Исследование цитотоксической активности и механизмов действия производных бетулина и глицирризиновой кислоты в опухолевых клетках в культуре
На правах рукописи
Шинтяпина Александра Борисовна
ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И
МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНЫХ БЕТУЛИНА И
ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ОПУХОЛЕВЫХ
КЛЕТКАХ В КУЛЬТУРЕ
03.00.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Кольцово – 2008
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России
Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Андрей Георгиевич Покровский
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Валерий Борисович Локтев кандидат биологических наук Владимир Олегович Пустыльняк
Ведущая организация:
Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН, Москва
Защита состоится «_» мая 2008 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Роспотребнадзора по адресу: п. Кольцово Новосибирской области, 630559, тел: (383)336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора.
Автореферат разослан «_ » апреля 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Л. И. Карпенко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Рост онкологической заболеваемости в XX веке происходил такими быстрыми темпами, что это дало основание для его сравнения с эпидемией. Ежегодно во всем мире от злокачественных опухолей умирает около 7 млн человек. По данным Всемирной организации здравоохранения в 2006 году в мире от рака умерло свыше 7 млн человек и диагностировано 10 млн новых случаев онкологических заболеваний. В большинстве развитых стран они занимают второе место среди причин смерти.
По оценкам Всемирной организации здравоохранения онкологические заболевания к 2020 году выйдут на первое место в мире по смертности в структуре всех заболеваний, обогнав при этом «традиционного лидера» – сердечно-сосудистые заболевания.
Национальный институт рака (National Cancer Institute) осуществляет программу по разработке противоопухолевых препаратов. В рамках этой программы ежегодно проводится тестирование in vitro более 10000 соединений как природного, так и синтетического происхождения. NCI Drug Information System располагает информацией о 400000 соединениях, протестированных на сегодняшний день. Важное место в таких исследованиях занимает поиск возможных молекулярных мишеней для этих препаратов. Число таких мишеней составляет уже более 100, и их число постоянно растет (Dai Z. et al., 2007).
Особенный интерес вызывают те соединения, о противоопухолевой активности которых уже есть данные. Давно известно, что глицирризиновая кислота (ГК), которая является активным компонентом корня солодки (Glycyrrhiza sps.), обладает антиканцерогенным и антимутагенным действием (Tanaka M. and Mano N., 1987). Позднее было показано, что глицирризиновая кислота и некоторые ее производные способны избирательно ингибировать рост опухолевых клеток в культуре (Rossi T. et al., 2003).
Бетулиновая кислота (БК) – растительный пентациклический тритерпеноид, выделенный из коры березы (Кислицын А. Н., 1994), обладает избирательным цитотоксическим действием в отношении различных опухолевых клеток, противовирусными свойствами, такими как анти-ВИЧ активность, а также противомалярийным, антибактериальным и системным противовоспалительным действием (Kashiwada Y. et al., 1996).
Противоопухолевая активность БК была показана на клеточной линии меланомы (Liu W. et al., 2004), а также на модели in vivo, на бестимусных мышах, несущих человеческую меланому (Pisha E. et al., 1995).
Противоопухолевое действие БК и некоторых ее аналогов связывают с избирательной индукцией апоптоза в опухолевых клетках (Eiznhamer D. et al., 2004). В настоящее время препарат на основе бетулиновой кислоты проходит клинические исследования в США в качестве средства для лечения злокачественной меланомы (http://clinicaltrials. gov/show/NCT00346502).
Данные последних исследований свидетельствуют о том, что БК, ГК и другие природные тритерпены ингибируют пролиферацию опухолевых клеток, индуцируют их апоптоз (Urech K. et al., 2005;
Essaady D. et al., 1996;
Rossi T. et al., 2003). Однако, несмотря на значительное количество данных о противоопухолевой активности растительных тритерпенов, на настоящий момент не до конца понятны механизмы их действия в клетке. Показано, что основной противоопухолевый механизм действия тритерпенов связан с индукцией апоптоза в опухолевых клетках, запуск которого под действием ГК, БК в раковых клетках осуществляется независимо от «рецепторов смерти» (CD 95/Fas) и белка р53. С другой стороны, из литературных данных известно, что при действии бетулиновой кислоты на опухолевые клетки происходит активация каспазы 9, но не каспазы 8, что может говорить о Bcl-2-зависимом пути индукции апоптоза (Fulda S. et al., 1997;
1999;
Zuco V. et al., 2002).
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение противоопухолевой активности производных тритерпенов in vitro, исследование особенностей молекулярных механизмов их противоопухолевого действия в опухолевых клетках человека in vitro.
Для достижения цели решались следующие задачи:
1) Исследовать цитотоксическую активность высших терпеноидов амиранового и лупанового рядов (глицирризиновой кислоты, глицирретовой кислоты, бетулина, бетулиновой кислоты и их производных) в культурах опухолевых клеток, выявить наиболее активные.
2) Изучить с помощью метода проточной цитометрии способность наиболее активных производных тритерпеновых соединений индуцировать апоптоз в опухолевых клетках человека (линии MT-4, MOLT-4, СЕМ, Hep G2, HeLa).
3) Исследовать влияние наиболее активных производных тритерпенов на изменение экспрессии гена апоптоза Bcl-2 и клеточного цикла Cyclin D1 в опухолевых клетках человека в культуре.
4) Исследовать с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ с последующим анализом на проточном цитометре возможное влияние производных наиболее активных тритерпенов на изменение экспрессии гена каталитической единицы теломеразы (hTERT) в опухолевых клетках in vitro.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено тестирование на противоопухолевую активность 25 соединений тритерпенового ряда на 5 опухолевых клеточных линиях человека. Определены 50% ингибирующие дозы для этих клеток (ИД50). Выявлены наиболее активные. С помощью метода проточной цитометрии получены новые данные, характеризующие способность природных тритерпенов лупанового ряда и их производных индуцировать апоптоз в опухолевых клетках in vitro. Исследованы молекулярные механизмы действия тритерпенов лупанового ряда в клетке.
Впервые показано, что механизм действия in vitro производных бетулиновой кислоты связан со снижением экспрессии гена апоптоза Bcl-2, клеточного цикла Cyclin D1, каталитической субъединицы теломеразы hTERT.
Оригинальный фактический материал, полученный в процессе экспериментальных исследований, представляет собой ценную информацию для дальнейшего изучения противоопухолевого действия тритерпенов с целью направленного создания производных с повышенной специфичностью воздействия на молекулярные мишени опухолевых клеток. Приведенные исследования также являются стимулом для дальнейшего доклинического исследования производных бетулиновой кислоты в системах in vivo их противоопухолевой активности и создания на их основе перспективных препаратов со специфической противоопухолевой активностью.
