптимальным опсонином для рекомбинантных люминесцирующих штаммов E.coli является нормальный иммуноглобулин человека, позволяющий исключить не связанные с фагоцитозом подавление биолюминесценции и бактерицидный эффект, одновременно обеспечивая достаточный уровень активации фагоцитов.
При изучении кинетики биолюминесценции с использованием рекомбинантного штамма E.coli «Эколюм-9» с клонированными luxCDABE генами P.leiognathi (рис. 1А) было установлено, что непосредственно после введения в фагоцитарную систему он демонстрировал развивающуюся к 45 - секунде кратковременную стимуляцию уровня свечения до уровня 129,9 ± 8,5 % от исходного. Дальнейшие же события заключались в прогрессирующем снижении уровня биолюминесценции до уровня 47,1 ± 6,5 % от исходного, что происходило на фоне пропорционального снижения количества жизнеспособных микроорганизмов, выявляемого при высеве на плотные питательные среды (коэффициент корреляции r = 0,96;
t = 7,11;
P 0,001).
Таким образом, развивающийся в динамике эксперимента киллинг использованных рекомбинантных микроорганизмов своим следствием имел дезорганизацию клонированных в них систем генерации свечения с соответствующим изменением (снижением) измеряемого результативного параметра.
С другой стороны, генно-инженерная конструкция на основе того же реципиентного штамма E.coli, но с клонированными luxCDABE генами P.luminescens (Эколюм-8), в тех же условиях демонстрировала только развивающуюся во времени стимуляцию уровня свечения, выходящего на «плато» эффекта к 180 - 200 секунде после формирования фагоцитарной системы и достигающего 268,1 ± 18,0 % от его исходного уровня (рис. 1А).
Однако, параллельная оценка киллингового эффекта, проводимая с использованием бактериологического метода, свидетельствовала о происходящем снижении количества жизнеспособных (колониеобразующих) клеток-мишеней, по своей выраженности достоверно не отличающейся от такового при использовании «Эколюм-9» (рис. 1Б). При этом отражением противоположного характера изменения величин биолюминесценции и киллинга стали отрицательные значения связывающего их коэффициента корреляции (r = -0,92;
t = 6,99;
P 0,001).
Обсуждая полученные парадоксальные результаты, следует указать, что отсутствие гашения биолюминесценции E.coli с клонированными luxCDABE генами P.luminescens при гибели самой бактериальной клетки отмечалось и ранее, в частности, при развитии бактерицидного эффекта в присутствии сыворотки крови (Дерябин, 2004). При этом возможной причиной подобной ситуации является отличная от прочих люминесцирующих микроорганизмов чрезвычайно высокая прочность нековалентных связей между белками ферментной системы генерации свечения P.luminescens, разрушающейся только после жесткой обработки 5М мочевиной (Forst, 1996). Условием же для возникновения подобной аномально стабильной мультиферментной системы могут являться экологические особенности P.luminescens, на определенном этапе своей циркуляции в симбиотико-паразитарной системе «бактерия – нематода - насекомое» призванной обеспечить свечение тела личинки насекомого в условиях тесного контакта микроорганизма с его гуморальными и клеточными механизмами противоинфекционной резистентности (Silva, 2002).
Соответственно, даже при освобождении ферментной системы из тела бактериальной клетки при ее гибели, но сохранении ее структурно функциональной целостности, интенсивность биолюминесценции может оставаться неизменной или даже нарастать.
А Б 3 120% 2,5 100% 2 80% БЛИ КОЕ 1,5 60% 1 40% 0,5 20% 0 0% 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 Время, мин Время, мин Рис. 1. Различия биолюминесцентного отклика рекомбинантных штаммов E.coli с различными lux-генами в фагоцитарной системе (А) и характеристика развивающегося в их отношении киллингового эффекта (Б). 1 - E.coli с генами P.leiognathi («Эколюм-9»);
2 - E.coli с генами P.luminescens («Эколюм-8»);
3 - E.coli с генами P.leiognathi («Микробиосенсор Z905») При проведении исследований с использованием в качестве объекта для фагоцитоза третьего из изученных рекомбинантных штаммов E.coli Z905, созданного на основе иного реципиента, но вновь несущего генетическую конструкцию с lux-опероном морского люминесцирующего микроорганизма вида P.leiognathi, сделанное предположение о зависимости биолюминесцентного отклика в фагоцитарной системе от природы клонированной ферментной системы генерации свечения получило свое подтверждение (рис. 1А). Так в первые 50 - 65 секунд после ведения в фагоцитарную систему данный рекомбинантный штамм демонстрировал рост интенсивности свечения, в данном случае несколько превышающий уровень аналогичной реакции у «Эколюм-9» и достигающий 161,9 ± 1,2 % от исходного.
