Разработка и применение мономерных красных флуоресцентных белков с большим стоксовым сдвигом

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ПЕТКЕВИЧ КИРИЛЛ ДМИТРИЕВИЧ

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МОНОМЕРНЫХ КРАСНЫХ

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ С БОЛЬШИМ СТОКСОВЫМ СДВИГОМ

03.01.04 – биохимия

03.01.06 – биотехнология

в том числе бионанотехнологии

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2011

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и на кафедре анатомии и структурной биологии Медицинского колледжа имени А. Эйнштейна, Нью-Йорк член-корреспондент РАН, Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Варфоломеев Сергей Дмитриевич кандидат химических наук, доцент Верхуша Владислав Витальевич член-корреспондент РАН,

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич доктор биологических наук Лукьянов Константин Анатольевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт Цитологии РАН

Защита состоится « » февраля 2011 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » января 2011 года Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее десятилетие одним из наиболее приоритетных методов исследований в биологии и медицине стала визуализация различных процессов, происходящих в живых организмах, тканях или клетках в режиме реального времени с помощью флуоресцентных маркеров. Особое место среди них занимает зеленый флуоресцентный белок (GFP), его варианты и гомологи.

Главными особенностями GFP-подобных белков при их использовании являются высокая стабильность и способность к формированию хромофора без участия кофакторов, ферментов или каких-либо субстратов, кроме молекулярного кислорода (Shaner et.al., 2007). Таким образом, образования хромофора и возникновения свечения возможно непосредственно в живых организмах, тканях или клетках.

Оказалось, что N- и C-концы флуоресцентных белков (FPs) доступны для создания гибридных белков, что позволяет осуществлять сшивку флуоресцентного белка (FP) с белком-мишенью. При этом FP не оказывает влияния на локализацию и функцию исследуемого белка. Это свойство делает GFP-подобные белки уникальными генетически кодируемыми флуоресцентными маркерами, которые стали незаменимыми инструментами для изучения взаимодействия белков, их локализации и транспорта, а также биосенсоров внутриклеточных метаболитов, позволяющих определять концентрацию Ca2+ и цАМФ, рН, мембранный потенциал, активность некоторых ферментов (например, каспаз, киназ и протеаз) в живой клетке (Stepanenko et.al., 2008).

Клонирование генов GFP-подобных белков, флуоресцирующих в желтой, оранжевой, красной и дальней красной областях спектра, явилось очередным этапом в использовании FPs для проведения исследований в области биологии (Matz et. al., 1999). Одновременное использование нескольких FPs с разными спектральными характеристиками привело к развитию современных методов исследований, позволяющих изучать многофакторные процессы в живой клетке и многоклеточном организме. Последующие научные исследования посттрансляционной химии, структуры и свойств GFP-подобных белков позволили разработать подходы к созданию новых FPs с улучшенными и даже заданными свойствами, которые нашли свое применение в биотехнологии и клеточной биологии (Heim et.al., 1996).

Все красные FPs дикого типа, так же как и первые улучшенные версии на их основе, обладали рядом существенных недостатков, таких как неполное и медленное образование хромофора, примесь зеленой флуоресцентной формы хромофора, склонность к агрегации и олигомеризации. Любой из перечисленных недостатков значительно ограничивает применение FP. Поэтому получение оптимальных красных FPs является очень актуальной проблемой, решение которой значительно расширяет возможности применения FPs в биологии и биотехнологии. В настоящее время наиболее эффективным методом получения улучшенных версий красных FPs является сочетание случайного и сайт-направленного мутагенеза с высоко эффективными техниками сортировки и отбора клеток. Данная стратегия уже была успешно использована для получения ряда FPs с заранее заданными физико химическими характеристиками (Subach et.al., 2009a, b).

Практическая значимость красных FPs особенно велика для микроскопии тканей и целых организмов, так как свет с большей длиной волны лучше проникает в биологические образцы. Это объясняется тем, что вода, меланин и гемоглобин, основные вещества, которые поглощают свет в биологических тканях, имеют минимальный коэффициент экстинкции в диапазоне длин волн от 600 до 900 нм.

Данный диапазон длин волн называется “оптическим окном” и является оптимальным для микроскопии биологических тканей и целых организмов (Konig, 2000). Более того, использование FPs с максимумом флуоресценции выше 600 нм может повысить чувствительность детекции флуоресценции. Это связано с тем, что автофлуоресценция клеток (прежде всего флуоресценция флавинов, витаминов, NAD(P)H) и светорассеивание в тканях уменьшаются с увеличением длины волны света.

На данный момент одним из лучших методов, позволяющих получать высококачественное трехмерное изображение живых тканей на глубину вплоть до миллиметра, является двухфотонная микроскопия (Zipfel et.al., 2003). Суть двухфотонной микроскопии состоит в том, что возбуждение флуоресценции происходит с помощью инфракрасного лазера большой интенсивности, что приводит к поглощению флюорофором двух фотонов с длиной волны в два раза больше длины волны однофотонного возбуждения. Использование красных FPs в мультифотонной микроскопии может открыть новые возможности для проведения исследований живых тканей и целых организмов с субклеточным разрешением в режиме реального времени. Однако красные FPs не могут быть эффективно возбуждены стандартным коммерчески доступным инфракрасным лазером, так как спектры их двухфотонного поглощения лежат в более длинноволновой области относительно рабочего диапазона длин волн данного лазера (Drobizhev et.al., 2009).

Возможным подходом к решению данной проблемы может быть разработка красного FP, спектр возбуждения которого смещен в коротковолновую область, или, другими словами, красного FP с большим Стоксовым сдвигом (large Stokes shift, LSS).

В настоящее время существует острая необходимость дальнейшего развития методов визуализации биологических объектов для выяснения фундаментальных основ жизнедеятельности клеток в условиях нормы и патологий различного происхождения. Создание новых вариантов флуоресцентных белков с длиной волны флуоресценции более 600 нм и при этом характеризующиеся большим Стоксовым сдвигом является актуальной задачей, которая имеет большое теоретическое и практическое значение. Более того, сочетание подобных белков с зеленым или синим FPs может быть также использовано для многоцветной двухфотонной микроскопии, что позволит наблюдать за нескольким клеточными процессами одновременно.

Введение этих белков в практику экспериментальной работы невозможно без выяснения механизмов, лежащих в основе спектральных свойств FP, а также изучения связи между их структурой и оптическими, а также биохимическими характеристиками. Понимание механизма большого Стоксового сдвига в GFP подобных белках может позволить рациональный дизайн красных FPs с большим Стоксовым сдвигом на основе существующих стандартных FPs.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось создание на основе гена белка mKate (Scherbo et.al., 2007) новых мономерных красных FPs с большим Стоксовым сдвигом, с длиной волны максимума флуоресценции более 600 нм, исследование связи особенностей первичной структуры новых белков с их спектральными свойствами и фотохимическими характеристиками. Оценить возможности практического применения новых красных FPs в белках слияния с различными клеточными белками в живых клетках в качестве флуоресцентного маркера для многоцветной одно- и двухфотонной микроскопии в тканях живых мышей.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. На основе гена мономерного красного FP mKate (длина волны флуоресценции 635 нм) методами молекулярного клонирования и эволюции создать по крайней мере два новых красных FPs с большим Стоксовым сдвигом, обладающих длиной волны максимума флуоресценции более 600 нм, названные LSS-mKate1 и LSS-mKate2.