Положения, выносимые на защиту:
1. Бетулин, бетулиновая, глицирретовая кислоты и их химически модифицированные в С-28 положении производные ингибируют рост опухолевых клеток человека в культуре. Амиды, содержащие 7, 8, метиленовых остатков и COO- концевую группу, и дипептид бетулоновой кислоты являются наиболее активными ингибиторами роста опухолевых клеток in vitro.
2. Азотсодержащие производные бетулиновой кислоты являются эффективными индукторами апоптоза в опухолевых клетках человека in vitro. Наиболее эффективными индукторами апоптоза in vitro являются амиды и дипептид бетулоновой кислоты.
3. Индукция апоптоза под действием бетулиновой кислоты, амидов бетулоновой кислоты, содержащих 7, 8, 10 метиленовых остатков и COO концевую группу, и дипептида в опухолевых клетках человека in vitro сопровождается снижением экспрессии гена апоптоза Bcl-2, клеточного цикла Cyclin D1, экспрессия гена каталитической субъединицы теломеразы hTERT снижается под действием амидов, содержащих 8 и метиленовых остатков и COO- концевую группу и дипептида бетулоновой кислоты.
Апробация работы и публикации. Результаты исследования были представлены на 10-ой международной школе-конференции для молодых ученых «Биология – наука XXI века», (Пущино, 2006), на 14-й, 15-ой, 16-ой международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье» (Санкт Петербург, 2005;
2006;
2007), на международном симпозиуме «Biology of Disease – A Molecular Battlefield» (Германия, 2006), на 10-ом симпозиуме европейского общества медицинской химии и американского общества органической химии «International Symposium on Advances in Synthetic and Medicinal Chemistry ASMC 07» (Санкт-Петрбург, 2007). По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Личный вклад автора. Все эксперименты были выполнены и проанализированы автором, часть измерений на проточном цитометре была проведена сотрудниками Института клинической иммунологии СО РАМН Борисовым В. И. и Пронкиной Н. В.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 16 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а также списка литературы (234 источника).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные соединения. Использовавшиеся в работе соединения (глицирризиновая кислота, глицирретовая кислота и ее производные, бетулиновая кислота, бетулоновая кислота и ее производные (всего соединений) были получены в лаборатории медицинской химии Института органической химии СО РАН, г. Новосибирск (зав. лаб. д.х.н. Щульц Э. Э.).
Соединения растворяли в ДМСО, хранили при температуре -20°С.
Клетки. В работе использовали 5 опухолевых клеточных линий человека (МТ-4, MOLT-4, CEM, Hep G2, HeLa). Клетки МТ-4, MOLT-4, CEM культивировали в среде RPMI-1640, клетки Hep G2, HeLa в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота, ммоль/л L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина, 30 мкг/мл линкомицина при температуре 37°С в CO2 инкубаторе.
МТТ-тест. Для определения ИД50 (дозы, на 50% ингибирующей рост клеток) использовали 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (MTT) (Mosmann T. et al., 1983;
Wilson J., et al., 1990). Клетки МТ-4, MOLT-4, CEM, Hep G2, HeLa высевали на 96-луночный планшет, исследуемые вещества добавляли к клеткам до конечных концентраций 0,01-1000 мкМ.
Клетки, инкубируемые в тех же условиях без добавления препаратов, являлись контрольными. Клетки культивировали 48 ч. Водный раствор МТТ (5 мг/мл) добавляли в культуру, инкубировали 4 ч при температуре 37°С в CO инкубаторе. Далее добавляли по 200 мкл смеси (50% пропанола-2, 10% додецилсульфата натрия, 0,01 Н HCl), 30 мин инкубировали. Оптическую плотность (ОD) измеряли при длине волны 540 нм. 50% ингибирующую дозу (ИД50), стандартную ошибку (SE) ИД50 определяли с помощью программы GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Inc., США).
Анализ апоптоза. Клетки после инкубации с экспериментальными препаратами в конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 48, 72 ч ФСБ (х1) фиксировали в 70% этаноле 12 ч при -20°C, отмывали ФСБ (х1), в течение 12 ч.
Инкубировали при температуре 4°C в растворе пропидия йодида (50 мкг/мл), содержащем 0,1% натрия цитрата, 0,1% тритона X-100 и РНКазу (150 ед.
акт./мл). Клетки, инкубируемые без экспериментальных соединений, использовали в качестве контроля. Измерения проводили на проточном цитометре FACSCalibur («Becton Dickinson», США). Рассчитывали апоптотический индекс (АИ, %) с использованием программы CellQuest («Becton Dickinson», США).
ОТ-ПЦР. Суммарную РНК выделяли из клеток с помощью набора RNeasy Mini Kit («Qiagen», США) согласно протоколу фирмы-производителя. Реакцию ОТ проводили в конечном объеме 25 мкл при следующих условиях: 1 мкг РНК, буфер (50 мМ трис-HCl, рН 8,3, 3 мМ MgCl2, 75 мМ KCl, 10 мМ DTT), 0,5 мМ dNTPs, 0,4 мкМ oligo(dT)15, 200 ед. акт. обратной транскриптазы M-MLV («Сибэнзим», Россия). Смесь инкубировали 60 мин при 37°С, затем 10 мин при 70°С. Мультиплексную ПЦР (Wong H. et al., 1994) проводили в конечном объеме 30 мкл на амплификаторе Gradient Palm-Cycler («Corbett Research», Австралия). В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводили нормализацию продуктов амплификации исследуемых генов, был выбран ген «домашнего хозяйства» -actin. В ПЦР использовали специфические праймеры к последовательностям исследуемых генов: Bcl- (прямой: 5'-TTCCCATCGCTGTCCTTCG-3', обратный: 5'-CTGTGCCTGTAAA CATAGATTCGC-3' (340 п.н.), Cyclin D1 (прямой: 5'-TATTTGCATAACCCTG AGCG-3', обратный: 5'-GTGACTACATG CATATGAGC-3' (350 п.н.) и -actin (прямой: 5'-ACGTTATGGATGATGATATCGC-3', обратный: 5'-CTTAATGTC ACGCACGATTTCC-3' (644 п.н.). ПЦР предварительно оптимизировали по числу циклов, количеству праймеров. Каждая реакционная смесь содержала мкл кДНК, буфер для ПЦР (х1), 50 мкМ dNTPs, 20 пкМ каждого праймера к acitn и 2 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим», Россия). Равные количества (20 пкМ) праймеров для амплификации гена Bcl-2 или Cyclin D были добавлены через несколько циклов. В наших условиях наиболее подходящее число циклов было для -acitn – 30, для Bcl-2, Cyclin D1 – 22.
