Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2н (d) и 13с, с высокими степенями изотопного обогащения.

На правах рукописи

МОСИН ОЛЕГ ВИКТОРОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО

ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ,

АМИНОКИСЛОТ И

НУКЛЕОЗИДОВ, МЕЧЕННЫХ

2Н (D) И 13С, С

ВЫСОКИМИ СТЕПЕНЯМИ

ИЗОТОПНОГО

ОБОГАЩЕНИЯ.

03.00.23-Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание

учёной степени

кандидата

химических наук

Москва -1996

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской ордена Трудового Красного Знамени Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор, член корреспондент РАМН, В. И. ШВЕЦ, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Д. А. СКЛАДНЕВ.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Н. Ф. МЯСОЕДОВ.

кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Б.

М. ПОЛАНУЕР.

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ "ГОСНИИСИНТЕЗБЕЛОК".

Защита диссертации состоялась 24 мая 1996 г в 15.00 на заседании Диссертационного совета Д 063. 41. 01 в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 1S7571, Москва, пр-т Вернадского, дом 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу:

119831, Москва, ул. Малая Пироговская, дом 1.

Автореферат разослан. апреля 1996 г Учёный секретарь Диссертационного Совета, Кандидат химических наук, старший научный сотрудник А. И.

ЛЮТИК

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность работы. В настоящее время во всем мире растет интерес к природным соединениям, меченным стабильными изотопами, в частности дейтерием 2Н (D) и углеродом С, которые незаменимы для разнопрофильных биомедицинских и диагностических целей, структурно функциональных исследований, а также для изучения клеточного метаболизма разнообразных биологически активных соединений (БАС) с использованием стабильных изотопов.

Тенденции к применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной и лазерной спектроскопией, масс-спектрометрией. Развитие этих современных методов за последние годы позволило усовершенствовать проведение многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне. Зачастую для данных исследований необходимо, чтобы молекулы синтезируемых БАС имели как можно более высокие степени изотопного обогащения.

Именно поэтому разработка путей биосинтетического получения БАС с высокими степенями изотопного обогащения является очень актуальной задачей для современной биотехнологии и отечественной микробиологической промышленности. С развитием новых биотехнологических подходов в последнее время появилась возможность получать разнообразные стабильно меченные соединения за счёт биологической конверсии сравнительно дешёвых дейтерированных субстратов дейтерометанола и тяжёлой воды CD3OD/D2O в генетически сконструированных штаммах бактерий (О.В.

Мосин, Д.А. Складнев). Однако опробированные в лабораторных условиях процессы редко применяются в биотехнологии из-за наличия ряда трудностей, связанных с клеточной адаптацией к тяжёлой воде (D2O).

Явление адаптации к тяжёлой воде интересно не только с научной точки зрения, но оно также позволяет получать уникальный биологический материал, очень удобный для решения задач молекулярной организации клетки с помощью метода ЯМР-спектроскопии.

Вышеперечисленные данные послужили основой для выбора объектов исследования в наших экспериментах.

Ими являлись генетически маркированные штаммы продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, относящиеся к различным таксономическим родам микроорганизмов: факультативные метилотрофные бактерии Brevibacterium meihylicurn, облигатные метилотрофные бактерии Methylobactllusflagettatum, галофильные бактерии Halobacterium halobium и бациллы Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens.

Настоящая работа выполнена на кафедре биотехнологии МГАТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках научно-технической программы "Наукоёмкие химические технологии ".

Целью данной работы была разработка методов биотехнологического получения молекул аминокислот, белков и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода С с высокими степенями изотопного обогащения.

Поскольку биосинтетический потенциал исследуемых штаммов за счёт конверсии тяжёлой воды к началу проведения данной работы был изучен недостаточно, в рамках работы представляло интерес исследование принципиальной возможности их адаптации к росту на средах содержащих тяжёлую воду для синтеза меченных целевых продуктов. Для этого были разработаны специальные биотехнологические подходы по получению меченных БАС, что позволило подойти к реализации комплексного использования химических компонентов биомассы полученных штаммов-продуцентов и созданию новых безотходных микробиологических производств по получению изотопно-меченных молекул БАС на их основе.

Научная новизна работы заключается в следующих аспектах:

1. Предложен метод получения штаммов-продуцентов БАС, устойчивых к максимальным концентрациям тяжёлой воды в ростовой среде.

2. Показана перспективность использования суммарных химических компонентов биомассы метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, полученных в результате многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде для биосинтеза дейтерий-меченных молекул аминокислот, белков и нуклеозидов.

3. Разработаны методы получения изотопно-меченных молекул БАС, основанные на использовании высокоактивных штаммов-продуцентов, адаптированных к росту и биосинтезу на средах с высокими концентрациями тяжёлой воды. Получены с высокими выходами индивидуальные дейтерий- и углерод-меченные С аминокислоты (степени изотопного включения в молекулы составляют до 97,5% от общего количества атомов водорода в молекуле), [1,3',4',2,8-D5]-инозин (степень включения дейтерия в молекулу 62,5% от общего количества атомов водорода в молекуле) и дейтерий меченный бактериородопсин с селективным и униформным характером включения метки в молекулу.

4. Разработаны общие принципы масс спектрометрического анализа степеней изотопного обогащения мультикомпонентных смесей аминокислот при данном способе введения метки за счёт применения прямой обработки (дериватизации) культуральной жидкости и белковых гидролизатов дансилхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном.

Практическая значимость: Полученные в работе результаты могут быть использованы для создания новых безотходных производств по синтезу изотопно-меченных молекул БАС. В частности, основанных на использовании биологической конверсии дешёвых меченных низкомолекулярных субстратов в дорогостоящие клеточные БАС.

На способ получения униформно-меченного дейтерием L-Phe имеется положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче авторского свидетельства № от 17.11.1995 г на заявку № 930558240 от 15.12.1993 г. На способ получения [1,2',41,2,8-D5]-инозина оформлена заявка № 95118778 от 14.11.1995 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Подбор условий получения биомассы штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum с униформным характером обогащения клеточных БАС дейтерием. Использование гидролизатов дейтеро-биомассы данного штамма для биосинтеза дейтсрий-меченного инозина и бактериородопсина.

2. Методы получения дейтерий- и С -аминокислот, [1',3',4',2,8-D5] -инозина и бактериородопсина за счёт биологической конверсии дейтерометанола/13С метанола СDзОD/13СНзОН и тяжёлой воды D2O.

3. Метод прямой химической модификации интактных культуральных жидкостей дансиллхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном.

Применение данного метода для масс-спектрометрического анализа степеней изотопного обогащения молекул аминокислот в составе мультикомпонентных смесей при данном способе введения изотопной метки в молекулы.

Апробация. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 3-м международном конгрессе по аминокислотам, пептидам и их аналогам (Вена, август, 1993), на 4-й Всероссийской научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Екатеринбург, апрель, 1994), 6-й международной конференции по ретинальным белкам (Ляйден, июнь, 1994), 7-м международном симпозиуме по генетике промышленных штаммов микроорганизмов (Монреаль, июль, 1994), 8-м международном симпозиуме по микробному росту на C1-соединениях (Сан-Диего, август, 1995), Евроазийском симпозиуме по современным направлениям в биотехнологии (Анкара, ноябрь, 1995).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано девять печатных работ и шесть тезисов научных конференций.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов, выводов. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 15 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы и питательные среды.

Исследования проводили с генетически маркированными штаммами-продуцентами аминокислот, белков и нуклеозидов:

Штамм №l. - Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652 (leu), штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцент L-фенилаланина.

Штамм №2. - Methylobacillus flagellatum КТ (ile), штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент L-лейцина.

Штамм №3. - Bacillus subtilis (his, tyr, ade, иrа), штамм граммотрицательиых бактерий, продуцент инозина.

Штамм №4. - Bacillus amyloliquefacien ade, иrа), штамм грамм отрицательных бактерий, продуцент тимидина.

Штамм №5. - Halobacterium halobium ET 1001, пигментсодержащий штамм галофильных бактерий, способный синтезировать бактериородопсин.

В настоящей работе использовали следующие питательные среды.

1. Минимальная среда М9 (Miller J., 1976). Среду использовали для ферментации штаммов №1 и №2 и выделения отдельных колоний.

2. Комплексная ферментационная среда (ФМ-среда) (Казаринова Л.А, 1980). Среду использовали для ферментации штаммов №3 и №4.

3. Синтетическая среда TS (Gibson Т., 1962).

Среду использовали для ферментации штамма №5.

Условия адаптации и культивирования бактерий на дейтерий-содержащих средах.

