Исследование регуляторных белков, действующих в сверхмалых дозах, выделенных из сыворотки крови млекопитающих
На правах рукописи
Вечеркин Владислав Владиславович
ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ,
ДЕЙСТВУЮЩИХ В СВЕРХМАЛЫХ ДОЗАХ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ
СЫВОРОТКИ КРОВИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
03.00.23 биотехнология
03.00.04 биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Москва 2008 г.
1
Работа выполнена в Институте элементорганических соединений им. А.Н.
Несмеянова РАН и в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Научные руководители:
доктор химических наук, проф. Игорь Александрович Ямсков доктор биологических наук, Виктория Петровна Ямскова
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, проф. Синицин Аркадий Пантелеймонович доктор химических наук, проф. Варламов Валерий Петрович
Ведущая организация:
Институт Биохимии им А.Н. Баха РАН
Защита диссертации состоится " 27 " мая 2008г. в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.59 при МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: Москва, ГСП-1, Ленинские горы
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им.
М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан " 25 " апреля 2008г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук И.К. Сакодынская Введение.
Актуальность работы. Поиск, изучение свойств и возможности использования новых биологически активных веществ является актуальной проблемой современных биотехнологии и биохимии. В этом аспекте особый интерес вызывают компоненты сыворотки крови, которая содержит широкий спектр различных веществ, проявляющих разнообразные типы биологической активности. Среди таковых следует отметить группу новых эндогенных биорегуляторов (РБ), характеризующихся проявлением биологического действия в сверхмалых дозах (СМД), соответствующих 10-10–10-15 мг белка/мл. Данные биорегуляторы оказывают влияние на важнейшие биологические процессы.
Биологически активные в сверхмалых дозах РБ данной группы были обнаружены в различных тканях млекопитающих. РБ стимулируют миграцию и адгезию клеток, влияют на клеточную пролиферацию и дифференцировку, а также апоптоз. РБ данной группы представляют собой низкомолекулярные, устойчивые к воздействию различных физико-химических факторов белки, вторичная структура которых характеризуется значительным содержанием -структур. В водных растворах молекулы РБ проявляют тенденцию в образованию наноразмерных ассоциатов. В тканях РБ присутствуют в виде нескольких отличающихся по заряду фракций – наиболее представлены фракции кислых и фракции основных белков.
Наиболее изученным представителем данной группы биорегуляторов является слабокислый биорегулятор, выделенный из сыворотки крупного рогатого скота. Было показано, что в состав данного биорегулятора входит низкомолекулярный, высокогликозилированный белок (остатки маннозы и N ацетилглюкозамина) со значением рI в области рН 4,5-5,1. В аминокислотном составе РБ превалируют остатки дикарбоновых аминокислот, серина и глицина. В СМД РБ сыворотки крови оказывал влияние на пролиферацию и миграцию фибробластов in vitro, проявлял мембранотропное действие в отношении клеток млекопитающих. Было установлено, что данный РБ сыворотки крови в постнатальном периоде находится в крови в неактивном состоянии, в отличие от эмбрионального периода (первые две трети эмбриогенеза), когда он присутствует в крови в активном состоянии. На основании данного РБ были разработаны новые фармакологические препараты, которые в настоящее время применяются в практике медицины: «Адгелон-глазные капли» в офтальмологии;
«Адгелон-раствор для инъекций» - ортопедии и травматологии.
Однако присутствующие в сыворотке крови в существенно больших количествах кислые и основные РБ данной группы до настоящей работы не изучались.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явились выделение и очистка кислых и основных регуляторных белков, активных в сверхмалых дозах, из сыворотки крови млекопитающих, изучение их физико-химических свойств и биологической активности. Особое внимание в этой работе было уделено сравнительному исследованию свойств РБ, обнаруженных в сыворотке крови млекопитающих. Для этого предполагалось решить следующие задачи:
1.Исследовать сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС) и лошади для идентификации кислых и основных РБ.
2.Изучить физико-химические свойства РБ сыворотки крови млекопитающих: провести исследование состава и структуры данных белков, исследовать состояние РБ в водных растворах.
3.Идентифицировать ингибитор сывороточного РБ и изучить его свойства.
4.Изучить тканевую локализацию РБ сыворотки крови в печени млекопитающих.
5.Исследовать специфическую биологическую активность РБ сыворотки крови в СМД.
Научная новизна работы. В результате проведенной работы впервые в сыворотке крови млекопитающих были идентифицированы и получены в высокоочищенном состоянии новые ранее не изученные кислые и основные РБ, которые проявляли биологическую активность в СМД. Впервые были изучены физико-химические свойства данных белков и показано, что они представляют собой низкомолекулярные белки, вторичная структура которых представлена, в основном, -структурами и неупорядоченными элементами, описываемыми в терминах статистического клубка. Было установлено, что в растворах данные белки образуют наноразмерные частицы диаметром 100±20нм. По физико-химическим свойствам данные белки проявляют сходство с ранее выделенным РБ сыворотки КРС со значением рI в области рН 4,5-5,1. Впервые было показано, что сывороточный белок, обратимо ингибирующий биологическую активность РБ сыворотки, представляет собой белок, в высокой степени гомологичный сывороточному альбумину, и представляет собой его изоформу. Впервые было показано, что в основе обратимой инактивации РБ сыворотки крови лежит взаимодействие с белком-инактиватором, которое осуществляется по механизму белок-углеводного узнавания. Впервые была установлена межклеточная локализация РБ сыворотки крови со значением рI в области рН 4,5-5,1 в печени позвоночных животных.
Впервые на новых экспериментальных моделях органного роллерного культивирования кожи амфибий было продемонстрировано в СМД протекторное свойство изучаемых РБ сыворотки крови млекопитающих, а также ранозаживляющее действие на модели экспериментальной кожной раны у мышей in vivo.
