Влияние внутриутробной гипоксии на процессы пролиферации и свободнорадикального окисления в миокарде белых крыс на ранних этапах постнатального онтогенеза
На правах рукописи
Крыжановская Светлана Юрьевна
ВЛИЯНИЕ ВНУТРИУТРОБНОЙ ГИПОКСИИ НА ПРОЦЕССЫ
ПРОЛИФЕРАЦИИ И СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В
МИОКАРДЕ БЕЛЫХ КРЫС НА РАННИХ ЭТАПАХ
ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА
03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Владивосток, 2008 2
Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО Дальневосточного государственного медицинского университета Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РОСЗДРАВа.
Научные руководители:
доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Тимошин Сергей Серафимович доктор медицинских наук Сазонова Елена Николаевна
Официальные оппоненты:
Ведущая организация:
Защита состоится «»2007 года в _ часов на заседании специализированного диссертационного совета Д 208.007.01 при Владивостокском государственном медицинском университете (690950, г. Владивосток, пр. Острякова, 2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета (690950, г. Владивосток, пр.
Острякова, 2).
Автореферат разослан «_» 2007 г.
Ученый секретарь д.м.н., профессор, Диссертационного совета Рева Галина Витальевна Актуальность темы. Внутриутробная гипоксия (ВУГ) является наиболее распространенной причиной, приводящей к нарушению развития плода [Дещекина М.Ф., 1990;
Сенькевич О.А. и соавт., 2006]. Частота встречаемости осложнений со стороны сердечно-сосудистой системы у новорожденных, перенесших перинатальную гипоксию, составляет, по данным разных авторов, от 40 до 100% [Прахов А.В., 1998;
Шабалов Н.П., 1999;
Симонова Л.В., 2001]. О снижении компенсаторных возможностей сердца после перенесенной ВУГ и отсроченной манифестации таких нарушений свидетельствуют клинические и экспериментальные данные [Кельмансон И.А., 1999;
Li G et al., 2004;
Netuka I. et al., 2006].
В литературе встречаются макроскопические и ультрамикроскопические описания постгипоксических изменений миокарда плодов и новорожденных [David H., 1984, Задорожная Т.Д., Давиденко О.А., 1988, Murotsuki J, 1997]. Однако нами не обнаружены данные о таком важном показателе тканевого гомеостаза, как состояние пролиферации в миокарде млекопитающих, перенесших ВУГ.
Период активной пролиферации кардиомиоцитов ограничен ранними этапами онтогенеза [Румянцев П.П., 1982]. Формирующийся в этот период суммарный геном кардиомиоцитов определяет, в основном, резерв роста сердца у взрослых млекопитающих и, следовательно, его компенсаторные возможности. Размер суммарного генома миокарда зависит не только от генетической программы, но и от условий перинатального периода развития [Бродский В.Я., 1986, 1995].
Существенным звеном патогенеза постгипоксических нарушений у новорожденных является активизация процессов свободнорадикального окисления [Saugstad O.D., 2005]. Активные метаболиты кислорода (АКМ) служат не только деструктивными молекулами, но и выполняют функцию мессенджеров, в том числе могут участвовать в регуляции прохождения клетками митотического цикла [Гамалей И.А., 2001]. Коррекция биогенеза АКМ играет важную роль в защите миокарда от постгипоксических нарушений [Бокерия Л.А. и соавт., 2000;
Капелько В.И., 2004;
Маслов Л.Н.
и соавт., 2006]. Мы не встретили данных о взаимоотношениях между постгипоксическими структурными изменениями в миокарде новорожденных и биогенезом АКМ.
Регуляторные пептиды (РП) участвуют в регуляции биологических функций в норме и в условиях патологии. Профилактическое антенатальное введение некоторых РП экспериментальным животным препятствует развитию последствий пренатального гипоксического стресса [Маслова М.В. и соавт., 2001;
Соколова Н.А. и соавт., 2002]. В ряде клеточных популяций происходит нормализация показателей пролиферативной активности [Уткина Л.И., Тимошин С.С., 1991;
Лебедько О.А. и соавт., 1994;
Ганьчева Е.А. и соавт., 1997].