Адаптацию клеток к дейтерию проводили на твёрдых агаризованных средах (2 %-ный агар), с тяжелой водой.

При этом использовали как простой рассев культур до отдельных колоний на средах, приготовленных из 99, ат.% тяжёлой воды, так и многостадийную адаптацию бактерий на средах, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды.

Для биосинтеза меченных БАС использовали среды тех же составов, приготовленные на основе тяжёлой воды и дейтерометанола D2О/СDзОD с использованием безводных реагентов. Полученную таким образом биомассу В. mehylicum гидролизовали в DCI и использовали в качестве источника суммарных химических компонентов для культивирования штаммов №3 и № соответственно.

С-аминокислоты были получены за счёт конверсии СНзОН в метилотрофных бактериях.

Для введения дейтерия в молекулу бактериородопсина использовали селективную синтетическую среду TS, в которой ароматические аминокислоты -L-Phe, L-Tyr и L-Тгр были замещены их дейтерированными аналогами - L-[2,3,4,5,6-Ds]-Phe, L-[3,5 D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D3]-Trp.

Методы выделения и анализа изотопно-меченых БАС.

Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ метанол (2:1) по методу Блайера и Дайера (Bligh E.G.. Dyer W.J, 1959).

Определение содержания глюкозы в культуральной жидкости проводили глюкозооксидазным методом (Beyrich Т., 1965).

Бактериородопсин выделяли из пурпурных мембран Н.

halobium ET 1001 по методу Остерхельда и Стохениуса (Oesterhdt О., & Stohenius, 1976).

Гидролиз белка проводили с использованием 4 н. Ва(ОН):

и 6 н. DC1 ( в D2 О)(110°С,24ч).

Бензилоксикарбонильные производные аминокислот получали в ходе реакции Шоттена-Баумана (GreensteinJ., Winitz M., 1961).

Дансильные производные аминокислот получали по методу Греема и Хартли (GreemB., Hartly В, 1963).

Метиловые эфиры дансил-аминокислот получали по методу Физера (Fiser J., 1963).

Аналитическое и препаративное разделение бензилоксикарбонильных производных аминокислот проводили методом обращённо-фазовой ВЭЖХ, разработанным Егоровой Т. А. (Егорова Т.А., 1993).

Разделение метиловых эфиров дансил-аминокислот проводили на жидкостном хроматографе "Кпаиег" (ФРГ), снабженным УФ-детектором "2563" и интегратором "C-R ЗА" (Shirnadzu, Япония). Неподвижная фаза: Separon SGX С 18,1 мкм, 150 х 3,3 мм (Kova, Чехословакия).

Использовали градиентное элюирование растворителями:

(А) - ацетонитрил-трифторуксусная кислота (20 об/об) и (В) - ацетонитрил (от 20% В до 100% В в течение 30 мин, при 100% В в течение 5 мин, от 100% В до 20% В в течение 2 мин, при 20% В в течение 10 мин), Ионнообменную хроматографию проводили па приборе "Biotronic LC 500!" (ФРГ), 230x3,2 мм, рабочее давление 50-60 атм, скорость подачи буфера 18,5 мл/ч, нингидрина 9,25 мл/ч, детекция при 570 нм и 440 нм.

Масс-спектры электронного удара получены на приборе "МВ-80А " (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ. Масс-спектры FAB были получены на приборе " MBA " (Hitachi, Япония) при ионном токе 0,6-0,8 мА.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ БАС, АДАПТИРОВАННЫХ К РОСТУ И БИОСИНТЕЗУ НА СРЕДАХ С МАКСИМАЛЬНЫМИ КОНЦЕНТРАЦИЯМИ ТЯЖЁЛОЙ ВОДЫ.

Адаптация облигатных метилотрофных бактерий М.

flagellatum. В связи с важностью препаративного аспекта получения дейтерий-меченных соединений в рамках данной работы была изучена возможность адаптации различных штаммов-продуцентов БАС к росту на средах с максимальными концентрациями тяжелой воды (D2O). Для этого были проверены представители различных таксономических групп метилотрофных бактерий, имеющихся в коллекции ГосНИИ Генетики: L-лейцин продуцирующий штамм облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum (ileu), реализующий 2-кего-3 дезокси-6-фосфогдюконат-альдолазный (КДФГ) вариант рибулё'зо-5- монофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции углерода и L-фенилаланин-продуцирующий штамм факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum (leu), ассимилирующий метанол по РМФ- циклу.

Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации тяжёлой воды в ростовых средах, так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к тяжёлой воде будет оказывать благоприятный эффект на скорость роста культуры. При этом штамм М. flagellatum обнаружил повышенную чувствительность к тяжёлой воде: ингибирование роста бактерий наблюдалось при концентрациях D 2 О в среде 74,5 об.%. Роста бактерий на более высокой концентрации тяжёлой воды достичь не удалось. В связи с этим, в экспериментах по изучению уровней включения дейтерия в аминокислоты использовали препараты культуральной жидкости и биомассы М. flagellatum, полученные со среды, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Концентрация экзогенного дейтерометанола CD3OD составляла, как обычно, 1 об.%.

Адаптация факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum. Попытки адаптировать штамм В.

methylicum к росту при сохранении способности к биосинтезу L-фенилаланина на максимально дейтерированной среде привели к желаемому результату.

К данному штамму метилотрофных бактерий был применён специально разработанный нами подход по адаптации, который заключался в серии из пяти адаптационных пассажей исходной культуры на агаризованных средах (с добавкой 2 об. % дейтерометанолом CD3OD) при ступенчатом увеличении концентраций экзогенной тяжёлой воды (от 0;

24,5;

49,0;

73,5 об% до 98 об% D 2 O) и последующей селекции устойчивых к тяжёлой воде клонов бактерий. При этом последовательно отбирали отдельные колонии, выросшие на средах, содержащих тяжёлую воду. Затем их пересевали на среды с большей степенью дейтерированпости, включая среду с 98 об.% тяжёлой водой (степень выживаемости бактерий на конечной полностью дейтерированной среде составляет не более 40%).

Полученный результат в опытах по адаптации В.

methylicum к тяжёлой воде, позволил использовать гидролизаты его биомассы, а также саму биомассу, полученную в ходе многоступенчатой адаптации к D2O в качестве полноценных ростовых субстратов для выращивания бациллярных штаммов В. subtillis и В.

amytoliquefaciens, а также штамма галофильных бактерий Н. halobium ET1001.

Адаптация бацилл В. subtittis и В. amyloliqucfaciens. В следующих опытах была исследована способность к росту на тяжёлой воде бациллярных штаммов В. subtillis (his, tyr, ade, иrа), и В. amyloliquefaciens (ade, иrа), продуцентов инозина и тимидина, соответственно. Мы предположили, что замедление роста бактерий на минимальных средах, содержащих тяжёлую воду могло быть обусловлено появлением ауксотрофности по отдельным ростовым факторам. Чтобы проверить это предположение, в дальнейшем мы использовали комплексные среды. Как и предполагалось, обе культуры удалось адаптировать к дейтерию путём рассева на твёрдые среды, приготовленные из 99,9 ат.% тяжёлой воды. Они сразу обнаружили нормальный рост на тяжёлой воде. У штаммов В. subtilis и В. amyloliquefaciens при росте на тяжёлой воде было отмечено сохранение высокого уровня продукции по инозину и тимидину (3,9 и 3,0 г/л соответственно).

Адаптация галофильных бактерий Н. halobium ET 1001. В случае с Н. halobium ET 1001 адаптацию проводили как на агаре, содержащим 99,9 ат.% тяжёлую воду путём рассева штамма до отдельных колоний, так и на жидкой среде с тяжёлой водой. В обычных для этой бактерии условиях культивирования (37°С, на свету) в клетках синтезировался фиолетовый пигмент по всем характеристикам не отличающийся от нативного бактериородопсина.

2. ИЗУЧЕНИЕ РОСТА И БИОСИНТЕЗА БАС ПОЛУЧЕННЫМИ ШТАММАМИ Изучение ростовых характеристик М. flagellatum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O, а также СНзОН.

Данные по росту штамма М. flagellatum на минимальных средах с добавкой 1 об.% метанола СНзОН и его меченных аналогов (СDзOD/ 13 СНзОН) и содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды приведены в таблице 1.

Таблица 1. Влияние изотопного состава среды на рост штамма M.flagelaum.