Практическая значимость. Регуляторные белки сыворотки крови в СМД оказывали протекторное действие на ткань кожи амфибий in vitro, а слабокислый регуляторный белок (СРБ) в СМД стимулировал репаративные процессы в ткани кожи и способствовал восстановлению её гистроструктуры при экспериментальной травме у мышей in vivo. Можно полагать (учитывая отсутствие видовой специфичности у РБ данной группы), что идентифицированные в данной работе кислые и основные РБ сыворотки крови могут быть использованы в качестве субстанций для разработки новых фармакологических препаратов, аналогично применяемому в настоящее время эффективному лекарственному средству Адгелон, созданному на основе слабокислого регуляторного белка, а СРБ найдет новое важное применение.
Апробация результатов исследования. Материалы диссертации доложены: на V Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе «Химия и медицина» Уфа, 5-8 сентября 2005;
на XIV школе «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» Москва, 15 ноября, 2005;
на V ежегодной международной молодёжной конференции ИБХФ РАН – ВУЗы «Биохимическая физика» Москва, 14-16 декабря 2005.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 161 страницах и включает следующие главы: введение, где рассмотрены актуальность, новизна, практическая значимость работы;
литературный обзор, в котором описана структура крови, белки входящие в её состав, а также рассмотрены белки, участвующие в процессах регуляции;
экспериментальная часть, в которой описаны материалы и основные методы, с помощью которых было осуществлено исследование;
результаты и их обсуждение – глава, в которой представлены результаты, полученные при исследовании регуляторных белков, выделенных из сыворотки крови, а также их обсуждение;
заключение и выводы. Диссертация содержит 6 таблиц, 46 рисунков, 188 литературных ссылок.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из которых 3 являются оригинальными статьями.
Результаты и их обсуждение.
1. Выделение и очистка регуляторных белков, выделенных из сыворотки крови КРС Регуляторные белки (РБ), биологически активные в СМД, были обнаружены в различных тканях позвоночных животных. В этих работах было установлено, что РБ в тканевых экстрактах присутствуют в виде нескольких фракций – кислых и основных белков.
Ранее в сыворотке крови позвоночных животных была идентифицирована только одна фракция, содержащая РБ, значение изоэлектрической точки которого находится в области рН 4,5-5,1, поэтому в данной работе была предпринята попытка идентификации фракций кислых и основных РБ в сыворотке крови КРС.
Для этого сыворотку крови фракционировали по схеме, ранее разработанной для выделения и очистки РБ изучаемой группы (рис 1).
После разделения супернатанта сыворотки крови методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) собирали и далее исследовали следующие три фракции, количественные характеристики которых представлены в табл.1 :
1. Фракция, собранная в области значений рН менее 3,0–кислые регуляторные белки (КРБ);
2. Фракция, собранная в интервале значений рН 4,5–5,1–слабокислые регуляторные белки (СРБ);
3. Фракция, собранная в интервале значений рН 8,5 – 10,0 – основные регуляторные белки (ОРБ).
Таблица 1. Характеристики ИЭФ-фракций РБ, выделенных из сыворотки крови КРС*) Наработанная Концентрация белка в Общее содержание фракция растворе (мкг/мл) белка (мг) * ) д ан н ые п ри вед ен ы, и сх од я из расчет а выд ел ен и я ф рак ци й Р Б из 20 ли т ров сыворот к и крови К РС.
Данные три фракции далее были изучены методом биотестирования для идентификации РБ, биологически активных в СМД.
Аналогично из сыворотки крови лошади были выделены три фракции с идентичными значениями изоэлектрической точки, как и для РБ сыворотки КРС: это кислый РБ сыворотки лошади (КРБЛ), слабокислый РБ сыворотки лошади (СРБЛ) и основной РБ сыворотки лошади (ОРБЛ).
Данные три фракции были также изучены методом биотестирования.
2. Исследование мембранотропного действия регуляторных белков Метод биотестирования основан на способности РБ данной группы оказывать влияние на вязко упругие свойства и проницаемость плазматической мембраны клеток млекопитающих (гепатоцитов).
Однако механизм мембранотропной активности РБ остается до сих пор не изученным.
Изучение механизма, лежащего в основе метода биотестирования регуляторных белков Был изучен ряд различающихся по структуре маннозосодержащих олигосахаридов с помощью метода биотестирования. Была осуществлена попытка выявить углеводную компоненту, структура которой наиболее близка к строению олигоманнозидных цепей РБ данной группы. На рис.3 в качестве примера проявления биологической активности и её отсутствия приведены дозовые зависимости активности для моносахарида СН3-Маn (проявление биологической активности) и моносахарида СН3-Glu (отсутствие биологической активности).
В таблице 2 представлены сводные результаты данного исследования. Биологически активными в СМД являются CH3-Man, CH3-Gal, GlcNAc, но не CH3-Glu и СН3-Fuc. Из маннозосодержащих олигосахаридов биологическую активность в СМД проявляли те, терминальные остатки которых были представлены дисахаридом Man1-2Man и дисахаридом Gal1-4GlcNAc. Мембранотропная активность этих веществ характеризуется бимодальной дозовой зависимостью, которая сходна с дозовой зависимостью мембранотропной активности исследуемых РБ (рис. 3).
Полученные данные указывают на присутствие на поверхности ПМ клеток печени сайтов, специфически узнающих маннозо- и галактозосодержащие олигосахариды, которые содержат терминальные остатки указанных выше дисахаридов. Кроме того эти сайты оказались чувствительны к остаткам маннозы, галактозы, N-ацетилглюкозамина, которые являются терминальными остатками N олигоманнозидных и цепей смешанного типа.
А * * * * * * * * МА % 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Х Б МА % 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Х Ри с. 3. Исследование с помощью метода биотестирования мембранотропной активности моносахаридов: А- СН3-Маn и Б - СН3-Glu (таблица 3.2.1, структуры №2 и 3). Темный столбик – контроль;
светлые столбики – опыт (влияние изучаемого моносахарида). По ординате – МА, мембранотропная активность;
по абциссе – Х, показатель степени десятикратного последовательного разбавления исходного раствора моносахарида [10Х] (исходная концентрация моносахарида равна мг/мл).