В научно-производственном объединении «Пептос» и лаборатории химии пептидов кардиологического научного центра РАМН был синтезирован ряд РП – синтетических аналогов эндогенных опиоидных пептидов. Среди них – седатин (аналог дерморфина) и неопиатный аналог лей-энкефалина (НАЛЭ). На основе этих РП планируется создание фармакологических средств. Учитывая антигипоксантные свойства ряда РП, а также способность РП влиять на ранний постнатальный морфогенез миокарда [McLaughlin P.J., 1994;
Ventura C. еt al., 2003], можно предположить эффективность использования пептидных регуляторов для коррекции постгипоксических нарушений структурного гомеостаза миокарда млекопитающих в постнатальном периоде.
Цель исследования. Изучить характер влияния внутриутробной гипоксии на процессы пролиферации и свободнорадикального окисления в миокарде белых крыс на ранних этапах постнатального онтогенеза.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние внутриутробной гипоксии на показатели пролиферации в миокарде новорожденных белых крыс.
2. Изучить влияние внутриутробной гипоксии на показатели пролиферации в миокарде белых крыс в позднем молочном периоде.
3. Изучить влияние внутриутробной гипоксии на параметры ядрышкового аппарата клеток миокарда белых крыс в раннем постнатальном периоде.
4. Оценить состояние свободнорадикального окисления в миокарде и сыворотке крови новорожденных белых крыс, подвергнутых внутриутробной гипоксии.
5. Оценить возможность коррекции нарушений, индуцированных внутриутробной гипоксией, у белых крыс с помощью регуляторных пептидов.
Научная новизна:
1. Впервые проведен комплексный анализ показателей пролиферативной активности миокарда новорожденных млекопитающих, подвергнутых тяжелой ВУГ.
2. Впервые продемонстрирована антиоксидантная активность РП:
седатина и НАЛЭ в сердце и сыворотке крови новорожденных животных, как в норме, так и при окислительном стрессе.
3. Впервые показана возможность коррекции постгипоксических изменений у новорожденных млекопитающих с помощью седатина и НАЛЭ.
Практическая значимость работы. Результаты данной работы могут быть использованы при определении показаний и противопоказаний к использованию лекарственных препаратов, созданных на основе исследуемых пептидов. Выявленное в работе позитивное влияние седатина и НАЛЭ на выживаемость животных, подвергнутых ВУГ, может служить экспериментальным обоснованием перспективности использования фармакологических препаратов на основе этих РП в неонатологии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Внутриутробное гипоксическое воздействие индуцирует ряд постнатальных морфогенетических изменений в миокарде, имеющих структурный след, как минимум, до конца молочного периода (до 21 дня жизни у крыс).
2. У животных, перенесших ВУГ, проявления окислительного стресса регистрируются как минимум до конца периода новорожденности.
3. Введение седатина или НАЛЭ новорожденным животным, подвергнутым ВУГ, способно препятствовать пролонгированию окислительного стресса и снизить уровень летальности.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на 11 международном русско-японском симпозиуме (Ниигата, 2004);
на VIII Краевой конференций молодых ученых и аспирантов, секция медицинские науки (Хабаровск, 2006);
на научно практической конференции с международным участием «Пути реализации приоритетного национального проекта в сфере профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний» (Хабаровск, 2007);
на совместном заседании сотрудников центральной научно-исследовательской лаборатории, кафедр патофизиологии, нормальной физиологии, гистологии и эмбриологии, анатомии человека ДВГМУ (2007).
Публикация результатов работы. Основные положения диссертации отражены в 10 печатных работах: 5 статьях и 5 тезисах докладов. В том числе 3 статьи опубликованы в ведущих рецензируемых научных изданиях.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и библиографического указателя.
Объем диссертации включает 151 страницу машинописного текста, таблицы, 28 рисунков (в том числе 11 микрофотографий) и список литературы (272 источника). Диссертация изложена на русском языке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Моделирование внутриутробной гипоксии. Использовали самок белых крыс 3-4 месячного возраста. Животных с 14 по 19 день гестации на 4 часа ежедневно помещали в барокамеру и создавали разрежение, которое соответствует высоте 9000 м над уровнем моря (давление 224 мм.рт.ст.).