Дальнейшие же события, происходящие на фоне регистрируемого бактериологическим методом падения количества жизнеспособных бактериальных клеток, вновь заключались в синхронном снижении интенсивности биолюминесценции до 46,5 ± 4,8 % от исходного (коэффициент корреляции между названными параметрами r = 0,93;
t = 7,03;
P 0,001).
Еще одой полезной особенностью рекомбинантных штаммов E.coli с клонированными luxCDABE генами P.leiognathi являлась возможность термоинактивации биолюминесценции при 42 C в течение 10 мин без потери жизнеспособности самих бактериальных клеток. При этом выполнение подобной процедуры создавало возможность для исследования в фагоцитарной системе феномена хемилюминесценции, развивающегося в присутствии экзогенно вносимого люминола (см. ниже). В свою очередь данный эффект у клеток с lux-опероном P.luminescens был выражен в значительно меньшей степени (сохранение до 42 % от исходной интенсивности биолюминесценции), что может объясняться более высоким температурным оптимумом ферментной системы генерации свечения данного микроорганизма.
Таким образом, полученные результаты демонстрируют существование зависимости биолюминесцентного отклика рекомбинантных штаммов E.coli при их введении в фагоцитарную систему от природы клонированных lux оперонов. При этом для заявленных целей предпочтительным оказывается использование генетического материала морской люминесцирующей бактерии P.leiognathi, что позволяет достичь прямой зависимости результативного параметра (интенсивности свечения) от выраженности развивающегося в этих условиях киллингового эффекта, а так же создает условия для исследования в фагоцитарной системе еще одной реакции, сопровождающейся генерацией свечения - хемилюминесценции. Сказанное свидетельствует в пользу необходимости использования в технологии биолюминесцентного метода оценки фагоцитоза не абстрактных генноинженерных микроорганизмов, в наиболее общем виде обозначаемых как lux+, но, напротив, рекомбинантных штаммов с жестко контролируемыми по происхождению lux-оперонами.
Сопоставление динамики биолюминесценции и числа жизнеспособных бактерий, изолируемых на разных сроках существования фагоцитарной системы при высеве на плотные питательные среды, при общей направленности их изменения, а также близости достигаемых итоговых значений свечения / жизнеспособности, заставило констатировать опережающий характер тушения биолюминесценции по сравнению с развитием бактерицидного эффекта. При этом в качестве одной из возможных причин подобного явления нами рассмотрена роль продуктов перекисного окисления липидов тела бактериальной клетки, возникающих в результате воздействия генерируемых фагоцитами активных форм кислорода и способных выступать в качестве субстратов или ингибиторов люминесцентной реакции.
Выполнение данного фрагмента исследования потребовало сопоставления спектров жирных кислот в клетках использованных рекомбинантных люминесцирующих клеток E.coli с таковым у природного морского люминесцирующего микроорганизма P.phosphoreum. При этом основанием для подобной постановки вопроса явился различный характер изменения уровня их биолюминесценции в условиях окислительного стресса, индуцируемого ионами двухвалентного железа. Так использование FeSO4 в диапазоне концентраций 0,25 - 5 мМ вызывало дозозависимую стимуляцию интенсивности свечения P.phosphoreum, достигающую 125,5 ± 2,4 % от исходных значений. При этом регистрируемые эффекты хорошо согласовывались с данными А.Д. Исмаилова с соавт. (1994), зафиксировавшим сходные явления в бесклеточном экстракте Vibrio harveyi, а их вероятной причиной могло быть увеличение пула длинноцепочечных альдегидов как результата запускаемых в присутствии ионов двухвалентного железа процессов ПОЛ. В свою очередь проведение аналогичных экспериментов с использованием рекомбинантного люминесцирующего штаммма E.coli с клонированными luxCDABE генами P.leiognathi позволило зарегистрировать только дозозависимое снижение интенсивности свечения до 1,2 ± 0,6 – 36,8 ± 4,4 % от исходных значений.