*) Отмечены степени разбавления растворов моносахарида, для которых параметр МА статистически достоверно отличается от контроля (р 0,05).
Таблица 2. Мембранотропная активность различных моно- и олигосахаридов в СМД* № МА** Структура вещества п/п 1 есть CH3-Gal Man 2 есть CH 3 нет CH3-Glc Fuc 4 нет CH 2Man Man 5 есть Man1 3Man 6 нет 6Man Man 7 нет 4Man Man 8 нет GalNAc 9 нет GlcNAc 10 есть Man Man 11 нет Man1 4GlcNAc OH Man 1 4GlcNAc Man Man Man 12 нет Man 1 4GlcNAc OH Man 1 4GlcNAc 2Man Man 2Man Man 3 Man 13 есть Man 1 4GlcNAc OH Man 1 4GlcNAc 2Man Man 1 2Man 2Man Man 3 Man 14 есть 2Man Man1 4GlcNAc OH 3 Man 1 4GlcNAc 2Man Man1 2Man Gal 1 4GlcNAc 1 2Man 4GlcNAc OH Man 1 4GlcNAc 15 есть Gal 1 4GlcNAc 1 2Man NAc Gal Man NAc Gal 16 нет 4GlcNAc OH Man1 4GlcNAc NAc Gal Man NAc Gal 2Man NANA 2 6Gal 1 4GlcNAc 17 нет 3 Man 1 4GlcNAc OH 4GlcNAc 2Man NANA 2 6Gal 1 4GlcNAc * в с е о л и г о с а х а р и д ы б ы л и в ы д е л е н ы и з ра з л и ч н ы х г л и к о п р о т е н о в и л юб е з н о п р е д о с т а в л е н ы д л я и с с л е д о в а н и я с о т р уд н и к о м И Н Э О С и м. А. Н. Н е с м е я н о в а Р А Н П и с к а ре в ы м В. Е.
** МА – мембранотропная активность Результаты этого исследования согласуются с ранее полученными данными, которые показали, что остатки маннозы, галактозы и N-ацетилглюкозамина играют принципиальную роль в адгезии гепатоцитов in vitro.
Исследование мембранотропной активности регуляторных белков, выделенных из сыворотки крови млекопитающих С помощью метода биотестирования было показано, все три фракции РБ, выделенных как из сыворотки крови КРС так и из сыворотки крови лошади, проявляют мембранотропную активность в СМД, т.е. содержат изучаемые РБ. На рис. 4. в качестве примера, представлены результаты исследования фракций КРБ, выделенных из сыворотки крови КРС. Аналогичные диаграммы полимодальной дозовой зависимости, отражающие мембранотропное действие РБ, были получены и при изучении фракции РБ, выделенных из сыворотки лошади.
Таким образом, в сыворотках крови млекопитающих были идентифицированы две новых фракции РБ, проявляющих биологическую активность в СМД. Далее эти фракции кислых и основных РБ были изучены физико-химическими методами совместно с фракцией РБ, pI которого лежит в интервале рН 4,5 – 5,1.
160 * * 140 * * * * МА,% 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Х Рис. 4. Исследование мембранотропной активности РБ, выделенного из крови КРС, со значением В pI в области рН меньше 3,5 (КРБ) (метод биотестирования). Темный столбик – контроль;
светлые столбики – опыт (влияние изучаемого РБ). По ординате – величина мембранотропного эффекта (МА);
по абциссе – показатель степени десятикратного последовательного разбавления исходного раствора олигосахарида [10Х] (исходная концентрация РБ равна 0,1 мг/мл).
*) Отмечены степени разбавления растворов РБ, для которых параметр МА статистически достоверно отличается от контроля (р 0,05).
3. Исследование физико-химических свойств регуляторных белков Изучение регуляторных белков с помощью метода электрофореза в ПААГ Для исследования состава фракций РБ, выделенных из сыворотки крови млекопитающих (КРС и лошадь), а также определения значений “кажущейся” молекулярной массы РБ, был проведён электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДСН). Из рис. 5 видно, что основным компонентом каждой изучаемой фракции является низкомолекулярный белок со значением “кажущейся” молекулярной массы менее 14 кДа.
Для получения препаратов биологически активных РБ проводили электрофорез фракций, полученных после изоэлектрофокусирования, без добавления ДДСН. Следует также отметить, что в этих условиях картина разделения фракций РБ не изменялась. Было установлено, что биологическую активность проявляла низкомолекулярная фракция. Полученный результат предполагает, что изучаемые РБ являются низкомолекулярными белками.
Помимо метода электрофореза в ПААГ для СРБ был использован метод диализа через полупроницаемые мембраны. После диализа разбавленного раствора СРБ (10-6 мг белка/мл) через полупроницаемую мембрану, пропускающую вещества с молекулярным весом до 15 кДа, мембранотропная активность (параметр МА) была обнаружена как во внешнем, так и во внутреннем объемах. Биологическая активность была выявлена при разбавлении фракции внешнего и внутреннего объемов, соответственно, в 102-103-и 105- 107 раз (значения параметра МА в данном эксперименте составили 133-144% относительно контроля). При использовании пленки, пропускающей вещества со значением молекулярной массы до 8 кДа, биологическая активность была обнаружена только во фракции внутреннего объема. Эти данные согласуются с результатами, полученными при исследовании значения молекулярной массы РБ методом электрофореза в ПААГ. Выяснение точного значения молекулярной массы возможно только после определения первичной структуры РБ.
А Б Рис 5. Исследование трех фракций СРБ, КРБ, ОРБ, выделенных из сыворотки крови КРС (а), а также трех фракций СРБЛ, КРБЛ, ОРБЛ, выделенных из сыворотки крови лошади (б), методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДДСН условиях. Слева представлены маркерные белки.