Потомство подопытных и интактных крыс забивали методом быстрой декапитации на 5, 7 и 21 сутки после рождения. Согласно классификации Западнюк И.П. (1974) период с 1 по 7 сутки после рождения именуется периодом новорожденности. Возраст с 8 по 21 сутки - инфантильный, или поздний молочный период. Всего исследовано потомство 63 самок крыс (597 крысят).
Приготовление гистологических препаратов. Сердца подопытных животных извлекали сразу после эвтаназии и фиксировали в смеси 70% этанола, формалина и ледяной уксусной кислоты в соотношении 20:1:1 в течение суток. Для иммуногистохимического исследования использовали в качестве фиксатора 10% раствор формалина на фосфатном буфере. Затем препараты промывали в течение суток и обезвоживали в батарее восходящих спиртов. Биоптаты заливали в парафин и готовили срезы толщиной 5-6 мкм на микротоме “Leica”.
Изучение процессов пролиферации проводили в субэндокардиальных слоях миокарда с помощью следующих методов. На препаратах, окрашенных гематоксилином Лилли-Майера и эозином, подсчитывали число фигур митоза путем просмотра не менее 5000 ядер и вычисляли митотический индекс (МИ) в промилле.
Для анализа ДНК-синтетической активности клеток миокарда у новорожденных белых крыс использовали метод авторадиографии.
Животным за 1 час до эвтаназии вводили Н3-тимидин из расчета 1 мкКюри на 1 г массы (уд.активность 84 Кюри/моль). Радиоавтографы готовили по принятой в лаборатории методике. Индекс меченых ядер (ИМЯ) определяли путем просмотра 1000 клеток в субэндокардиальных слоях миокарда каждого отдела сердца и выражали в процентах. Интенсивность метки (ИМ) рассчитывали как среднее число треков на 50 ядер в каждом отделе миокарда.
В желудочковом миокарде 21-суточных животных с помощью иммуногистохимического окрашивания выявляли ядра, экспрессирующие антигены пролиферирующих ядер (PCNA). При данном методе исследования метятся ядра клеток, находящиеся в разных фазах митотического цикла, кроме G0 [Toschi L., Bravo R., 1988].
Иммуногистохимическое окрашивание проводили по протоколу, рекомендуемому фирмой DAKO (Дания).
Микроскопирование препаратов проводили с помощью микроскопа «Jenalumar», иммерсионного объектива 90х, окуляры 10х.
Оценка параметров ядрышкового аппарата кардиомиоцитов позволяет косвенно охарактеризовать белоксинтетические процессы в клетке [Мамаев Н.Н. и соавт., 1989]. Окраску препаратов проводили AgNO3 по методике, описанной в работах Мамаева Н.Н. и соавт. (1989) и Д.Э. Коржевского (1990). С помощью компьютерной морфоцитометрии на комплексном анализаторе изображения "МЕКОС-Ц" определяли число и площадь ядрышек путем просмотра не менее 50 ядер в субэндокардиальных слоях каждого желудочка.
Процессы свободнорадикального окисления в миокарде и сыворотке крови новорожденных крыс оценивали методом хемилюминесценции (ХМЛ). Регистрацию ХМЛ осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50B «PERKIN ELMER». Сигнал стандартизировали с помощью встроенной программы "Finlab". Спонтанную и индуцированную Fe2+ ХМЛ исследовали по методу Ю.А. Владимирова (1991). Определяли:
светосумму за 1 мин. спонтанной ХМЛ (Sсп.), величина которой коррелирует с интенсивностью свободнорадикальных процессов;
максимум быстрой вспышки (Н1) индуцированной ХМЛ, свидетельствующий о содержании гидроперекисей липидов;
светосумму (S1инд.) за 2 мин. после "быстрой" вспышки, отражающую интенсивность накопления перекисных радикалов.
Кинетику ХМЛ, инициированную H2O2 в присутствии люминола [Арутюнян А.В. и соавт., 2000], анализировали по двум параметрам:
максимуму быстрой вспышки (H2), указывающему на потенциальную способность исследуемого биосубстрата к перекисному окислению и светосумме (S2инд.) за 2 мин., величина которой зависит от активности антиоксидантной антирадикальной систем защиты.