С целью выяснения природы выявленных особенностей реагирования природного и рекомбинантного микроорганизмов были проанализированы спектры присутствующих в их клетках жирных кислот (ЖК) с акцентом на выявление веществ, способных оказывать воздействие на интенсивность бактериального свечения.
Полученные данные свидетельствовали о том, что в жирнокислотном спектре природного морского изолята P.phosphoreum до 10,61 % составляет тетрадекановая кислота, производное которой – миристиновый альдегид – как раз и является основным субстратом для люцифераз P.phosphoreum, P.leiognathi и Vibrio fischeri. В свою очередь допущение о возникновении альдегидных субстратов в результате пероксидации ненасыщенных жирных кислот позволило констатировать возможность образования в клетках P.phosphoreum гексаналя (С6) и малонового диальдегида, гептаналя (С7) и нонаналя (С9), из которых последнее соединение в биолюминесцентной реакции характеризуется относительно высокой активностью (на уровне 50% от таковой у тетрадеканаля).
В жирнокислотном спектре рекомбинантного штамма E.coli присутствие тетрадекановой кислоты также обнаруживалось, что может являться одним из условий для воспроизведения биолюминесцентной реакции в данной гетерологичной системе. Однако ее относительное содержание оказывалось примерно в три раза ниже, а основным компонентом (36,33 % от общего содержания ЖК и их производных) оказывалась ненасыщенная 11 октадеценовая кислота. При этом последующее исследование эффектов коммерческого препарата цис-11-октадеценовой кислоты (Sigma, США) на активность ферментной системы генерации свечения в системе in vitro характеризовало ее как мощный ингибитор биолюминесценции, что согласуется с представлениями об аналогичных свойствах у другой ненасыщенной жирной кислоты с 18 атомами углерода – 9-октадеценовой (олеиновой) (Eetkauskaite, 2004). Более того, предварительный контакт цис-11-октадеценовой кислоты с ионами Fe2+ достоверно усиливал ингибирующие эффекты, что позволяет рассматривать возникающие в процессе ее липопероксидации производные (окисленные липидные радикалы, гидропероксиды) в качестве вероятных конкурентов миристинового альдегида.
Таким образом, одной из возможных причин опережающего по отношению к бактерицидному эффекту тушения рекомбинантных бактериальных клеток-мишеней могут являться особенности состава спектра их жирных кислот, в отличие от природных люминесцирующих микроорганизмов не вполне адекватного для обеспечения свечения в условиях инициации перекисного окисления липидов. Прикладной же аспект полученных данных заключается в возможности более ранней (по сравнению с классическим бактериологическим методом) биолюминесцентной оценки итоговых величин киллинга бактериальных клеток-мишеней начиная с 30-й минуты существования фагоцитарной системы.
Решение задачи определения оптимальных условий для использования люминесцирующих бактерий в качестве объекта фагоцитоза явилось основой для выполнения следующего этапа работы, связанного с обоснованием подходов к раздельному учету биолюминесценции и хемилюминесценции в фагоцитарной системе.
Первый из подобных подходов основан на обнаруженной возможности термоинактивации клонированной в E.coli ферментной системы генерации свечения P.leiognathi без изменения жизнеспособности реципиентных бактериальных клеток. Соответственно сущностью данного варианта биохемилюминесцентного способа оценки фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека явился раздельный учет интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов и биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней, проводимый во всем спектральном диапазоне, но в двух отдельных пробах, в одну из которых фагоцитируемые объекты вносят после дополнительной инкубации при 42 С в течение 10 мин (для подавления биолюминесценции), а в другую не вносят люминол (для исключения хемилюминесценции). При этом в качестве фагоцитируемых объектов использовали рекомбинантные люминесцирующие бактерии E.coli с клонированными luxCDABE генами P.leiognathi, предварительно опсонизированные нормальным иммуноглобулином человека в концентрации 10 мг/мл на 109 КОЕ/мл бактериальных клеток.
