Воздействие физиологически активных веществ на процессы регенерации у древесных растений
На правах рукописи
БОНДОРИНА Ирина Анатольевна
ВОЗДЕЙСТВИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА
ПРОЦЕССЫ РЕГЕНЕРАЦИИ У ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ
Специальность: 03.02.01 – Ботаника
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
.
Москва - 2012
2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор, Кашин Александр Степанович доктор биологических наук, профессор, Плотникова Лилиан Суреновна доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Теодоронский Владимир Сергеевич
Ведущая организация:
Российский Государственный аграрный университет – МСХА имени К.А.Тимирязева.
Защита диссертации состоится 24 мая в 11 часов на заседании диссертационного совета Д. 002.028.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук, в конференц-зале лабораторного корпуса по адресу: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д.4, ГБС РАН;
E-mail:[email protected] Факс: 8 (499) 977-91-
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГБС РАН по адресу: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. Автореферат разослан 22 февраля и размещен на сайтах ВАК http:
vak.ed.gov.ru и ГБС РАН www.gbsad
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Ю.К. Виноградова Актуальность темы. Применение стимуляторов корнеобразования позволило разработать и внедрить в производство современные технологии ускоренного вегетативного размножения растений, в том числе и интродуцированных, черенками. Достигнутые в этой области результаты бесспорны. В то же время физиологически активные вещества (ФАВ) практически не применяются при другом широко используемом способе вегетативного размножения растений – прививке, где вопросы об успешности, жизнеспособности и сроках выращивания привитых растений всегда являются важнейшими. Наряду с другими общепринятыми методами (совершенствование способов и сроков прививки, подбор оптимальных прививочных комбинаций, агротехнические и технологические мероприятия и т. д.), применение ФАВ позволило бы без больших временных и материальных затрат значительно повысить эффективность прививок.
Однако, в научных исследованиях и практических работах до сих пор отсутствует научно-обоснованная оценка применения ФАВ в качестве стимулирующих веществ, способных повлиять на регенерационно восстановительный процесс при срастании подвоя и привоя. Кроме того, остаются нерешенными такие важные вопросы, как способы обработки зоны срастания стимулирующими веществами и препаратами, динамика протекания регенерационного процесса под воздействием ФАВ. Все это требует всестороннего и глубокого изучения.
изучить особенности протекания Цель исследования:
регенерационно-восстановительных процессов при ранении периферийных тканей у лиственных и хвойных древесных растений под воздействием физиологически активных веществ и оценить пригодность ФАВ в качестве стимуляторов для повышения эффективности прививки.
Задачи исследования:
- найти оптимальный способ обработки раневой поверхности ФАВ, позволяющий объективно определить регенерационную реакцию древесных растений на воздействие этих веществ;
- выявить особенности протекания регенерационного процесса в зависимости от способа обработки раневой поверхности ФАВ;
- выделить основной диагностический признак, позволяющий определить долю влияния ФАВ на регенерационно-восстановительный процесс;
- оценить влияние ФАВ на скорость протекания регенерационного процесса;
- установить наличие коррелятивной связи между величинами, характеризующими естественную реакцию конкретных видов древесных растений при регенерации, и их реакцию под воздействием ФАВ;
- изучить действие различных по составу ФАВ на регенерационно восстановительные процессы и оценить стимулирующие свойства этих веществ;
- определить особенности протекания регенерации у разных видов растений при воздействии одних и тех же веществ и препаратов;
- разработать способ обработки места соединения подвоя и привоя, позволяющий ФАВ наиболее эффективно воздействовать на регенерационный процесс в зоне срастания;
- обосновать целесообразность применения различных стимулирующих веществ и препаратов при прививках.
Научная новизна. На основе комплексного исследования впервые разработана универсальная методика оценки ФАВ на наличие или отсутствие стимулирующих регенерационно-восстановительные процессы свойств.
Выявлена реакция различных видов растений на одни и те же вещества или препараты: определена доля влияния ФАВ на протекание регенерационного процесса у разных видов растений, а также особенности протекания регенерации при передозировке. Предложена универсальная формула для оценки стимулирующих свойств ФАВ. Впервые предложен перспективный способ обработки зоны срастания ФАВ при помощи медицинского шприца, позволяющий не только равномерно распределить стимулирующее вещество на поверхности прививочных срезов, но и обеспечить оптимальную продолжительность его воздействия. Установлено, что обладающие стимулирующими свойствами вещества и препараты оказывают влияние на сроки и скорость образования каллуса, а это является решающим фактором для успешного срастания между подвоем и привоем.
Применение Научно-практическая значимость работы.
разработанной методики позволит существенно повысить эффективность прививок хозяйственно ценных видов и декоративных форм и сортов древесных растений. Предложенная методика позволяет тестировать ФАВ и подбирать наиболее подходящие из них для стимулирования зоны регенерации конкретного вида растений. За счет ускорения образования каллуса становится возможным использовать в качестве привоя двух-, трех и четырехлетние ветви, а это позволяет, по сравнению с общепринятой технологией, на два-четыре года уменьшить срок выращивания привитых растений. Материалы диссертации могут быть использованы в высших учебных заведениях при разработке специальных курсов по вегетативному размножению растений.
Основные положения, выносимые на защиту:
- теоретическое и практическое обоснование целесообразности использования ФАВ в качестве стимуляторов для повышения эффективности прививок;
- разработанная методика и предложенная формула для оценки степени стимулирующих регенерацию свойств у тестируемых ФАВ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на симпозиуме «Состояние современного лесного комплекса: образование, наука, промышленность», (МГУЛ, 1996);
Международной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения члена-корреспондента АН СССР П.И. Лапина в ГБС РАН (Москва, 1999);
Международной конференции в Никитском Ботаническом саду (Ялта, 2003);
V Международной научной конференция (Харьков, 2006);
Всероссийской научно-практической конференции «Декоративное садоводство России: состояние, проблемы, перспективы» (Сочи, 2008);
Международной научной конференции «Проблемы современной дендрологии» (посвященная 100-летию со дня рождения член-корреспондента АН СССР П.И.Лапина) (Москва, 2009);
XIII международных научно-практических конференциях «Проблемы озеленения крупных городов» (Москва, 2010, 2011), международной конференции «Formation of Urban Green Areas 2011: Harmony of Small Architecture with Green Planting» (Клайпеда, 2011), научной конференции «Развитие российского цветоводства: состояние и перспективы» (Москва, 2011) научных семинарах ГБС РАН (1999-2012гг.).
Публикации. По материалам исследований опубликовано 39 работ, в том числе 16 статей в журналах, рекомендованных Перечнем ВАК РФ, два патента на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 265 страницах, состоит из введения, 5 глав, заключения, практических рекомендаций и основных выводов, приложения. Содержит 61 рисунок и 31 таблицу. Список использованной литературы включает 259 работ, в том числе 69 на иностранных языках.
Введение.
Содержит обзор отечественных и зарубежных работ, посвященных изучению способов повышения результативности прививки. Дана оценка многолетних научно-исследовательских работ, проводимых в ГБС им. Н.В.
Цицина РАН, по поиску новых способов и методов воздействия на прививки, позволяющих максимально повысить их эффективность, в том числе и в условиях интродукции. Отмечено, что имеющиеся немногочисленные сведения по использованию стимулирующих веществ в технологии прививки носят весьма противоречивый характер, что является следствием отсутствия единой методики для оценки пригодности этих веществ и препаратов в качестве стимуляторов при размножении растений путем прививочных операций. Это предопределило основную направленность данной работы, не имеющей аналогов как в нашей стране, так и за рубежом.
Глава 1. УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проводили в отделе декоративных растений Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина Российской академии наук с 1995 по 2011 год.
Для проведения исследования выбраны вещества и препараты, широко применяемые при искусственном размножении растений черенками: циркон (иммуномодулятор, изготовленный из эхинацеи пурпурной, действующее вещество – раствор гидроксикоричных кислот в спирте 0,1 г/л), в концентрации 1мл на 10 л воды, эпин (эпибрассинолид, на территории России распространен исключительно Эпин-Экстра) - 1мл на 5 л воды, ИМК (индолилмасляная кислота – природный ауксин) 25 мг/л,, препарат корневин (действующее вещество ИМК, в концентрации 5 г/кг) 5г на 5 л воды, Рибав экстра (продукт жизнедеятельности микоризных грибов, выделенных из корня жень-шеня) 1 мл на 10 л воды., цитодеф (ГАС-1 Суперцитокинин, действующее вещество – калиевая соль триазолил мочевины) 1мл на 1л воды, пенергетик Р 2 гр. на 10 л воды, а также новые препараты, полученные с использованием нано-технологий – Нано-гро (6 гран/л) и Нано-стим (2,2 на 10 в минус пятой степени).
Модельными объектами служили лиственные древесные растения видов, двух сортов и трех садовых форм: Acer negundo L., Acer platanoides 'Globosa', Acer platanoides L., Aesculus hippocastanum L., Betula pendula Roth., Citrus limon (L.) Burm.f, Fortunella japonica Swing., Malus baccata (L.) Borkh., Malus purpurea 'Wierdak', Populus tremula L., Quercus robur 'Fastigiata', Quercus robur L., Rosa canina L., Sorbus aucuparia L., Syringa vulgaris 'Flora 1953', Syringa vulgaris L., Tilia platyphyllos 'Laciniata', Tilia platyphyllos Scop.