2. Измерить спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции, спектры двухфотонного поглощения, определить величины фотостабильности, квантового выхода, коэффициента экстинкции, скорости созревания хромофора и рН стабильности флуоресценции, исследовать олигомерное состояние LSS-mKate белков. Сравнить полученные характеристики с соответствующими значениями для единственного ранее опубликованного красного FP с большим Стоксовым сдвигом mKeima (Стоксов сдвиг состовляет 180 нм) (Kogure et.al., 2006) и другими страндартыми FPs других диапозонов флуоресценции.

3. Определить третичные структуры полученных LSS-mKate белков методом рентгеноструктурного анализа. Установить аминокислотные замены, ответственные за увеличение Стоксового сдвига флуоресценции, а также влияющие на биохимические характеристики новых LSS-mKate белков. Установить молекулярный механизм флуоресценции LSS-mKate белков.

4. Проанализировать возможности практического использования белков LSS mKate в живых клетках путем создания и анализа экспрессии его химерных генетических конструкций с клеточными белками в культивируемых клетках млекопитающих, а также с помощью стандартной флуоресцентной микроскопии показать возможности многоцветного мечения клеток новыми LSS-mKate1 и LSS mKate2 и известными красными FPs.

5. Исследовать возможности практиктического использования белков LSS mKate1 и LSS-mKate2 для многоцветной двухфотонной микроскопии живых тканей и организмов.

Научная новизна полученных результатов. Созданы два новых мономерных красных FPs, названные LSS-mKate1 и LSS-mKate2 и обладающие максимумами возбуждения около 460 нм и максимумами флуоресценции более 600 нм. Оба полученных LSS-mKate белка обладали улучшеными физико-химическими свойствами по сравнению с таковыми для единственного известного красного FP с большим Стоксовым сдвигом mKeima. Определены аминокислотные последовательности полученных белков. Установлены аминокислотные остатки, ответственные за сдвиг максимумов возбуждения в коротковолновую область и биохимические свойства новых белков.

Описаны спектральные и фотохимические свойства LSS-mKate1 и LSS-mKate2.

Измерены полупериоды формирования хромофора, эффективность созревания хромофора и рН-зависимость интенсивности флуоресценции для LSS-mKate белков.

Установлено, что флуоресценция LSS-mKate1 и LSS-mKate2 является самой рН стабильной из всех известных красных FPs. Установлено влияние внесенных мутаций на структурно-функциональные изменения белка mKate, которые определяют флуоресцентные и биохимические свойства LSS-mKate белков в процессе молекулярной эволюции.

Впервые показано, при сравнении с аналогичными характеристиками уже существующего красного FP mKeima с большим Стоксовым сдвигом, LSS-mKate белки обладают существенными преимуществами для применения в клеточной биологии.

Были решены кристаллические структуры белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2 во флуоресцентных состояниях с разрешением 2.0 и 1.5. Изучены зависимости спектральных характеристик белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2 от температуры, рН среды, протонно-дейтериевого состава растворителя. На основании полученных данных были предложены молекулярные механизмы большого Стоксового сдвига для LSS-mKate1 и LSS-mKate2.

Впервые была предложена схема рационального дизайна новых красных FPs с большим Стоксовым сдвигом на основе уже существующих стандартных красных FPs. Используя данную стратегию, была получена серия флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом, которые обладают максимумами флуоресценции в широком диапазоне длин волн от 560 до 640 нм.

Показано, что новые LSS-mKate белки расширяют возможности многоцветного мечения клеток для двухфотонной микроскопии, добавляя новый красный цвет, и спектрально отличаются от существующих красных FPs при использовании для многоцветной стандартной флуоресцентной микроскопии. Впервые была проведена многоцветовая двухфотонная микроскопия тканей живых мышей с субклеточным разрешением в режиме реального времени. Данный подход был использован для анализа взаимного расположения органелл клеток в раковой опухоли мыши как функции расстояния до ближайшего кровеносного сосуда. Высокая фотостабильность LSS-mKate белков сделала возможным длительное наблюдение за отдельно взятой клеткой при ее миграции в раковой опухоли. Анализ полученных изображенный показал поляризацию пар комплекс Гольджи-ядро в раковых клетках, расположенных на расстояниях менее 40 мкм до ближайшего кровеносного сосуда.

Практическое значение полученных результатов. Практическое значение результатов диссертационной работы состоит прежде всего в том, что в ходе работы были получены новые белки LSS-mKate, которые могут быть эффективно использованы для многоцветной двухфотонной микроскопии живых тканей.

Спектральные характеристики LSS-mKate белков оптимальны для визуализации живых клеток и тканей с субклеточным разрешением в течение длительного времени. Белки LSS-mKate лишены таких серьезных недостатков, как склонность к агрегации в живых клетках, низкая рН-стабильность и остаточная зеленая флуоресценция и, таким образом, имеют большой потенциал применения в биотехнологии. Созданные FPs раскрывают новые возможности многоцветного мечения биологических объектов, поскольку могут быть эффективно спектрально разрешены с другими стандартными флуоресцентными белками. В паре с уже существующими синими FPs, LSS-mKate1 и LSS-mKate2 могут использоваться для создания молекулярных биосенсоров, работающих на основе безизлучательного переноса энергии (FRET). Белки LSS-mKate возбуждаются стандартными синими лазерами 407 нм и 457 нм проточных цитофлуориметров, благодаря чему станут полезным инструментом для биомедицинских исследований. Предложенная схема рационального дизайна красных FPs с большим Стоксовым сдвигом может быть использована для получения других подобных FPs с улучшенными и заданными спектральными характеристиками.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлена на: The American Society for Cell Biology 48th Annual Meeting (San Francisco, США, 2008);

VII Ежегодная Международная Молодежная Конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая Физика» (Москва, Россия, 2008);

XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009» (Москва, Россия, 2009);

Intern. Conf. «Biocatalysis-2009:

Fundamentals&Applications;» (Архангельск, Россия, 2009);

III Международная конференция: "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины" (Ростов-на-Дону, Россия, 2009).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 статей и 5 тезисов докладов на международных конференциях и симпозиумах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит страницы печатного текста, 29 рисунков, 5 таблиц, 153 ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспериментальная часть Объект исследования. Ген белка mKate, мутантные варианты mKate, белки LSS-mKate, их первичная, вторичная и третичная структуры, спектральные и фотохимические характеристики, химерные конструкции LSS-mKate белков с клеточными белками.