Изучение вторичной структуры регуляторных белков с помощью метода кругового дихроизма Для исследования вторичной структуры РБ сыворотки был применен метод кругового дихроизма (КД). Белки изучали в дальней ультрафиолетовой области (от 185 до 285 нм). Полученные данные, представленные в таблице 3, свидетельствуют о преимущественном содержании -структур, а также участков с неупорядоченным состоянием пептидных цепочек РБ в водных растворах, т.е. вторичная структура таких участков молекул РБ описывается в терминах статистического клубка. Следует отметить, что полученные КД спектры были обработаны с помощью программы k2d и CDNN, в основе которых лежит аддитивная математическая модель: расчет спектральных данных производился на основе базы данных, полученных для других белков с помощью рентгеноструктурного анализа.
Таблица 3. Характеристика вторичной структуры молекул, исследуемых регуляторных белков сыворотки крови.
Элементы вторичной структуры Процентное содержание элементов в молекулах РБ СРБ СРБЛ КРБ КРБЛ ОРБ ОРБЛ 10, - спирали 8,5 ±0,5% 8,0 ±0,5% 9,7±0,5% 9,0 ±0,5% 8,5 ±0,5% ±0,5% 38,0 44,3 40,0 45,6 40, Антипаралельные -складки 45,7±0,5% ±0,5% ±0,5% ±0,5% ±0,5% ±0,5% Паралельные -складки 2,0 ±0,5% 3,6±0,5% 2,0 ±0,5% 3,7±0,5% 2,0 ±0,5% 3,7 ±0,5% 18,0 17,0 17,4 18, -изгибы 17,7±0,5% 17,4 ±0,5% ±0,5% ±0,5% ±0,5% ±0,5% 32,0 33,0 31, Статистистический клубок 30,6±0,5% 29,9±0,5% 31,1±0,5% ±0,5% ±0,5% ±0,5% С помощью метода КД было изучено влияние различных физико-химических факторов на состояние вторичной структуры РБ в водных растворах. Было показано, что биологическая активность РБ не изменялась после воздействия температуры (например, СРБ сохранял биологическое действие после нагревания его раствора до 100 С в течение 20-30 минут). РБ данной группы полностью сохраняли биологическую активность после многократных процедур «замораживание-оттаивание», при действии органических растворителей, мочевины. В качестве примера на рисунке 7 представлены значения эллиптичности, отражающей состояние вторичной структуры РБ, выделенных сыворотки крови КРС, при воздействии ЭДТА.
Полученные данные свидетельствуют об отсутствии изменений во вторичной структуре РБ при повышении температуры раствора до 100 С и воздействии хаотропных агентов по сравнению с исходными растворами РБ. Аналогичные результаты были получены при исследовании РБ, выделенных из сыворотки крови лошади.
Обращает на себя внимание тот факт, что после обработки ЭДТА наблюдается небольшое изменение эллиптичности растворов РБ, причем с увеличением концентрации ЭДТА значение эллиптичности имело тенденцию к большим изменениям. Эти данные указывают на участие ионов Са+2 в организации вторичной структуры РБ. В пользу этого предположения свидетельствуют ранее полученные данные при изучении РБ данной группы, выделенных из других тканей, которые показали, что в состав молекулы РБ входят ионы Са+2.
Рис. 7. КД - спектры РБ Х -6 -5 -4 -3 -2 -0,50, сыворотки крови КРС при 0, -0, Значение эллиптичности воздействии ЭДТА. По в млдегри для 222 нм.
- ординате –, значение эллиптичности при 222 нм - (млдегри);
по абсциссе – - Х, значения показателя десятичной степени - молярной концентрации Х ЭДТА, 10 (моль/л).
- СРБ ОРБ КРБ Изучение растворов регуляторных белков с помощью метода атомно-силовой микроскопии Полученные регуляторные белки были исследованы с помощью метода атомно-силовой микроскопии (АСМ). На рис. 8 в качестве примера представлена картина распределения частиц на подложке раствора КРБ.
нм Рис 8. Атомно-силовая микроскопия раствора КРБ.
Данные, представленные на рисунке 8 показывают, что в водных растворах РБ, выделенных из сыворотки крови, присутствуют в виде наноразмерных частиц. В результате рассчета с помощью программы FemtoScan Online размер частиц варьирует в области: 100±20нм для растворов фракции КРБ (концентрация белка 100 мг/мл);
100±20нм для растворов фракции СРБ (концентрация белка 100 мг/мл);
60±10нм для растворов фракции ОРБ (концентрация белка 100 мг/мл). Таким образом, методом АСМ было показано образование в водных растворах сывороточных РБ крупных наночастиц, размер которых находится в пределах от 60 до 120 нм.
Полученные нами результаты показывают, что в водных растворах РБ, выделенных из сыворотки крови КРС, образуются достаточно крупные частицы. Мы полагаем, что в состав этих частиц входят изучаемые РБ, поскольку полученные ранее данные с привлечением других методов исследования, также указывали на ярко выраженную тенденцию молекул РБ данной группы образовывать межмолекулярные ассоциаты.
Исследование регуляторных белков, выделенных из сыворотки крови млекопитающих, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии С целью более детального определения состава фракции РБ сыворотки крови КРС и лошади были исследованы с помощью метода обращено-фазовой ВЭЖХ. Нужно отметить, что ранее были предприняты попытки разделения СРБ другими хроматографическими методами, однако, четкой картины разделения удалось достичь только при применении обращенно-фазовой хроматографии в градиенте ацетонитрилл вода. Все эти данные подтверждают предположение, выдвинутое в предыдущих разделах, о сложном составе изучаемых фракций РБ сыворотки крови. В качестве примера на рисунке 12. представлена картина разделения фракции КРБ, выделенной из сыворотки крови КРС.
DAD1 E, Sig=280,16 Ref =360,100 (BEREZIN\BER10105.D) Norm.