Исследуемые вещества. Для оценки корригирующей роли РП были выбраны следующие вещества. Седатин – аналог дерморфина [H-Arg-Tyr D-Ala-Phe-Gly-OH]. Особенность структуры седатина - наличие остатка аминокислоты L-аргинин в N-концевом положении. Для исследования возможной роли аргинина в реализации эффектов седатина, использовали вещество аналогичной структуры, но не содержащее эту аминокислоту:
безаргининовый аналог седатина [H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH].
В работе использовали также пептид НАЛЭ - неопиатный аналог лей энкефалина [Н-Phe-D-Ala-Glu-Phe-Leu-Arg-ОН]. Это вещество не обладает аффинностью к известным опиоидным рецепторам. Как и седатин, НАЛЭ содержит остаток аминокислоты L-аргинин в краевом положении, но в отличие от седатина, на С-конце.
Растворы РП вводили 5-кратно внутрибрюшинно со 2-го по 6-й день жизни в дозе 100мкг\кг. Контрольные животные получали эквиобъемное количество изотонического раствора хлорида натрия. Эвтаназию проводили в возрасте 7 дней, то есть через одни сутки после последней инъекции, и в возрасте 21 день, то есть через 15 суток после последней инъекции.
Статистическая обработка результатов исследования проведена с использованием t-критерия Стьюдента с применением программы Statistica 5.0. Различия между группами считали достоверными при p0,05.
СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о выраженном повреждающем влиянии гипоксии на систему «мать-плод».
Среди подопытных самок было зарегистрировано 5,4% летальных случаев.
В группе интактных самок таких случаев не было.
В 10,7% случаев гипоксическое воздействие привело к мертворожденности или гибели всего помета в течение 12 часов после рождения. Летальность потомства подопытных крыс в течение первых трех недель постнатального периода выросла почти в пять раз (на 487%) в сравнении с контролем (рисунок 1). В отличие от контроля, в подопытной группе летальные случаи регистрировались не только в период новорожденности, но и на второй и третьей неделях постнатального развития, что может свидетельствовать о недостаточности компенсаторных процессов, наступлении дезадаптации органов и систем.
1неделя контроль 2 неделя 3 неделя ВУГ 40 % 0 10 20 Рисунок 1. Влияние внутриутробной гипоксии на летальность белых крыс в течение 21 суток постнатального периода (%).
Масса тела крыс подопытной группы в период новорожденности была достоверно ниже контрольных показателей (рисунок 2). К возрасту суток разница массы тела контрольных и подопытных животных нивелировалась. Более того, к возрасту 21 суток наметилась тенденция к инверсии соотношения этого показателя. Сходную динамику массы тела животных, подвергнутых ВУГ, описывали Савченков Ю.И., Лобынцев К.С.
(1980), Gross J. et al. (1999).
Относительная масса сердца белых крыс группы «ВУГ» в возрасте суток оказалась достоверно выше, чем в группе «контроль» (рисунок 2). В дальнейшем этот показатель не отличался от контроля на статистически значимом уровне. Абсолютная масса сердца подопытных крыс достоверно не изменялась относительно контрольных показателей во все изученные возрастные периоды (рисунок 2). Следовательно, динамика относительной массы сердца обусловлена динамикой массы тела подопытных животных.
Наши данные согласуются с результатами, полученными другими авторами [Савченков Ю.И., Лобынцев К.С., 1980;
Li G. et al, 2003].
110 % * уровень 100 контроля * * масса тела масса сердца относительная масса сердца 5 сутки 7 сутки 21 сутки Рисунок 2. Динамика соматометрических показателей белых крыс, подвергнутых ВУГ. Примечания: 1) данные представлены в % от уровня соответствующей контрольной группы;
2) *- р0,05 по отношению к контролю.
Результаты анализа показателей пролиферации в миокарде 5 суточных животных подопытной группы свидетельствуют об увеличении пролиферативной активности клеток миокарда. На этом сроке наблюдения достоверно возрастал митотический индекс в субэндокардиальных слоях миокарда желудочков и число ДНК-синтезирующих ядер (таблица 1).