Методы исслдования. В работе использовались следующие штамы бактерий E.coli: DH5 и LMG194. Все генно-инженерные манипуляции проводили согласно описанным методам и протоколам (Маниатис и др., 1984).

Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезировны в лаборатории фирмы Fisher Oligo (США). Амплификацию генов проводили на приборе MyCycler Thermal Cycler фирмы BioRad (США). Сайт-направленный мутагенез проводили с использованием QuikChange Mutagensis Kit (Stratagene, США). Случайный мутагенез осуществляли с помощью GeneMorph II Random Mutagenesis Kit (Stratagene, США). Выделение плазмидных ДНК и очистку ПЦР-продуктов проводили с использованием специальных наборов для выделения и очистки ДНК «GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit» (Fermentas, Латвия) и «QuickClean PCR Purification Kit» (GenScript, США).

Сортировку бактериальных библиотек проводили на проточном цитофлуориметре MoFlo XDP (Dako, США) или FACSAria (Becton Dickinson, США).

Вторичную селекцию бактериальных клонов проводился с помощью флуоресцентного стереомикроскопа Leica MZ16F, оснащенного спектрофотометром QDI-202 (CRAIC, США).

Выделение рекомбинантных белков, синтезированных в клетках E.coli, проводили по стандартной методике с использованием металлоаффинного сорбента Ni-NTA (Qiagen, США) или B-Per реактива, для лизиса бактериальных клеток (Pierce, США). Исследования основных физико-химических характеристик флуоресцентных белков проводили в фосфатно-солевом буфере PBS при рН 7. после очистки на металлоаффинном сорбенте Ni-NTA (Qiagen, США). Измерения двухфотонных спектров возбуждения проводили используя лазерную систему Cameleon Ultra Ti-Sapphire (Coherent, США).

Кристаллы белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2, обладающие хорошей дифракцией рентгеновских лучей, были получены диффузией паров летучих веществ методом «сидящей капли». Данные дифракции были зарегистрированы на детекторе Quantum 315 CCD (Area Detector Systems Corp., Poway, США) с длиной волны облучения 1.08 на X29A пучке синхротронного излучения (National Synchrotron Light Source, Brookhaven, США). Полученные дифракционные данные были обработаны с помощью программного обеспечения HKL2000, TRUNCATE, PHASER, COOT, REFMAC, WHATCHECK и PROCHEK.

Для исследования возможностей применения новых FPs в клеточной биологии использовали культуры клеток линии HeLa, MTLn3, MTLn3 со сверхэкспрессией ErbB1 и MDA-MB-231. Микроскопию животных клеток проводили с использованием конфокального микроскопа SP5 AOBS (Leica, США) или инвертированного микроскопа IX81 (Olympus, США), оборудованном источником света Lumen PRO с металло-галоидной лампой (Prior). Трансплантация раковых клеток в молочные железы ТКИД мышей и хирургическая обработка опухоли были проведены в соответствии с протоколами Института Исследований животных при Медицинском колледже имени А. Эйнштейна (AECOM, США). Двухфотонная микроскопия in vivo производилась с использованием микроскопа IX81 (Olympus, США) с титан-сапфировым лазером (BioRad, США). Микроскопию раковых клеток проводили при длине волны 870 нм. Серии изображений были реконструированы с помощью программы ImageJ и проанализированы с использованием программного обеспечения Region of Interest Tracker (AECOM, США).

Результаты и их обсуждение 1. Создание красных флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом Среди существующих дальне-красных флуоресцентных белков, следует отметить недавно созданный белок mKate, который существенно ярче, чем его аналоги HcRed (Gurskaya et.al., 2001) или mPlum (Wang et.al., 2004), имеющие сходные спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции. Кроме того, mKate характеризуется мономерным состоянием, высокой скоростью и степенью созревания красного хромофора. Сначала был проведен случайный мутагенез гена белка mKate с применением полимеразой цепной реакции. Затем ПЦР-продукты были лигированы в экспрессионный вектор pBAD/His-B и трансформированы в клетки E.coli штамма LMG194. Полученные в результате мутагенеза бактериальные библиотеки размерами до 7107 независимых клонов, сортировались на проточном цитофлуориметре. Критерий отбора был таковым: собирались клетки не обладающие зеленой (возбуждение 488 нм, эмиссия 520/40 нм), красной (возбуждение 568 нм, эмиссия 620/30), синей (возбуждение 407 нм, эмиссия 450/ нм) флуоресценцией, но обладающие красной флуоресценцией при возбуждении лазером с длиной волны 407 нм (возбуждение 407 нм, эмиссия выше 580 нм). Из каждой библиотеки собиралось несколько тысяч клеток с максимальной яркостью нужного фенотипа, которые высевались на чашки Петри для синтеза целевого белка.

Вторичная селекция клонов проводилась с использованием флуоресцентного стереомикроскопа. Самые яркие колонии нужного фенотипа переносились на штрихи для измерения их спектров флуоресценции, с использованием присоединённого к стереомикроскопу спектрометра Craic QDI202. После каждого Рис. 1. Спектральные, биохимические свойства и фотообесцвечивание белков LSS-mKate (сплошная линия), LSS-mKate2 (пунктирная линия), и mKeima (точечная линия). (а) Спектры возбуждения и эмисси флуоресценции. (б) Кривые кинетики созревания. (в) рН-зависимость интенсивности флуоресценции. (г) Нормированные кривые фотообесцвечивания для капель растворов LSS-mKates, mKeima, и EGFP (линия точка-тире) в масле, фотообесцвечивание проводилось с использованием излучения металл-галогеновой лампы. (д) Двухфотонные спектры возбуждения для LSS-mKate1, LSS-mKate2, mKeima, EGFP, и ECFP (линия две точки-тире). (е) Кривые фотообесцвечивания для меченных белками ядер живых клеток линии HeLa, измеренных при двухфотонном возбуждении с длиной волны 870 нм. Каждая кривая представляет данные, усредненные для 16-20 клеток.

раунда мутагенеза и скрининга, из 25-30 самых ярких клонов с большим Стоксовым сдвигом и минимальной флуоресценцией в других областях спектра, выделялась ДНК, которая секвенировалась. Смесь кДНК отобранных вариантов затем использовали как исходную для следующего раунда мутагенеза. В результате нескольких последовательных раундов молекулярной эволюции белка mKate были найдены мутантные белки mKate/Lys69Tyr/Pro131Thr/Ser148Gly/Met167Glu/ Thr183Ser/Met196Val и mKate/Lys69Tyr/Pro131Thr/Ser148Gly/Met167Asp/Thr183Ser/ Met196Val (нумерация приведена по выравниванию аминокислотной последовательности со стандартным белком GFP), которые назвали LSS-mKate1 и LSS-mKate2, соответственно.