Каждую пробу амплифицировали трижды. Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 2% агарозном геле с 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
Денситометрию продуктов амплификации проводили с помощью программы TotalLab 3.0 («Phoretix», США). Относительное содержание мРНК рассчитывали как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы исследуемых генов к интенсивности полосы гена -actin.
Флуоресцентная гибридизация in situ с последующим анализом на проточном цитометре (flow FISH). Для анализа содержания мРНК гена hTERT использовали метод flow-FISH (flow fluorescence in situ hybridization) (Larsen R.
D. et al., 2003). После инкубации с экспериментальными препаратами или без (контроль), клетки отмывали ФСБ (х1), фиксировали 1% парафармальдегидом 15 мин. Далее клетки отмывали и инкубировали с 0,1% Tween-20 15 мин.
После этого, клетки снова отмывали ФСБ (х1). Зонд пептидной нуклеиновой кислоты (GripNA-зонд), меченный флюоресцеином (FITC) («Active Motif», США), комплементарный мРНК hTERT с нуклеотидной последовательностью 5'-CGTGCGCAGCAGGACGCA-3', добавляли в конечной концентрации 0, мкг/мл, инкубировали в течение 12 ч. Добавляли 0,5 мл 1% параформальдегида.
Анализ проводили на проточном цитометре FACS Calibur («Becton Dickinson», США) с помощью программы Cell Quest («Becton Dickinson», США). Сигнал флуоресценции мРНК hTERT определяли как средний уровень флуоресценции клеток, прошедших гибридизацию в присутствии GriPN-зонда, вычитанием аутофлуоресценции клеток, прошедших FISH в отсутствии GripNA-зонда.
Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Exсel-2000 и STATISTICA 6.0.
Результаты представлены как среднее значение ± отклонение от среднего. Для оценки достоверности различий (р) использовали t-критерий Стьюдента.
Достоверными считали различия при р0,05. Результаты всех экспериментов представлены в виде среднего значения данных, полученных из 3-х независимых повторов экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование цитотоксической активности производных бетулина in vitro Было проведено тестирование на ингибирующую активность экспериментальных препаратов, с помощью МТТ-теста, представленных на рис. 1 (производных бетулина (Iа,б, III, IV, IVа-л) на опухолевые клетки человека (линии МТ-4, MOLT-4, CEM, Hep G2 и HeLa).
I R1=OH, R2 = H, R3 = CH2OH;
Ia R1=OC(O)(CH2)2CO2H, R2 = H, R3 = 29 CH2OC(O)(CH2)2CO2H;
Iб R1=OAc, R2 = H, R3 = CH2OC(O)(CH2)2CO2H;
11 R III R1=OH, R2 = H, R3 = CO2H;
R1 IV R1+R2 = O, R3 = CO2H;
3 5 IVa R1+R2 =O, R3 = CO2NH(CH2)7CO2H;
R IVб R1+R2 =O, R3= CO2NH(CH2)8CO2H;
Iа,б, III, IV, IVа-л I, Ia,б, III, IV, IVa-г IVв R1+R2 =O, R3 = CO2NH(CH2)10CO2H;
IVг R1+R2 =O, R3 = CO2NH(CH2)8CONHCH(Ph)CH2CO2H.
IVд R1+ R2=O, R3=C(O)NHCH(CH3)C2H5;
IVе R1+ R2=O, R3=C(O)N(H)C4H9;
IVж R1+ R2=O, R3=C(O)N(H)– ;
IVз R1+ R2=O, R3=C(O)N(H)– ;
IVи R1+ R2=O, R3=C(O)–N IVк R1+ R2=O, R3=C(O) –N –CH2Ph;
;
IVл R1+ R2=O, R3=C(O)N(H)C(H)2– N.
Рис. 1. Структура соединений, производные бетулина (I).
Количественная характеристика ингибирования (50% ингибирующие дозы, ИД50) растительных тритерпенов и их модифицированных производных приведена в табл. 1.
Из результатов табл. 1 видно, что клеточные линии оказались в разной степени чувствительны к действию тритерпенов данного ряда. Гетерогенность ответа между разными популяциями опухолевых клеток in vitro является одним из критериев, говорящим в пользу специфической противоопухолевой активности, нежели о неспецифической токсичности, где в разных популяциях клеток ответы сходны (Freshney R. I., 1989).
Таблица 1. Ингибирование жизнеспособности опухолевых клеток производными бетулина, ИД50 (мкМ) ± SE.
ИД50 ИД50 ИД50 ИД50 ИД (мкМ), (мкМ), (мкМ), (мкМ), (мкМ), Соединение MOLT-4 CEM MT-4 Hep G2 HeLa 90,3 ± 2,3 74,6 ± 2,7 147,9 ± 2,2 141,2 ± 2,5 151,5 ± 1, I 62,5 ± 1,2 56,8 ± 1,2 90,6 ± 2,5 109,3 ± 1.3 96,5 ± 2, Iа 20,14 ± 0,9 35,9 ±1,0 54,7 ± 1,3 85,4 ± 1,2 82,8 ± 2, Iб 62,5 ± 1,4 50,8 ± 0,8 11,6 ± 1,7 118,4 ± 2,5 120,5 ± 1, III 65,2 ± 1,3 40,4 ± 1,4 21,8 ± 1,5 108,3 ± 3,5 101,0 ± 2, IV 41,2 ± 1,2 17,1 ± 0,8 14,5 ± 0,8 53,3 ± 1,4 80,0 ±1, IVa 32,8 ± 0,9 26,2 ± 0,6 20,5 ± 0,7 52,5 ± 1,7 89,4 ± 2, IVб 50,4 ± 0,4 15,6 ± 1,5 12,5 ± 0,2 50,2 ± 1,3 47,9 ± 1, IVв 5,5 ± 0,5 6,4 ± 0,3 9,1 ± 1,2 33,1 ±0,8 24,5 ±1, IVг 200,7 ± 2,5 250,4 ± 2,5 225,5 ± 2,6 100,4 ±0,9 290,0 ± 3, IVд 390,5 ± 2,2 390,0 ± 4,2 276,5 ± 3,35 350,0 ± 1,3 260,0 ± 6, IVе 200 ± 1,2 251,5 ± 3,1 256,0 ± 2,7 298,0 ± 4,27 300,0 ± 5, IVж 380 ± 3,4 320,5 ± 4,2 230,5 ± 3,3 287,0 ± 2,4 275,0 ± 2, IVз 245,3 ± 3,8 287,0 ± 2,4 180,0 ± 2,4 198,5 ± 2,3 187,5 ± 2, IVи 287,0 ± 4,3 250,0 ± 4,0 220,0 ± 3,5 320,0 ± 2,4 250,0 ± 3, IVк 230,5 ± 2,4 267,0 ± 4,3 210,0 ± 4,5 120,0 ± 2,4 200,0 ± 2, IVл Показатель ИД50 исследованных соединений находился в интервале между 5,5 ± 0,5 и 390,5 ± 2,2 мкМ. С28-Моносукцинат ацетата бетулина (Iб) обладал более выраженной ингибирующей активностью