Стимуляция клеточного деления после ВУГ является, по-видимому, компенсаторной реакцией в ответ на увеличение клеточных потерь.
Гипоксия стимулирует процессы апоптоза в кардиомиоцитах [Haunstetter A. et al, 1998, Bittar F.F. et al, 2002].
Таблица 1.
Влияние ВУГ на показатели пролиферативной активности и ядрышкового аппарата клеток миокарда пятисуточных белых крыс.
Контроль (n=10) ВУГ (n=10) Показатель Левый желудочек МИ,‰ 4,62 + 0,48 7,61+0,80* ИМЯ,% 8,89+0,50 10,73+0,42* ИМ 28,91+0,99 27,64+0, Число ядрышек 3,26+0,27 3,48+0, Правый желудочек МИ,‰ 3,24 + 0,35 5,74+0,49* ИМЯ,% 7,69+0,34 8,88+0,33* ИМ 26,26+0,78 27,63+1, Число ядрышек 3,13+0,12 3,56+0,13* Примечание: *- р 0,05 по отношению к контролю Активизация ядрышкового аппарата клеток миокарда может свидетельствовать об усилении белоксинтетической функции [Мамаев Н.Н. и соавт., 1989].
Мы сопоставили показатели пролиферации миокарда пятисуточных крыс, подвергнутых ВУГ, в группе самцов и в группе самок. Оказалось, что ВУГ-индуцированные изменения митотического индекса и показателей синтеза ДНК более выражены у новорожденных самцов, чем у самок (рисунок 3). В контрольной группе изучаемые показатели у самцов и самок не отличались. На основании полученных данных можно предположить, что повреждающее влияние ВУГ на сердце более значительно у плодов мужского пола.
Исследование активности ДНК-синтетических процессов в субэндокардиальных слоях миокарда 7- суточных крыс, подвергнутых ВУГ, не выявило достоверных изменений количества меченных Н3 тимидином ядер (таблица 2). Таким образом, в отличие от 5-суточных 0 100 % ИМЯ * МИ самки * ИМЯ * * МИ * 0 100 самцы % левый желудочек правый желудочек Рисунок 3. Изменения показателей пролиферации миокарда пятисуточных белых крыс, подвергнутых ВУГ, в зависимости от пола.
Примечания: 1) данные представлены в % от уровня соответствующей контрольной группы;
2) * - р0,05 по отношению к контролю.
животных, у 7-суточных белых крыс подопытной группы отсутствовало достоверное увеличение числа ДНК-синтезирующих ядер. При этом отмечалось снижение ИМ в левом желудочке, что косвенно свидетельствует об увеличении продолжительности клеточного цикла.
МИ в миокарде 7-суточных белых крыс, подвергнутых ВУГ, несколько превышал контрольные показатели (таблица 2). Это может быть обусловлено большим числом делящихся клеток, хотя нельзя исключить замедление прохождения клетками митоза.
Одновременно нарастала активация ядрышкового аппарата. По данным морфоцитометрии достоверно увеличивалось число и площадь ядрышек, что расценивается как свидетельство стимуляции синтеза белка в клетке (таблица 2).
Таблица 2.
Влияние ВУГ на показатели пролиферативной активности и ядрышкового аппарата клеток миокарда семисуточных белых крыс.
Контроль (n=10) ВУГ (n=10) Показатель Левый желудочек МИ,‰ 3,82+0,33 4,79+0, ИМЯ,% 8,57+0,69 9,08+0, ИМ 29,7+0,76 25,4+1,17* Число ядрышек 2,29+ 0,08 2,68+0,15* Площадь ядрышек, мкм2 2,68 + 0,24 3,56+0,27* Правый желудочек МИ,‰ 4,05+0,45 5,80+0,60* ИМЯ,% 8,17+0,69 9,21+0, ИМ 28,5+0,94 26,9+0, Число ядрышек 2,01+ 0,10 2,50+0,15* Площадь ядрышек, мкм2 2,55+ 0,14 3,55+0,26* Примечание: *- р 0,05 по отношению к контролю Активация белоксинтетических процессов, по-видимому, обусловлена ускорением созревания кардиомиоцитов и увеличением их функциональной активности [Румянцев П.П., 1982;
Ибрагимова И.Ф. и соавт., 1997]. Такие изменения, в сочетании с увеличением длительности клеточного цикла, могут быть отражением дифференцировки кардиомиоцитов.