2. Основные физико-химические характеристики очищенных рекомбинантных белков LSS-mKate1 и LSS-mKate На следующем этапе были характеризованы очищенные белки LSS-mKate1 и LSS-mKate2 и их свойства сравнивали со свойствами FP mKeima в одинаковых условиях. Основные характеристики белков LSS-mKate1, LSS-mKate2 и mKeima приведены на Рис. 1 и в Таблице 1. Спектры двухфотонного возбуждения для вариантов LSS-mKatе, ECFP, and EGFP измеренные в пределах от 760 до 1000 нм показали существенное перекрывание, кроме того значение максимума спектров двухфотонного возбуждения 2PE для LSS-mKate1 было в 1.6 раза ниже, а для LSS mKate2 в 1.4 раза выше соответствующего значения для mKeima (Рис. 1, д).

Величина фотостабильности при двухфотонном возбуждении для LSS-mKatе1 была такой же, как для mKeima, а значение двухфотонной фотостабильности для LSS mKatе2 было в 1.4 раза выше, чем для mKeima (Рис. 1, е).

Tаблица 1. Свойства белков LSS-mKate1, LSS-mKate2 и mKeima 1/ Фото Exmaxа, Emmaxб, в, Созревания QYг Яркостьд Белок стабиль рКа M1 cм нм нм при 37°С, ность, с мин LSS-mKate1 463 624 31 200 0,08 2,5 60 3,2 LSS-mKate2 460 605 26 000 0,17 4,5 44 2,7 440 620 13 400 0,24 3,4 19 6,0 mKeima 584 620 2 500 0,17 н.д. н.д. н.д. н.д.

Здесь и далее: aмаксимум возбуждения флуоресценции;

бмаксимум эмиссии флуоресценции;

в коэффициент молярной экстинкции;

гквантовый выход;

дяркость флуоресцентного белка определяется как произведение квантового выхода на коэффициент молярной экстинкции, деленный на 1000.

Мономерность очищенных рекомбинантных LSS-mKate белков была показана с помощью белкового электрофореза в полунативных полиакриламидных гелях с использование мономерного, димерного и тетрамерного белков в качестве контроля.

Белок mKeima, согласно проведенному анализу, имеет тенденцию к димеризации даже при относительно невысокой концентрации 50 мкг/мл.

3. Молекулярный механизм большого Стоксового сдвига в белках LSS-mKate Большой Стоксов сдвиг в белках LSS mKate может быть объяснен переносом протона в возбужденном состоянии хромофора (excited-state proton transfer, ESPT). Данное явленение было ранее исследованно на вариантах GFP, также обладающих большим Стоксовым сдвигом.

Чтобы доказать данное предположение, а также установить аминокислотные остатки участвующие в переносе протона были решены кристаллические структуры LSS mKate белков во флуоресцентном состоянии, исследована зависимоть спектральных характеристик от рН, температуры, H/D изотопного состава растворителя, проведен мутагенез ключевых аминокислотных Рис. 2. Молекулярные структуры остатков вовлеченных в перенос протона.

хромофоров LSS-mKate1 (а) и LSS 3.1. Третичная структура белков LSS- mKate2 (б) и их ближайшего микроокружения с суперналожением на mKate1 и LSS-mKate2. С целью иссле соответствующую 2Fo – Fc электронную дования молекулярных механизмов красной плотность хромофоров (по контуру 1).

Водородные связи представлены флуоресценции белков LSS-mKate1 и LSS зелеными пунктирными линиями с mKate2, были решены их кристаллические длиной указанной в ангстремах;

атомы окрашены по типу атомов (углерод – структуры во флуоресцентных состояниях с серый, азот – синий, кислород – разрешением 2.0 и 1.5, соответственно. красный, сера – желтый);

молекулы воды показаны как красные шары.

Наложение структур LSS-mKate белков на Стрелками указаны торсионные углы структуру их предшственника mKate и 2.

показало значительное структурное сходство всех соответствующих аминокислотных остатков, за исключением тех, которые были заменены в процессе молекулярной эволюции. Электронные плотности хромофоров, образованных трипептидом Met63-Tyr64-Gly65, согласовались с соответствующими параметрами для DsRed-подобного хромофора. В структуре LSS-mKate1 цис-конфигурация фенольного кольца хромофора преобладала у всех четырех молекул ассиметричной единицы. Напротив, в структуре LSS-mKate2, преобладала транс-конфигурация фенольного кольца хромофора, с небольшой популяцией (~10%) цис-изомера, присутствующего в двух из четырех молекул ассиметричной единицы.

Детальный анализ третичных структур LSS-mKate белков позволил определить две различные цепи водородных связей с участием фенольных групп хромофора. В случае LSS-mKate1 гидроксильная группа тирозина цис-хромофора формирует водородную связь с карбоксильной группой боковой цепи Glu167, которая в свою очередь образует водородные связи с Ser165 и молекулой воды (Рис.

2, а). В структуре LSS-mKate2 фенольная группа транс-хромофора образует непосредственную водородную связь с Ser165, который связан водородной связью с карбоксильной группой Asp167 и молекулой воды (Рис. 2, б). Геометрия Рис. 3. Спектры поглощения и флуоресценции белков LSS-mKate1 (а, б, в) и LSS-mKate2 (г, д, е) при различных значениях рН (а, б, г, д) (смотри также Табл. 1) и в двух разных растворителях при 77 и 298 К (в и г). На панелях б и д, спектры поглощения были измерены при рН 7 после возвращения рН образцов белков с 11 обратно к нейтральному значению рН. На панелях в и е длина волны возбуждения составляла 450 нм. Спектры нормированы на 100%.

водородных связей между гидроксильной группой остатка тирозина и боковыми цепями Ser165 и Asp167 оптимальная с точки зрения углов и длин связей. Возможно, что значительное отличие между длинами волн максимумов эмиссии флуоресценции и квантовыми выходами белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2 (Таблица 1) обусловлены различными конфигурациями их хромофоров и окружениями их фенольных колец, так же как это наблюдалось в случае мутантных белков eqFP (Nienhaus et.al., 2008).

3.2. Зависимость спектральных свойств белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2 от рН, температуры и изотопного состава растворителя. Спектры поглощения белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2 при значениях рН 3, 5, 7, 9 и 11 были измерены при комнатной температуре (Рис. 3, а и г). В отличие от других FPs с большим Стоксовым сдвигом, спектры поглощения LSS-mKate белков при значениях рН от до 11 практически не изменялись. При значении рН 11 появлялся новый пик поглощения, смещенный в красную область спектра с максимумом 579 нм, который был обозначен как пик В. Возбуждение пика В приводило к красной флуоресценции с максимумом при 628 нм, который совпадал для обоих белков LSS-mKate (Рис. 3, б и д). Спектры флуоресценции белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2 демонстрировали сильную зависимость от температуры и изотопного состава растворителя: смещение максимумов флуоресценции в коротковолновую область спектра при низких температурах и увеличение коротковолнового плеча спектра флуоресценции при замещении протонов дейтеронами (Рис. 3, в и е). Похожие эффекты при замене протонов на дейтерий были ранее описаны для белка mKeima и некоторых вариантов GFP, в которых реализуется механизм ESPT (Shi et.al., 2007;

Henderson et.al., 2009).