на рост клеток, чем бетулин (I). Необходимо отметить, что в других исследованиях, в частности на клетках меланомы (линия B16), также показана слабая активность бетулина, для этого соединения показатель ИД50 на этих клетках составлял 100,0 мкг/мл (277 мкМ) (Liu W. K. et al., 2004). Из литературных данных известны примеры высокоактивных цитотоксичных ацетоксилупанов, также содержащих С28 карбоксильную группу (Sarec J. et al., 2003). Высокой ингибирующей активностью по отношению к росту опухолевых клеток обладали амиды и дипептид бетулоновой кислоты (IVa-г). Эти соединения (IVa-г) явились более активными ингибиторами роста опухолевых клеток МТ-4, MOLT-4, Hep G2, НeLa, они ингибировали рост клеток в меньших концентрациях (ИД составила 5,5 ± 0,5 – 89,4 ± 2,1 мкМ), чем БК (III) (ИД50 составила 11,6 ± 1,7 – 120,5 ± 1,4 мкМ) или бетулоновая кислота (ИД50 составила 21,8 ± 1,5 – 108,3 ± 3,5 мкМ), хотя в клетках СЕМ БК (III) оказалась более активной, чем амиды (IVa-в). Наиболее активным соединением оказался дипептид бетулоновой кислоты (IVг). Таким образом, длина метиленового звена (СH2)n (n=7,8,10) в амидном остатке незначительно изменяет цитотоксическую активность, однако введение второго амидного остатка приводило к увеличению ингибирования роста опухолевых клеток (соединение IVг). Слабую противоопухолевую активность in vitro проявили соединения (IVд-л), показатель ИД50 составил 100,4 ± 1,9 мкМ и более. Можно предположить, что это связано с наличием неполярных заместителей в С-28 положении этих соединений, отсутствием концевой карбоксильной группы в этом положении.
Таким образом, существует определенная связь между химической структурой и противоопухолевой активностью исследованных тритерпеновых гликозидов in vitro. Ранее показано, что противоопухолевая активность тритерпеновых гликозидов в малой степени зависит от химической структуры агликона, а в основном определяется количеством и местом присоединения к агликону боковых радикалов (Baglin I. et al., 2003). Замечено, что модификации БК по положению С-20 не приводят, по данным МТТ-теста, к усилению ее цитотоксической активности in vitro (Kim J. Y. et al., 2001). Кроме того, модификации в С-3 положении тритерпенового остова приводят к снижению активности БК (Darrik S. H. et al., 1998). С другой стороны, в литературе есть данные о том, что простые химические трансформации в С-28 положении влияют на способность ингибировать рост опухолевых клеток в культуре (You Y. J. et al., 2003). С этими данными согласуются и дополняют их результаты проведенных нами экспериментов (табл. 2), говорящие о том, что превалирующим фактором для производных бетулоновой кислоты является длина спейсер-метиленового звена радикала в 17-положении тритерпенового остова, а также концевая группа радикала в 17-положении. Из чего можно предположить, что радикал в 17-положении тритерпенового остова каким-либо образом влияет на противоопухолевую активность производных бетулиновой кислоты in vitro.
Исследование цитотоксической активности производных глицирризиновой кислоты in vitro Для исследования были взяты ГК и ее производные (II, IIа-ж) (рис. 2).
II R1 = H, R2 = OH;
COR IIa R1= H, R2 = NH(CH2)4CO2H;
H IIб R1= H, R2 = NH(CH2)5CO2H;
O IIв R1=H, R2 = NH(CH2)6CO2H;
14 IIг R1=H, R2 =NH(CH2)7CO2H;
3 5 R1O IIд R1=Ac, R2 = NH(CH2)8CO2H;
IIе R1=H, R2 = NH(CH2)10CO2H;
II, IIa-ж IIж R1 =H, R2 = NH(CH2)8CONHCH(Ph)CH2CO2H.
ГК R1= 2'-O-(-D-глюкуронопиранозил)- -D-глюкуронопиранозид, R2=ОH Рис. 2. Структура исследуемых соединений. Производные глицирризиной кислоты (ГК).
В табл. 2 приведены ИД50 (50% ингибирующие дозы) для этих соединений на пяти опухолевых клеточных линиях человека (MT-4, MOLT-4, CEM, Hep G2, HeLa).
Таблица 2. Ингибирование жизнеспособности опухолевых клеток производными ГК, ИД50 (мкМ) ±SE.
ИД50 (мкМ), ИД50 (мкМ), ИД50 (мкМ), ИД50 (мкМ), ИД50 (мкМ), Соединение MT-4 MOLT-4 CEM Hep G2 HeLa не достиг. не достиг. не достиг. не достиг. не достиг.
ГК 334,8 ± 1,5 411,9 ± 1,7 363,4 ± 1,4 418,5 ± 3,4 440,5 ± 2, II 158,5 ± 1,2 152,3 ± 1,9 132,7 ± 1,5 289,8 ± 3,4 168,0 ± 1, IIa 132,2 ± 1,5 169,3 ± 1,5 107,5 ± 1,8 352,7 ± 4,6 211,0 ± 3, IIб 214,7 ± 2,1 134 ± 2,5 138,3 ± 1,4 300,7 ± 1,5 214,7 ± 1, IIв 160,2 ± 2,3 87,6 ± 1,0 121,4 ± 1,7 146,7 ± 2,1 146,0 ± 3, IIг 77,6 ± 1,3 81,0 ± 1,4 57,2 ± 2,5 98,1 ± 1,4 83,5 ± 2, IIд 196,5 ± 1,4 235,8 ± 1,4 141,5 ± 0,9 314,4 ± 3,6 173,5 ± 2, IIе 112,8 ± 1,5 162,2 ± 1,6 109,3 ± 1,6 141,0 ± 3,6 113,5 ± 1, IIж Как видно из табл. 2, на исследуемых клеточных линиях ГК оказалась неактивна, 50% ингибирующая доза (ИД50) не была достигнута, жизнеспособность опухолевых клеток была аналогична жизнеспособности клеток необработанных экспериментальными соединениями. Глицирретовая кислота (II) обнаруживала способность ингибировать рост опухолевых клеток, хотя, и самую слабую в этом ряду исследованных соединений (ИД50 составила 334,8 ± 1,5 – 440,5 ± 2,4 мкМ).