А бБ а 150 100 50 0 400 800 1200 1600 400 800 1200 0 200 400 600 800 0 200 400 600 Рис. 2. Результаты раздельного (А) и совместного (Б) измерения биолюминесценции (1) и хемилюминесценции (2) в фагоцитарной системе.
По оси абсцисс – время измерения (сек);
по оси ординат – интенсивность свечения (отн. ед.).
При этом регистрация интенсивности свечения в каждой из подобных проб позволила зафиксировать сопряженные изменения, описывающие активацию кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов и развитие обусловленного их активностью киллинга бактериальных клеток-мишеней (рис.
2А).
Другая возможность раздельной оценки люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов и биолюминесценции бактериальных клеток мишеней базируется на полученных экспериментальных данных о неидентичности спектров их световой эмиссии, в основе которых лежат различия в химической природе эмиттеров: 3-аминофталата и 4а гидроксифлавина.
Так анализ спектра биолюминесценции рекомбинантного штамма E.coli с клонированным luxCDABE-опероном P.leiognathi, проведенный с использованием серии полосовых интерференционных светофильтров, позволил зафиксировать характерное распределение с максимумом 480 ± нм, где его интенсивность составляла 30,88 ± 0,75 % от суммарной световой эмиссии. Прочие особенности спектра определялись существованием более крутого коротковолнового (от 420 нм) и пологого длинноволнового плеча. При этом использование интерференционного светофильтра 560 ± 5 нм позволяло регистрировать до 2,63 ± 0,40 % от суммарной интенсивности свечения, что свидетельствовало о существовании эмиссии и в более длинноволновом диапазоне. Подобный спектр является типичным для большинства природных и рекомбинантных люминесцирующих микроорганизмов (Thouand, 2003), в качестве светового эмиттера использующих 4а-гидроксифлавин, распад которого как раз и сопровождается освобождением избыточной энергии в виде кванта сине-зеленого света.
В свою очередь исследование спектра люминолзависимой хемилюминесценции заставило констатировать его неидентичность таковому при бактериальной биолюминесценции со смещением в сторону коротких длин волн. В частности, подобное заключалось в обнаружении максимума свечения при использовании светофильтра с полосой пропускания 440 ± 5 нм, выявляющего 26,07 ± 0,32 % от суммарной световой эмиссии. В свою очередь хемилюминесценция не обнаруживалась в спектральном диапазоне 540 нм, а использование светофильтра 400 ± 5 нм позволяло регистрировать до 8,94 ± 0,43 % от суммарной интенсивности свечения, что предполагает его наличие и в ближней ультрафиолетовой области.
Таблица Сравнительная характеристика спектров хемилюминесценции люминола и бактериальной биолюминесценции (доля от суммарной световой эмиссии, %) Оцениваемый Бактериальная Люминолзависимая диапазон спектра биолюминесценция хемилюминесценция 400±5 нм 0 8, 420±5 нм 0,24 18, 440±5 нм 4,84 26, 460±5 нм 16,36 17, 480±5 нм 30,88 11, 500±5 нм 21,20 12, 520±5 нм 15,83 4, 540±5 нм 8,03 0, 560±5 нм 2,63 В целом проведенные исследования свидетельствовали о достаточно существенной (до 87 %) зоне «перекрывания» сравниваемых спектров, что исключало возможность их раздельной оценки в максимумах световой эмиссии, одновременно создавая подобную возможность на неперекрывающихся коротко- и длинноволновом участках. Реализация подобного подхода при оценке интенсивности свечения в одной фагоцитарной системе в двух различных частях спектра позволила зарегистрировать изменения (рис. 2Б), по своей направленности и временным характеристикам соответствующие описанным выше кинетике био- и хемилюминесценции.
При этом использование светофильтров результировалось в снижении общей интенсивности сигнала, что потребовало использования более высоких коэффициентов усиления с закономерным возникновением дополнительных «шумов». Последнее, в свою очередь, обусловило необходимость более продолжительных периодов осреднения, а также использования не полосовых, но отсекающих ( 420 нм и 540 нм) светофильтров.
Для реализации описанных выше вариантов метода оценки фагоцитоза разработан проект двухканального биохемилюминометра, позволяющего проводить одновременный анализ свечения смесей «фагоциты : бактерии» в двух пробах различного компонентного состава во всем спектральном диапазоне или в одной пробе в двух диапазонах длин волн.