Таблица 2. Спектральные свойства мутантных белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2.

Белок Exmax, нм Emmax, нм QY pKa LSS-mKate1 463 624 0,08 3, LSS-mKate1/Ser165Ala 463 624 0,09 3, LSS-mKate2 460 605 0,17 2, LSS-mKate2/Ser165Ala 463 624 0,08 3, LSS-mKate2/Ser165Thr 463 627 0,12 3, LSS-mKate2/Ser165Met 463 627 0,08 3, 3.3. Мутагенез ключевых аминокислотных остатков в LSS-mKate1 и LSS mKate2. Замена Ser165 на Ala, Thr или Met приводит к существенному сдвигу максимума флуоресценции белка LSS-mKate2, также данные мутации уменьшают рН-стабильность и квантовый выход LSS-mKate2. В случае белка LSS-mKate замена Ser165 на гидрофобный Ala не приводит к каким-либо существенным изменениям спектральных характеристик (Таблица 2). Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что остаток Ser165 вовлечен в цепь переноса протонов в белке LSS-mKate2, но не участвует в реализации ESPT в белке LSS mKate1.

Рис. 4. Предполагаемые фотоциклы для LSS-mKate1 (а) и LSS-mKate2 (б) при нейтральном рН и комнатной температуре. Возбужденное состояние нейтрального хромофора А*, образующееся при облучении светом с длиной волны ~460 нм, превращается после ESPT в возбужденное анионное состояние, обозначаемое как I*. После эмиссии красной флуоресценции, протон переносится от Glu167 (LSS-mKate1) или Asp167 (LSS-mKate2) к хромофору с образование основного состояния нейтрального А хромофора.

Полученные данные свидетельствуют о протекании ESPT в белках LSS-mKate.

Более того по аналогии с GFP дикого типа (Chattoraj et.al., 1996), был предложен возможный фотоцикл для белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2. На Рис. проиллюстрированы ключевые стадии схемы фотофизических и фотохимических процессов, происходящих в белках LSS-mKate при нейтральных значениях рН при комнатной температуре. В основном состоянии хромофора рКа карбоксила Glu/Asp167 ниже чем рКа гидроксильной группы тирозина хромофора, и хромофоры находятся в нейтральной форме, стабилизируемой карбоксил-анионом. В возбужденном состоянии происходит резкое возрастание кислотности гидроксильной группы тирозина хромофора (pKa может достигать значений 2-3), что позволяет ей выступать в качестве донора протона и протонировать карбоксильные группы Glu/Asp167 (Wiehler et.al., 2003).

Рис. 5. Предполагаемые схемы кислотно-основных равновесий хромофора и его ближайшего аминокислотного окружения для белков LSS-mKate1 (а) и LSS-mKate2 (б) которые объясняют рН зависимое поведение спектральных свойств данных белков.

Простая модель, включающая три различных состояния хромофора и его ближайшего окружения, адекватно объясняет рН-зависимое поведение белков LSS mKate (Рис. 5). При значениях рН ниже 3,5, и хромофор и карбоксильная группа Glu/Asp160 протонированы, таким образом ESPT не происходит. При значениях рН в пределах от 3,5 до 10, хромофор протонирован, а карбоксильные группы Glu/Asp160 депротонированы, и эффективный ESPT приводит к красной флуоресценции с большим Стоксовым сдвигом. При рН 11 и, возможно, выше образуется флуоресцентная анионная форма хромофора, которая характеризуется максимумами возбуждения и эмиссия флуоресценции 579 нм и 630 нм, соответственно, для обоих LSS-mKate белков. Депротонирование хромофора происходит при достаточно высоких значениях рН. Это может означать, что отрыв протона от нейтрального хромофора является энергетически неблагоприятным процессом, возможно из-за тесной близости двух отрицательно заряженных групп:

карбоксильной группы Glue160/Asp160 и фенольной группы хромофора. Более того, на спектры поглощения белков LSS-mKate рН влияет обратимо (Рис. 3, б и д). Таким Рис. 6. Сети водородных связей участвующие в переносе протонов в белках LSS-mKate1 (а), LSS mKate2 (б) и mKeima (в) показаны для хромофора и аминокислотных остатков, вовлеченных в ESPT (водородные связи выделены серым).

образом, мы предполагаем, что пик А в спектре поглощения белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2 соответствует нейтральному состоянию хромофора, а пик В – анионному состоянию хромофора.

4. Рациональный подход к созданию флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом Было предположено, что цепи водородных связей для переноса протона, реализуемые в белках LSS-mKate и mKeima (Рис. 6), могут быть созданы и в других оранжевых и красных FPs с тирозинсодержащим хромофором, путем введения Asp или Glu в микроокружение хромофора. Для проверки данной гипотезы было выбрано пять стандартных FPs, таких как mNeptune (Lin et.al., 2009), mCherry, mStrawberry, mOrange (Shaner et.al., 2004) и mKO (Karasawa et.al., 2004) вместе с белком mKate, для введения сайт-направленных мутаций, которые могут создать условия для протекания ESPT. Предварительный выбор позиций для аминокислотных замен основывался на выравнивании аминокислотных последовательностей белков LSS-mKate1, LSS-mKate2 и mKeima с аминокислотными последовательностями указанных выше белков.

Для превращения выбранных FPs в варианты с большим Стоксовым сдвигом, были созданы две серии библиотек кДНК генов для каждого белка с помощью сайт направленного мутагенеза. В первом случае в 165 позицию были введены Asp или Glu, а позиция 167 была заменена случайным образом. В другом случае, в позиция была заменена случайно, а в 167 позицию были введены Asp или Glu. В результате последующего скрининга были найдены клоны обладающие оранжевой или красной флуоресценцией при возбуждении циановым светом, то есть обладающие большим Стоксвым сдвигом. В результате секвенирования полученных ДНК были обнаружены гены, которые кодировали соответствующие исходные белки с одной или двумя Таблица 3. Спектральные свойства оранжевых и красных FPs с аминокислотными заменами по аминокислотными заменами в позициям 165 и 167.

позициях 165 и/или 167 (Табл. 3).