Vitis amurensis Rupr. Также 6 видов хвойных древесных растений: Abies concolor (Gord) Engelm., Pinus nigra Arn., Pinus mugo Turra, Pinus sylvestris L., Larix sibirica Ledeb., Picea omorica (Panic) Purk.
При помощи хорошо заточенной трубки из нержавеющей стали диаметром 10 мм на однолетних побегах или 2-3-летних ветвях вырезали и удаляли фрагменты коры до ксилемы.
Наблюдение за объектами опытов проводили визуальным способом, а отдельные этапы протекания регенерационного процесса фиксировали цифровой фотокамерой Sony Alpha 100 с максимальным разрешением 3872х2594 пикселей в автоматическом режиме. Полученные фотографии зоны регенерации изучали в пяти-десятикратном увеличении при помощи компьютера.
При этом учитывали число дней от момента проведения вырезов коры до появления первых очагов каллуса, а также образование каллуса на поверхности выреза в динамике.
Критерий оценки стимулирующих свойств у тестируемых веществ и препаратов определяется на основе наличия или отсутствия разницы в образовании каллуса между контролем и вариантами, обработанными растворами этих веществ.
Для каждого образца вычисляется процент занятой каллусом площади выреза в динамике спустя двое суток после начала тестирования при помощи предложенной нами формулы.
При постановке опытов для разработки методики оценки стимулирующих свойств исходили из минимально возможного числа вырезов на модельных растениях, позволяющего получить достоверные результаты при 95% доверительном уровне (четыре-пять вырезов в трех повторностях). Такая постановка вопроса актуальна, когда речь идет об интродуцированных древесных растениях.
Особенностей естественного протекания регенерационного процесса исследовали у пяти видов древесных растений.
Для выявления более эффективного способа обработки ФАВ раневой поверхности, модельные растения делили на три группы. Первая группа (контроль) место ранения обвязывали прозрачной пленкой. Вторая группа – место ранения обрабатывали ФАВ при помощи тампона, затем обвязывали пленкой. Третья группа – место ранения обвязывали пленкой, затем при помощи медицинского шприца пленку в зоне ранения прокалывали и впрыскивали раствор ФАВ до окончательного заполнения пространства между пленкой и вырезом. Через сутки обвязочную пленку снимали.
В весенние сроки выполнялось тестирование трех различных ФАВ на пяти лиственных и четырех хвойных видах.
В летние сроки испытывались пять ФАВ на пяти лиственных и четырех хвойных видах.
Регенерационная реакция одного вида на воздействие различных ФАВ определялась для восьми тестируемых препаратов и веществ.
Для исследования возможности стимулирования регенерационного процесса при прививке в качестве объектов были выбраны шесть прививочных комбинаций. Прививочные операции выполнялись в открытом и закрытом грунте способами окулировка и копулировка.
Подвой – A. platanoides, привой A. platanoides 'Globosum' (эпин) подвой – T. platyphyllos, привой T. platyphyllos 'Laciniata' (эпин);
подвой – Q. robur, привой Q. robur 'Fastigiata' (эпин);
подвой – S. vulgaris, привой S. vulgaris 'Flora' (эпин);
подвой – P. sylvestris, привой P. mugo;
(Рибав-экстра);
подвой – C. limon, привой Fortunella japonica (эпин).
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методом двухфакторного дисперсионного анализа небольшой группы данных (Зайцев, 1984).
Глава 2. ОСОБЕННОСТИ ЕСТЕСТВЕННОГО ПРОТЕКАНИЯ РЕГЕНЕРАЦИОННОГО ПРОЦЕССА И РЕГЕНЕРАЦИЯ ПОД ВЛИЯНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБОВ ОБРАБОТКИ РАНЕВОЙ ПОВЕРХНОСТИ ФАВ Основным признаком для оценки действия ФАВ является способность растений к образованию каллусной ткани при ранении. При естественном ходе регенерации у растений разной видовой или сортовой принадлежности наблюдаются как общие тенденции образования каллуса, так и некоторые отличия, в основном связанные со скоростью протекания этого процесса.
а б Рисунок 1. Динамика естественного образования каллуса в весенний период на побегах P. tremula: а – спустя 7 суток после начала эксперимента;
б спустя 21 сутки. 1 – побег;
2 – разрез перидермы на побеге;
3 – вскрытая ксилема, не занятая каллусной тканью;
4 – каллус, образовавшийся по бокам выреза;
5 – каллус, образовавшийся в нижней части выреза.
а б Рисунок 2. Динамика естественного образования каллуса в весенний период на побеге а - L. sibirica спустя 30 суток после начала эксперимента;
б – P.
omorica, спустя 30 суток. 1 – побег;
2 – вырез периферийных тканей;
3 – каллус.
Естественное образование каллуса в значительной мере связано со скоростью возобновления деятельности камбия вблизи зоны ранения, а также меристематической активностью тканей, прилегающих к раневой поверхности, что зависит, в основном, от видовых особенностей растений. На поверхности раневых вырезов у P. tremula на 21 сутки образовавшийся каллус занимает 70,3% от общей площади выреза, а у L. sibirica к 30 суткам 28,5%. Каллусообразование у лиственного вида P. tremula протекает намного быстрее, чем у L. sibirica и P. omorica, относящихся к хвойным древесным видам.
Рисунок 3. Динамика естественного образования каллуса (в процентах) в зависимости от числа дней после начала эксперимента у Populus tremula.
Динамика естественного протекания регенерации у P. tremula хорошо прослеживается на графике, представленном на рис. 3. Видно, что большая часть раневого каллуса (50%) образуется до седьмых суток. В дальнейшем процесс каллусообразования идет плавно, и к 60-63 суткам, т.е. за следующие 50-55 дней, образуется еще 40-45% каллусной ткани.
Рисунок 4. Площадь естественно образовавшегося каллуса у хвойных пород в разные сроки в среднем за 90 суток. 1-й срок (начало опыта - весна) - с апреля по 24 июля, 2-й срок (лето) – с 1 июня по 30 августа.
Оценивая каллусообразование на годичных побегах у хвойных видов древесных растений, принадлежащих к семейству Pinaceae, в весенние и летние сроки, выявлено, что L. sibirica обладает, при равных других условиях, наиболее высокой способностью к образованию каллуса на раневой поверхности, как в весенний, так и в летний период. Для остальных видов (P. omorica, A. concolor, P. nigra) наибольшая способность к образованию каллуса проявляется в летний период. Четыре вида изучаемых хвойных растений в период с 1 июня по 30 августа проявляют высокую естественную регенерационную активность, что дает основание считать этот период наиболее благоприятным для выполнения прививочных операций в открытом грунте (рис. 4).
Применяя различные ФАВ, можно влиять на образование каллуса, ускоряя или замедляя этот процесс и, в конечном итоге, оказывать влияние на эффективность прививочных операций. Для того, чтобы выделить долю влияния ФАВ на каллусообразовательный процесс из совокупности влияния других, не менее важных факторов, необходимо в первую очередь решить вопрос о способе обработки раневой поверхности. Предпочтение надо отдавать тому способу, при котором меняется только динамика этого процесса, но не меняются этапы прохождения естественного каллусообразования, а также место образования каллуса на раневой поверхности. Для того, чтобы максимально сохранить естественную регенерационно-восстановительную реакцию у травмированных тканей растений, необходимо не только равномерно распределить ФАВ на раневой поверхности, но и обеспечить оптимальную продолжительность их воздействия.
В научных исследованиях и практической работе применяется несколько общепринятых способов применения ФАВ как для воздействия на растение в целом, так и на его части (замачивание, опрыскивание и др.). Из возможных способов обработки, применяемых для выявления стимулирующего эффекта у изучаемых ФАВ, предпочтение в наших исследованиях было отдано двум способам. Первый – смачивание раневой поверхности тампоном с ФАВ. Второй (предложенный нами) - введение в зону между обвязочной пленкой и раневой поверхностью раствора ФАВ при помощи медицинского шприца.
На рис. 5 заметны особенности каллусообразования при различных способах обработки раневой поверхности раствором Рибав-экстра. Видно, что на образце, не обработанном стимулятором, каллус появляется естественным образом, возникая, в основном, по периферии выреза (рис. 5 а).
При обработке раневых вырезов ФАВ с помощью тампона, раствор попадает на поверхность выреза неравномерно, и стимулирующее действие вещества проявляется на поверхности также неравномерно (рис. 5 в). При введении шприцем изучаемого ФАВ, наблюдается равномерное образование каллуса, и на 21-е сутки после начала эксперимента вся поверхность выреза полностью покрыта вновь образованной каллусной тканью (рис. 5 б).
а б в Рисунок 5. Особенности образования каллуса на поверхностях раневых вырезов у Rosa canina при применении различных способов обработки препаратом Рибав-экстра спустя 20 дней после проведения операции.
a – вырез без обработки;
б – вырез, обработанный ФАВ способом шприцевания;
в – вырез, обработанный ФАВ при помощи тампона;
1 – побег;
2 – разрез перидермы;
3 – вскрытая ксилема;
4 – каллусная ткань.