3. 11. Ри с. 12. Об ращен о- ф аз овая ВЭЖ Х ф ракц ии КР Б. По ординате –, значение интенсивности сигнала (мАВ);
по абсциссе – t, время выхода веществ из колонки (мин).
3. 3. 12. 3. 5. 13. 13. 13. 13. 12. 12. 3. 4. 14. 0 2 4 6 8 10 12 14 min Основываясь на полученных картинах разделения можно выделить две общие фракции:
гидрофильную – это область удержания со временем выхода от 3 до 4 минут, и гидрофобную – это область удержания со временем выхода от 11 до 14 минут соответственно. С помощью метода биотестирования было установлено, что в препарате КРБ биологически активными в СМД были две фракции, характеризующиеся временем удержания 3, 301 и 13,396 мин. В препарате СРБ биологически активными в СМД были фракции с временем удержания 3,620 и 11,637 мин. В препарате ОРБ – 3,260 и 13, 310 мин удержания. Полученные данные показывают, что РБ сыворотки крови КРС способны проявлять как гидрофильные, так и гидрофобные свойства, т.е. являются амфифильными веществами. Аналогичные результаты были получены при разделении методом обращено-фазовой ВЭЖХ фракций РБ, выделенных из сыворотки крови лошади.
Исследование состава фракций регуляторных белков с помощью ядерного магнитного резонанса.
Три РБ, выделенных из сыворотки крови КРС, были изучены с помощью метода ядерного магнитного резонанса (рис. 13, в качестве примера приведен спектр СРБ). Основываясь на литературных данных, позволяющих частично расшифровать состав исследуемых фракций РБ, можно заключить, что в их состав входят как углеводные составляющие: это пики из области 2.4 – 2.6 м.д., так и липидные: пики - 1.25 и 2.7 м.д. Кроме того, следует отметить сходную картину (область 2.4-2.6 м.д. с пиками, отвечающими за присутствие углеводов) для всех трех спектров изучаемых РБ. И хотя оценка состава по спектрам ЯМР носит достаточно приближенный характер, однако такое сходство (особенно для КРБ и ОРБ) в целом указывает на гомологию углеводных составляющих. Помимо этого, в состав изучаемых РБ входят аминокислоты, которые идентифицируются по различным пикам (3.0 – 3.8 м.д.). Полученные результаты указывают на сложный состав РБ, выделенных из сыворотки крови КРС.
4. 0 3. 8 3. 6 3. 4 3. 2 3. 0 2. 8 2. 6 2. 4 2. 2 2. 0 1. 8 1. 6 1. 4 1. 2 1. 0 0. ( p p m) Рис. 13. ЯМР-спектр фракций регуляторных белков сыворотки крови: А – СРБ;
Б – КРБ;
В – ОРБ. По ординате –, значение и нт ен си вн ости (от н.ед );
по абсциссе – ppm, химический сдвиг (в мил.дол.).
Изучение липидной компоненты фракции среднекислого регуляторного белка Фракция СРБ была подвергнута длительной обработке серным эфиром. Исследование состава эфирной вытяжки методом масс-спектрометрии показало присутствие в ней таких жирных кислот как декановая, линолевая, холевая, дезоксихолевая и пальмитиновая (рис.14).
m/z Рис. 14. Изучение липидной фракции методом MALDI TOF масс-спектрометрии. По ординате –, значение и нт ен си вн ость (от н.ед );
по абсциссе – m/z, отношение массы иона к его заряду.
Данные жирные кислоты являются постоянными компонентами сыворотки крови млекопитающих, однако не выясненным остается вопрос: какова роль этих жирных кислот в формировании устойчивых наночастиц, которые обнаруживаются в растворах РБ сыворотки крови.
Исследование фракции кислых регуляторных белков сыворотки методом масс-спектрометрии Electrospray Данные, представленные в более ранних исследованиях первичной структуры СРБ, проведенных методом MALDI TOF масс-спектрометрии после дегликозилирования белка, указывают на низкое значение полученного молекулярного иона (1338,7 Да). При использовании метода MALDI TOF масс спектрометрии вещество наносится на матрицу. В этих условиях гликозилированные белковые молекулы очень сильно взаимодействуют с матрицей, что затрудняет применение этого метода для изучения структур гликопротеинов. В связи с этим было осуществлено химическое дегликозилирование (с помощью трифторметансульфокислоты), поскольку обработка белка различными специфическими ферментами не привела к отделению гликозидной компоненты. Но в результате такого способа дегликозилирования возможна частичная деградация пептидной цепи с образованием её фрагментов, чем и может объясняеть образование низкомолекулярного иона. В связи с этим в настоящем исследовании был использован метод Electrospray масс-спектрометрии, позволяющий изучать вещества в растворах.
Результаты проведенного исследования КРБ указывают на наличие низкомолекулярного иона (1222 Да, рис. 15), т.е. на то, что в состав изучаемого РБ входят низкомолекулярные пептидные фрагменты.
Следует отметить, что для определения молекулярной массы вещества необходимо учитывать значение заряда иона, которое для белков всегда больше единицы, т.е. значение молекулярной массы КРБ может быть больше полученного значения. Тем не менее, можно предположить, что молекулярная масса исследуемого РБ не превышает 8 кДа (данные, полученные методом диализа через полупроницаемые мембраны).
R1_1222 #1 RT: 63.48 AV: 1 NL: 1.98E T: ITMS + p ESI Z ms [ 1197.00-1247.00] 1222. Рис. 15. Исследование раствора фракции КРБ методом El ect ros pra y масс-спектрометрии. По ординате –, значение ин т ен си вн ост ь (отн.ед ) ;
по абсциссе – m/z, RelativeAbundance отношение массы иона к его заряду.