Следует отметить, что производные глицирретовой кислоты, содержащие фрагмент аминооктановой или аминононановой кислоты (IIг, д), а также ее дипептид (IIж) оказались более активными ингибиторами роста опухолевых клеток, чем соответствующие амиды (IIа-в, е), содержащие остатки аминомасляной, аминопентановой, аминогексановой или аминоундекановой кислот. В целом, наибольший эффект на исследованные клетки оказал амид глицирретовой кислоты (IIд), ИД50 составила 77,6 ± 1,3 – 98,1 ± 1,4 мкМ.
Можно предположить, что это связано с наличием ацетогруппы в С- положении тритерпенового остова этого соединения, которая отсутствует у других исследованных амидов глицирретовой кислоты (IIа-г, е, ж). Из полученных экспериментальных данных также можно сделать вывод о том, что введение химических модификаций, также как и в случае производных бетулоновой кислоты, в структуру глицирретовой кислоты вызывает усиление ее ингибирующих свойств в культуре опухолевых клеток.
Таким образом, впервые показано, что азотсодержащие производные глицирретовой кислоты (IIа-ж), модифицированные по С-28 положению, могут оказывать ингибирующее действие на рост опухолевых клеток человека МТ-4, MOLT-4, CEM, Hep G2, HeLa в культуре, эти результаты оказались достаточно интересными. Если сравнивать результаты табл. 1 и 2, где приведены величины ИД50 для производных тритерпенов, то становится видно, что амидные производные глицирретовой кислоты в целом менее активны, чем производные бетулина и бетулиновой кислоты.
Таким образом, из полученных экспериментальных данных также можно сделать вывод о том, что введение химических модификаций (пептидных остатков) в структуру тритерпенов вызывает усиление их ингибирующих свойств на рост опухолевых клеток в культуре.
Исследование способности тритерпенов вызывать апоптоз в опухолевых клетках in vitro При первичном скрининге соединений обнаружено, что производные бетулина эффективно ингибируют рост опухолевых клеток в культуре. Ранее было показано, что БК обладает апоптозиндуцирующей активностью в культурах опухолевых клетках (Schimdt M. L. et al., 1997;
Fulda S. et al., 1999;
Eiznhamer D. A. et al., 2004;
Ehrhardt H. et al., 2004). Поэтому, с учетом полученных результатов МТТ-теста для тритерпеновых соединений, проявивших наибольшую ингибирующую активность, с помощью проточной цитофлуориметрии была определена способность вызывать апоптоз в исследованных клетках. Для этого были выбраны наиболее активные ингибиторы лупанового типа – бетулин (I), сукцинаты бетулина (Ia,б), БК (III), бетулоновая кислота (IV) и ее производные (IVа-г). Метод проточной цитометрии является методом выбора для количественного анализа апоптоза клеток (Nicoletti I. et al., 1991;
Afanasyev V. et al., 1993;
Riccardi C. et al., 2006).
Одно из апоптотических событий реализуется в ядре клетки и заключается во фрагментации ДНК. Метод проточной цитометрии позволяет регистрировать клетки, содержащие фрагментированную ДНК, которые оцениваются на гистограммах как субдиплоидный пик (пре-G1) и соответствует доли клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК.
Контроль III IVа IVб IVв А Б В Г Д Интенсивность флуоресценции Рис. 3. ДНК гистограммы проточной цитометрии клеток линий MT-4 (А), MOLT- (Б), CEM (В), Hep G2 (Г), HeLa (Д) до (контроль) и после обработки бетулиновой кислотой (III) или ее амидами (IVa-в). На гистограммах приведена зависимость числа клеток (ордината) от величины флуоресценции по второму каналу FL2 (абсцисса). Субдиплоидный (пре-G1) пик представлен регионом М1, соответствующим клеткам в стадии апоптоза.
На рис. 3 представлены ДНК-гистограммы, характеризующие распределение клеток по фазам клеточного цикла (регион М1 соответствует апоптозу, М2 – G0/G1, М3 – S+G2+M фазам клеточного цикла). Как видно из ДНК гистограмм рис. 3, количество клеток в контрольных линиях MT-4, MOLT-4, CEМ, Hep G2, HeLa с гиподиплоидным содержанием ДНК (регион М1) незначительно, в то время как в опыте (после обработки клеток этих линий экспериментальными соединениями) наблюдается увеличение содержания клеток в стадии апоптоза. Далее из ДНК гистограмм с помощью программы CellQuest («Becton Dickinson», США) рассчитывали апоптотический индекс (АИ, %). Значения АИ для соединений I, Ia, Iб, III, IV, IVа-г в различных опухолевых клетках в культуре представлены на рис. 4-5.
Рис. 4. Влияние тритерпеновых производных на уровень апоптоза лейкозных клеток. К – контроль (клетки, необработанные соединениями). Индукция апоптоза в клетках MT-4 (А), (Б), (В). Приведены средние значения ± отклонение от среднего, * – достоверность различий относительно контроля (p0,05), # – достоверность различий относительно БК (III) (p0,05).
Рис. 5. Влияние тритерпеновых производных на уровень апоптоза клеток Hep G2 и HeLa. К – контроль (клетки, необработанные соединениями). А. Индукция апоптоза в клетках Hep G2. Б. – В клетках HeLa. Приведены средние значения ± отклонение от среднего, * – достоверность различий относительно контроля (p0,05), # – достоверность различий относительно БК (III) (p0,05).
Как видно из данных рис. 4 и 5, действие бетулиновой кислоты, производных бетулина и бетулоновой кислоты на клетки приводило к развитию апоптоза, эффективность индукции которого зависела от структуры соединения, продолжительности инкубации и типа клеток.