Первое из реализованных при его создании технических решений заключается в использовании двух независимых фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) и кюветного отделения, содержащего две темновые камеры, каждая из которых находится в оптической связи с отдельным ФЭУ со своей системой регистрации импульсов (рис. 3А), сигнал с которой передается на единую схему сопряжения, позволяющую ввести данные в ПК с последующим расчетом абсолютной и относительной разницы интенсивности свечения в сравниваемых пробах.
А Б Рис. 3. Схема конструкции двухканального биохемилюминометра.
1 – цельнометаллический корпус кюветного отделения;
2 – сменная ячейка кюветного отделения (А – двухкюветная, Б – однокюветная);
3 – измерительные кюветы;
4 – щели для установки светофильтров;
5 – ФЭУ.
Другое техническое решение предусматривает использование сменного кюветного отделения, снабженного центрально расположенной темновой камерой для размещения одной анализируемой пробы, имеющей два боковых окна с соосными им цилиндрическими выточками для крепления ФЭУ. В свою очередь на оптическом пути от анализируемой пробы к каждому из ФЭУ в структурной связи с боковыми окнами кюветного отделения находятся перпендикулярно расположенные по отношению к ним щели, позволяющие размещать в них полосовые или отсекающие интерференционные светофильтры (рис. 3Б).
Использование предложенного биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитоза в группе здоровых доноров позволило определить значения нормативных показателей активации фагоцитов и их киллинговой активности, составившие соответственно 450 ± 55 % и 60 ± 10 % от исходного уровня данных параметров (до формирования фагоцитарной системы).
70% 800% 700% 60% Уровень остаточной биолюминесценции, % 600% 50% Активация фагоцитов, % 500% 40% 400% 30% 300% 20% 200% 10% 100% 0% 0% 4 5 6 7 8 9 10 4 5 6 7 8 9 Гликозилированный гемоглобин, % Гликозилированный гемоглобин, % Рис. 4. Соответствие показателей хемилюминесценции фагоцитов (слева) и биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней (справа) с содержанием гликозилированного гемоглобина в крови обследованных пациентов с сахарным диабетом 2-го типа.
В свою очередь апробация предложенного метода в группе из 34 больных сахарным диабетом 2 типа (рис. 4) с определением зависимостей активированной хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов периферической крови и их влияния на интенсивность биолюминесценции (БЛ) бактериальных клеток мишеней от степени компенсации данного заболевания, определяемой по уровню гликозилированного гемоглобина крови (HbA1c), позволила зафиксировать сопряженные изменения анализируемых параметров, связанных регрессионными зависимостями вида ХЛ=-0,38[HbA1c]+5,24 и БЛ= 0,052[HbA1c]+0,602. Полученные результаты являются основанием для использования разработанного подхода для мониторинга состояния фагоцитарного звена у лиц с различными иммунодефицитными состояниями, что должно обеспечить возможность выполнения своевременных лечебных мероприятий и профилактики возникновения инфекционно-воспалительных осложнений.
Выводы 1. Обоснован вариант опсонизации рекомбинантных люминесцирующих штаммов E.coli нормальным иммуноглобулином человека, позволяющая исключить не связанный с фагоцитозом преждевременный бактерицидный эффект и обеспечивающая достаточный уровень активации фагоцитов.
2. Показана предпочтительность использования в качестве объекта для фагоцитоза рекомбинантных штаммов E.coli с клонированными lux-оперонами Photobacterium leiognathi, демонстрирующих прямую пропорциональность между величинами свечения и количеством клеток, сохранивших жизнеспособность после подобного воздействия.
3. Установлено опережающее по отношению к развитию бактерицидного эффекта снижение интенсивности биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней при фагоцитозе, что может определяться влиянием на ферментную систему генерации свечения продуктов пероксидации их жирных кислот.
4. Продемонстрирована неидентичность спектров биолюминесценции бактерий и люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов и определены диапазоны длин волн ( 540 нм и 420 нм), при которых возможен раздельный учет интенсивности каждого из названных видов свечения.
5. Разработаны два варианта биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека, проводимого в одной пробе путем оценки интенсивности свечения в двух различных дипазонах спектра или в двух отдельных пробах, в одну из которых бактериальные клетки-мишени вносят после дополнительной термообработки (для подавления биолюминесценции), а в другую не вносят люминол (для исключения хемилюминесценции).