1223. 1200. 1216. 1229. 1220. 1199.880 1202. 10 1214.940 1224.800 1232.800 1238. 1208. 1242. m/z 1200 1205 1210 1215 1220 1225 1230 1235 1240 m/z 4. Изучение локализации в тканях позвоночных животных, а также специфической биологической активности регуляторных белков сыворотки крови Исследование локализации слабокислого регуляторного белка в печени тритона Pleurodeles waltl Изучение распределения РБ сыворотки крови в тканях позвоночных животных проводили, исследуя СРБ. Локализацию СРБ сыворотки крови изучали на ткани печени тритона Pleurodeles waltl, поскольку, во-первых, большинство сывороточных белков продуцируются печенью, а во-вторых, известно, что в печени амфибий, помимо синтеза белков сыворотки крови, идет и кроветворение в постнатальном периоде. В качестве антигена для получения поликлональной антисыворотки был использован белок, полученный после электрофоретического разделения фракции СРБ в ПААГ. С помощью методов иммуногистохимии было показано, что СРБ сыворотки крови локализован в межклеточном пространстве гепатоцитов печени тритона, а также на поверхности кроветворных клеток (рис. 16). Полученные данные предполагают, что данный СРБ сыворотки крови может синтезироваться клетками печени, а также может участвовать в процессах кроветворения.
А Б Рис. 16. Локализация СРБ сыворотки крови в межклеточном пространстве печени тритона (конфакальная флуоресцентная микроскопия) А – в межгепацитарном пространстве;
Б – на поверхности клеток кроветворения.
Исследование влияния слабокислого регуляторного белка сыворотки крови на состояние ткани кожи тритона Pleurodeles waltl при органном культивировании in vitro В данном разделе исследования изучали протекторное действия трех РБ: КРБ, СРБ и ОРБ сыворотки крови на состояние кожи позвоночных в условиях культивирования in vitro и процессы ранозаживления кожи у млекопитающих. Учитывая отсутствие видовой специфичности биологического действия изучаемых РБ, работа была проведена на роллерных органных культурах кожи тритона in vitro, а также на модели кожной раны in vivo. Результаты гистологического исследования органных культур кожи после 14 ти дней культивирования показали значительный протекторный эффект изучаемых регуляторных белков сыворотки крови.
А Б Рис. 17. Органные культуры кожи тритона после 7 дней роллерного культивирования А – интактная печень тритона;
А- контроль;
Б - влияние КРБ в концентрации 10-11 мг белка/мл.
На рис. 17а представлен гистологический препарат культуры контрольной серии. Можно отметить развитие дегенеративных процессов в ткани кожи тритона, покровный эпителий и железы деструктированы, наблюдается тотальная гибель клеток в кориуме.
На данном сроке в культурах опытной серии (при воздействии РБ сыворотки крови) наблюдали сохранение желёз, которые продолжали секретировать слизь, на поверхности кожи виден многослойный эпителий, погруженный в большое количество слизи. В кориуме процессы клеточной деградации выражены менее, чем в контроле, между кориумом и поверхностью фрагмента кожи пигментированные клетки образовали плотный слой (рис.17в).
Полученные данные указывают на протекторное действие, которое проявляют РБ сыворотки крови в СМД на кожу тритона in vitro. Следует отметить, что значительное увеличение секреции слизи и обновление покровного эпителия, а также увеличение количества пигментированных клеток, имеет место во время линьки амфибий или при помещении их в неблагоприятные условия.
Полученные данные нашли подтверждение в результатах, полученных при исследовании специфической биологической активности СРБ сыворотки крови на модели ранозаживления кожи мыши in vivo.
В этом исследовании изучали биологическое действие фракции СРБ, которую дополнительно очищали с помощью электрофореза в ПААГ. Полученный препарат слабокислого регуляторного белка сыворотки крови изучали в дозе, соответствующей 10-13 мг белка/мл.
В 1-ой контрольной группе животных (необработанная рана) на сроке 11 дней после нанесения раны наблюдали практически полную реэпителизацию, незначительное воспаление (рис. 18.а).
А Б В Эпидермис Формирование волосяных фолликулов Формирование мышечных элементов Дерма Рис. 18. Влияние СРБ после очистки методом электрофореза на ранозаживление кожи мыши ( сутки после нанесения раны). А Протоки контроль№1, необработанная рана;
желез Б - контроль №2, влияние физ. р ра;
В - влияние СРБ.
Подкожная жировая ткань В дерме много мелких капилляров, волокна коллагена располагаются плотными тяжами параллельно эпидермису, то есть происходит формирование фиброзного рубца. В подкожной ткани присутствовали жировые клетки, которые имели неправильную форму и разделялись участками соединительной ткани.
Наблюдали небольшое количество восстанавливающихся протоков желез. В подкожной ткани также происходило формирование рубца, волокна коллагена более рыхлые, чем в дерме, но почти отсутствовали жировые клетки (рис. 18.а).
У мышей 2-ой контрольной группы, после ежедневной обработки раны физ. р-ром на 11-ые сутки в центральной части раны наблюдали образование очага хронического воспаления и формирование соединительнотканного рубца в дерме, отмечали отсутствие полной реэпитализации (рис. 18.б). Очевидно, что выявление признаков значительного воспаления у животных этой группы, по сравнению с животными первой группы, связано с применением водного раствора, представляющим собой благоприятную среду для развития патогенной микрофлоры.
В 3-ей опытной группе наблюдали совершенно иную картину репарации кожи: сильное стягивание краев раны и практически полную ее реэпителизацию, более выраженную, чем у животных обеих контрольных групп (восстанавливались все слои многослойного эпителия). Отмечали отсутствие очагов воспаления. Структура дермы почти восстановлена. В дерме (особенно под раной) и в подкожной ткани отмечено восстановление многочисленных протоков желез и волосяных фолликулов. Жировая ткань сильно развита. В отдельных участках под раной отмечено частичное восстановление мышечных элементов (рис. 18.в).
Полученные данные указывают на исключительно высокую эффективность СРБ в заживлении кожных ран у млекопитающих in vivo. Данный РБ не только стимулировал регенерацию в кожной ране, но и способствовал формированию в области травмы морфологически полностью восстановленной ткани.