Анализ состояния миокарда у 21-суточных крыс, перенесших ВУГ, показал, что индекс ядер, экспрессирующих PCNA, не отличался достоверно от уровня контроля. Однако сохранялось достоверное увеличение показателей ядрышкового аппарата (рисунок 4), что может расцениваться как структурный след ВУГ.
Результаты ХМЛ-исследования свидетельствуют, что ВУГ обуславливает существенное изменение процессов свободнорадикального окисления в сердце и в сыворотке крови новорожденных белых крыс (таблица 3).
* уровень * * контроля 100% ИМЯ площадь ядрышек число ядрышек Левый желудочек Правый желудочек Рисунок 4. Индекс экспрессирующих PCNA ядер и параметры ядрышкового аппарата клеток миокарда 21-суточных крыс, подвергнутых ВУГ. Примечания: 1) данные представлены в % от уровня соответствующей контрольной группы;
2)*- р0,05 по отношению к контролю.
Так, произошло увеличение продукции АКМ, в том числе за счет накопления гидроперекисей липидов и перекисных радикалов (возросли показатели Sсп, Н1, Sинд.1). Кроме того, ряд показателей (Н2, Sинд.2) указывают на снижение устойчивости к перекисному окислению и уменьшение активности антиоксидантной защиты у подопытных животных (таблица 3).
Таблица 3.
Влияние ВУГ на показатели хемилюминесценции гомогенатов миокарда и сыворотки крови семисуточных белых крыс.
ВУГ Контроль (n=16) Показатель (n=19) Гомогенаты миокарда Sсп (отн. ед) 1,58±0,09 3,04±0,21* Н1 (отн.ед) 2,88±0,17* 1,39±0, 2+ Инд. ХМЛ (Fe ) Sинд.1 (отн.ед) 3,42±0,25 7,80±0,53* Н2 (отн.ед) 4,72±0,28 14,05±1,24* Инд. ХМЛ (люминол-Н2О2) Sинд.2 (отн.ед) 18,49±1,00* 8,01±0, Сыворотка крови 0,31 + 0,02 0,74 + 0,06* Sсп (отн. ед) 0,64 + 0,05* Н1 (отн.ед) 0,19 + 0, Инд. ХМЛ (Fe2+) 0,80 + 0,04 2,23 + 0,11* Sинд.1 (отн.ед) 1,69 + 0,1 6,06 + 0,52* Н2 (отн.ед) Инд. ХМЛ (люминол-Н2О2) 9,30 + 0,70* Sинд.2 (отн.ед) 2,34 + 0, Примечание: * - р 0,05 по отношению к контролю Таким образом, у животных, перенесших ВУГ, нами был зарегистрирован выраженный окислительный стресс. Изменения показателей ХМЛ были выявлены у 7-суточных крыс, то есть спустя суток после заключительного гипобарического воздействия. Это может означать, что повреждающее действие ВУГ не только не заканчивается после прекращения кислородной депривации, а скорее «дает старт»
изменениям биогенеза АКМ, которые продолжают разворачиваться еще длительный период.
Оценка способности РП корригировать ВУГ-индуцированные нарушения. Первоначально мы проверили характер влияния исследуемых РП на животных, развивавшихся в условиях нормального кислородного обеспечения. По данным ХМЛ-анализа антиоксидантное действие оказывали аргинин-содержащие пептиды: седатин и НАЛЭ (рисунок 5).
Поэтому эти пептиды были использованы для оценки корригирующей роли РП у белых крыс, перенесших ВУГ.
120 % уровень * контроля * 80 ** ** ** * * * * * * * 60 * * * Sсп Н1 S1 Н2 S2 Sсп Н1 S1 Н2 S миокард сыворотка крови седатин аналог седатина НАЛЭ Рисунок 5. Показатели ХМЛ гомогенатов миокарда и сыворотки крови новорожденных белых крыс, получавших РП. Примечания: 1) данные представлены в % от уровня соответствующей контрольной группы;
2) * - р0,05 по отношению к контролю.