6. Для реализации данного метода разработан двухканальный биохемилюминометр, конструкция которого включает два независимых регистратора (фотоэлектронных умножителя) и двух сменных кюветных отделений, использование которых позволяет проводить одновременное кинетическое измерение интенсивности свечения смесей «бактерии : фагоциты»
в одной пробе в двух диапазонах длин волн, либо в двух параллельных пробах различного компонентного состава во всем спектральном диапазоне.
7. Апробация биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитоза в группе больных сахарным диабетом 2 типа позволила констатировать сочетанные изменения активированной хемилюминесценции лейкоцитов и их киллинговой активности, а также зависимость данных показателей от степени компенсации заболевания.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Каримов И.Ф. Устройство для измерения хемилюминесценции и биолюминесценции / И.Ф. Каримов, Д.Г. Дерябин, А.Н. Никиян, Д.А. Грудинин // Патент РФ на полезную модель № 49998, опубл. 10.12.2005, Бюлл. №34.
2. Каримов И.Ф. Влияние компонентов сыворотки крови на уровень свечения рекомбинантного люминесцирующего микроорганизма и ферментной системы генерации свечения / И.Ф. Каримов, Д.Г. Дерябин, Д.А. Грудинин, Ю.Б. Иванов // Иммунология Урала, 2006. – №1 (5). – С. 157-158.
3. Каримов И.Ф. Обоснование оптимального режима опсонизации рекомбинантных люминесцирующих бактерий / И.Ф. Каримов, Д.Г. Дерябин, Д.А. Грудинин // Вестник Оренбургского гос. ун-та. – 2006. – №12. – С.6-10.
4. Каримов И.Ф. Кюветное отделение для биохемилюминометра / И.Ф.
Каримов, Д.Г. Дерябин, А.Н. Никиян, Д.А. Грудинин // Патент РФ на полезную модель № 64373, опубл. 27.06.2007, Бюлл. №18.
5. Каримов И.Ф. Особенности реагирования рекомбинантных люминесцирующих бактерий с различными lux-оперонами в фагоцитарной системе / И.Ф. Каримов, Д.Г. Дерябин // Вестник Оренбургского гос ун-та. – 2007. – №12. – С.4-7.
6. Каримов И.Ф. Оценка бактерицидных систем крови человека с использованием рекомбинантных люминесцирующих бактерий / И.Ф. Каримов, Д.Г. Дерябин // Материалы III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». – Пермь, 2008. – С. 26-27.
7. Каримов И.Ф. Биолюминесцентные меоды оценки бактерицидности биологических жидкостей и слеточных суспензий / И.Ф. Каримов, Д.Г. Дерябин // Материалы IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». – СПб, 2008. – С. 144.
8. Каримов И.Ф. Возможность одновременной оценки хемилюминесценции и биолюминесценции в фагоцитарной системе / И.Ф. Каримов, Д.Г. Дерябин // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины.
– 2009. – Т.147. – № 3 – С. 322-327.
9. Д.Г. Дерябин Бактериальная биолюминесценция: результаты изучения и возможности использования / Д.Г. Дерябин, Е.С. Алешина, И.Ф. Каримов // Бюлл. Московского общества испытателей природы. Отдел биологический. – 2009. – Т. 144. – №2. – С. 207-208.
10. Дерябин Д.Г. Методы и приборное обеспечение использования люминесцирующих бактерий при исследовании живых систем / Д.Г. Дерябин, И.Ф. Каримов // Материалы V Международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» – СПб, 2009. – С. 184.
11. Каримов И.Ф. Биолюминесцентный способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов / И.Ф. Каримов, Д.Г. Дерябин // Патент РФ на изобретение № 2366953, опубл. 10.09.2009, Бюлл. № 25.
Для заметок _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Лицензия № ЛР020716 от 02.11. Формат 6084 1/16. Бумага офисная.
Усл. печ. листов 1,2.
Тираж 100. Заказ 505.
ИПК ГОУ ОГУ 460352, г.Оренбург, ГСП, пр.Победы,13.
Государственное образовательное учреждение «Оренбургский государственный университет»