Таким образом, в проведенной экспериментальной серии было показано, что СРБ локализован в межклеточном пространстве ткани печени тритона. На основании этих данных высказано предположение о том, что синтез данного РБ сыворотки крови происходит в печени. Изучаемые РБ сыворотки крови в СМД обладают протекторным действием в отношении ткани кожи тритона, культивированной in vitro. СРБ участвует в процессах ранозаживления в коже у млекопитающих in vivo, стимулируя восстановительные и репаративные процессы. И, наконец, полученные данные указывают на отсутствие видовой специфичности биологического действия у данных РБ.
5. Исследование белка, инактивирующего мембранотропное действие слабокислого регуляторного белка сыворотки крови Для исследования физико-химических свойств белка-инактиватора с помощью методов ВЭЖХ, кругового дихроизма (КД), ДДСН-электрофореза в ПААГ, а также для проведения аминокислотного анализа использовали фракцию белка-инактиватора, полученную после аффинной хроматографию.
Значение молекулярного веса, определенное с помощью метода ДДС-Na-электрофореза, составляло около 70кДа (рис. 19). Для этого препарата белка-инактиватора с помощью метода изоэлектрофокусирования было установлено значение изоэлектрической точки в интервале рН от 3,9 до 4,0.
Молекула БСА обладает сформировавшейся вторичной структурой, которая характеризуется высоким содержанием -спиралей (около 70%). Высокое содержание -спиралей было выявлено и в структуре молекулы инактиватора СРБ в результате изучения спектров кругового дихроизма (рис. 20). На это указывает наличие характерных минимумов КД-спектров при длинах волн, соответственно, 208 и нм.
Электрофорез ВЭЖХ Инактивато р Рис. 19. Физико-химические свойства белка-инактиватора (СДС электрофорез и обращеннофазовая ВЭЖХ).
Маркеры Рис. 20. КД – спектр белка, млдегри инактиватора. По ординате –, значение эллиптичности при 222 нм - - (млдегри);
по абсциссе – длинна - волны (нм).
190 200 210 220 230 240 250 Длинна волны, нм.
На данном этапе работы в результате исследования при помощи метода MALDI-TOF масс спектрометрии было установлено, что белок-инактиватор относится к семейству альбуминов, проявляя высокую гомологию с БСА (рис. 21).
Рис 21. Исследование белка-инактиватора методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. По ординате –, значение и нт ен си вн ости (от н.ед );
по абсциссе – m/z, отношение массы иона к его заряду.
m/z Очевидно, белок-инактиватор представляет собой одну из изоформ суперсемейства сывороточных альбуминов, которая, возможно, образуется в результате альтернативного сплайсинга и имеет, кроме того, высокое сродство к определенной фракции липидов сыворотки крови. Данное сродство к липидам также характерно и для изучаемых РБ, что обусловливает образование устойчивых межмолекулярных ассоциатов.
Как показано на рис. 22. КД-спектр белка-инактиватора после взаимодействия с СРБ претерпевает изменения: экстремум в области 188 нм становится более выраженным. Полученные данные указывают на изменения во вторичной структуре молекулы белка-инактиватора после взаимодействия с СРБ. Наиболее вероятно, что эти изменения касаются -структур, а не -структур молекулы этого белка, поскольку данная область спектра (188 – 190 нм) отвечает за состояние -структур в молекуле белка.
Как показано на рис. 22, взаимодействие БСА с СРБ не оказало влияния на вид КД-спектра БСА – оба спектра практически не отличаются друг от друга. Можно предположить, что в данном случае, конформация молекулы БСА не изменилась.
Таким образом, полученные данные показывают, что белок-инактиватор проявляет высокую гомологию с БСА и очевидно, является одним из изоформ этого белка. БСА не оказывает влияния на биологическую активность СРБ, КД спектр этого белка оставался без изменений после взаимодействия с СРБ.
Полученные данные нашли подтверждение в исследовании, проведенном методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Было проведено изучение ряда параметров, характеризующих состояние третичной структуры белка-инактиватора до и после взаимодействия с СРБ.
9 А Б Взаимодействие белка инактиватора с СРБ Взаимодействие БСА и СРБ 5 Белок-инактиватор БСА, млдегри, млдегри 1 - - - - -3 - 190 200 210 220 230 240 250 260 190 200 210 220 230 240 250 Длинна волны, нм. Длинна волны, нм.
Рис 22. КД - спектры белка-инактиватора, БСА до (а) и после (б) их взаимодействия с СРБ: По ординате –, значение эллиптичности при 222 нм (млдегри);
по абсциссе – длинна волны (нм).
Заключение В результате проведенного исследования удалось идентифицировать в сыворотках крови млекопитающих две фракций РБ - кислых и основных белков, изучить ряд их физико-химических свойств.
Важнейшим свойством РБ данной группы, в том числе, выделенных из сыворотки крови млекопитающих, является проявление ими биологической активности в СМД. В настоящем исследовании показано, что в СМД сывороточные РБ проявляют мембранотропное действие, а РБ, значение изоэлектрической точки лежит в интервале рН4,5-5,1, проявляет выраженное ранозаживляющее свойство. С помощью методов иммуногистохимиии была показана внеклеточная локализация данного РБ сыворотки крови в печени млекопитающих.
Механизм, лежащий в основе биологического действия РБ данной группы, до сих пор остаётся малоизученным, так же как и для других веществ, проявляющих биологическую активность в СМД. В настоящем исследовании был идентифицирован белок, инактивирующий биологическую активность РБ со значением изоэлектрической точки в интервале рН 4,5-5,1. В этом аспекте следует отметить, что сыворотка крови не проявляет мембранотропной активности при исследовании адгезиометрическим методом, применяемым для идентификации РБ данной группы.