Исходный Введенные Exmax, Emmax, белок мутации нм нм Измеренные спектры возбуждения Нет 588 флуоресценции отобранных вариантов 167Asp 449 mKate 167Glu 451 624 показали, что даже при нейтральных 165Gly, 167Glu 451 значениях рН большинство 165Asp 450 Нет 600 650 мутантных белков обладали 165Asp 460 mNeptune протонированным хромофором. В 165Gly, 167Glu 467 165Ser, 167Glu 466 628 дальнейшем улучшение полученных в Нет 587 данной работе оранжевых и дальне mCherry 165Glu, 167Ala 457 165Ser, 167Glu 456 610 красных вариантов с большим Нет 574 Стоксовым сдвигом приведет к mStrawberry 165Asp 438 165Asp, 167Leu 438 572 созданию отличных маркеров с двумя Нет 548 спектрально разрешаемыми цветами 165Asp, 167Gly 433 165Asp, 167Ala 434 560 для молекулярной и клеточной mOrange 165Asp, 167Leu 441 биологии. Данная стратегия может 165Glu, 167Ala 436 165Ala, 167Glu 441 561 быть использована для получения Нет 548 новых FPs с большим Стоксовым mKO 165Glu 439 165Asp, 167Leu 438 559 сдвигом.

5. Характеризация белков LSS-mKatе1 и LSS-mKate2 в живых клетках Для характеризации белков LSS-mKatе1 и LSS-mKate2 в клетках млекопитающих, сначала проводили временную трансфекцию клеток линии HeLa плазмидными ДНК, кодирующими белки LSS-mKatе без какого-либо сигнала локализации. Были получены изображения флуоресцирующих клеток с помощью флуоресцентного микроскопа с широким полем зрения или конфокального микроскопа. Высокий уровень флуоресценции клеток, экспрессирующих гены LSS mKate белков, можно было наблюдать через 20 часов после трансфекции. Высокий уровень флуоресценции сохранялся как минимум в течение 72 часов после проведения временной трансфекции. Флуоресцентные сигналы LSS-mKate белков были равномерно распределены внутри цитоплазмы и ядра живых клеток линии HeLa без какой-либо видимой агрегации или неспецифической локализации. Затем были созданы белки слияния вариантов LSS-mKatе с -актином, -актином, паксиллином, кератином, -тубулином, гистоном H2B, и цитохром C оксидазой. Эти конструкции слияния хорошо встраивались в соответствующие эндогенные клеточные структуры, указывая, что белки LSS-mKatе ведут себя как мономеры в клетках. Однако в случае белка mKeima не все его конструкции слияния хорошо встраивались в эндогенные клеточные структуры. В случае актина, актинина и тубулина белки слияния демонстрировали заметную агрегацию, и повышенный внутриклеточный фоновый сигнал для белков слияния с актином, паксиллином и тубулином. Эти данные, вместе с результатами анализа in vitro, указывают на высокую склонность белка mKeima к образованию димеров.

Яркость и фотостабильность белков LSS-mKatе позволяет проводить эксперименты по визуализации внутриклеточной динамики в течение достаточно длительных промежутков времени. Микроскопия митохондрий, меченных LSS mKate белками, в течение 40 минут под эпифлуоресцентным микроскопом с широким полем зрения показала отсутствие заметного фотообесвечивания флуоресцентных белков. Нормированные значения фотостабильности LSS-mKatе1 и LSS-mKatе2 в живых клетках линии HeLa при высокой мощности возбуждающего света были в 3,6 раз и в 2 раза выше, чем у известного ECFP.

Клетки аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231, аденокарциномы молочной железы крысы MTLn3 и клетки MTLn3 со сверхэкспрессией рецептора эпидермального фактора роста ErbB1 стабильно экспрессирующие гены белков LSS-mKatе, локализованных в цитоплазме либо ядрах клеток, характеризовались высокой яркостью флуоресценции и нормальной скоростью пролиферации в культуре, тем самым указывая на низкую цитотоксичность FPs.

Уровень флуоресценция LSS-mKate в стабильных клеточных линиях не претерпевал заметных изменений в течение как минимум нескольких пассажей.

Флуоресценция LSS-mKate в стабильных клеточных линиях MDA-MB-231 и MTLn демонстрировала хорошую фотостабильность в процессе получения изображений в течение длительных промежутков времени. Полувремена фотообесцвечивания в этих условиях оказались сходными с полученными для очищенных белков LSS mKatе. Наблюдаемое деление клеток во время длительной микроскопии свидетельствует о низкой фототоксичности использующихся LSS-mKate белков.

Рис. 7. Флуоресцентная микроскопия белков слияния LSS-mKate1, LSS-mKate2, и mKeima с гистоном Н2В, которые были совместно экспрессированы с mCherry--тубулином, в живых клетках линии HeLa. Флуоресцентные изображения (левая колонка;

красный цвет) были получены с использованием фильтров 436/20 для возбуждения и 605/40 для флуоресценции. Изображения стандартной красной флуоресценции (средняя колонка;

зеленый цвет) были получены с использованием фильтров 570/30 для возбуждения и 615/40 для флуоресценции. В правой колонке представлены наложения изображений левой и центральной колонок. Маштабный отрезок равен 10 мкм.

С целью проверить возможность применения белков LSS-mKatе в качестве дополнительного красного цвета при визуализации с существующими красными FPs со стандартным Стоксовым сдвигом, конструкции белков слияния LSS-mKatе и mKeima были одновременно экспрессированы вместе с конструкциями mCherry- тубулин, TagRFP--актинин, и mKate-VSVG (белок tsO45 вируса везикулярного стоматита G) в живых клетках линии HeLa (на Рис. 7 показаны клетки, экспрессирующие гены белков слияния LSS-mKate1, LSS-mKate2, и mKeima с гистоном Н2В, которые были совместно экспрессированы с mCherry--тубулином).

Два набора фильтров позволили визуализировать оба белка LSS-mKatе с белками mCherry, TagRFP (Merzlyak et.al., 2007), или mKate без перекрывания сигналов между каналами. Белок mKeima демонстрировал сильную красную флуоресценцию при возбуждении светом 570/30, который, препятствовал получению изображений структур mCherry--тубулин, TagRFP--актинин, и mKate-VSVG отдельно от белков слияния с mKeima. Красную флуоресценцию белков LSS-mKatе при возбуждении 570/30 нм не наблюдали даже в клетках с высоким уровнем экспрессии данных белков.

6. Многоцветная двухфотонная микроскопия в живых мышах Для проведения многоцветной двухфотонной микроскопии in vivo была использована модель ксенотрансплантанта метастатических клеток рака молочной железы у мышей. Гены белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2 были стабильно экспрессированы в ядрах MTLn3 клеток. Дополнительно, в клетках экспрессирующих LSS-mKate1, были коэкспрессированы белки ECFP в комплексе Гольджи и EGFP в цитоплазме. Таким образом, MTLn3 клетки, экспрессирующие LSS-mKate1 могут быть легко отличимы от клеток, которые экспрессируют LSS mKate2, по различным флуоресцентным сигналам. Данная особенность позволяет сравнивать физико-химические свойства LSS-mKate белков in vivo в абсолютно одинаковых условиях.