Номер Компоненты среды, об% Величина Выход Время опыта лаг-фазы биомассы генерации Н2О D2O СНзОН СDзОD 99,0часы 0 %1,0 ч 1 0 0 100 1, 2 99,0 0 0,5 0,5 0,2 91,0 0, 3 99,0 0 0 1,0 0,8 81,0 1, 4 49,5 49,5 1,0 0 2,4 76,0 1, 5 49,5 49,5 0,5 0,5 5,7 75,0 1, 6 49,5 49,5 0 1,0 6,7 70,0 1, 7 24,5 74,5 1,0 0 5,6 29,0 1, 8 99,0 0 1,0 0 0,1 72,0 1, 13СНз ОН Как видно из таблицы 1, на средах, содержащих тяжёлую воду и изотопные аналоги метанола – дейтеро метанол CD3OD и 13С-метанол CH3OH, выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с 74,5 об.% тяжёлой водой выход биомассы составил 29%, что в 3,4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали обычную воду и метанол СНзОН (табл. 1, опыты 1,3,8). Как видно, способность к росту у М. flagellatum сохранялась лишь в среде, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Выше этой концентрации наблюдалось ингибирование скорости роста бактерий.

Как и следует из литературных данных (Складнее Д.

А, 1990), введение стабильного изотопа углерода С не приводит к летальным последствиям для клетки, что мы и наблюдали в случае с М. flagellatum. В целом, полученные для М. flagellatum данные могут свидетельствовать о том, что адаптация к тяжёлой воде определяется как видовой специфичностью метилотрофных бактерий, так и особенностями их метаболизма. Кроме этого, из таблицы следует, что данный подход можно эффективно использовать для введения в молекулы синтезируемых БАС двойной изотопной метки (дейтерий- и изотоп углерода C).

Изучение ростовых и биосинтетических характеристик B. methylicum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O.

Данные по росту исходного и адаптированного к тяжёлой воде штамма В. methylicum и максимальному уровню накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости на минимальных средах с добавкой 2 об.% метанола и его дейтерированного аналога СН3OН/CD3OD, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды, представлены в таблице 2.

Как видно из табл. 2, в отсутствии дейтерий-меченных субстратов продолжительность лаг-фазы не превышала ч (см. табл. 2, опыт 1). С увеличением концентрации тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64,4 ч на средах с 98 об.% тяжелой водой и 2 об.% CD3OD (табл. 2, опыт 10). Отмечено, что длительность времени клеточной генерации с увеличением степени изотопного насыщения среды дейтерием постепенно увеличивается, достигая 4,9 часов на максимально дейтерированной среде (табл. 2, опыт 10).

Таблица 2.

Влияние изотопного состава среды на рост штамма В.

mehylicum и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости*.

Номер Компоненты среды, об% лаг-фаза Выход Время Выход опыта биомассы генер. L-Phe, Н2 О D2 O СH3ОН CD3OD ч 98 % 0 2ч 0 % 24, 1 100 2,2 2 98 0 0 2 30,3 92,3 2,4 99, 3 73,5 24,5 2 0 32,1 90,6 2,4 96, 4 73,5 24,5 0 2 34,7 85,9 2,6 97, 5 49,0 49,0 2 0 40,5 70,1 3,0 98, 6 49,0 49,0 0 2 44,2 60,5 3,2 98, 7 24,5 73,5 2 0 45,8 56,4 3,5 90, 8 24,5 73,5 0 2 49,0 47,2 3,8 87, 9 0 98,0 2 0 60,5 32,9 4,4 79, 10 0 98,0 0 2 64,4 30,1 4,9 71, 10' 0 98,0 0 2 39,9 87,2 2,9 95, 'Данные (1-10) приведены для В. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия.

Данные 10' приведены для адаптированного В. methylicum.

Как видно из табл. 2, опыт 2, дейтерометанол CD 3 OD не вызывал существенного ингибирования роста и не оказывал влияния на выход микробной биомассы, в то время как на средах с 98 об.% тяжёлой водой микробный рост подавлялся. Так, на среде, содержащей 98 об.% тяжёлой воды и 2 об.% дейтерометанола СDзОD, выход микробной биомассы был снижен в 3, раза no-сравнению с контролем. Важно то, что выход микробной биомассы и уровень накопления L фенилаланина в культуральной жидкости при росте адаптированного к тяжёлой воде штамма В. inethylicum в полностью дейтерированной среде изменяются по сравнению с контрольными условиями на 12,8% и 5% соответственно (табл. 2, опыт 10').

За счёт использования данного штамма В. methylicum удалось выделить порядка 1 г L-Phe из 1 л среды.

Исследование биосинтеза L-фенилаланина штаммом В. methylicum.

Общей особенностью биосинтеза L-Phe в протонированных средах было значительное увеличение его продукции на ранней фазе экспоненциального роста В.

inethylicum, когда выход микробной биомассы был незначителен (рис. 1).

Рис. 1. Динамики роста В. methylicum (la, 10'а, 10а) и накопления L-Phe в культуральной жидкости (16, 10'б, 106) на средах с различным изотопным составом: 1 а,б - исходный микроорганизм на протоннрованной среде М9;

10' а,б -адаптированный В. methylicum на полностью дейтерированной среде;

10 а,б - еадаптированный микроорганизм на полностью дейтерированной среде.

Во всех изотопных экспериментах наблюдалось ингибирование биосинтеза L-фенилаланина на поздней фазе экспоненциального роста и снижение его концентрации в ростовых средах. Согласно данным по микроскопическому исследованию растущей популяции микроорганизмов, наблюдаемый характер динамики секреции L-Phe не коррелировал с качественными изменениями ростовых характеристик культуры на различных стадиях роста, что служило подтверждением морфологической однородности микробной популяции.

Скорее всего, накопленный в процессе роста фенилаланин ингибировал ферменты собственного пути биосинтеза.

Кроме того, мы не исключаем возможность, что при ферментации без рН-статирования может происходить обратное превращение экзогенного фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза, что отмечено в работах других авторов (Ворошилова Э. Б., Гусятипер М. М., 1989). Данные по исследованию культуральной жидкости методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) показали, что кроме L фенилаланина данный штамм В. methylicum синтезирует и накапливает в культуральной жидкости другие метаболически-связанные аминокислоты (аланин, валин, лейцин, изолейцин), четко детектируемые масс спектрометрическим анализом (см. след, главу).

Изучение качественного и количественного состава внутриклеточных сахаров В. subtilis.

В ходе выполнения работы был изучен качественный и количественный состав внутриклеточных сахаров при росте В. subtilis на среде с 99,9 ат.% тяжёлой воды (см.

табл. 3).

Таблица 3.

Качественный и количественный состав внутриклеточных Сахаров В. subtilis при росте на 99,9 %тяжёлой воде.

Компонент Содержание в биомассе, % Рост на Н 2О Рост на 99,9% D2O Глюкоза 20,01 21, Фруктоза 6,12 6, Рамноза 2,91 3, арабиноза 3,26 3, мальтоза 15,30 11, сахароза 8,62 Как видно из таблицы 3, в гидролизатах биомассы данного штамма фиксируются глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза, сахароза и мальтоза. Содержание внутриклеточных сахаров при росте на тяжёлой воде меняется незначительно, за исключением лишь сахарозы, которая в дейтерированном образце не детектируется.

Изучение аминокислотного состава биомассы метилотрофных бактерий В. methylicum.

Аминокислотный состав суммарных белков биомассы В. methylicum, полученного в ходе многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде показан в таблице 4.

Результаты исследования показали небольшое снижение содержания в дейтерированном белке Ala, Leu и Нis по сравнению с белком, полученным на обычной воде, что может быть объяснено метаболическим воздействием тяжёлой воды на биосинтез (табл. 4).

Таблица 4.

Качественный и количественный состав аминокислот общих белков биомассы В. methylicum.

Аминокислота Содержание в белке, % Рост на Н2О Рост на 98% D2O Gly 8,03 9, Ala 12,95 13, Val 3,54 3, Leu 8,62 7, His 4,14 3, Phe 3,88 3, Tyr 1,56 1, Asp 7,88 9, Glu 11,68 10, Lys 4,37 3, His 3,43 3, Thr 4,81 5, Met 4,94 2, Arg 4,67 5, Изучение ростовых и биосинтетических характеристик В. subtilis на средах, содержащих тяжёлую воду и гидролизаты метилотрофных бактерий.

Графики, отражающие динамику роста, ассимиляции глюкозы и накопление инозина в культуральной жидкости штаммом В. subtilis в условиях протонированной среды и среды, с 99,9 ат.% тяжёлой воды представлены на рис. 2.

Как видно из рис. 2, при переносе клеток со стандартной на дейтерированную среду выход микробной биомассы, продолжительность лаг-фазы и длительность времени клеточной генерации в целом изменяются незначительно. При росте исходного штамма В. subtilis па среде, содержащей обычную воду уровень накопления инозина в культуральной жидкости достигал величины 17,3 г/л после пяти суток культивирования (рис.