Результаты исследования показали, что введение РП крысам, подвергнутым ВУГ, приводило к снижению уровня летальности. В группе «ВУГ+НАЛЭ» этот показатель был достоверно ниже, чем в группе «ВУГ+физ.раствор» (8% против 30%). В группе «ВУГ+седатин» снижение было недостоверным - до 21 %. Вопрос о влиянии аргинин-содержащих РП на летальность животных, подвергнутых гипоксии, требует дальнейшего изучения.
Показатели пролиферативной активности и ядрышкового аппарата миокарда изменялись однонаправлено с аналогичными показателями группы «ВУГ», получавшей изотонический раствор хлорида натрия (рисунок 6).
Введение седатина или НАЛЭ новорожденным белым крысам, перенесшим ВУГ, приводило к нивелированию признаков окислительного стресса, регистрируемых с помощью ХМЛ в миокарде и сыворотке крови (рисунок 7).
150 % * * * ** *** * * уровень _ 100 контроля ** * * ИМЯ ИМ число площадь ИМЯ ИМ число площадь ядрышек ядрышек ядрышек ядрышек левый желудочек правый желудочек ВУГ ВУГ+ седатин ВУГ+ НАЛЭ Рисунок 6. Показатели пролиферативной активности и ядрышкового аппарата клеток миокарда новорожденных белых крыс, подвергнутых ВУГ и получавших РП или изотонический раствор хлорида натрия. Примечания:
1) данные представлены в % от уровня соответствующей контрольной (интактной) группы;
2) * - р0,05 по отношению к контролю.
* 400 % * * * * * * * * * уровень _ контроля Sc H1 S1 H2 S2 Sc H1 S1 H2 S миокард сыворотка крови ВУГ ВУГ+седатин ВУГ+НАЛЭ Рисунок 7. Показатели ХМЛ миокарда и сыворотки крови новорожденных белых крыс, подвергнутых ВУГ и получавших РП или изотонический раствор хлорида натрия. Примечания: 1) данные представлены в % от уровня контрольной (интактной) группы;
2)* - р0,05 по отношению к контролю.
Следует отметить, что однонаправленное влияние седатина и НАЛЭ нельзя объяснить с позиций опиоидной активности РП, поскольку НАЛЭ не обладает сродством к известным опиоидным рецепторам. По-видимому, важную роль в реализации полученных эффектов играет наличие в формуле пептидов L-аргинина в концевом положении. Косвенно это предположение подтверждается отсутствием эффектов после введения безаргининового аналога седатина (рисунок 5). Концевое положение L аргинина способствует освобождению этой аминокислоты в результате протеолиза [Исакова О.Л. и др., 1986]. Известно, что в физиологических концентрациях L-аргинин, посредством активации синтеза NO, угнетает процессы пероксидации липидов и защищает клетки от окислительного стресса [Suschek C.V. et al., 2003].
ВЫВОДЫ 1. Внутриутробное гипоксическое воздействие вызывает компенсаторную стимуляцию пролиферативных процессов в миокарде новорожденных белых крыс, проявляющуюся увеличением уровня митотической и ДНК-синтетической активности.
2. В миокарде новорожденных крыс-самцов ВУГ-индуцированные изменения показателей пролиферативного статуса более выражены, чем у крыс-самок.
3. В миокарде животных, подвергнутых внутриутробной гипоксии, к концу периода новорожденности нормализуются процессы синтеза ДНК, и нарастает активность ядрышкового аппарата клеток миокарда.
4. В миокарде белых крыс, подвергнутых внутриутробной гипоксии, повышенная активность ядрышкового аппарата сохраняется, как минимум, до конца молочного периода.
5. У крыс, перенесших внутриутробную гипоксию, проявления окислительного стресса в сердце и сыворотке крови сохраняются, как минимум, до конца периода новорожденности, о чем свидетельствуют выраженные изменения показателей ХМЛ.