Смесь полученных флуоресцентных клеток была трансплантирована в молочную железу ТКИД (тяжелый комбинированный иммунодефицит) мышей.

Через четыре недели введенные клетки сформировали раковую опухоль размером в несколько миллиметров. Кожа возле опухоли была заменена на оптическое стекло, что позволяло проводить микроскопию раковых клеток живой мыши в течение последующих нескольких недель.

Рис. 8. Прижизненная визуализация клеток раковой опухали в мыши с использованием двухфотонного возбуждения. Представлены изображения клеток MTLn3 с сверхэкспрессией ErbB и стабильной экспрессией белков слияния сигнала ядерной локализации с LSS-mKate1 (красный), -1,4-галактозилтрансферазы с ECFP (синий), и EGFP (зеленый) в цитоплазме клетки, или со стабильной экспрессией белка слияния сигнала ядерной локализации с LSS-mKate2 (красный).

Сигнал флуоресценции получали одновременно с сигналом генерации второй гармоники от коллагеновых волокон (серый). Изображения клеток опухоли получали в глубину по оси Z на мкм с шагом в 5 мкм, на данном рисунке представлена серия снимков раковой опухоли на глубине 55, 60, 65, 70 и 75 мкм.

Эмпирически была найдена оптимальная длина волны двухфотонного лазера для одновременного возбуждения белков LSS-mKate, ECFP и EGFP, которая составила ~870 нм. Двухфотонный сканирующий микроскоп позволил получить серию изображений раковой опухоли с шагом в 5 микрон с максимальным проникновением вглубь ткани до 125 микрон (Рис. 8). Анализ полученных изображений показал, что LSS-mKate белки локализованы в ядрах и присутствуют практически во всех клетках опухоли. Яркость белка LSS-mKate2 in vivo оказалась в два раза выше яркости LSS-mKate1, что соответствует соотношению яркостей данных белков in vitro. Следует отметить, что по мере проникновения вглубь ткани яркость ECFP и EGFP уменьшалась сильнее, чем яркость LSS-mKate белков. На глубине 100 микрон флуоресценция ECFP и EGFP была уже тусклой тусклой.

Пространственное разрешение снимков клеток раковой опухоли позволяли точно определить положение каждой отдельно взятой клетки и расположение в ней ядра, комплекса Гольджи и цитоплазмы. Это достоинство было использовано для изучения движения раковых клеток in vivo и для исследования взаимного расположения органелл клеток в раковой опухоли. В дельнейших экспериментах был использован белок LSS-mKate1. Предполагалось, что если удастся детектировать флуоресценцию LSS-mKate1 в тканях живых мышей, то флуоресценция более яркого и фотостабильного LSS-mKate2 так же может быть надежно детектирована в подобных условиях.

Для визуализации движения клеток были получены серии снимков раковой опухоли до 60 микрон вглубь. Фотостабильность LSS-mKate1 при двухфотонном возбуждении была достаточна для длительной микроскопии MTLn3 клеток c гиперэкспрессией ErbB1 в выбранном поле. Микроскопию определенной области опухоли проводили в течение 45-60 минут со сканированиями Z-серий каждые минут. Обычно, наибольшей подвижностью раковые клетки обладают в непосредственной близости от кровеносного сосуда. Для облегчения поиска кровеносных сосудов, находящихся в бластоме, в кровь мыши непосредственно перед микроскопией был впрыснут комплекс флуоресцеин-декстран. Удалось проследить судьбу отдельной раковой клетки, которая мигрировала в бластоме в течение часа. Использование LSS-mKate1 в комбинации с ECFP позволяет получать изображения раковых клеток в живых мышах с субклеточным разрешением, достаточным для детализации пространственного расположения клеточных органелл. Такое преимущество высокого разрешения было использовано для анализа взаимного расположения пар комплекс Гольджи-ядро в потенциально поляризованных клетках раковой опухоли (Рис. 9, а и б). Ранее было описано, что комплекс Гольджи идет впереди ядра во время миграции раковых клеток, вызванной искусственным повреждением тканей (ранением) (Nobes et.al., 1999). Более того было установлено, что поляризация раковых клеток происходит в непосредственной близости к кровеносным сосудам (Wyckoff et.al., 2000). Следовательно, в данной работе было проанализировано взаимное расположение пар комплекс Гольджи Рис. 9. (а) Изображения расположения пар ядро-комплекс Гольджи и поляризации клеток in vivo, полученные с использованием двухфотонного возбуждения.

Представленные изображения клеток MTLn со сверхэкспрессией ErbB1 и стабильной экспрессией белков слияния сигнала ядерной локализации с LSS-mKate1 (красный) и -1,4 галактозилтрансферазы с ECFP (синий), и флуоресцеин-декстраном (кровеносные сосуды, зеленый) показывают пары ядро аппарат Гольджи (желтые стрелки) выстроившиеся в линию по соседству с кровеносным сосудом опухоли. Маштабный отрезок равен 50 мкм. (б) Диаграмма, демонстрирующая метод для расчета угла оси ядро-комплекс Гольджи относительно оси, направленной перпендикулярно к центру кровеносного сосуда. Расстояния ядро-сосуд рассчитывали по линейным сегментам (пример показан на (а), линии, обозначенные желтыми точками, отмеченные как 1, 2 и 3).

(в) Анализ углов расположения ядро-аппарат Гольджи-сосуд. Горизонтальная ось показывает расстояния от сосуда к ядру, вертикальная ось показывает количество пар ядро-аппарат Гольджи характеризующихся или малым углом (90°, черные столбцы) или большим углом (90°, серые столбцы) расположения, рассчитанным относительно ближайшего юольшим углом (90°, серые столбцы) сегмента кровеносного сосуда. Данные представлены как значение ± SEM. Столбцы графы (г) показывают отношение количества пар с низким углом (90°) к количеству пар с высоким углом (90°) в пределах 0-40 мкм для 21 различных сегментов сосуда.

ядро по отношению к центру ближайшего кровеносного сосуда, как функция расстояния до сосуда (Рис. 9, в). Серии снимков по оси Z были произведены с шагом в 2 мкм, углы расположения комплекса Гольджи к ядру рассчитывали по отношению к перпендикулярной ориентации ядра клетки и центра ближайшего кровеносного сосуда (Рис. 9, б, диаграмма). Для анализа кровеносные сосуды были сегментированы на линейные области (Рис. 9, а, желтые пунктирные линии).