4 Рисунок 6. Особенности образования каллуса на поверхностях раневых вырезов у Vitis amurensis при обработке раствором ФАВ при помощи тампона.
1 – побег;
2 – разрез перидермы;
3 – вскрытая ксилема;
4 – каллус.
На раневых поверхностях вырезов, обработанных только при помощи тампона, каллусная ткань образуется более интенсивно в тех частях выреза, куда попало, по-видимому, достаточное количество стимулирующего вещества (рис. 6).
Проведенный анализ показал, что достоверное определение доли влияния ФАВ на образование каллуса возможно только при таком способе обработки раневой поверхности, при котором регенерационный процесс будет подобен естественному, при этом он будет или ускоряться или замедляться за счет стимулирующих или ингибирующих свойств ФАВ.
Результаты экспериментальной проверки трех физиологически активных препаратов при различных способах обработки раневой поверхности позволили выявить их влияние на скорость и интенсивность образования каллуса.
Во всех вариантах опыта на обработанных растворами ФАВ раневых поверхностях при шприцевании каллусная ткань образуется в большем количестве, чем при смачивании тампоном (табл. 1). Эта разница для эпина составляет 12,9 %, для Рибав-экстра – 37,6 %, а для циркона – 12 %.
Таблица Образование каллуса на поверхности раневых вырезов у Rosa canina в зависимости от способа обработки ФАВ через 20 дней, (%) ФАВ Способ обработки смачивание тампоном шприцевание ЭПИН 45,9±0,5 58,8±0, РИБАВ-ЭКСТРА 56,9±0,5 94,5±0, ЦИРКОН 35,3±0,1 47,3±0, Общая средняя 46,0±0,4 66,9±0, Оценивая данные по площади, занятой каллусом, следует подчеркнуть разницу в его образовании при двух способах применения препарата на 20,9%.
Хотя эта разница достаточно существенна, тем не менее, нельзя с полной уверенностью утверждать, что она является только результатом воздействия одного фактора – способа обработки раневой поверхности, исключив из этого процесса влияние неучтенных факторов. Определение доли влияния на результаты опыта этих неучтенных факторов и доли влияния интересующих нас факторов (стимулирующие свойства ФАВ и эффективность способа обработки) решали при помощи дисперсионного анализа (Зайцев, 1984).
В результате двухфакторного дисперсионного анализа (табл.2) установлено, что оба учтенных фактора в отдельности оказывают достоверное действие на регенерацию, так как вычисленные значения для фактора 1 (F1 = 46,46) и для фактора 2 (F2= 18,16) намного выше, чем величина табличных значений (для фактора 1 Fтаб = 4,45 и для фактора соответственно Fтаб = 2,81). Доля влияния на образование каллуса для каждого из факторов в процентном отношении от общей совокупности факторов, влияющих на регенерационный процесс, составляет: по первому фактору (эффективность способа обработки ФАВ) – 30,1 %;
по второму фактору (стимулирующая способность использованных в эксперименте препаратов) – 58,9 %;
и для неучтенной в данном опыте совокупности факторов (биологические особенности и физиологическое состояние растений, условия проведения опытов и т.д.) доля влияния составляет всего 11%.
Таблица Дисперсионный анализ влияния способа обработки (фактор 1) и стимулирующей эффективности ФАВ (фактор 2) на образование каллуса на поверхности раневого выреза у Rosa canina (по данным табл. 1) Варьирование Сумма Степень Дисперсия Критерий Доля данных квадратов свободы Фишера участия, отклонений % F F' Р=95% Общее =2095,83 23 93,12 6,85 2,19 По фактору 1 1=631,04 1 631,4 46,46 4,45 30, По фактору 2 2=1233,75 5 246,75 18,16 2,81 58, Остаточное 3=231,04 17 13,59 1,00 – 11, Средняя арифметическая всего опыта М=56,45%.остаточ. 56, Ошибка средней арифметической mм = 1,53 %.
N mм 1, Показатель точности опыта P = 100 2,72%.
М 56, Судя по результатам дисперсионного анализа, стимулирующие свойства ФАВ играют определяющую роль в регенерационном процессе.
Необходимо особенно отметить, что до настоящего времени нет какой-либо единой методики (как в практике, так и в научных исследованиях) для быстрого выявления стимулирующих регенерацию свойств у ФАВ. Решение этой проблемы весьма актуально, так как позволяет быстро внедрить новые экономически выгодные и экологически безопасные препараты, обладающие физиологически активными свойствами узконаправленного или многостороннего действия.
Анализ полученных экспериментальных данных и их математическая оценка дают основание считать, что опыт был методически правильно поставлен, о чем свидетельствует вычисленная величина показателя точности опыта Р = 2,72%, так как она не превышает допустимую величину показателя точности 5 %.
От способа обработки раневой поверхности зависит локализация образовавшегося каллуса, и, соответственно, протекание регенерационного процесса.
Установлено, что только при заполнении ФАВ всей зоны ранения процесс образования каллуса наиболее соответствует естественной регенерационной реакции растений.
Глава 3. ОЦЕНКА ПРИГОДНОСТИ ФАВ ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ РЕГЕНЕРАЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ.
В основу разработанной нами методики легла идея о возможности проводить сравнительную оценку регенерационных процессов, протекающих без применения ФАВ и с их применением. Предполагалось, что регенерационные процессы у одних и тех же видов растений без применения ФАВ будут протекать с определенной скоростью, присущей этому виду или сорту. При этом продолжительность прохождения отдельных этапов регенерации и всего процесса в целом можно измерить как во временных, так и в количественных единицах. Если сравнивать между собой показатели регенерации без применения каких-либо стимулирующих веществ с показателями, полученными в результате воздействия какого-либо ФАВ, то разница между ними будет указывать не только на наличие или отсутствие биостимулирующего свойства у испытуемого вещества, но и на его эффективность. Мы решили эту задачу при помощи предложенной нами формулы:
S K R=, n1 n в %, где R – стимулирующая эффективность тестируемого вещества;
S – сумма образованного каллуса у вырезов, обработанных раствором тестируемого вещества (в процентах);
K – сумма образованного каллуса у вырезов в контроле, не обработанных растворами ФАВ (в процентах);
n1 – число вырезов у растений, обработанных раствором тестируемого вещества;
n2 – число вырезов у контрольных растений, не обработанных раствором тестируемого вещества.
Тестируемые вещества или препараты обладают стимулирующими свойствами, если показатель R 0. Чем выше R, тем выше стимулирующие свойства тестируемого вещества. При R = 0 стимулирующие свойства отсутствуют. И, наоборот, при R 0 вещество или препарат действует как ингибитор.
Принцип и подготовка модельных растений для изучения влияния ФАВ на регенерационные процессы показан на рис. 7.
1 Рисунок 7. Последовательная подготовка выреза коры для введения ФАВ: 1– металлическая трубка;
2 – вырез коры;
3 – обвязка пленкой;
4 - медицинский шприц.
В ходе дальнейшей разработки установлено, что между степенью эффективности стимулирующих свойств (R) и сроками выполнения раневых вырезов наблюдается корреляционная связь. Степень стимулирующей эффективности в наиболее благоприятные для выполнения прививочных операций сроки (летние и весенние) неодинакова для разных видов лиственных и хвойных растений, что объясняется особенностями их физиологического состояния. Рассматривая вопрос о реакции различных видов древесных растений на воздействие одних и тех же ФАВ в разные сроки тестирования, можно отметить, что все изучаемые вещества, по сравнению с контролем (табл. 3), оказывают положительное стимулирующее действие на каллусообразование у лиственных древесных видов.
Вычисленные значения R показывают, что для стимулирования регенерационных процессов при заживлении ран, в том числе и прививок, для A. platanoides наиболее подходят эпин и Рибав-экстра, так как показатели их стимулирующей эффективности достаточно высокие (29,4% и 27,3%).
Менее эффективной оказалась ИМК, у которой показатель R составляет 24,7%. Надо отметить, что в среднем каллусообразование у растений, обработанных эпином, начинается на четвертые-пятые сутки, а у контрольных - на пятые-седьмые сутки. По этому показателю тестируемые ФАВ оказывают положительное стимулирующее влияние на начало каллусообразовательного процесса (табл. 3).
Таблица Оценка степени стимулирующего влияния ФАВ на регенерацию каллуса в летний срок (начало опыта – середина июля) Вид Название Начало Площадь Степень ФАВ каллусо- образованного стимулирующей образования каллуса эффективности (число спустя 30 R,% дней, в суток (в среднем) среднем), % Acer Контроль 6,3±0,5 55,5 ± 0, platanoides Эпин 4,5±0,3 84,9 ± 2,4 29, ИМК 5,5±0,3 80,2 ± 0,7 24, Циркон 5,0±0,2 83,1 ± 0,9 26, Рибав- 5,5±0,2 82,8 ± 0,6 27, экстра Aesculus Контроль 7,5±0,3 51,0 ±0, hippocastanum Эпин 5,7±0,2 66,4 ±1,7 15, ИМК 6,2±0,2 64,0 ±0,7 13, Циркон 5,2±0,2 69,8 ±0,7 18, Рибав- 7,0±0,4 61,8 ±1,3 10, экстра Populus Контроль 5,2±0,2 69,7 ±1, tremula Эпин 4,7±0,2 84,8 ± 1,3 15, ИМК 4,2±0,2 91,0 ± 1,8 21, Циркон 4,5±0,3 87,7 ± 1,4 18, Рибав- 4,0±0,4 93,2 ± 2,5 23, экстра Quercus robur Контроль 11,2±0,5 39,9 ± 0, Эпин 11,0±0,4 41,2 ± 0,7 1, ИМК 10,5±0,6 50,5 ± 0,8 10, Циркон 10,7±0,5 48,6 ± 0,8 8, Рибав- 9,5±0,3 69,9 ± 0,9 30, экстра Воздействие тех же самых ФАВ экспериментально проверено и для других видов растений.