2).

Рис.2. Динамики роста B.subtilis (1a, 2a), конверсии глюкозы (1б,2б) и накопления инозина в культуральной жидкости (1в,2в) на средах с различным изотопным составом: 1 а,б,в-B.

Subtilis на обычной протонированной среде;

2 а,б,в-B.subtilis на полностью дейтерированной среде с гидролизатом дейтеро-биомассы метилотрофных бактерий.

Уровень накопления инозина на дейтерированной среде был снижен в 4,4 раза по-сравнению с исходным штаммом на протонированной среде (рис. 2). Низкие уровни секреции инозина на дейтерированной среде коррелируют со степенью конверсии глюкозы в этих условиях. Так, кривая конверсии глюкозы на полностью дейтерированной среде имела меньший угол наклона, чем на среде с обычной водой, что свидетельствует о том, что при росте на дейтерированной среде скорость ассимилиляции глюкозы несколько замедляется (рис. 2).

Полученные для исследуемых микроорганизмов данные, в целом, подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация клетки к тяжёлой воде является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные к тяжёлой воде клетки возвращаются к нормальному росту и биосинтезу в протонированных средах после некоторого лаг-периода. В то же время обратимость роста на D2O/H2O-cpeдax теоретически не исключает возможности того, что этот признак стабильно сохраняется при росте в тяжёлой воде, но маскируется при переносе клеток на дейтерированную среду. Можно предположить, что клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют функциональной реорганизации работы ферментных систем в тяжёлой воде. Также не исключено, что наблюдаемые при адаптации эффекты связаны с образованием в тяжёлой воде более прочных и стабильных связей, чем связей с участием водорода. По теории абсолютных скоростей разрыв С-H-связей может происходить быстрее, чем C-D-связей, подвижность дейтерия D+ меньше, чем подвижность протия Н +, константа ионизации D2O в 5 раз меньше константы ионизации Н2О (Crespy J., Kalz H.H., 1979). С точки зрения физиологии, наиболее чувствительными к замене протия на дейтерий могут оказаться аппарат биосинтеза макромолекул и дыхательная цепь, т. е. именно те клеточные системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва водородных связей.

3. ИЗУЧЕНИЕ СТЕПЕНЕЙ ВКЛЮЧЕНИЯ ИЗОТОПОВ ДЕЙТЕРИЯ и УГЛЕРОДА 13С в МОЛЕКУЛЫ ЭКЗОГЕННЫХ АМИНОКИСЛОТ B. methylicum и М.

flagellatum.

Получение лиофилизованных препаратов культуральных жидкостей, содержащих экзогенные дейтерий - и 13С аминокислоты.

Дейтерий-меченные аминокислоты были выделены в составе препаратов лиофилизованных интактных культуральных жидкостей, свободных от белков и полисахаридов, при росте штамма В. methylicum на минимальных средах с добавкой 2 об% метанола СНзОН и с различным содержанием тяжёлой воды. |3С-аминокислоты были получены за счет культивирования штамма М, flagellatum на среде, содержащей обычную воду и 1 об% 13С-метанол СНзОН. Данные по степеням включения | дейтерия и С в молекулы экзогенных аминокислот двух исследуемых штаммов приведены в таблице 5. Во всех анализируемых образцах культуральной жидкости независимо от рода штаммов методом масс спектрометрии электронного удара были обнаружены аланин, валин, лейцин/изолейцин и фенилаланин (табл.

5). В масс-спектрах дериватизованной культуральпой жидкости M. flagellatwn в дополнение к вышеобозначенным аминокислотам также фиксировался глицин.

Получение метиловых эфиров дансил-и карбобензокси-проазводных аминокислот.

Степени включения изотопов дейтерия и изотопа углерода С в мультикомпонептные смеси аминокислот в составе культуральной жидкости и белковых гидролизатов определяли методом высокочувствительной масс спектромстрии электронного удара метиловых эфиров Dns-аминокислот или в виде Z-производных аминокислот после их препаративного разделения методом обращённо фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии ОФ ВЭЖХ.

Аналитическое и препаративное разделение Z производных аминокислот проводили методом ОФ ВЭЖХ, разработанным Егоровой Т. А. (Егорова Т. А., 1993).

Степени хроматографической чистоты выделенных из культуральных жидкостей В. methylicwn и М. flagellatum 2-й Dns-производных дейтерий- и С-аминокислот составили 93-95%, а выходы 65-87% соответственно.

Предложенная нами модификация метода получения производных аминокислот заключалась в прямой химической обработке препаратов культуральной жидкости, полученной после отделения клеток, DnsCI (и ZCI) и CN2H2. Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении DnsCl (ZCI) -аминокислота, равным 5:1 (см. схему ниже). Для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с моно-производными было характерно образование ди-Z-(Dns)-производных: ди-Z,(Dns)-лизина, ди-Z,(Dns) гистидина, О,N-ди-Z,(Dns5)-тирозина, О,N-ди-Z,(Dns) серииа, O,N-AH-Z,(Dns)-Tpeoнина и N,S-ди-Z,(Dns) цистеина (на схеме эти произодные не показаны). Кроме этого, из аргинина синтезировался три-Z,(Dns)-аргинин.

Летучесть Dns-и Z-производных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе повышали за счет дополнительной дериватизации по карбоксильной группе (этерификации) диазометаном. Выбор диазометана в качестве этерифицирующего реагента был связан с необходимостью проведения реакции в мягких условиях, исключающих обратный изотопный (H-D-обмен в ароматических аминокислотах. При использовании диазометана происходило дополнительное N-метилирование по a-NH2гpynne аминокислот, в результате чего в масс спектрах метиловых производных аминокислот фиксировались дополнительные пики, соответствующие соединениям с молекулярной массой на 14 массовых единиц больше исходных.

Исследование степеней включения дейтерия в молекулу L-фенилаланина В. methylicum, полученного со сред с тяжёлой водой.

Как видно из данных таблицы 2, рост данного штамма метилотрофных бактерий на средах с возрастающими концентрациями тяжёлой воды сопровождался снижением уровней накопления клеточной биомассы, увеличением времени генерации бактерий и продолжительности лаг фазы при сохранении способности синтезировать и накапливать L-фенилаланин в ростовой среде. Поэтому было интересно изучить, как изменяются степени включения дейтерия в молекулу L-фенилаланина и других аминокислот В. methylicum в этих условиях.

Во всех опытах наблюдалось специфичное возрастание уровней изотопного включения дейтерия в молекулы аминокислот при ступенчатом увеличении концентраций тяжёлой воды в ростовой среде (табл. 5).

Так, для индивидуальных аминокислот культуральной жидкости В. melhylicum, количество включённых атомов дейтерия по скелету молекул варьирует в пределах 49% ной концентрации D2O и составляет для Phe 27,5%, Ala 37,5%, Val - 46,3%, Leu/Ile - 47% (табл. 5). Аналогичное увеличение молекулярной массы аминокислот в зависимости от концентрации тяжёлой воды в среде было зафиксировано во всех экспериментах.

Таблица 5.

Степени включения дейтерия- и изотопа углерода 13С в молекулы секретируемых аминокислот В. melhylicum* и M. flagellation**.

Аминокисл СН3ОН Содержание :Н2О в оты среде, об% 24,5 49,0 1% 73,5 98,0 Gly - • - 60, Ala 24,0 37,5 62,5 77,5 35, Val 20,0 46,3 43,8 58,8 50, Leu/Ile 15,0 47,0 46,0 51,0 38, Phe 15,0 27,5 51,3 75,0 95, * Данные по включению дейтерия в аминокислоты приведены для В. methyticum при росте на средах, содержащих 2 об.% СН3ОН и 24,5;

49,5;

73,5;

98,0 об.% D2O. "Данные по включению 13С приведены для М.

flagellatum при росте на среде, содержащей 1 об.% СН3ОН и 99 об.% Н2О.

Исследование степеней включения дейтерия в сопутствующие аминокислоты В. meihylicum на средах с тяжёлой водой.

В масс-спектрах всех исследуемых образцов культуральной жидкости Б. melhylicum кроме основной секретируемой аминокислоты (фенилаланин) были обнаружены примеси, метаболически с ней связанных аланина, валина и лейцина/изолейцина {на уровне 3- мМ). В опыте, где концентрация тяжёлой воды в среде составила 49 об.% (таблица 5, опыт 5), изотопный состав фснилаланина характеризовался увеличением молекулярной массы на 4,1 единицу, аланина на 2, единицы, валина - 3,5 единицы, а лейцина/изолейцина на 4,6 единиц. Таким образом, в отличии от фенилаланина, количество включенного дейтерия в последних трех аминокислотах сохраняет стабильное постоянство в довольно широком интервале концентраций экзогенной тяжёлой воды (от 49 об.% до об.%).