6. 5-кратное введение олигопептидов (седатина или НАЛЭ), содержащих в концевом положении остаток L-аргинина, новорожденным белым крысам, уменьшает выраженность ВУГ-индуцированных нарушений.
Нормализуется биогенез АКМ в сердце и сыворотке крови, снижается летальность подопытных животных.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Крыжановская, С. Ю. Влияние внутриутробной гипоксии на ранний постнатальный морфогенез миокарда белых крыс [Текст] / С. Ю.
Крыжановская, Е. Н. Сазонова // Актуальные проблемы морфологии : сб.
науч. трудов. - Красноярск, 2004. - С. 146-147.
2. Крыжановская, С. Ю. Некоторые показатели тканевого гомеостаза новорожденных белых крыс, перенесших внутриутробную гипоксию [Текст] / С. Ю. Крыжановская, Е. Н. Сазонова, С. С. Тимошин // Бюлл.
эксперим. биологии и медицины. - 2004. - № 7. - С. 29-32.
3. Krizhanovskaja, S.Yu. Influencing intrauteral hypoxia on some indexes of homeostasis of the myocardium newborn in white rats [Text] / S. Yu.
Krizhanovskaja, E. N. Sazonova // The Eleventh International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange. - Niigata, 2004. - P. 364.
4. Крыжановская, С. Ю. Влияние аналогов дерморфина и лей-энкефалина на биогенез активных кислородных метаболитов в кардиореспираторной системе новорожденных белых крыс [Текст] / С. Ю. Крыжановская, О. Е.
Гусева, О. А. Лебедько [и др.] // Дальневосточный медицинский журнал 2006. - № 3. – С. 86-88.
5. Крыжановская, С. Ю. Влияние внутриутробной гипоксии на постнатальный морфогенез миокарда белых крыс [Текст] / С. Ю.
Крыжановская // Материалы VII и VIII Краевых конференций молодых ученых и аспирантов. Секция медицинские науки. – Хабаровск, 2006. – С.
47-54.
6. Крыжановская, С. Ю. Корригирующее влияние неопиоидного аналога лей-энкефалина на биогенез активных кислородных метаболитов в кардиореспираторной системе новорожденных крыс, подвергнутых внутриутробной гипоксии [Текст] / С. Ю. Крыжановская, О. Е. Гусева, О. А.
Лебедько // Актуальные проблемы морфологии : сб. науч. трудов. Красноярск, 2006. - С. 85-87.
7. Гусева, О. Е. Пептидный препарат седатин – корректор нарушений биогенеза активных кислородных метаболитов в кардиореспираторной системе у новорожденных, перенесших перинатальную гипоксию (экспериментальное исследование) [Текст] / О. Е. Гусева, О. А. Лебедько, С.Ю. Крыжановская, С. С. Тимошин // Актуальные проблемы охраны здоровья женщин и детей на современном этапе : сб. науч. трудов. Хабаровск, 2006. – С. 43-49.
8. Сазонова, Е. Н. Влияние опиоидных пептидов на тканевой гомеостаз миокарда новорожденных белых крыс [Текст] / Е. Н. Сазонова, С. Ю.
Крыжановская, Н. В. Масленникова, С. С. Тимошин // Пути реализации приоритетного Национального проекта в сфере профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний : тезисы докл. науч.-практ. конф. Хабаровск, 2007 / Дальневосточный медицинский журнал. - 2007. - № 2. – С.88.
9. Крыжановская, С. Ю. Влияние внутриутробной гипоксии на тканевой гомеостаз миокарда [Текст] / С. Ю. Крыжановская, Е. Н. Сазонова, О. А.
Лебедько, С. С. Тимошин // Пути реализации приоритетного Национального проекта в сфере профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний :
тезисы докл. науч.-практ. конф. - Хабаровск, 2007 / Дальневосточный медицинский журнал. - 2007. - № 2. – С. 82.
10. Крыжановская, С.Ю. Влияние синтетических аналогов дерморфина на тканевой гомеостаз миокарда новорожденных белых крыс [Текст] / С. Ю.
Крыжановская, О.А. Лебедько, Е.Н. Сазонова, С.С. Тимошин, Л.Е.
Молоканова // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2007. - №10. - С.
413-416.