Контроль 1 2 Эпин ИМК 1 Циркон Рибав – Экстра Рисунок 8. Образование каллуса на поверхностях раневых вырезов у A.
platanoides при обработке растворами различных ФАВ спустя 30 дней после проведения операции 1 – площадь, не занятая каллусом;
2 – площадь, занятая каллусом.
Например, наиболее эффективно на A. hippocastanum влияет циркон (табл. 3). Вычисленное значение R составляло 18,8%, а занятая каллусом площадь – 69,8%. Достаточно хорошие стимулирующие свойства проявил эпин (R=15,4%) и ИМК (R=13,0%). Незначительное положительное влияние на регенерационный процесс оказал Рибав-экстра (R=10,8%).
Оценивая вышеизложенное, следует подчеркнуть, что в раннелетний период (до середины июля) все модельные растения отреагировали положительно на стимулирующие каллусообразование известные препараты и вещества, но в разной степени. Это позволяет не только определять наличие стимулирующих свойств у тестируемого ФАВ, но и сравнивать его с другими аналогичными хорошо известными препаратами.
Исследования с теми же самыми ФАВ (эпин, ИМК, циркон и Рибав экстра) были проведены в середине мая, но с другими видами, принадлежащими к трем семействам (Aceraceae, Betulaceae, Rosaceae)..
Рисунок 9. Степень стимулирующего влияния ФАВ на образование каллуса у лиственных древесных растений в весенние сроки (начало опыта – середина мая).
Выявлено, что при обработке раневой поверхности эпином, ИМК, цирконом и Рибав-экстра все пять тестируемых растений реагируют на них положительно (табл. 4 и рис. 9). Спустя 30 суток после начала эксперимента количество каллуса, образовавшегося в контроле, меньше, чем в вариантах, с обработкой стимулирующими веществами или препаратами. Однако экспериментальные данные свидетельствуют о том, что одни и те же ФАВ проявляют свои стимулирующие свойства в неодинаковой степени у различных видов модельных растений.
Если суммировать величины стимулирующей эффективности для всех четырех ФАВ и вычислить среднюю, можно получить представление о биологической отзывчивости и реакции конкретного вида на воздействие любых веществ, обладающих стимулирующими свойствами.
Таблица Оценка стимулирующего влияния ФАВ в весенне-летние сроки (начало опыта – середина мая) на лиственные древесные растения (%) Вид Название Площадь, занятая Степень ФАВ каллусом стимулирующей за 30 суток (%), в эффективности, среднем R, % Acer negundo Контроль 40,8±0,3 Эпин 43,7±0,2 2, ИМК 41,2±0,2 0, Циркон 49,8±0,2 9, Рибав-экстра 46,6±0,2 5, Среднее 4, Betula Контроль 40,3±0,2 pendula Эпин 60,9±0,5 20, ИМК 55,6±0,2 15, Циркон 42,9±0,3 2, Рибав-экстра 51,0±0,3 10, Среднее 12, Malus baccata Контроль 68,8±0,5 Эпин 89,5±0,2 20, ИМК 85,9±0,2 17, Циркон 75,0±0,4 6, Рибав-экстра 91,5±0,4 22, Среднее 16, Sorbus Контроль 38,2±0,2 aucuparia Эпин 55,4±0,2 17, ИМК 49,9±0,3 11, Циркон 43,7±0,2 5, Рибав-экстра 58,5±0,2 20, Среднее 13, Rosa canina Контроль 38,6±0,2 Эпин 61,0±0,3 22, ИМК 57,1±0,3 18, Циркон 52,2±0,3 13, Рибав-экстра 67,3±0,3 28, Среднее 20, В данном эксперименте A. negundo, в целом, в наименьшей степени реагирует на обработку ФАВ (R сред.=4,5%). Наиболее отзывчивым объектом на воздействие ФАВ является R. canina (Rсред.=20,8%).
Оценивая растения по этому показателю, можно определить, насколько эффективно конкретный вид будет реагировать на обработку ран и зоны срастания ФАВ.
В нашем случае по этим показателям R. canina занимает первое место (Rсред.=20,8%), на втором M. baccata (Rсред.=16,7%), на третьем S.
aucuparia (Rсред.=13,7%), на четвертом B. pendula (Rсред.=12,2%) и на последнем, пятом A. negundo (Rсред.=4,5%).
Экспериментальная проверка возможности применения предложенной методики для оценки степени пригодности ФАВ в качестве стимуляторов, повышающих эффективность прививки, показала правильность и перспективность выбранного направления.
При помощи данной методики мы можем определить наличие стимулирующего или ингибирующего влияния у тестируемых ФАВ на регенерационный процесс у лиственных древесных видов растений. Кроме того, по результатам вычисленной величины R (степень стимулирующей эффективности ФАВ) можно подобрать наиболее подходящий стимулятор для каждого конкретного вида растений.
Проведенные исследования показали, что в ГБС у четырех изучаемых видов хвойных древесных растений, так же, как у лиственных древесных растений, регенерационно-восстановительные процессы изменяются под воздействием ФАВ.
В период с 30 апреля по 30 июня (за 60 суток) образовавшийся каллус на поверхности вырезов, в среднем, характеризует как естественную реакцию на ранения каждого вида, так и реакцию каждого вида на воздействие различных ФАВ (табл. 5).
Видно, что P. omorica наиболее интенсивно отзывается на воздействие эпина. Образование каллуса за период наблюдения (60 суток) на поверхности вырезов составило 52,5% от общей площади, и это на 21,3% больше, чем в контроле (31,2%). Обработка ран раствором циркона также дала положительные результаты - 50,1% от общей площади занято каллусом при 31,2% у контроля. Корневин не оказал какого-либо заметного влияния на регенерационно-восстановительные процессы, протекающие на поверхности ран у P. omorica.
Применение эпина оказалось наиболее эффективным по сравнению с другими препаратами и для L. sibirica (96,4%) и A. concolor (47,4%).
Образование каллуса медленнее всего протекает у P. nigra. За первые два месяца у контрольных вырезов образовалось всего 6,6% каллусной массы. На образование каллуса существенное влияние оказала обработка раневой поверхности вырезов цирконом. В этом случае на раневой поверхности образовалось 43,7% каллуса, что на 37,1% больше, чем у контроля. Обработка эпином и корневином также оказала положительное влияние на регенерационный процесс, хотя и намного меньше, чем обработка цирконом.
Если эпин проявил себя как лучший стимулятор для P. omorica (R=21,3%), то его влияние на регенерацию у L. sibirica самое слабое (R=4,1%). Из четырех видов хвойных деревьев P. nigra хорошо реагирует на воздействие всех трех тестируемых препаратов (табл. 5). И это, прежде всего, связано с низкой естественной способностью этого вида в весенний период к регенерации, о чем свидетельствует небольшое образование каллуса у контроля.
Таблица Оценка степени стимулирующего влияния ФАВ в весенние и раннелетние сроки (с 30 апреля по 30 июня) у хвойных древесных растений Вид Название ФАВ Образование Степень каллуса в стимулирующего среднем за 60 эффекта, R (%) суток (%).
Picea omorica Контроль 31,2±0,3 Циркон 50,1±0,3 18, Эпин 52,5±0,2 21, Корневин 31,2±0,2 Среднее 13, Larix sibirica Контроль 92,3±0,2 Циркон 94,3±0,3 2, Эпин 96,4±0,3 4, Корневин 93,8±0,5 1, Среднее 2, Abies concolor Контроль 31,9±0,5 Циркон 43,7±0,3 11, Эпин 47,4±0,4 15, Корневин 36,0±0,4 4, Среднее 10, Pinus nigra Контроль 6,6±0,2 Циркон 43,7±0,2 37, Эпин 25,4±0,3 18, Корневин 30,6±0,2 24, Среднее 26, Противоположная картина наблюдается у L. sibirica. За 60 суток в контроле регенерационный процесс идет очень интенсивно, и каллус к этому моменту занимает в среднем 92,3% от площади вырезов. На фоне достаточно L. sibirica высокой естественной регенерационной способности дополнительное стимулирование этого процесса при помощи трех ФАВ также оказывает положительное влияние, но не очень сильное.
Стимулирующая эффективность корневина у L. sibirica составляет R=1,5%, циркона R=2,0% и эпина R=4,1%.