Проводили сравнение ориентаций с углами менее 90° и углами более чем 90° (положение - аппарат Гольджи предшествующий ядру = 0 градусов). Хотя на расстоянии до сосуда больше чем 40 мкм значения углов расположения аппарата Гольджи распределялись случайным образом (0-180°), в пределах 40 мкм наблюдалось 50% увеличение пар аппарат Гольджи-ядро с углами меньше чем 90° (Р 0,05). Однако в пределах 40 мкм не все сегменты сосудов характеризовались увеличением количества ориентаций с низкими величинами углов ориентации пар комплекс Гольджи-ядро (Рис. 9, г). Из 21 сегмента сосудов, содержащих пары аппарат Гольджи-ядро в пределах 40 мкм, приблизительно 70% сегментов обладали большинством пар комплекс Гольджи-ядро с углами расположения меньше чем 90°.

Почти 25% сегментов сосуда содержали в два раза большее количество пар комплекс Гольджи-ядро с низким значением угла расположения, что указывает на поляризацию по направлению к центру кровеносного сосуда.

ВЫВОДЫ 1. Методами молекулярного клонирования и направленной эволюции на основе кДНК мономерного красного FP mKate, созданы мономерные красные FPs, названные LSS-mKate1 и LSS-mKate2 с максимумами возбуждения/флуоресценции 463/624 нм и 460/605 нм, соответственно.

2. Определены аминокислотные последовательности новых белков LSS-mKate и LSS-mKate2 и установлено влияние каждой введенной аминокислотной замены на основные физико-химические характеристики белков.

3. Были подробно исследованы основные физико-химические характеристики флуоресцентных белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2 in vitro и in vivo. Определены двухфотонные характеристики LSS-mKate1 и LSS-mKate2 белков, такие как двухфотонные спектры возбуждения и полупериоды фотообесцвечивания при двухфотонном возбуждении.

4. Были определены третичные структуры белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2 с разрешением 2.0 и 1.5. Изучены зависимости спектральных характеристик белков LSS-mKate1 и LSS-mKate2 от температуры, рН среды, протонно-дейтериевого состава растворителя, введения точечных аминокислотных замен. На основании полученных данных было доказано, что перенос протона в возбужденном состянии (ESPT) ответсвенен за большой Стоксов сдвиг в белках LSS-mKate1 и LSS-mKate2.

5. Впервые была предложена схема рационального дизайна новых красных флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом на основе уже существующих красных флуоресцентных белков. Используя данную стратегию, была получена серия флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом, которые обладают максимумами флуоресценции в широком диапазоне длин волн от 560 до 640 нм.

6. На модельных экспериментах продемонстрированы возможности LSS-mKate и LSS-mKate2 в качестве оптимальных флуоресцентных маркеров для мечения клеточных белков.

7. Показано, что новые FPs LSS-mKate расширяют возможности многоцветного мечения клеток для двухфотонной микроскопии, добавляя новый красный цвет, и спектрально отличаются от существующих красных FPs при использовании для многоцветной стандартной микроскопии.

8. Впервые была проведена многоцветовая двухфотонная микроскопия живых тканей с субклеточным разрешением в режиме реального времени. Данное преимущество было использовано для определения взаимного расположения органелл клеток в раковой опухоли как функции расстояния до ближайшего кровеносного сосуда. Анализ полученных изображенный показал поляризацию пар комплекс Гольджи-ядро в раковых клетках, расположенных в непоредственной близости от кровеносного сосуда (менее 40 мкм).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Петкевич, К.Д., Ефременко, Е.Н., Верхуша, В.В., Варфоломеев, С.Д. Красные флуоресцентные белки и их свойства. // Успехи химии, 2010, 79(3), 273-290.

2. Piatkevich K.D., Malashkevich V.N., Almo S.C., and Verkhusha V.V. Engineering ESPT pathways based on structural analysis of LSSmKate red fluorescent proteins with large Stokes shift. // J. Am. Chem. Soc., 2010, 132:10762-70.

3. Piatkevich, K.D., and Verkhusha V.V. Advances in engineering of fluorescent proteins and photoactivatable proteins with red emission. // Curr. Opin. Chem. Biol., 2010, 14: 23 29.

4. Piatkevich, K.D., Hulit, J., Subach, O.M., Wu, B., Abdulla, A., Segall, J.E., and Verkhusha, V.V. // Monomeric red fluorescent proteins with a large Stokes shift. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107: 5369-5374.

5. Morozova, K.S., Piatkevich, K.D., Gould, T.J., Zhang, J., Bewersdorf, J., and Verkhusha, V.V. Far-red fluorescent protein excitable with red lasers for flow cytometry and superresolution STED nanoscopy. // Biophys. J., 2010, 99:L13-15.

6. Subach, F.V., Subach, O.M, Gundorov, I.S., Morozova, K.S., Piatkevich, K.D., Cuervo, A.M., and Verkhusha, V.V. // Monomeric fluorescent timers that change color from blue to red. Nature Chem. Biol., 2009, 5: 118-126.

7. Subach, O.M., Malashkevich, V.N., Zencheck, W.D., Morozova, K.S., Piatkevich, K.D., Almo, S.C., and Verkhusha, V.V. // Structural characterization of acylimine containing blue and red chromophores in mTagBFP and TagRFP fluorescent proteins.

Chem. Biol. (Cell press), 2010, 17: 333-341.

8. Subach O., Subach F., Morozova K., Piatkevich K., Cuervo A., Verkhusha V.

Development of new fluorescent proteins: a bright blue mTagBFP and the changing color from blue to red fluorescent timers. // The American Society for Cell Biology 48th Annual Meeting. 2008, San Francisco, USA, December 13-17, p. 124.

9. Петкевич К.Д., Субач О.М., Верхуша В.В., Варфоломеев С.Д. Разработка мономерного флуоресцентного белка с большим стоксовым сдвигом. // VII Ежегодная Международная Молодежная Конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая Физика». 2008, Москва, Россия, 11-13 ноября, с. 168-169.

10. Петкевич К.Д., Субач О.М., Верхуша В.В., Варфоломеев С.Д. Создание мономерного красного флуоресцентного белка для мультифотонной микроскопии. // XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009». 2009, Москва, Россия, 13-18 апреля, с. 27.

11. Piatkevich K.D., Verkhusha V.V., Varfolomeyev S.D. A large Stokes shift red fluorescent protein for fluorescence energy transfer applications. // Intern. Conf.

«Biocatalysis-2009: Fundamentals&Applications;». 2009, Arkhangelsk, Russia, 19- June, p. 120.

12. Петкевич К.Д., Верхуша В.В., Варфоломеев С.Д. Эффективная FRET-пара на основе красного флуоресцентого белка с большим Стоксовым сдвигом. // III Международная конференция: "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины", 2009, Ростов-на-Дону, Россия, 1-4 октября, с. 107-108.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ТКИД – тяжелый комбинированный иммунодефицит ESPT – перенос протона в возбужденном состоянии FRET – индуктивно-резонансный (Фёрстеровский) перенос энергии FP – флуоресцентный белок FPs – флуоресцентные белки GFP – зеленый флуоресцентный белок