В связи с тем, что штамм - продуцент фенилаланина В.

methylicum был ауксотрофом по лейцину, эту аминокислоту в немеченном виде добавляли в ростовую среду, содержащую 98 об.% тяжёлой воды. Как показали наши исследования по включению дейтерия к молекулы экзогенных аминокислот, в условиях ауксотрофности по лейцину степень изотопного обогащения лейцина, а также метаболически связанных с ним аминокислот немного ниже, чем для других аминокислот. Так, при росте В.

methylicum на среде, содержащей 98 об.% тяжёлой воды и немеченный L-Leu, степени включения дейтерия в Leu составили 51,0%, Ala -77,5%, Val - 58,8% (табл. 5).

Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о сохранении минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом лейцина de novo. Другим логическим объяснением наблюдаемого эффекта может быть ассимиляция клеткой немеченного лейцина из среды на фоне биосинтеза меченного изолейцина de novo.

Исследование степеней включения дейтерия в L Phe В. methylicum в максимально дейтерированной среде.

Мы предположили, что за счёт ауксотрофности штамма В. methylicum по лейцину, уровни включения дейтерия в секретируемыи фенилаланин на фоне максимальных концентраций тяжёлой воды могут быть ниже теоретически допустимых вследствие функционирования в клетке ряда биохимических реакций, связанных с ассимиляцией протонированного лейцина извне. Как мы и ожидали, отмеченная особенность лучше всего проявлялась при биосинтезе фенилаланина на дейтерированной среде, в которой единственным протонированным соединением, кроме метанола, являлся лейцин (см. табл. 5, опыт 9). В этом опыте степень дейтерированности L-фенилаланина составила 75%, т.е.

только шесть атомов (из восьми в углеродном скелете) в молекуле фенилаланина биосинтетически замещены на дейтерий. С огласно данны м м асс- спектрометрического анализа, атомы дейтерия распределены по положениям С1-С ароматической части фенилаланина и сопредельному положению, причем, как миниум четыре из них могут быть локализованы в самом бензольном кольце молекулы фенилаланина. Результат по получению L-Phe с данным характером включения метки очень важен для биотехнологического использования и имеет существенные преимущества по-сравнению с химическим (Н-D)-обменом (Griffiths D. V., 1986).

Исследование степени включения дейтерия в молекулу фенилаланина за счёт конверсии дейтерометанола CD3OD в В. methylicum.

Контроль за включением дейтерия в молекулу L-Phe за счет конверсии дейтерометанола CD3OD при росте бактерий на среде, содержащей обычную воду и 2 об.% дейтерометанол CD3OD (соответствуют опыту 2, табл. 1) показал незначительное количество дейтерия, которое поступает в молекулу L-фенилаланина вместе с углеродом CD3OD, Процент дейтерирования фенилаланина был вычислен по величине пика с m/z 413 за вычетом вклада пика примеси природного изотопа (не более 4%).

Полученный результат может быть объяснён разбавлением дейтериевой метки за счёт протекания как биохимических процессов, связанных с распадом дейтерометанола CD3OD при его ассимиляции клеткой, так и реакциями изотопного обмена и диссоциации в тяжёлой воде. Так, из четырёх атомов дейтерия, имеющихся в молекуле СDзOD, лишь один атом дейтерия при гидроксильной группе -OD самый подвижный и поэтому легко диссоциирует в водной среде с образованием СDзОН. Три оставшихся атома дейтерия в составе СDзОН входят в цикл ферментативного окисления метанола, который, в свою очередь, мог привести к потере дейтериевой метки за счёт образования соединений более окисленных, чем метанол. В частности, такое включение дейтерия в молекулу L-фенилаланина подтверждает классическую схему ферментативного окисления метанола до формальдегида в клетках метилотрофов, который лишь после этого ассимилируется у данного штамма метилотрофных бактерий РМФ-путем фиксации углерода (Nesvera J., 1991).

Исследование степеней включения изотопа углерода С в молекулы экзогенных аминокислот М. flagellatum за счёт биоконверсии 13СНзОН.

Наши исследования подтвердили, что для получения | С-аминокислот за счет микробной конверсии СНзОН 3 предварительная адаптация не является лимитирующим этапом, поскольку этот., субстрат не оказывает негативного биостатического эффекта на ростовые и биосинтетические характеристики метилотрофов. При росте М. flagellatum на среде, содержащей 99 об.% воду и 1 об.% СНзОН клетка продуцирует лейцин, a также глицин, фланин, валин и фенилаланин. Как видно из таблицы 5, уровни изотопного включения 13С в Gly, Ala, Val и Phe составляют 60, 35, 50 и 95% соответственно. При этом низкая степень включения изотопа углерода С в метаболически связанные с изолейцином аминокислоты обусловлена эффектом ауксотрофиости бактерий в изолейцине, который добавляли в ростовую среду в немеченном виде.

4. ИЗУЧЕНИЕ СТЕПЕНЕЙ ВКЛЮЧЕНИЯ ИЗОТОПОВ ДЕЙТЕРИЯ и УГЛЕРОДА 13С в АМИНОКИСЛОТНЫЕ ОСТАТКИ СУММАРНЫХ БЕЛКОВ M. methylkiim и М.flagellatum.

Выделение дейтерий- и 13С-аминокислот из белковых гидролизатов. Поскольку при работе с микробной биомассой возникают проблемы, связанные с очисткой от сопутствующих компонентов, было необходимо применять специальные подходы при выделении фракции суммарных белков из бактериальных источников.

При выделении фракции суммарных белков биомассы метилотрофных бактерий (В. methylicum, M.

flagellatum) учитывалось наличие в них углеводов. Мы использовали богатые по белку штаммы бактерий со сравнительно небольшим содержанием углеводов в них, гидролизу в качестве фракции суммарных белков подвергали остаток после исчерпывающего отделения пигментов и липидов экстракцией органическими растворителями (метанол-хлороформ-ацетон}.

Во всех случаях гидролиз белков проводили в 6 н.

растворе DC1 (3 масс.% фенола в D2O) или в 4 н. растворе Ва(ОН):для предотвращения реакций обратного изотопного обмена (H-D) в ароматических аминокислотах и их разрушения.

Дейтерий- и С-меченные аминокислоты в составе гидролизатов суммарного белка биомассы были разделены методом ОФ ВЭЖХ со степенью хроматографической чистоты 93-96% и выходами 75-89% в условиях, аналогичных таковым для разделения секретируемых аминокислот (табл. 6). Хотя в таблице приведены данные только для 10 аминокислот, очевидно, что в остальных аминокислотах уровни изотопного включения сопоставимы, хотя они не детектируются данным методом. Это предположение подтверждается данными по разделению белковых гидролизатов метилотрофных бактерий методом ионнообменной хроматографии на колонке "Biotronic LC 5001", где детектируется уже 15 аминокислот (см. рис. 4).

Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки белка В. methylicum па средах с тяжёлой водой.

Общие принципы изучения степени изотопного обогащения молекул аминокислот при данном способе введения метки продемонстрированы на примере анализа включения дейтерия в мультикомпонентные смеси аминокислот, полученные после гидролиза суммарных белков биомассы в 6 н. DCl и 4 н. Ва(ОН).

Таблица 6.

Степени включения D и 13С в аминокислотные остатки общих белков биомассы В. melhyiicum* и М. flagellatum**.

Аминокисл Содержание D2O в СНз оты среде, об% 24,5 49,5 ОН 73,5 98,0 50,0 об% Gly 15,0 35,0 90,0 90, Ala 20,0 45,0 62,5 97,5 95, Val 15,0 36,3 50,0 50,0 50, Leu/lie 10,0 42,0 45,0 49,0 49, Phe 24,5 37,5 50,0 95,0 80, Туr 20,0 48,8 68,8 92,8 53, Ser 15,0 36,7 47,6 86,6 73, Asp 20,0 36,7 60,0 66,6 33, Glu 20,0 40,0 53,4 70,0 40, Lys 10,0 21,1 40,0 58,9 54, 'Данные по включению дейтерия в аминокислоты приведены для В. melhyiicum при росте на средах, содержащих 2 об.% СН3ОН и 24,5;

49,5;

73,5;

98,0 об.% D2O. **Данные по включению 13С приведены для М.

flagellatum при росте на среде, содержащей 1 об.% СН3ОН и 99 об.% Н2О.