Во втором варианте опыта, проведенного в летний период, кроме трех стимулирующих препаратов - циркона, эпина и корневина, добавлены еще два препарата: Рибав-экстра и пенергетик (таб. 6). Использование препарата пенергетик в качестве стимулятора дало обратный результат для всех четырех изучаемых видов (рис. 10).
Результаты, полученные в контроле, гораздо выше, чем результаты, полученные во всех вариантах опыта, обработанных препаратом пенергетик.
Следовательно, данный препарат в рекомендуемых дозах на изученные хвойные породы действует как ингибитор, т.е. подавляет каллусообазовательный процесс. Ингибирующее действие препарата пенергетик наиболее заметно, когда обработке подвергаются раневые вырезы у P. nigra R= -9,9%, а в наименьшей степени он воздействует на A. concolor R= -5,0%.
Рисунок 10. Степень стимулирующего влияния ФАВ на образование каллуса у хвойных древесных растений в летние сроки (с 1 июня по 30 августа).
Сравнивая между собой результаты, полученные в весенние (табл. 5), и летние сроки (табл. 6), можно отметить, что весной эпин оказал наиболее заметное влияние на три из четырех видов хвойных: P.omorica, L.sibirica и A.concolor, а в летний период - только у P.omorica. Самое слабое, но положительное влияние на каллусообразование в весенний период оказал корневин у трех из четырех видов (P. omorica, L. sibirica, A. concolor), а в летний период корневин показал самое низкое, но положительное влияние у двух видов (L.sibirica и A.concolor), а Рибав-экстра - у P.nigra и P.omorica.
Таблица Оценка степени стимулирующего влияния ФАВ в летние сроки (1 июня – июля) у хвойных древесных растений Вид Название ФАВ Образование Степень каллуса в стимулирующего среднем за 60 эффекта, R (%) суток, % Picea omorica Контроль 47,4±0,4 Циркон 51,0±0,5 3, Эпин 52,7±0,5 5, Корневин 51,5±0,3 4, Рибав-экстра 50,4±0,3 3, Пенергетик 39,5±0,2 -7, Среднее 1, Larix sibirica Контроль 69,7±0,3 Циркон 92,7±0,4 23, Эпин 79,4±0,4 9, Корневин 72,0±0,3 2, Рибав-экстра 84,9±0,3 15, Пенергетик 64,0±0,4 -5, Среднее 8, Abies concolor Контроль 62,7±0,5 Циркон 69,0±0,8 6, Эпин 77,4±0,4 14, Корневин 64,0±0,4 1, Рибав-экстра 82,6±0,6 19, Пенергетик 57,7±0,5 -5, Среднее 7, Pinus nigra Контроль 62,6±0,7 Циркон 69,9±0,4 7, Эпин 71,0±0,6 8, Корневин 78,9±0,5 16, Рибав-экстра 69,7±0,4 7, Пенергетик 52,7±0,2 -9, Среднее 5, Оценивая величину стимулирующего эффекта для каждого препарата, можно отметить, что наиболее высокие стимулирующие свойства показал циркон (R = 23,0%) при обработке ран у L. sibirica, Рибав-экстра (R = 19,9%) проявил свои лучшие стимулирующие свойства при обработке вырезов у A.
concolor, корневин - у P. nigra (R= 16,3%) и эпин - у P. omorica (R=5,3%).
Обобщая вышеизложенное, хочется подчеркнуть, что не все предлагаемые препараты можно использовать в качестве стимулирующих веществ. Поэтому тестирование ФАВ предложенной методикой позволяет на раннем этапе отбраковывать не подходящие для стимулирования регенерации препараты.
Образование каллуса, как для лиственных, так и для хвойных растений, является основным фактором успешного срастания подвоя и привоя, особенно на начальном периоде – спустя 30 суток после выполнения прививочной операции. От образования каллуса на поверхности прививочных срезов зависит конечный результат прививки, поэтому очень важной является возможность влиять на этот процесс при помощи биологически активных веществ.
В данном эксперименте контроль 1 - это ранение без обработки каким либо веществом, то есть происходит естественное протекание регенерационно-восстановительного процесса. Контроль 2 – ранение было обработано дистиллированной водой. Стимулирующая эффективность вычислялась по отношению к двум вариантам контролям (соответственно R (по отношению к контролю 1) и R2 (по отношению к контролю 2).
Таблица Влияние тестируемых веществ на образование каллуса у Acer platanoides спустя 30 дней после начала эксперимента Тестируемый Среднее Стимулирующая Стимулирующая препарат или образование эффективность, эффективность, R вещество каллуса,(%) R1 % % Контроль 1 55,5±0,8 - (без обработки) Контроль 2 72,3±0,7 16,8 (дистиллирован ная вода) Водопроводная 71,2±0,4 15,7 -1, вода Эпин 84,9±2,4 29,4 12, ИМК 80,2±0,7 24,7 7, Циркон 83,1±0,9 27,6 10, Рибав-экстра 82,8±0,6 27,3 10, Нано-гро 89,1±0,5 33,6 16, Нано-стим 78,7±0,4 23,3 6, Полученная таким образом разница объективно указывает на ту долю влияния, которую оказывает это вещество или препарат на каллусообразование (таб. 7).
Дистиллированная вода, равно как и водопроводная, проявляет себя по сравнению с контролем 1, как стимулирующее вещество и, соответственно, будет оказывать положительное влияние на регенерационный процесс. По видимому, это связано, прежде всего, с тем, что в зоне каллусообразования наличие в течение суток дистиллированной воды создает более благоприятные условия для протекания регенерационного процесса. При таком подходе величину стимулирующей эффективности, вычисленную для любого препарата или вещества, растворенного в дистиллированной воде, можно разделить условно на две составляющие – одна получена в результате присутствия дистиллированной воды, другая - за счет наличия стимулирующих свойств изучаемого вещества. Например, если эффективность каллусообразования в зоне выреза, обработанного Нано-гро, растворенного в дистиллированной воде, составляет R=33,6%, то можно считать, что это произошло под влиянием обоих компонентов в растворе.
При этом доля влияния дистиллированной воды составляет R=16,8%, от влияния растворенного в дистиллированной воде препарата Нано-гро R = 33,6%. Таким образом, для любого вещества или препарата можно выделить долю его стимулирующей эффективности, которая для Нано-гро будет равна 16,8% (33,6-16,8%), для ИМК – 7,9% (24,7-16,8) и т.д.
Рисунок 11. Стимулирующая эффективность ФАВ (модельное растение Acer platanoides).
Величина стимулирующей эффективности водопроводной воды, когда в качестве контроля служит естественное протекание регенерации, составляет 15,7%. Рассматривая водопроводную воду как раствор из дистиллированной воды и различных примесей, можно выделить их воздействие на регенерационный процесс. По сравнению с чистой дистиллированной водой (16,8%), это влияние отрицательно.
Обобщая вышеизложенное, можно отметить, что разработанная методика позволяет объективно оценить степень стимулирующего или ингибирующего воздействия различных веществ и препаратов на каллусообразование в зоне ранения у древесных растений. Проведено сравнение различных веществ по степени стимулирующего воздействия.
Глава 4. РЕГЕНЕРАЦИОННАЯ РЕАКЦИЯ РАСТЕНИЙ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАВ.
Успех прививки в большой степени зависит от скорости, с которой протекает регенерационный процесс. Особенно это актуально в северных регионах, где совокупность климатических факторов не благоприятствуют регенерации.
Мы выяснили, как при других равных условиях повысить эффективность прививки, при этом не только увеличить процент приживаемости, но и сократить сроки выращивания привитых растений. Эта проблема решается в случае использования в качестве привойного материала двух-четырехлетних ветвей маточного растения.
Таблица Степень стимулирующего влияния ФАВ на разные виды лиственных древесных растений Вид Степень стимулирующей эффективности ФАВ, R (%) Стимулятор Эпин ИМК Циркон Рибав экстра Acer platanoides 29,4 24,7 26,6 27, Acer negundo 2,9 0,4 9,0 5, Aesculus 15,4 13,0 18,8 10, hippocastanum Betula pendula 20,6 15,3 2,6 10, Malus baccata 20,7 17,1 6,2 22, Populus tremula 15,1 21,3 18,0 23, Quercus robur 1,3 10,6 8,7 30, Sorbus aucuparia 17,2 11,7 5,5 20, Rosa canina 22,4 18,5 13,6 28, Для того, чтобы решить эту весьма перспективную задачу, в первую очередь необходимо подобрать для каждой прививочной комбинации то ФАВ которое будет оказывать наиболее сильное положительное влияние на регенерационный процесс, особенно в первое время после прививки (табл. 8).
Нами установлено, что испытанные в данной работе ФАВ, обладают различной способностью оказывать стимулирующее влияние на образование каллуса. Кроме того, применение веществ, обладающих стимулирующими свойствами, существенно влияет не только на начало появления каллуса, но и на динамику и интенсивность его образования.
Эпин, по сравнению с остальными испытываемыми веществами, оказал наиболее выраженное положительное стимулирующее влияние на регенерационный процесс у A. platanoides (R=29,4%) и B. pendula (R=20,6%).