Апоптозиндуцирующая способность сукцинатов бетулина (Ia,б) (АИ составил не более 12%) была на уровне активности бетулиновой кислоты (на клетках MT-4, MOLT-4 и HeLa). Апоптозиндуцирующая активность амидов и пептида бетулоновой кислоты (IVa-г) оказалась выше активности бетулиновой кислоты (III) (АИ был в диапазоне 10-55%), а также бетулоновой кислоты (IV) на клетках MT-4, MOLT-4, CEM и HeLa. Хотя, в клетках СЕМ АИ достигал 25 ± 2% на 72 ч инкубации, что сопоставимо с апоптозиндуцирующей активностью амидов (IVa, IVв) и дипептида (IVг) бетулоновой кислоты на этих клетках, где АИ составлял 30 ± 4,3% (рис. 4В). В клетках HeLa максимальный уровень апоптоза был на 72 ч инкубации с соединением (IVa), АИ составил 23 ± 1,8% (рис. 5А). Низкий уровень апоптоза (АИ не более 10%) во всех случаях обработки экспериментальными соединениями наблюдался в клетках Нер G (рис. 5Б). Таким образом, введение амидной функции в положение C- лупановых тритерпеноидов приводит к получению эффективных индукторов апоптоза. Варьирование длины n (CH2)n - звена амидного заместителя в положении С-28 незначительно влияет на изменении апоптозиндуцирующих свойств соединений, что хорошо видно на примере производных (IVa-в) и дипептида (IVг).
Также полученные данные свидетельствуют о том, что на исследованных клеточных линиях апоптозиндуцирующая активность тритерпенов зависела от продолжительности инкубации. Процентное содержание клеток в фазе апоптоза после 72 часов инкубации клеток с экспериментальными препаратами было выше, чем при 48 часовой инкубации, что может быть связано с внутриклеточным механизмом индукции апоптоза данными соединениями. Это может свидетельствовать о том, что исследуемые соединения действуют в определенной фазе клеточного цикла и требуют более длительного воздействия в течение нескольких клеточных циклов.
Впервые апоптозиндуцирующая активность представителей высших терпеноидов выделенных из растений, с использованием культур клеток, была продемонстрирована в 1995 году (Pisha E. et al., 1995;
Qian L. et al., 1995). В дальнейшем были синтезированы и исследованы модифицированные производные природных тритерпенов лупанового ряда, которые оказались более активными индукторами апоптоза в опухолевых клетках (Sarec J. et al., 2003). Работы свидетельствуют, что модификации по 17-положению тритерпенового остова приводят к усилению апоптозиндуцирующих свойств пентациклических тритерпенов, как это было показано на клетках мышиной меланомы (линия B16 2F2) (Hata K. et al., 2002).
Таким образом, представленные данные позволяют считать, что противоопухолевое действие тритерпенов выражается в снижении клеточного роста и увеличении числа клеток, гибнущих в форме апоптоза. В связи с этим, конечно, важно выяснить, как цитотоксические эффекты реализуются в опухолевых клетках, и какие внутриклеточные механизмы вовлечены в противоопухолевые эффекты производных тритерпенов.
Исследование влияния производных тритерпенов на экспрессию гена Bcl-2 в лейкозных клетках Ранее показано, что апоптоз, индуцированный тритерпеновыми соединениями, в частности БК, в раковых клетках осуществляется независимо от «рецепторов смерти» (CD-95/Fas) и белка р53.
Одним из ведущих генов, определяющим механизм клеточной гибели, является Bcl-2. Этот ген кодирует образование антиапоптотического белка, накапливающегося в митохондриях, и проявляет онкогенный эффект, так как снижает апоптоз. В связи с этим, мы исследовали возможное влияние БК (III), бетулоновой кислоты (IV), ее амидов (IVа-в) и дипептида (IVг) на экспрессию гена апоптоза Bcl-2 в наиболее чувствительных к их апоптозиндуцирующему действию опухолевых клетках MOLT-4 и CEM. Для этой цели был применен метод мультиплексной ОТ-ПЦР. Ген -actin был использован как эндогенный внутренний стандарт, относительно которого проводилась нормализация количества продуктов амплификации мРНК Bcl-2. На рис. 6 представлены результаты мультиплексной ОТ-ПЦР гена Bcl-2 в лейкозных клетках. Видно (рис. 6А), что обработка клеток СЕМ экспериментальными соединениями (III, IV, IVа-г) приводит к уменьшению содержания мРНК Bcl-2 в этих клетках в 1,8 – 2,3 раза по сравнению с контрольными клетками СЕМ (p0,05).
Рис. 6. Данные мультиплексного ОТ-ПЦР анализа экспрессии гена Bcl-2 в лейкозных клетках СЕМ (А) и MOLT-4 (Б) в контроле (К) и опыте (в клетках, обработанных соединениями III, IV, IVа-г). М – маркер молекулярного веса ДНК. На диаграмме приведены средние значения ± отклонение от среднего (n=3), * – достоверность различий относительно контроля (p0,05).
Обработка экспериментальными соединениями (III, IV, IVа-г) клеток МОLT-4 также приводит к уменьшению содержания мРНК Вcl-2 в этих клетках в 1,6 – 2,2 раза по сравнению с контрольными клетками МОLT-4 (p0,05).
Приведенные выше результаты показывают принципиальное вовлечение Bcl-2 зависимого пути в механизмы индукции апоптоза тритерпеновыми соединениями (III, IV, IVа-г), под действием которых происходит снижение экспрессии гена Bcl-2. Эти данные согласуется с данными других исследований, которые показывают, что, в частности БК, индуцирует апоптоз в опухолевых клетках, сопровождающийся активацией каспазы 9 (Fulda S. et al., 1997;
Grunewald S. et al., 2005), которая реализуется путем инициации митохондриального (Bcl-2 зависимого) пути, но не каспазы 8, активируемой в результате осуществления каскада реакций, запускаемых взаимодействием CD95/Fas рецептора с лигандом и, таким образом, независимо от этого пути апоптоза (Jin Z. et al., 2005).
Исследование влияния производных тритерпенов на экспрессию гена Cyclin D1 в опухолевых клетках Также было определено с помощью мультиплексного ОТ-ПЦР анализа изменение экспрессии гена Cyclin D1 в клетках СЕМ, MOLT-4 контрольных линий и клеток, подвергнутых действию тритерпенов. Для исследования были выбраны наиболее активные производные тритерпенового ряда. Результаты мультиплексной ОТ-ПЦР представлены на рис. 7.
Рис. 7. Данные мультиплексного ОТ-ПЦР анализа экспрессии гена Cyclin D1 в лейкозных клетках СЕМ (А) и MOLT-4 (Б) в контроле (К) и в клетках, обработанных препаратами (III, IV, IVа-г). М – маркер молекулярного веса. На диаграмме приведены средние значения ± отклонение от среднего (n=3), * – достоверность различий относительно контроля (p0,05).