Во всех экспериментах по изучению содержания дейтерия в аминокислотных остатках белка наблюдалась корреляция между степенью изотопного насыщения среды и уровнями включения дейтерия в аминокислоты (табл. 6), Например, для индивидуальных аминокислот белковых гидролизатов количество включенных атомов дейтерия по скелету молекулы варьирует незначительно в пределах 49%-ной концентрации тяжёлой воды и составляет для Ala 45%, Val - 36,3%, Leu/Ile - 42%, Phe -37,5%.

Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки белка В. melhylicum на максимально дейтерированной среде.

Полученные данные свидетельствуют о возможности достижения максимальных уровней включения дейтерия в аминокислотные остатки белков за счет адаптации культуры В. melhyiicum к росту и биосинтезу на среде с максимальной концентрацией тяжёлой воды. Как видно из таблицы 6, при росте В. methylicum на среде, содержащей 98 об.% тяжёлой воды, степени включения дейтерия в остатки Gly, Ala и Phe составляют 90, 97,5 и 95%, т.е.

уровень мечения можно считать униформным. Низкие степени включения дейтерия в молекулы лейцина (49%), а также в метаболически связанных аминокислотах в этих условиях могут быть объяснены за счет ауксотрофности штамма в лейцине, который добавляли в среду культивирования в протонированной форме.

Полученный результат по разбавлению дейтериевой метки в лейцине может быть объяснён сохранением доли минорных реакций в биосинтезе лейцина de novo.

Исследование степеней включения изотопа углерода C в аминокислотные остатки белка М.

flagellatum за счёт биоконверсии СH3ОН.

В экспериментах по включению изотопа углерода 13 С в молекулы белков за счёт биоконверсии СH3ОН метилотрофными бактериями М.flagellalum была показана эффективность мечения аминокислот изотопом углерода С. Так, в Phe детектировалось 80,5 % метки, в Ala - 95 %, в Gly - 90% (см. табл. 6).

Во всех экспериментах степени включения дейтерия и изотопа углерода С в метаболически связанных аминокислотах обнаружили определённую коррелляцию.

Так, степени изотопного обогащения валина и лейцина (семейство пирувата), фенилаланина и тирозина (семейство ароматических аминокислот} совпадают (табл. 6). Степени изотопного включения глицина и серина (семейство серина), аспарагиповой кислоте и лизина (семейство аспарагина) также имеют близкие величины. Сравнивая данные таблицы 5 и 6, можно заключить, что степени изотопного обогащения экзогенных аминокислот и соответствующих аминокислотных остатков суммарного белка, в целом, также коррелируют.

Как и в случае с экзогенными аминокислотами, низкие степени включения изотопа углерода С в остатки Leu при росте на 1 об.% СНзОН обусловлены ауксотрофностью бактерий в этой аминокислоте.

Таким образом, нам удалось достичь максимальных уровней включения стабильных изотопов в суммарные белки биомассы метилотрофных бактерий. Именно поэтому мы посчитали возможным использовать гидролизаты их биомассы для биосинтеза других изотопно - меченных БАС.

5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГИДРОЛИЗАТОВ БИОМАССЫ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ В. methylkum в КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ [1',3',4',2,8-D5]-ИНОЗИНА.

Получение [1',3',4',2,8-D5]- инозина.

В следующих экспериментах было апробировано использование дейтеро-компонентов биомассы метилотрофных бактерий, полученных в условиях многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде для синтеза высокодейтерированных нуклеозидов (на примере инозина).

Для синтеза Н-меченого инозина использовали мутантный штамм грамположительных бактерий Bacillus subtilis (предварительно адаптированный к дейтерию скринингом до отдельных колоний), который из-за нарушения метаболических путей регуляции биосинтеза пуриновых рибонуклеозидов синтезирует в стандартных условиях выращивания (дрожжевая среда, поздний экспоненциальный рост, 32-340С) 17 г инозина на 1 л культуральной жидкости (КЖ). Максимальный выход инозина достигался при использовании природной протонированной среды, содержащей в качестве в качестве источников ростовых факторов и аминного азота 2% БВК дрожжей, а в качестве источника углерода и энергии глюкозу (не менее 12 мас.%).

При проведении синтеза требовалось заменить протонированные ростовые субстраты их дейтерированными аналогами, а также использовать Н2О высокого уровня изотопной чистоты. Для решения поставленной задачи использовали адаптированный к дейтерию штамм факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum с 50% уровнем биоконверсии метанола (при эффективности конверсии 15.517.3 г сух. биомассы на 1 г потребленного субстрата).

Рис. 3. Динамики роста (1а, 2а), накопления инозина (1б,2б) и ассимиляции глюкозы (1в,2в) на обычной протонированной среде (а) и на тяжёловодородной среде (б) Дейтерий-меченный инозин был получен биосинтетически за счёт использования штамма-продуцента В. subtilis и выделен из культуральной жидкости по методике, включающей адсорбцию инозина на активированном угле, десорбцию спиртово-аммиачным раствором и перекристаллизацию из метанола. ТСХ инозина, с детекцией при 249 нм показала наличие в анализируемом образце единственного пятна с Rf = 0,55, -соответствующего по подвижности чистому инозину.

Схема синтеза дейтерий-меченого инозина разрабатывалась с учетом способности метилотрофных бактерий синтезировать большое количество белка (выход 50% от веса сухого вещества), 1517% полисахаридов, 1012% липидов (в основном, фосфолипиды) и 18% зольных веществ. Гидролиз биомассы проводили автоклавированием в 0.5 н. 2НCl (в 2Н2O), чтобы обеспечить высокие выходы этих соединений и минимизировать реакции обратного (1Н-2Н) обмена в аминокислотных остатках молекул белков.

Качественный и количественный состав ароматических аминокислот метилотрофного гидролизата изучали в дейтерированной среде М9 на катионообменной колонке Biotronic LC-5001 (ФРГ) с сульфированной смолой UR-30, а уровни дейтерированности молекул масс-спектрометрией электронного удара метиловых эфиров N диметиламинонафталин-5-сульфонильных производных аминокислот.

Гидролизат представлен пятнадцатью идентифицированными аминокислотами (за исключением пролина, который детектировался при 440 нм) при выходах аминокислот, сопоставимом с потребностями штамма в источниках углерода и аминного азота. При этом индикатором, определяющим высокую эффективность включения дейтерия в синтезируемый продукт служит высокий уровень дейтерированности молекул аминокислот, который варьирует от 49% для лейцина/изолейцина до 97.5% для аланина.

Биосинтетические характеристики штамма B. subtilis снимали в протонированной дрожжевой среде с обычной водой и синтетической тяжеловодородной среде с 2Н2О и 2% Н-меченым метилотрофным гидролизатом B. methylicum (рис.

3). Отмечена корреляция в характере изменения ростовых динамик (рис. 3, 1а, 2а), выхода инозина (рис. 3, 1б, 2б) и ассимиляции глюкозы (рис. 3, 1в, 2в). Максимальный выход инозина (17 г/л) зафиксирован в опыте 1б (рис. 3, 1б) на протонированной среде при уровне ассимилируемой глюкозы 10 г/л (рис. 3, 1в). На тяжеловодородной среде выход инозина снижался в 4.4 (3.9 г/л) (рис. 3, 2б), а уровень ассимиляции глюкозы в 4 раза, о чем свидетельствует 40 г/л неассимилируемой глюкозы в КЖ (рис. 3, 2в).

Применение сложных физико-химических методов для выделения биосинтетически 2Н-меченого инозина из КЖ диктовалось необходимостью получать инозин высокой степени хроматографической чистоты. Поскольку в КЖ наряду с синтезируемым продуктом присутствуют примеси неорганических солей, белков и полисахаридов, а также сопутствующие вторичные метаболиты нуклеиновой природы (аденозин, гуанозин) и непрореагировавшие субстраты (глюкоза, аминокислоты), проводили ступенчатое фракционирование КЖ. Повышенная чувствительность инозина к кислотам и щелочам и его нестабильность при выделении диктовали использование кислотных и щелочных растворов низкой концентрации, а также по-возможности проводить выделение при низких температурах, избегая длительного перегрева реакционной смеси.

Фракционирование КЖ заключалось в низкотемпературном осаждении высокомолекулярных примесей органическими растворителями ацетоном и метанолом, твердофазной адсорбции/десорбции на поверхности активированного угля, экстрактивного извлечения продукта, перекристаллизации и ионообменной хроматографии. Белки и полисахариды удаляли низкотемператрным осаждением ацетоном при -40С, проводя последующую адсорбцию суммы рибонуклеозидов активированным углем на холоду. Десорбированные рибонуклеозиды извлекали из прореагировавшей твердой фазы элюцией этанольно-аммиачным раствором при 600С, а сам инозин экстракцией 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН 8.9) с последующей перекристаллизацией в 80% этаноле.