Стимулирующая эффективность циркона проявляется наиболее заметно у A.
hippocastanum (R=18,8%) и A. negundo (R=9,0%). Стимулирующее влияние ИМК также положительно, но по сравнению с эпином, цирконом и Рибав экстра, ИМК не проявила себя как вещество, способное оказывать наиболее высокое влияние конкретно на какое-либо из растений. Действие Рибав экстра оказалось более универсальным. Положительная реакция на стимулирующие свойства этого препарата наблюдалась у пяти из девяти видов растений (M. baccata R=22,7%;
P. tremula R=23,5%;
Q. robur – R=30,0%;
S. aucuparia – R=20,3%;
R. canina – R=28,7%). Можно прогнозировать, что его применение в качестве стимулирующего препарата в прививочных операциях, где данные виды участвуют в качестве подвоя или привоя приведет к повышению приживаемости прививки.
Все три представителя семейства Rosaceae отреагировали наиболее положительно на препарат Рибав-экстра, и в самой меньшей степени, на циркон (M. baccata – R=6,2%;
S. aucuparia – R=5,5%;
R. canina – R=13,6%).
Обобщая вышеизложенное, следует еще раз подчеркнуть, что регенерационные процессы у разных лиственных древесных растений протекают с неодинаковой скоростью и активностью после воздействия на эти процессы стимуляторами. Растения, принадлежащих к разным семействам, родам и видам, при регенерации отзываются на одни и те же ФАВ по-разному, и степень стимулирующего влияния одного и того же препарата будет неодинаковая для разных видов растений.
Модельные хвойные растения также реагируют на воздействие стимулирующих веществ (рис. 12).
Летом наиболее сильное влияние ФАВ оказали на L. sibirica (табл. 9).
По-видимому, это связано, прежде всего, с биологическими особенностями модельных растений. Хотя они принадлежат к одному семейству Pinaceae, тем не менее, лиственница ежегодно сбрасывает хвою. Соответственно, она отличается от остальных хвойных по фенологическому ритму роста и развития, что в первую очередь влияет на ее естественную регенерационную способность, которая, как показали наши исследования, намного выше, чем у P. omorica, A. concolor и P. nigra.
Обращает на себя внимание и тот факт, что все три тестируемые вещества проявили более сильно свои стимулирующие свойства в весенний период. В среднем наиболее высокие показатели наблюдаем для циркона - R ср.= 17,47% в весенние сроки тестирования, и R ср.= 10,05% для летних сроков. Самые низкие показатели вычислены для корневина - R ср.=7,4% для весенних, и R ср.=6,0% для летних сроков тестирования.
циркон эпин корневин Рисунок 12. Степень стимулирующего влияния ФАВ в зависимости от сроков воздействия на модельные хвойные растения.
Таблица Степень стимулирующего влияния ФАВ на регенерацию каллуса у хвойных древесных растений разных видов Вид Степень стимулирующей эффективности ФАВ (R%) Циркон Эпин Корневин Среднее весна весна весна весна лето лето лето лето Picea 18,9 3,6 21,3 5,3 0,0 4,1 13,4 4, omorica Larix sibirica 2,0 23,0 4,1 9,7 1,5 2,3 2,5 11, Abies 11,8 6,3 15,5 14,7 4,1 1,3 10,5 7, concolor Pinus nigra 37,1 7,3 18,8 8,4 24,0 16,3 26,6 10, Средняя 17,45 10,05 14,92 9,53 7,40 6,00 13,3 8, При тестировании ФАВ и оценке их стимулирующей эффективности необходимо брать во внимание физиологическое состояние модельных растений, которое меняется в течение периода вегетации, как у лиственных, так и у хвойных растений (табл. 9).
Принимая во внимание, что действие стимулирующих свойств у любого вещества не может сохраняться неограниченно долго, для разработки и совершенствования предлагаемой методики были выделены этапы протекания регенерационного процесса, во время которых стимулирующие свойства ФАВ проявляются наиболее активно. Кроме того, определен тот этап протекания регенерационного процесса, когда действие стимулирующего вещества прекращается. Это позволяет оценить влияние, которое будет оказывать применяемое вещество на регенерацию прививки в каждой конкретной прививочной комбинации.
Известно, что регенерационный период или период срастания между подвоем и привоем, у разных видов имеет различную продолжительность.
Этот период начинается сразу после выполнения прививочной операции и заканчивается после успешного соединения проводящих систем подвоя и привоя.
Для изучения влияния ФАВ на динамику регенерационных процессов взяты четыре вида древесных лиственных растений, для которых по предварительному тестированию (табл. 9) были определены наиболее эффективные стимулирующие вещества и препараты.
Уже в начальный период, независимо от видовых особенностей растений, образование каллуса при обработке стимуляторами протекает более интенсивно. Суточная разница в образовании каллуса у опытных и контрольных растений, составляет, например, у P. tremula на четвертые сутки 0,2%, и у A. platanoides на шестые сутки 0,8% (табл. 10). В дальнейшем это опережение сохраняется у всех видов до 21-го дня. После чего образование каллуса в контроле и вариантах, обработанных стимуляторами, выравнивается.
Таблица Воздействие ФАВ на динамику регенерационного процесса у лиственных древесных растений Вид, Число Образование каллуса, % стимулирующее дней естественным путем под воздействием ФАВ вещество (контроль) среднее За сутки, % среднее За сутки, % Populus tremula 4 5,2±0,1 1,3 6,0±0,2 1, (Рибав-экстра) 7 31,0±0,1 3,7 36,6±0,9 4, 14 57,7±0,2 3,8 75,1±0,3 5, 21 70,3±0,1 1,8 88,4±0,5 1, 28 77,3±0,3 1,0 96,1±0,3 1, 35 80,8±0,2 0,5 99,6±0,3 0, 42 84,3±0,2 0,5 100 49 87,1±0,3 0,4 - 56 89,9±0,3 0,4 - 63 91,3±0,2 0,2 - Acer platanoides 6 2,8±0,2 0,5 7,9±0,2 1, (эпин) 7 22,2±0,2 2,8 28,7±0,2 3, 14 45,3±0,2 3,3 61,6±0,3 4, 21 52,3±0,4 1,0 77,7±0,3 2, 28 55,1±0,3 0,4 84,7±0,3 1, 35 59,9±0,4 0,7 92,5±0,3 1, 42 60,0±0,3 0,1 96,0±0,3 0, 49 62,1±0,3 0,3 98,1±0,3 0, 56 64,2±0,3 0,2 99,5±0,3 0, 63 78,2±0,4 2,0 Betula pendula 7 4,2±0,3 0,6 5,8±0,1 0, (ИМК) 14 23,8±0,3 2,8 27,5±0,2 3, 21 39,2±0,3 2,2 59,7±0,2 4, 28 46,9±0,4 1,1 72,3±0,3 1, 35 51,1±0,3 0,6 79,3±0,3 1, 42 54,6±0,3 0,5 82,8±0.2 0, 49 58,1±0,3 0,5 85,6±0,2 0, 56 61,6±0,2 0,5 90,5±0,3 0, 63 63,0±0,4 0,2 91,9±0,3 0, Aesculus 7 5,9±0,2 0,8 7,3±0,2 1, hippocastanum 14 29,0±0,4 3,3 33,9±0,2 3, (циркон) 21 44,4±0,3 2,2 54,9±0,4 3, 28 50,7±0,2 0,9 61,9±0,3 0, 35 54,9±0,4 0,6 67,5±0,3 0, 42 57,7±0,4 0,4 71,0±0,3 0, 49 60,5±0,3 0,4 73,8±0,3 0, 56 62,6±0,2 0,3 75,2±0,3 0, 63 64,0±0,3 0,2 76,6±0,3 0, Эффект стимулирующих свойств у ФАВ проявляется до 20–25 суток.
После этого периода стимулирующие свойства практически достигают нулевого порога, о чем свидетельствуют близкие значения динамики суточного образования каллуса у контрольных и обработанных ФАВ растений.
Тем не менее, у разных растений повышение регенерационной способности зависит от их видовых особенностей и стимулирующих свойств ФАВ, которые могут проявляться по-разному конкретно для каждого вида.
Например, для P. tremula препарат Рибав-экстра – оказался наиболее подходящим по сравнению с другими стимулирующими веществами, использованными в данном эксперименте. Первые заметные каллусные образования появляются на четвертые сутки после ранения и к этому сроку уже занимают 5,2% от площади выреза контрольного растения (табл. 10). У P. tremula активная фаза естественного образования каллуса продолжается до 14-15 суток, и самый высокий процент за одни сутки наблюдается в период с 7 до 14 суток (3,8%). В дальнейшем процесс каллусообразования постепенно замедляется, и на 28 сутки достигает всего 1%. Такая тенденция сохраняется и до 63 суток, когда каллусообразование для контрольного варианта снижается до минимума – всего 0,2% в сутки. К этому сроку каллус занимает 91,3% от площади раневого выреза. Однако регенерационные процессы ускоряются под воздействием стимулирующих веществ. При этом, как и у контроля, суточное образование каллуса нарастает с начала эксперимента и достигает также максимума к 14 суткам (5,5%). В дальнейшем площадь образованного каллуса в сутки уменьшается. К 35 суткам под воздействием препарата Рибав-экстра каллусная ткань занимает 99,6% от площади раневого выреза.