Белок-инактиватор проявляет высокую гомологию с БСА и, очевидно, является членом мультисемейства сывороточных альбуминов. При взаимодействии с РБ происходит изменение вторичной и третичной структур белка-инактиватора. Полученные результаты предполагают, что в основе образования комплекса между этими белками лежит углевод-белковое взаимодействие. Возможно, что данный белок инактиватор также взаимодействует с другими сывороточными РБ и регулирует их биологическую активность аналогичным образом. Кроме того, данные этого исследования указывают на определенную малоизученную роль членов семейства альбуминов, которая заключается в регуляции биологической активности веществ эндогенного происхождения в организме.
Выводы.
В сыворотках крови крупного рогатого скота и лошади, идентифицированы новые 1.
регуляторные белки: кислый, основной, действующие в сверхмалых дозах (соответствующих 10-8 – 10-15 мг/мл), свойства которых сходны со свойствами других регуляторных белков, выделенных из различных тканей млекопитающих.
2. Показано, что регуляторные белки сыворотки крови представляют собой низкомолекулярные белки, их вторичная структура характеризуется преимущественным содержанием -структур и элементов, описываемых в терминах статистического клубка. Установлено, что регуляторные белки присутствуют в водных растворах в виде наноразмерных частиц.
Показано, что в сыворотке крови млекопитающих присутствует белок, обратимо 3.
инактивирующий биологическую активность регуляторного белка, значение рI которого находится в интервале рН 4,5-5,1. Белок-инактиватор характеризуется высокой гомологией с альбумином сыворотки крови крупного рогатого скота, но отличается от него аминокислотной последовательностью N-концевого домена и значением изоэлектрической точки (3,9-4,0).
Методом кругового дихроизма показана высокая устойчивость изученных 4.
регуляторных белков к действию повышенных температур (до 100С), хаотропных агентов (гуанидинхлорида). Изменение эллиптичности при действии ЭДТА указывают на влияние ионов Са2+ на процесс организации вторичной структуры регуляторных белков.
Методом кругового дихроизма показано, что при инактивации РБ в присутствии 5.
белка-инактиватора и ионов Са2+ происходит изменение конформации молекулы белка-инактиватора.
Методами иммуногистохимии и конфокальной микроскопии изучена локализация в 6.
ткани печени регуляторного белка сыворотки крови, значение рI которого находится в интервале рН 4,5-5,1. Установлено, что данный регуляторный белок расположен в межклеточном пространстве паренхимы печени позвоночных животных.
Установлено, что регуляторные белки сыворотки крови млекопитающих проявляли в 7.
сверхмалых дозах выраженную биологическую активность: протекторное действие на ткань кожи амфибий при роллерном органном культивировании;
регуляторный белок, значение рI которого находится в интервале рН 4,5-5,1, стимулировал репаративные процессы в коже, способствовал восстановлению ее гистоструктуры при экспериментальной травме у мышей in vivo.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Виноградов А.А., Вечеркин В.В., Ямсков И.А.
1.
Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови млекопитающих.// Прикладная биохимия и микробиология. 2004. т.40, №4, с.407-413.
М.С. Краснов, А.В. Качалина, А.В. Беляева, Е.Ю. Рыбакова, В.В Вечёркин, В.П.
2.
Ямскова «Изучение влияния фармакологического препарата Адгелон, основанного на сывороточном регуляторном белке, на заживление кожных ран у мышей in vivo.» // Онтогенез. 2005. т. 36. № 5. С. 378 - 379. Тезисы докладов XIV школы «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии».
Е.Ю. Рыбакова, В.В Вечёркин. «Исследование адгезивных белков сыворотки 3.
крови млекопитающих, биологически активных в сверхмалых дозах.» // Онтогенез. 2005. т. 36. № 5. с. 392. Тезисы докладов XIV школы «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии».
4. В.В Вечёркин, Е.Ю. Рыбакова «Изучение физико-химических свойств сывороточных регуляторных белков, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах.» // V Всероссийский научный семинар и Молодежная научная школа Химия и медицина. 5-8 сентября 2005 г. Уфа. Тезисы (сборник тезисов «Новые лекарственные средства. Успехи и преспективы» с. 112-113).
Е.Ю. Рыбакова, В.В Вечёркин, В.П. Ямскова, И.А. Ямсков «Регуляторные белки 5.
сыворотки крови млекопитающих, биологически активные в сверхмалых дозах.»
// V Ежегодная международная молодёжная конференция ИБХФ РАН – ВУЗы «Биохимическая физика». 14-16 декабря 2005 г. Москва. Тезисы (сборник тезисов «Труды V Ежегодной международной молодёжной конференции ИБХФ РАН – ВУЗы «Биохимическая физика»» с. 88).
Е.Ю. Рыбакова, В.В Вечёркин «Регуляторные белки, идентифицированные в 6.
сыворотке крови крупного рогатого скота: изучение молекулярной структуры, биологической активности.» // Онтогенез. 2006 т.37. № 4. с.317. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.. 21 декабря 2005 г. Москва В.П. Ямскова, Е.Ю. Рыбакова, В.В. Вечеркин, В.Е. Пискарёв, И.А. Ямсков 7.
«Исследование мембранотропной активности сверхнизких концентраций маннозсодержащих олигосахаридов.»//Материалы IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт Петербург, 3-7 июля, 2006г.
V.P. Yamskova, E.Yu. Rybakova, V.V. Vecherkin, B.B. Berezin, A.G. Filatova, I.V.
8.
Blagodatskikh and I.A. Yamskov “Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses: 1. Isolation, purification and physicochemical properties.”, pp. 57-67 // In the book “Biochemical Physics Frontal Research”, Ed. by S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov and G.E. Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc, p. 160, 2006.
V.P. Yamskova, M.S. Krasnov, E.Yu. Rybakova, V.V. Vecherkin, A.V. Borisenko, I.A.
9.
Yamskov “Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses: 2. Tissue localization and role in wound healing”, pp. 68-77 // In the book “Biochemical Physics Frontal Research”, Ed. by S.D.
Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov and G.E. Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc, p. 160, 2006.