Окончательная стадия очистки заключалась в колоночной ионообменной хроматографии на катионообменнике AG50WX 4, уравновешенным 0.3 М NH4-формиатным буфером с 0.045 М NH4Cl с ТСХ контролем при Rf 0.5. Данные по выделению инозина из КЖ штамма-продуцента представлены в виде спектров УФ-поглощения на рис. 4, а-в.

Наличие в синтетическом образце (в) основной полосы поглощения, соответствующей нативному инозину (max нм, 249 7100 М-1 см-1) и отсутствие вторичных метаболитов и доказывает его однородность и эффективность разработанного метода выделения со степенью хроматографической чистоты 92%.

Особенности разработанного метода получения [1,3',4',2,8-D5]-инозина заключаются в следующих аспектах:

1. В способности высокоактивного штамма В. subtilis к росту и биосинтезу инозина на средах, содержащих максимальные концентрации тяжёлой воды;

2. Замене глюкозы и аминокислот, необходимых для роста этого штамма-ауксотрофа на гидролизаты дейтеро биомассы В. methylicutn. При последующих ферментациях в качестве источника ростовых факторов можно использовать ту же дсйтеро-биомассу метилотрофных бактерий, либо биомассу самого штамма-продуцента, содержащую в своем составе соединения, которые могут служить источниками углерода и ростовых факторов;

3. В практически полном отсутствии отходов: согласно схеме, дейтеро-биомасса базового штамма, после гидролиза в 6 н. DC1 возвращается в цикл в качестве ростовых факторов;

4. В высокой степени изотопного обогащения дейтерий мсченного инозина (62,5% атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий);

5. В высоких выходах (3,9 г/л) меченного продукта.

Исследование уровня дейтерированности инозина.

Уровень дейтерированности инозина исследовали методом масс-спектрометрии FAB из за высокой чувствительности, позволяющей детектировать 10-8-10-10 моль вещества в пробе, что существенно выше чем при использовании 1Н ЯМР спектроскопии.

Рис. 4. Масс-спектры инозина а) природный аналог;

б) биосинтетически полученный [1,3',4',2,8-D5]-инозин.

Пути фрагментации молекулы методом FAB приводят к распаду инозина на фрагмент рибозы А с Мr при массовом соотношении m/z 133 и гипоксантиновый фрагмент Б c Мr m/z 136 (их распад сопровождался миграцией протона Н+), который в свою очередь расщепляется на ряд менее низкомолекулярных осколочных фрагментов В, Г, Д, Е и Ж при m/z 109, 108, 82, 81 и 54 за счет элиминирования НСN и СО из гипоксантина (схема).

При анализе степени дейтерированности инозина учитывались следующие аспекты. Во-первых, вследствие того, что протоны в C1-C'5 положениях рибозной части молекулы инозина могли происходить из глюкозы, мы предположили,что характер биосинтетического включения дейтерия в рибозную часть молекулы инозина определяется, в основном, функционированием ряда процессов гексозо-моно-фосфатного (ГМФ) шунта, связанных непосредственно с ассимиляцией глюкозы и других сахаров. Во-вторых, многочисленные обменные процессы и внутримолекулярные перегруппировки, происходящие с участием тяжёлой воды могли также привести к специфическому включению метки по определенным позициям в молекуле инозина. Такими доступными позициями в молекуле инозина признаны, прежде всего, гидроксильные протоны -ОН и протоны при гетероатомах -NH (последние могут обмениваться на дейтерий в тяжёлой воде за счет кето-енольной таутомерии). Три атома дейтерия в рибозном остатке молекулы инозина могли происходить за счет функционирования многочисленных реакций ГМФ-шунта, два атома дейтерия а гипоксантинс также могли синтезироваться de novo (схема).

6. РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ БИОСИНТЕТИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЙТЕРИЙ-МЕЧЕНHOI О БАКТЕРИОРОДОПСИНА Получение дейтерии-меченного бактериородопсина.

В качестве другой модельной системы для введения стабильной изотопной метки в белки, использовали ретинальсодержащий белок бактериородопсин (bR), выполняющий роль АТФ-зависимой транслоказы в клеточной мембране солелюбивой бактерии H. halobium ET 1QOL.

Рис.5. Пространственная модель бактериородопсина.

Полипептидная цепь бактериородопсина состоит из 248 аминокислотных остатков, 67% которых являются гидрофобными. Липидная составляющая пурпурной мембраны Halobacterium halobium представлена диэфирным аналогом фосфатидилглицерофосфата (50%), сульфогликолипидами (30%), каротиноидами и неполярными липидами (рис.5А).

Пурпурная мембрана галофильных бактерий представляет собой естественный двумерный кристалл.

Молекулы бактериородопсина организованы в мембране в виде тримеров;

каждый тример окружён шестью другими так, что образуется правильная гексагональная решётка (рис.5, B).

Сама же молекула бактериородопсина состоит из семи -спирали находящихся в конформации сегментов, пронизывающих всю толщу мембраны клетки в направлении, перпендикулярном её плоскости (рис. 5, С).

Для включения дейтериевой метки в bR использовали два принципиально отличных подхода: сайт-специфическое введение отдельных аминокислот: L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L [3,5-D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D5]-Trp в bR и униформное мечение бактериородопсина дейтерием путем выращивания H.

halobium ET 1001 на среде, содержащей 99,9 ат.% тяжёлую воду и дейтеро-гидролизаты В. methylicum.

Выбор способа выделения бактериородопсина был определен целью исследования, связанной с изучением принципиальной возможности получения дейтерий-меченных препаратов бактериородопсина в препаративных количествах.

При выборе L-[2,3,4,5,6-D5]-фенилаланина, L-[3,5-D2] тирозина и L-[2,4,5,6,7-D5] -триптофана в качестве источников изотопных меток, учитывалась важность этих аминокислот в функционировании бактериородопсина, стабильность дейтерий-меченных аналогов этих аминокислот к (H-D) обмену в водной среде в условиях культивирования, а также возможность их детектирования методами масс спектрометрии.

Индивидуальные меченные аминокислоты и белки представляют огромную ценность для коммерческой биотехнологии, а также фармакологических и биомедицинских исследований на их основе. Цены на дейтерий-меченные ароматические аминокислоты по данным Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (2002 г.) варьируют на мировом рынке от 270 долларов за 1 грамм [2,3,4,5,6-2H5] фенилаланина и 370 долларов за 1 грамм для [3, 5-2H2]тирозина, до 700 долларов за 1 грамм [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана. Поэтому важно научиться получать подобные модифицированные дейтерием белки в очищенном виде и в препаративных количествах.

Основными этапами получения дейтерированных препаратов бактериородопсина являлись: выращивание штамма экстремальных галофильных бактерий H. halobium на синтетической среде с [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланином (0.26 г/ л), [3, 5-2H2]тирозином (0.2 г/л) и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофаном (0.5 г/л), выделение фракции пурпурных мембран (ПМ), отделение от низко- и высокомолекулярных примесей, клеточной РНК, каротиноидов и липидов, фракционирование солюбилизированного в 0.5% ДДС-Na белка метанолом, гель проникающая хроматография на сефадексе G-200, электрофорез в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na. Поскольку белок локализуется в ПМ, освобождение от низкомолекулярных примесей и внутриклеточного содержимого достигали осмотическим шоком клеток дистиллированной водой на холоду после удаления 4.3 М NaCl и последующим разрушением клеточной оболочки ультразвуком при 22 кГц. Последующую обработку клеточного гомогената РНК-азой (2-3 ед. акт.) проводили для разрушения клеточной РНК. Поскольку фракция ПМ наряду с искомым белком в комплексе с липидами и полисахаридами содержала примесь связанных каротиноидов и посторонних белков, применялись специальные методы фракционирования белка без повреждения его нативной структуры и диссоциации, что существенно усложняло задачу выделения индивидуального БР с применением методов декаротинизации и делипидизации, а также очистки и колоночной хроматографии. Декаротинизация, заключающаяся в многократной обработке ПМ 50% этанолом при -50С, являлась рутинным, но обязательным этапом, несмотря на значительные потери хромопротеина.

Использовалось не менее пяти обработок 50% этанолом, чтобы получить спектр поглощения суспензии очищенных от каротиноидов (4) и (5) ПМ (степень хроматографической чистоты 80-85%), показанного на рис. 6 на различных стадиях обработки (б) и (в) относительно нативного БР (а).