У контрольных и опытных растений наблюдаются явные различия в скорости образования каллуса. Степень стимулирующей эффективности наиболее явно проявляется у P. tremula до 21 суток, причем достигает своего максимума с 10 по 15 сутки. В этот период разница в образовании каллуса у контроля и опыта наиболее заметна и составляет 1,7%. Затем процесс каллусообразования и в опыте, и в контроле происходит примерно с одинаковой скоростью.
Надо отметить, что такая тенденция сохраняется и при использовании других препаратов (ИМК, эпин и циркон), примененных к другим видам растений. Динамика протекания регенерационного процесса в течение суток под воздействием ФАВ полностью совпадает с динамикой естественного протекания (табл. 10). Разница наблюдается только в площади образовавшегося каллуса на раневой поверхности. У A. platanoides под воздействием эпина среднее суточное количество вновь образованного каллуса достигает своего максимума к 14 суткам – 4,7% в сутки, как и у контроля – 3,3%. У B. pendula под воздействием стимулирующего вещества (ИМК) наиболее интенсивное образование каллуса наблюдается к 21-м суткам – 4,6% в сутки, а у контроля - к 14 суткам (2,8%). К 14-м суткам разница в образовании каллуса между контролем и вариантом с ИМК составляет всего 0,3%, а к 21-м суткам эта разница достигает 2,4% (рис. 13).
Такая тенденция наблюдается и для A. hippocastanum, только в данном случае и у контроля, и у растений, обработанных препаратом циркон, пик среднесуточного образования каллуса наступает к 14-м суткам – у контроля 3,3%, а под воздействием ИМК 3,8%, На начальном этапе регенерации прививки очень важно насколько быстро начинается образование каллуса на поверхности прививочных срезов подвоя и привоя. Так как этот процесс схож с процессом каллусообразования при заживлении ран, полученных в результате выреза коры, то любая возможность ускорить его приведет к повышению эффективности прививки.
В процессе каллусообразования ФАВ, как показали исследования, могут играть очень важную положительную роль.
Рисунок 13. Динамика процесса регенерации у B. pendula под воздействием ИМК (образование каллуса в процентах в зависимости от числа дней с начала опыта).
Чем раньше и интенсивнее начнется образование каллуса в зоне прививочных срезов, тем больше шансов для успешного срастания прививочных компонентов и, соответственно, получения хорошо развитого привитого растения.
Прививочную операцию можно считать успешной только в том случае, если между подвоем и привоем произошло прочное срастание без каких-либо аномальных или патологических изменений.
Acer negundo – Эпин Acer platanoides - Циркон Рисунок 14. Патология образования каллуса на поверхности раневых вырезов при передозировке ФАВ спустя 30 дней после проведения операции.
1 - нормальное развитие каллуса;
2 - патологические изменения.
При передозировке или других факторах, в том числе и особенностей ФАВ, наблюдается отклонение от обычного, типичного для данного вида растений протекания регенерационно-восстановительного процесса.
Патологические картины в протекании регенерации показаны на рис. 14. В первом случае регенерационно-восстановительный процесс у A. negundo при передозировке эпина протекает слишком интенсивно, что приводит к чрезмерному разрастанию каллусной ткани.
У A. platanoides (второй образец), регенерационный процесс под воздействием передозировки ФАВ также проходит с явными признаками аномалии. Раневая поверхность вырезов, обработанная более концентрированным раствором цирконом, почернела, что является характерным признаком, указывающими на гибель поверхностного слоя клеток у вскрытых при вырезе тканей. Конечно, гибель одного или нескольких рядов клеток на поверхности раневых срезов не может являться причиной отсутствия или прекращения образования каллуса, поскольку погибшие клетки вместе с вытекшим при ранении содержимым клеток входят в состав изолирующего слоя. Но в данном случае этот слой становится более мощным и для его преодоления при регенерации требуется гораздо больше времени.
Глава 5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАВ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИВИВОК На примере прививочной комбинации A. platanoides 'Globosum' на A.
platanoides (обработка эпином) разработаны основные методические принципы и приемы для практического использования ФАВ с целью повышения эффективности прививки и ускоренного размножения декоративных форм с необычной формой кроны (шаровидной, зонтичной, пирамидальной и др.). (рис 15) 3 Рисунок 15. Прививка Acer platanoides 'Globosum' способом улучшенной копулировки вприклад на подвой A. platanoides.
1 - подвой;
2 - привой трехлетняя ветвь;
3 - прививочный разрез;
4 обвязочная пленка;
5 - шприц Использование в качестве привоя двух-трехлетних ветвей вместо одной почки, как это делается при традиционном способе прививки, весьма целесообразно, когда речь идет о садовых формах с необычной формой кроны, так как позволяет сократить период выращивания привитых растений на два-три года.
В результате проведенных экспериментальных исследований установлено, что когда прививочную операцию выполняют в закрытом грунте и с применением соответствующего ФАВ для стимулирования регенерационного процесса приживаемость прививки увеличивается в среднем на 15-20%. В теплице необходимо поддерживать относительно высокую температуру (20-25°С) и влажность воздуха (80-95%) в период активного процесса регенерации. Предложенная методика прививки успешно апробирована и для таких прививочных комбинаций, как:
подвой – T. platyphyllos, привой – двухлетняя ветвь T. platyphyllos 'Laciniata' (эпин);
подвой – Q. robur, привой - трехлетняя ветвь Q. robur 'Fastigiata' (эпин);
подвой – S. vulgaris, привой – двулетняя ветвь S. vulgaris 'Flora 1953' (эпин);
подвой – P. sylvestris, привой – одревесневший побег P. mugo;
(Рибав экстра) подвой – C. limon, привой – одревесневший побег с 4-5 почками Fortunella japonica (эпин).
Такой подход позволяет получать привитые растения с достаточно хорошо сформированной кроной уже в первый год после выполнения прививочной операции. Полученные привитые растения можно высаживать на постоянное место уже спустя 2-3 месяца после выполнения прививочной операции, поскольку к этому сроку привитые растения имеют не только хорошо сформированную крону, но и достаточно прочное срастание между подвоем и привоем.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Разработанная методика позволяет определить наличие и интенсивность стимулирующих свойств у ФАВ при регенерации тканей на раневой поверхности. Кроме того, эта методика дает возможность быстро и надежно выявить наиболее подходящее стимулирующее вещество или препарат для конкретного вида растений. Проведенное исследование позволяет более широко использовать ФАВ в научно-исследовательских и научно-производственных работах, связанных с изучением регенерации прививок и вегетативном размножении растений прививкой.
Методика «Способ оценки стимулирующих свойств у физиологически активных веществ (ФАВ)» запатентована. Решение о выдаче патента на изобретение AO1G 7/00 от 01/2011г.
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.
1. Основными диагностическими параметрами для определения стимулирующих свойств у ФАВ и препаратов являются сроки образования каллуса и его количество на раневой поверхности.
2. Особенности образования каллусной ткани зависят от способа обработки ФАВ раневой поверхности. Естественной регенерационной реакции растений на ранение наиболее соответствует реакция при введении этих веществ непосредственно в пространство между обвязочной пленкой и раневой поверхностью до ее заполнения.
3. Скорость протекания регенерационных процессов является видоспецифичной. Для каждого вида растений подходящие ФАВ необходимо подбирать экспериментальным путем.
4. Разработана универсальная формула для оценки степени наличия у ФАВ свойств, стимулирующих регенерационно-восстановительный процесс при заживлении ран у древесных растений. Для каждого образца вычисляется процент занятой каллусом площади выреза в динамике после начала тестирования по предложенной нами формуле:
S K R=, n1 n в %, где R – стимулирующая эффективность тестируемого вещества;
S – сумма процентов образованного каллуса у вырезов, обработанных раствором тестируемого вещества;
K – сумма процентов образованного каллуса у вырезов контроля, не обработанных растворами ФАВ;
n1 – число вырезов у растений, обработанных раствором тестируемого вещества;
n2 – число вырезов у контрольных растений, не обработанных раствором тестируемого вещества.
При наличии биостимулирующих свойств у тестируемого вещества вычисленный показатель степени стимулирующих свойств R 0. Чем выше R, тем выше стимулирующие свойства тестируемого вещества. При R = стимулирующие свойства отсутствуют. При R 0 вещество или препарат действует как ингибитор.
5. Установлена связь между естественной регенерационной способностью растений и реакцией на воздействие ФАВ. Чем ниже естественная регенерация, тем выше степень проявления стимулирующего эффекта. На высоком естественном уровне регенерации проявление стимулирующих свойств ФАВ менее заметно.
6. Выявлено, что динамика регенерационного процесса одинакова у контрольных растений и обработанных ФАВ. Отличие наблюдается только в скорости заполнения каллусом раневой поверхности.
7. Установлено, что препараты пенергетик и циркон на исследуемых растениях и в примененных концентрациях оказали ингибирующее действие на процессы каллусообразования.
8. Показана целесообразность применение ФАВ в качестве стимуляторов при срастании прививок, выполненных различными способами (окулировка, улучшенная копулировка).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Разработана универсальная методика и формула для оценки степени наличия у ФАВ свойств, стимулирующих регенерационно восстановительный процесс при заживлении ран у древесных растений. Предложенная методика позволяет тестировать биологически активные вещества и препараты и определять наиболее эффективные ФАВ для данного вида растений.