Как видно из рис. 7А, инкубирование клеток СЕМ в течение 48 ч с соединениями (IVа-г) в концентрации 10 мкг/мл приводит к уменьшению экспрессии гена Cyclin D1 в 1,6 – 2 раза по сравнению с контролем (p0,05). Как оказалось, БК (III) и бетулоновая кислота (IV) не влияли на уровень мРНК Cyclin D1 в исследуемых клетках. Подобные результаты были получены при анализе содержания мРНК Cyclin D1 клетках MOLT-4. Рис. 7Б показывает, что обработка клеток MOLT-4 соединениями (IVа-г), приводит к снижению содержания мРНК Cyclin D1 в 1,9 – 2,1 раза (p0,05) в этих клетках.
Повышенная продукция Cyclin D1 способствует инициации клеточного деления. Избыток комплексов Cyclin D1/Cdk6(4) позволяет реализоваться транскрипционным факторам пролиферации, стимулирует переход клетки из состояния G0 в фазу G1 клеточного деления и затем клетка переходит в S-фазу клеточного цикла (Williams M. E. et al., 2005). Безусловно, этот белок в высоких количествах обладает онкогенными свойствами, поскольку влияет на контроль клеточного роста, темп клеточного цикла и экспрессию генов (Sutherland R. L.
et al., 2002). С другой стороны отмечено, что ингибирование экспрессии Cyclin D1 приводит к остановке клеточного деления и выходу клетки в фазу апоптоза.
Таким образом, проведенные эксперименты наглядно свидетельствуют о том, что один из механизмов противоопухолевого действия амидов и дипептида бетулоновой кислоты в клетках лейкозов человека (CEM, MOLT-4) связан со снижением экспрессии гена Cyclin D1 в этих клетках, что также может обуславливать остановку деления клеток и выход их в фазу апоптоза.
Исследование влияния производных тритерпенов на экспрессию гена hTERT в опухолевых клетках Следующим шагом в изучении возможных механизмов противоопухолевого действия тритерпенов стало исследование влияния соединений на уровень мРНК hTERT (каталитической единицы теломеразы) в лейкозных клетках MOLT-4.
Изменение содержания мРНК hTERT было определено с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ с последующим анализом на проточном цитометре (flow-FISH). Рис. 8 показывает осуществление автоматического анализа клеток MOLT-4 в потоке.
Рис. 8. А. Точечная диаграмма клеток MOLT-4, визуализация клеток по их плотности (боковое светорассеивание, SSC) и размеру клетки (прямое светорассеивание, FSC). Б.
Гистограмма проточной цитометрии, показывающая флуоресценцию клеток региона R1 по каналу FL1. Регион М1 – интенсивность флуоресценции клеток без зонда (собственная флуоресценция или аутофлуоресценция). Регион М2 – флуоресценция клеток с зондом (GripNA/FITC) к мРНК hTERT.
Типичная точечная диаграмма отображения клеток (регион R1) показана на рис. 8А. Автоматическая количественная обработка сигналов позволила строить функции распределения клеток из исследуемой популяции регион R1 в зависимости от сигнала интенсивности флуоресценции по первому каналу FL (рис. 8Б). Рис. 9 характеризует сравнительный анализ данных, полученных с помощью метода flow FISH, относительное содержания мРНК hTERT в контрольных клетках MOLT-4 (клетки необработанные соединениями) (100%) и обработанных соединениями (III, IVа-г), процентное содержание относительно контроля.
Рис. 9. Данные flow FISH анализа содержания мРНК hTERT в лейкозных клетках MOLT-4 в контрольной линии и в клетках, обработанных соединениями (III, IVа-г). Уровень мРНК hTERT представлен в % от уровня в контроле (100%). * – достоверность различий относительно контроля (p0,05).
Видно (рис. 9), что инкубирование лейкозных клеток MOLT-4 in vitro с экспериментальными препаратами (IVб-г) в концентрации 10 мкг/мл в течение 48 ч приводило к снижению содержания мРНК hTERT на 23,5, 33 и 55% соответственно относительно контроля (р0,05). Однако, в случае действия БК (III) и амида бетулоновой кислоты (IVа) на клетки MOLT-4 не происходило снижения содержания мРНК hTERT в выбранных условиях эксперимента.
Примерно в 90% опухолевых клеток человека обнаружена активность фермента теломеразы, тогда как нормальные соматические клетки (за исключением тканей, содержащих стволовые клетки) такую активность не проявляют (Shay J. et al., 1997;
Kim N. et al., 1997). Теломераза – это РНК зависимая ДНК-полимераза или обратная транскриптаза. Ферменты этого класса, синтезирующие ДНК на РНК-матрицах, хорошо известны. Они закодированы и содержатся в ретровирусах (например, в вирусе иммунодефицита человека) и служат для синтеза ДНК-копий их геномов, который в ретровирусе представлен РНК. В клеточном геноме обратные транскриптазы закодированы в ретротранспозонах. Существует ряд гипотез, предлагающих модель эволюционной связи: от мобильных элементов к теломерным последовательностям и наоборот. Эти гипотезы основаны на высокой степени гомологии между каталитической субъединицей теломеразы (hTERT) и обратной транскриптазой ретротранспозонов (Eickbush T. et al., 1997). Интересен тот факт, что антиретровирусное действие некоторых тритерпенов, в частности анти-ВИЧ активность, связана со способностью ингибировать обратную транскриптазу вируса (Pengsuparp T. et al., 1995;
Mizushina Y. et al., 2000;
Ильина Т. В. и др., 2002). Ранее было установлено, что в клетках HL-60 при длительном культивировании в присутствии некоторых тритерпеновых соединений происходит снижение активности теломеразы, что также сопровождается ингибированием их пролиферации и апоптозом (Ji Z. N.
et al., 2004). Приведенные данные может подтверждать тот факт, что некоторые антиретровирусные препараты, например, зидовудин, механизм действия которого связан с ингибированием обратной транскриптазы вируса, могут являться эффективными ингибиторами теломеразы в опухолевых клетках (Mo Y. et al., 2003;
Brown T. et al., 2003).
Таким образом, согласно полученным нами результатам, одним из механизмов противоопухолевого действия исследуемых производных растительных тритерпенов является ингибирование экспрессии гена hTERT в лейкозных клетках in vitro. Доказано, что ингибирование экспрессии этого гена ведет к потере активности теломеразы, что, скорее всего, приведет к потере теломер и хромосомной нестабильности – а это также может индуцировать апоптоз (Herbert B. et al., 1999).
Представленные нами данные показывают перспективность дальнейшего изучения многофункциональности противоопухолевого действия высших терпеноидов с целью направленного синтеза производных с повышенной специфичностью воздействия на молекулярные мишени опухолевых клеток, влияющих одновременно на различные этапы онкогенеза.