Образование ретинальпротеинового комплекса в молекуле БР приводит к батохромному сдвигу в спектре поглощения ПМ (рис. 6, в) основная полоса (1) при максимуме поглощения 568 нм, вызванная световой изомеризацией хромофора по С13=С14-кратной связи определяется наличием транс ретинального остатка ретиналя БР568, дополнительная малоинтенсивная полоса (2) при 412 нм характеризует незначительную примесь образующейся на свету спектральной формы M412 c депротонированной альдиминной связью между остатком транс-ретиналя и белком, а полоса (3) при 280 нм определяется поглощением ароматических аминокислот в полипептидной цепи белка (для чистого БR соотношение D280/D568 равно 1.5:1).

Гомогенность очищенного bR была потверждена электрофорезом в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1% ДСН (рис.5).

Рис.6. Спектры поглощения бактериородопсина в составе пурпурных мембран H. Halobium в этаноле на различных стадиях обработки: нативный БР (а);

пурпурные мембраны после промежуточной обработки (б);

очищенный от посторонних каротиноидов БР.

Полоса 1 соответствует спектральной форме БР 568 ;

(2) примесь спектральной формы М 412 ;

(3)-посторонние ароматические аминокислоты;

(4) и (5)-посторонние каротиноиды. В качестве контроля использован нативный БР ОФ ВЭЖХ метиловых эфиров Dns-, и Z производных аминокислот, полученных после гидролиза bR в 4 н. Ва(ОН)2 или 6 н. DCI (3 масс.% фенола, в тяжёлой воде) показала высокие степени хроматографической чистоты выделенных аминокислот и отсутствие примесей небелковой природы в гидролизатах bR. Согласно данным по разделению дериватизованных гидролизатов bR методом ОФ ВЭЖХ, степени хроматографической чистоты выделенных дейтерий меченных Dns-Phe-OMe, Dns-Tyr-OMe и Dns-Trp-OMe составили 96, 97 и 98% соответственно.

Исследование степени дейтерироваиности бактериородопсина.

Оба подхода показали хорошие результаты по введению дейтериевой метки в молекулу bR. Например, в масс-спектре гидролизата электрофоретически чистого bR, полученного с селективной среды, содержащей L [2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-2,4,5,6,7-D5]-Trp, после прямой обработки реакционной смеси Dns-Cl и CN2Н фиксируются пики, соответствующие молекулярным ионам обогащённых дейтерием Dns-Phe-OMe с М+. при m/ z 417 (вместо m/z 412 в контроле), Dns-Tyr-OMe с М+. при m/z 429 (вместо m/z 428) и Dns-Trp-OMe с М+. при m/z (вместо m/z 451).

Рис. 7. Масс спектры гидролизата бактериородопсина, полученного со среды с L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-2,4,5,6,7-D5]-Trp, после прямой обработки реакционной смеси Dns-Cl и CN2Н2.

В случае с униформным мечением bR, метка включалась равномерно по всем положениям углеродного скелета в аминокислотных остатках белка.

ВЫВОДЫ:

1. Подобраны условия для проведения адаптации штаммов R. melhylicum, H. halobium, В. subiilis и II.

amyloliquefaciens к росту на D2О-средах. Селекционно отобраны штаммы, сохранившие высокие ростовые и биосинтетические характеристики на средах с максимальными концентрациями тяжёлой воды.

2. Показана принципиальная возможность использования суммы химических компонентов дейтеро-биомассы факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum в качестве источников ростовых субстратов для синтеза дейтерий-меченных БАС.

3. Изучено влияние меченных субстратов – D 2 O, CD 3 OD и СН 3 ОН на ростовые и биосинтетические параметры различных штаммов -продуцентов БАС.

Показано, что униформные уровни включения дейтерия в молекулы синтезируемых БАС можно получить, используя высокодейтерированные среды (D2О и СНзОН), а в случае с С-мечением того же результата можно достигнуть за счёт использования СНзОН.

4. Предложена дансильная модификация препаратов культуральной жидкости для изучения степеней изотопного обогащения аминокислот методом масс-спектрометрии электронного удара. Метод позволяет проводить анализ изотопного состава мультикомпонентных смесей аминокислот, как свободных аминокислот из культуральной жидкости, так и аминокислот в составе гидролизатов суммарных белков биомассы.

5. Проведено сравнительное изучение степеней включения дейтерия и изотопа углерода 13С в молекулы экзогенных аминокислот, так и в аминокислотные остатки суммарных белков штаммов метилотрофных бактерий в условиях их роста на средах, содержащих ступенчато увеличивающие концентрации тяжёлой воды.

6. Определена чёткая корреляция между уровнем включения изотопной метки в молекулы аминокислот и концентрации тяжёлой воды в ростовых средах.

7. Разработана схема получения дейтерий меченных БАС с высокими степенями изотопного обогащения, основанная на использовании гетеротрофных микроорганизмов - продуцентов соответствующих БАС.

Данная схема проверена на примере получения дейтерий меченных инозина и бактериородопсина.

8. Исследованы методы сайт-специфического и униформного введения дейтериевой метки в бактериородопсин. Показано, что включение отдельных дейтерий-меченных аминокислот в молекулу бактериородопсина носит селективный характер, а использование адаптированного к D2O Н. halobium ET 1001 на средах с меченными субстратами и 99,9% D2O позволяет получать униформно меченный бактериородопсин.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ.

1.Мосин О. В.. Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А.

Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. Биосинтетическое получение дсйтерий-мсченного L-фенилалаиина, секрстируемого метилотрофным мутантом Brevibaclerium methylicum II Биотехнология. 1993. №9.

С. 16-20, 2. Егорова Т. А., Мосин О. В., Еремин С. В-, Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И.

Препаративное разделение аминокислот белковых гидролизатов в виде бензилоксикарбонильных производных // Биотехнология. 1993. № 8. С. 21-25.

3. Беккер Г. Д., Мосин О. В.. Карнаухова Е. Н.

Аминокислоты, меченные стабильными изотопами:

получение и масс-спектро метрически и контроль. (Тезисы докл. 4-й Всероссийской научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии") Екатеринбург. 20-22 апрель 1994. С. 127-128.

4. Мосин О. В.. Карнаухова Е. Н., Складнев Д. А., Акимова О. Л., Цыганков Д, Ю. Штамм Brevibacterium methylicum - продуцент униформно меченной дейтерием аминокислоты L-фенилаланина. Заявка РФ № 93055824 от 15.12.1993.

5. Казаринова Л. А., Королькова Н. В., Миронов А.

С., Мосин О. В.. Складнев Д. А., Юркевич А. М.

Способ получения высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов. Заявка РФ № 95118778 от 14.11.1995.

6. Karnaukhova Е. N. Mosin О. V.. and Reshetova О. S.

Biosynthetic production of stable isotope labeled ammo acids using methylotroph Methylobacillus JlageUattan // Ammo Acids. 1993. V. 5. № 1. P. 125.

7. Mogin O. V.. Karnaukhova E. N., Pshenichnikova А.

В., Reshetova O. S. Electron impact spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin. 6th International Conference on Retinal Proteins. 19-24 June 1994. Leiden. The Netherlands. P. 115.

8. Mosin O. V,. Karnaukhova E. N., Skladnev D.

A. Application of methylotrophic bacteria for preparation of stable isotope labeled amino acids. 7 th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms. June 1994. Quebec. Canada. P. 163.

9. Matveev A. V., Mosin_O.V.. Skladnev D. A., Yurkevich A. M., and Shvcts V. Melhylolrophic adaptation to highly deuterated substrates. 8th International Symposium on Microbial Growth on Ci-Compounds. 27 August-l September 1995. San Diego. U.S.A. P. 49.

10. Mosin O. V.. Karnaukhova E. N., Skladnev D. A., and Shvets V. I. Preparation of D-and 'C-amino acids L via bioconvertion of Ci-substrates, 8lh International Symposium on Microbial Growth on Сi-Compounds. August-l September 1995. San Diego. U.S.A. P. 80.

11. Shvets V. I., Yurkevich A. M., Mosin_O. V..

Skladnev D. A. Preparation of deuterated inosine suitable for biornedical application // Karadeniz Journal of Medical Sciences. 1995. V. 8. № 4. P. 231-232.

12. Мосин О. В.. Складнее Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum на средах, содержащих тяжелую воду. II Биотехнология. № 3.

1996. С. 32-37.

13. Мосин О. В.. Егорова Т. А., Чеботаев Д. В., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И.

Получение бантериородопсина, меченного по остаткам ароматических аминокислот L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана // Биотехнология. № 3. 1996.

С. 14-20.

14. Мосин _О.В. Казаринова Л. А., Преображенская Е.

С., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Рост бактерии Bacillus subtilis и биосинтез инозина на высокодейтерированной среде. // Биотехнология. № 4. 1996.