2. Предложена технология прививки с применением стимуляторов регенерационного процесса, позволяющих увеличить размер используемого привоя. Использование ФАВ для прививки позволяет сократить срок выращивания стандартных привитых саженцев, по сравнению с общепринятой технологией.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации:
1. Кръстев М.Т., Мельникова М.Н., Бондорина И.А., Окунева И.Б.
Оценка вегетативного размножения жимолости съедобной // Бюл. Гл.
ботан. сада. 1992. Вып.164. С. 24-30.
2. Кръстев М.Т., Бондорина И.А. Миниатюрные розы на штамбе // Инф.
бюл. Совет ботанических садов России. 1996. Вып.4. С. 76-78.
3. Кръстев М.Т., Бондорина И.А. Прививка сортов миниатюрных роз на неукорененные черенки // Бюл. Гл. ботан. cада. 1996. Вып. 173. С. 167 169.
4. Кръстев М.Т., Бондорина И.А., Буздин С.А. Основные принципы создания новых декоративных форм растений путем прививки // Цветоводство сегодня и завтра. М., 1998. С. 151-152.
5. Кръстев М.Т., Бондорина И.А., Окунева И.Б Оценка регенерационного потенциала древесных растений, используемых в качестве компонентов прививки // Проблемы дендрологии на рубеже ХХI века. М., 1999. С. 183 184.
6. Бондорина И.А. Методика определения биологической совместимости подвоя и привоя // Проблемы дендрологии на рубеже ХХI века. М., 1999. С.
46-47.
7. Кръстев М.Т., Бондорина И.А. Прививка в штамб как способ изменения декоративных качеств древесных лиственных растений // Бюл. гос.
Никитского ботанического сада. Ялта. 2003. Вып. 88. С. 79-81.
8. Кръстев М.Т., Бондорина И.А, Седов Г.А. // Оценка пригодности ФАВ для стимулирования регенерационных процессов при прививке // Цветоводство без границ. Материалы V Междунар. научн. конф. Харьков, 2006. С. 77-80.
9. Кръстев М.Т., Бондорина И.А, Седов Г.А. Эффективное размножение клена остролистного шаровидного прививкой // Цветоводство без границ.
Материалы V Междунар. научн. конф. Харьков, 2006. С. 80-82.
10. Кръстев М.Т., Бондорина И.А. Методы оценки регенерационного потенциала древесных лиственных растений // Сохранение биоразнообразия растений в природе и при интродукции. Сухуми, 2006. С. 282-283.
11. Кръстев М.Т., Бондорина И.А, Жукова И.Г., Карьянова И.В. Прививка древовидного пиона (Paeonia suffruticosa Andr.) на корни травянистого пиона (Paeonia lactiflora P.) // Теоретические и прикладные аспекты интродукции растений как перспективного направления развития науки и народного хозяйства. Минск, 2007. Т.1. С. 186-188.
12. Кръстев М. Т., Бондорина И.А, Жукова И.Г., Карьянова И.В.
Экспериментальная оценка эффективности прививки древовидного пиона (Paeonia suffruticosa Andr.) на сеянцы древовидного пиона // Современные проблемы интродукции и сохранения биоразнообразия. Воронеж, 2007. С.
292-294.
13. Бондорина И.А. Прививка как способ получения штамбовых форм // Цветоводство. 2008. №2. С. 15- 14. Кръстев М.Т., Бондорина И.А., Демидов А.С. Совершенствование методов размножения интродуцированных древесных растений прививкой в ГБС им. Цицина РАН. История, современное состояние вопроса // Декоративное садоводство России. Сочи, 2008. Вып. 41. С. 263-271.
15. Кръстев М.Т., Бондорина И.А. Эффективный способ размножения клена остролистного (Acer platanoides L.) 'Drummondii' // Вестник КрасГАУ. 2008. № 6. С. 79-83.
16. Кръстев М.Т., Бондорина И.А. Использование физиологически активных веществ для повышения эффективности прививки // Вестник КрасГАУ. 2009. № 3. С. 76-79.
17. Кръстев М.Т., Бондорина И.А. Влияние физиологически активных веществ (ФАВ) на процесс регенерации хвойных интродуцентов // Вестник КрасГАУ. 2009. № 4. С. 99-104.
18. Кръстев М.Т, Бондорина И.А. Прививка сортов сирени обыкновенной (Syringa vulgaris L.) с применением ФАВ // Проблемы современной дендрологии. М., 2009. С. 183-185.
19. Бондорина И.А Эффективный способ размножения дуба и липы // Экспериментальные основы интродукции декоративных растений. Пущино, 2009. Вып. 1. С. 7-9.
20. Бондорина И.А, Кръстев М.Т., Карьянова И.В. Определение регенерационных возможностей хвойных интродуцентов и оценка их пригодности для прививки // Экспериментальные основы интродукции декоративных растений. Пущино, 2009. Вып. 1. С. 9-23.
21. Бондорина И.А. Древесные растения в контейнерном озеленении городов // Проблемы озеленения крупных городов. М., 2010. С. 32-36.
22. Кръстев М.Т., Бондорина И.А. Влияние способа обработки раневой поверхности побегов физиологически активными веществами на регенерационный процесс // Бюл. Гл. ботан. сада. 2010. Вып. 196. С. 133 139.
23. Демидов А.С., Карписонова Р.А., Бондорина И.А. Интродукция цветочно-декоративных растений. Научные основы декоративного цветоводства / / История науки и техники. 2010. №5. С.28-32.
24. Бондорина И.А., Кръстев М.Т., Кириченко Е.Б. и др. Новый регулятор роста растений NANO-stim: стимуляция регенерации тканей у поврежденных древесных растений // III Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech – 10». М., 2010. С.
25. Бондорина И.А., Кръстев М.Т. Оценка пригодности ФАВ для использования в качестве стимуляторов при регенерации прививки // Вестник Саратовского Госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. 2011.
№1. С.24-26.
26. Патент на изобретение/Способ стимулирования приживаемости прививки/Демидов А.С., Кръстев М.Т., Бондорина И.А., Жукова И.Г., Карьянова И.В. № 2370018 Приоритет 22.03.2007. Зарегистрировано 20.10.2009. Бюл №29.
27. Бондорина И.А., Кръстев М.Т. Ускоренный способ размножения древесных растений прививкой // XIV Международная научно-практическая конференция Проблемы озеленения крупных городов. М., 2011, стр. 27-29.
28. Бондорина И.А., Кръстев М.Т. Привитые декоративные растения в озеленении городов // Formation of Urban Green Areas: Harmony of Small Architecture with Green Planting. Клайпеда, 2011.С. 32-35.
29. Бондорина И.А., Кръстев М.Т. Садовые формы яблонь – оценка экспозиционно-декоративной перспективности. // Особенности экспонирования коллекций декоративных растений. М.: КМК, 2011. С. 10 12.
30. Кръстев М.Т., Бондорина И.А. Привитые древесные формы в ландшафтных экспозициях ГБС // Особенности экспонирования коллекций декоративных растений. М.: КМК, 2011. С. 98-101.
31. Кръстев М.Т., Бондорина И.А., Протас С.А. Оценка регенерационного процесса в зоне срастания у прививки сосны горной (Pinus mugo Turra) на сосну обыкновенную (Pinus sylvestris L). // Материалы конф. Ботанические сады в современном мире: теоретические и прикладные исследования. М.:
КМК, 2011. С. 361-366.
32. Бондорина И.А. Методика оценки стимулирующих свойств различных веществ и препаратов. // Научные ведомости Белградского гос. университета. Серия Естественные науки. 2011. №9 (104) вып. 15/1.
С. 348-356.
33. Бондорина И.А. Прививка – Эффективный способ создания новых декоративных форм // Электронный журнал КубГАУ 2011. №71(07) сентябрь. 14 стр.
34. Бондорина И.А. Диагностика совместимости компонентов прививки.//Электронный журнал КубГАУ - №71(07) - сентябрь – 2011 – 13 стр.
35. Бондорина И.А. Эффективная технология размножения цитрусовых прививкой // Естественные и технические науки 2011. №6. С.96- 36. Бондорина И.А. О прививке декоративных цитрусовых культур // Цветоводство. 2012. №1. С. 37. Бондорина И.А. Физиологически активные вещества, как стимуляторы регенерации у лиственных древесных растений // Вестник Саратовского Госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. 2011. №12. С.14 18.
38. Бондорина И.А. Универсальный метод определения биологических возможностей лиственных и древесных видов к регенерации и оценка их перспективности для прививки//. Вестник Брянского ун-та № 4 (2011):
Точные и естественные науки. Брянск: РИОБГУ, 2011.-с. 101- 39. Бондорина И.А. Способность прививочных компонентов к регенерации.// Вестник Тверского ун-та сер. Биология и экология, № 40. Бондорина И.А., Кръстев М.Т. Оценка степени влияния ИМК на регенерационный процесс при заживлении ран у осины (Populus tremula L.).// Бюл. Гл. ботан. сада. 2012.Вып.198Б № 1.