Выводы 1. Впервые исследована цитотоксическая активность азотсодержащих производных тритерпеновых кислот – глицирретовой и бетулоновой, а также ацетооксипроизводных бетулина in vitro. Определены 50% ингибирующие дозы (ИД50) на опухолевых клетках человека МТ-4, MOLT-4, CEM, Hep G2, HeLa (5,5 – 440 мкМ). Показано, что химические трансформации бетулина, бетулиновой, глицирретовой кислоты в С- положении увеличивают их способность в 2-10 раз ингибировать рост опухолевых клеток в культуре.
2. Обнаружено апоптозиндуцирующее действие производных бетулина в опухолевых клетках в культуре. Показано, что азотсодержащие производные бетулиновой кислоты, замещенные в 17-положении тритерпенового остова, являются 2-5 раза более активными индукторами апоптоза в лейкозных клетках MT-4, MOLT-4, СЕМ, в 1,5 раза в клетках гепатокарциномы Hep G2 и 1,5-2,5 раза в клетках аденокарциномы шейки матки HeLa, чем бетулиновая кислота (р0,05).
3. Установлено, что под действием тритерпеновых соединений лупанового ряда (бетулиновой кислоты, бетулоновой кислоты, амидов бетулоновой кислоты, содержащих 7, 8, 10 метиленовых остатков и COO- концевую группу, и ее дипептида) происходит снижение содержания мРНК гена Bcl-2 в клетках MOLT-4 и СЕМ в 1,6-2,3 раза (р0,05).
4. Показано снижение содержания мРНК Cyclin D1 в клетках MOLT-4 и СЕМ в 1,6-2,1 раза (р0,05) под действием амидов бетулоновой кислоты, содержащих 7, 8, 10 метиленовых остатков и COO- концевую группу, и ее дипептида.
5. Впервые с помощью flow-FISH анализа установлено, что одним из механизмов противоопухолевого действия производных бетулоновой кислоты, модифицированных по 17-положению тритерпенового остова группой, содержащей 8 и 10 метиленовых остатков и COO- концевую группу, и дипептида, является ингибирование экспрессии гена hTERT на 23,5, 33 и 55% соответственно (р 0,05).
Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:
1. Шинтяпина А.Б., Шульц Э.Э., Петренко Н.И., Узенкова Н.В., Толстиков Г.А., Пронкина Н.В., Кожевников В.С., Покровский А.Г. Влияние азотсодержащих производных растительных тритерпенов – бетулина и глицирретовой кислоты на рост опухолевых клеток MT-4, MOLT-4, CEM и Hep G2 // Биоорг. химия. 2007. – Т. 33. – № 6. – С. 624-628.
2. Shintyapina A.B., Pokrovsky A.G., Schults E.E., Tolstikov G.A. In vitro antitumor effect and mechanism of action of new triterpene derivatives // Abstract book of «International Symposium on Advances in Synthetic and Medicinal Chemistry ASMC 07». 2007. P. 54.
3. Шинтяпина А.Б., Покровский А.Г., Борисов В.И., Пронкина Н.В., Кожевников В.С., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Исследование механизмов противоопухолевого действия производных бетулиновой кислоты in vitro // Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье. 2005. Т. 9. № 2. С. 87.
/ Тезисы XVI международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, 2007.
4. Покровский А.Г., Шинтяпина А.Б., Пронкина Н.В., Кожевников В.С., Плясунова О.А., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Индукция апоптоза производными бетулиновой кислоты в опухолевых клетках человека in vitro // ДАН. Раздел биофизика, биохимия, молекулярная биология. 2006. – Т. 407.
– № 5. – С. 698-701.
5. Shintyapina A.B. Induction of apoptosis by new derivatives of betulinic acid in human tumor cells MT-4, MOLT-4, CEM and Hep G2 //
Abstract
book of VIII International Symposium «Biology of Disease – A Molecular Battlefield». 2006.
P. 75. / VIII International EMBL Symposium «Biology of Disease – A Molecular Battlefield», Heidelberg, Germany, 2006.
6. Шинтяпина А.Б., Покровский А.Г., Пронкина Н.В., Петренко Н.И., Узенкова Н.В, Шульц Э.Э. Цитотоксическое и апоптозиндуцирующее действие новых производных бетулиновой кислоты в лейкозных клетках человека in vitro // Материалы международной школы-конференции для молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2006, C. 176-177.
7. Шинтяпина А.Б., Кожевников С.В., Шульц Э.Э., Петренко Н.И., Узенкова Н.В., Толстиков Г.А., Покровский А.Г. Апоптозиндуцирующий эффект производных бетулиновой кислоты на клетки Hep G2. // Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье. 2006. Т. 10. № 2. С. 45. / Тезисы XV-ой международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, 2006.
8. Шинтяпина А.Б., Покровский А.Г., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Индукция апоптоза бетулоновой кислотой в опухолевой линии человека // Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье. 2005. Т. 9. № 2. С. 90. / Тезисы XIV международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, 2005.
Список сокращений ДМСО - диметилсульфоксид ГК - глицирризиновая кислота БК - бетулиновая кислота ОТ - обратная транскрипция ПЦР - полимеразная цепная реакция FISH - (fluorescence in situ hybridization) флуоресцентная гибридизация in situ ФСБ - фосфатно-солевой буфер МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид ИД50 - доза, ингибирующая жизнеспособность опухолевых клеток на 50% АИ - апоптотический индекс, % Hep G2 - клетки карциномы печени человека CEM - клетки Т-клеточной лейкемии человека MT-4 - клетки Т-клеточной лейкемии человека MOLT-4 - клетки Т-лимфобластной лейкемии человека HeLa - клетки эпителиоидной карциномы шейки матки человека Благодарности Автор благодарит ближайших коллег, оказавших помощь к подготовке данной работы, и, персонально, выражает благодарность Н. С. Пронкиной, В.
И. Борисову (НИИКИ СО РАМН, Новосибирск) за помощь в освоении метода проточной цитометрии, к.б.н. О. А. Плясуновой (ГНЦ ВБ «Вектор») за моральную поддержку и дружеское участие при работе над диссертацией, заведующей лаборатории медицинской химии, д.х.н. Э. Э. Шульц (НИИОХ СО РАН, Новосибирск) за синтез соединений и ценные советы при обсуждении результатов, профессора, доктора медицинских наук, Покровского А. Г. за научное руководство работой.
Шинтяпина Александра Борисовна ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНЫХ БЕТУЛИНА И ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ В КУЛЬТУРЕ Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук.
Подписано в печать 15.04.2008. Заказ № 26.
Формат 60х90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз.
Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН