Комплементарное связывание нуклеиновых кислот с фотополимеризуемыми ленгмюровскими монослоями, содержащими нуклеолипиды
На правах рукописи
Старицын Сергей Николаевич
КОМПЛЕМЕНТАРНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С
ФОТОПОЛИМЕРИЗУЕМЫМИ ЛЕНГМЮРОВСКИМИ МОНОСЛОЯМИ,
СОДЕРЖАЩИМИ НУКЛЕОЛИПИДЫ
Специальность 03.00.02 – биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук
Москва – 2006 1
Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Твердислов Всеволод Александрович
Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Каданцев Василий Николаевич кандидат физико-математических наук Солдатов Евгений Сергеевич
Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
Защита диссертации состоится « 22 » июня 2006 г. в 16 ч. на заседании диссертационного совета К 501.001.08 при Московском государственном университете им.
М.В. Ломоносова по адресу: Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, физический факультет, аудитория 5-19.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. Ломоносова
Автореферат разослан « 19 » мая 2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета К 501.001. кандидат физико-математических наук, доцент Г.Б. Хомутов
Общая характеристика работы
Актуальность темы исследования. Настоящая работа, посвященная комплементарному связыванию нуклеиновых кислот с фотополимеризуемыми ленгмюровскими монослоями амфифильных производных азотистых оснований (нуклеолипидов) и жирных кислот, направлена на изучение и решение актуальных проблем биофизики планарных структур, молекулярной биологии, медицины и прикладных задач: создание биосенсоров и биомимикрических поверхностей, разработку новых методов формирования наноструктур с заданными свойствами.
Интерес со стороны молекулярной биологии и медицины в этой области, в частности, обусловлен тем, что природные и синтетические нуклеиновые кислоты, образовавшие комплекс с амфифильными молекулами, приобретают особые свойства, позволяющие им проходить через клеточные мембраны.
Для формирования ленгмюровских монослоев в данной работе использовали два класса липидов: жирные кислоты и нуклеолипиды. Жирные кислоты широко распространены в живой природе, являются одним из компонентов биомембран, и на долю жирных кислот приходится примерно 20% от общего количества липидов, «жестко» связанных с нативной ДНК. Тем не менее, в большинстве работ, посвященных липид-нуклеиновым взаимодействиям, исследуется взаимодействие нуклеиновых кислот (НК) с цвиттерионными или катионными липидами, а анионные липиды (в т.ч. и жирные кислоты) оказались практически забытыми. Например, имеется много литературных данных о строении комплексов нуклеиновых кислот с октадециламином, но отсутствует информация о комплексах со стеариновой кислотой, отличающейся от октадециламина зарядом гидрофильной части молекулы (октадециламин – производное стеариновой кислоты, в котором карбоксильная группа заменена на аминогруппу).
Второй класс веществ, использовавшийся для формирования ленгмюровских пленок, нуклеолипиды, представляют собой алкил-замещенные производные природных азотистых оснований (аденин, тимин, гуанин, цитозин). Благодаря остатку жирной кислоты, молекулы нуклеолипидов нерастворимы в воде и могут формировать стабильные монослои. При этом синтез нуклеолипидов проводился таким образом, что группы атомов, отвечающих за образование уотсон-криковских связей между азотистыми основаниями, остаются нетронутыми, вследствие чего нуклеолипиды приобретают присущую азотистым основаниям способность к избирательному связыванию по принципу комплементарности: аденин-тимин (урацил) и гуанин-цитозин. При изучении взаимодействия ДНК с катионными амфифилами (например, с алифатическими аминами или поликатионами) или при работе с тройными комплексами (фосфатидилхолин – 2-х валентный катион – нуклеиновая кислота), исследователь имеет дело, по сути, с взаимодействием заряженных молекул. Нуклеолипиды дают возможность перейти от рассмотрения проблемы на уровне зарядовых взаимодействий к следующему уровню детализации: учесть, что молекула нуклеиновой кислоты представляет собой не просто полимерную «нить», обладающую неким электрическим зарядом, а как «генетическая» молекула характеризуются детерминированной последовательностью азотистых оснований, входящих в её состав. Нуклеолипиды будут связываться, формируя липидное окружение, только с определенными участками молекулы нуклеиновой кислоты, что открывает подходы к созданию новых типов лекарственных средств и способов их доставки.
Нуклеолипиды как молекулярные компоненты, способные к избирательному связыванию, могут быть использованы для конструирования самоорганизующихся супрамолекулярных комплексов (концепция «снизу вверх» - создание сложных молекулярных комплексов на основе более простых по строению исходных компонентов), что представляет большой интерес с практической точки зрения, например, для создания дешевых и высокоспецифичных биосенсоров. Нуклеолипиды, связывающиеся с комплементарными им азотистым основаниям в цепочке нуклеиновой кислоты, могут формировать «слепок» с добавленных под монослой молекул нуклеиновых кислот. Для фиксации последовательности нуклеолипидов, заданной молекулой-матрицей, в данной работе используются двухкомпонентные ленгмюровские пленки нуклеолипидов (функциональный компонент) и дииновой кислоты (полимеризуемый амфифил).
Объект исследования: объектом исследования являются фотополимеризуемые ленгмюровские монослои генейкозодииновой кислоты и амфифильных производных азотистых оснований, а также ленгмюровские монослои производных стеариновой кислоты, различающихся зарядом гидрофильной части молекулы.
Предмет исследования: предметом исследования является комплементарное связывание нуклеиновых кислот с фотополимеризуемыми ленгмюровскими монослоями, содержащими нуклеолипиды, а также липид нуклеиновые взаимодействия между нуклеиновым кислотами и модельными мембранными структурами, сформированными из жирных кислот.
Целью диссертационной работы является разработка и экспериментальное обоснование методики формирования ультратонких ориентированных полимерных пленок, содержащих нуклеолипиды и фиксирующих их в последовательности, заданной молекулами ДНК.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Исследовать возможность избирательного связывания нуклеиновых кислот, растворенных в субфазе, с нуклеолипидами, формирующими монослой на границе раздела фаз вода-воздух.
2. Исследовать возможность встраивания молекул АПАО в фотополимеризующуюся матрицу (представляющую собой ленгмюровский монослой диацетиленовых кислот), т.е. возможность получения истинных растворов смесей нуклеолипидов и дииновой кислоты в ленгмюровских монослоях.
3. Исследовать закономерности фотополимеризации смешанных монослоев дииновой кислоты и нуклеолипидов;
исследовать свойства получаемых при этом полимерных пленок (таких как стабильность структуры и механическая прочность).
4. Разработать методику переноса ленгмюровских монослоев, содержащих нуклеолипиды, на твердые подложки с сохранением способности нуклеолипидов к избирательному связыванию нуклеиновых кислот.
5. Изучить морфологию комплексов (методами АСМ) нуклеиновых кислот с ленгмюровскими монослоями нуклеолипидов, жирных кислот и их смесей.
Научная новизна диссертации 1. Реализовано комплементарное связывание полирибонуклеотидов с искусственными полимеризующимися молекулярными структурами. Показано избирательное связывание нуклеолипидов, формирующих монослой на границе раздела фаз вода-воздух с растворенными в воде комплементарными полинуклеотидами большой длины (1000-3000 оснований).
2. Разработан способ формирования на твердых подложках стабильных, моделирующих биомембраны молекулярных структур, содержащих нуклеолипиды. Особенностью полученных нами структур является то, что функциональные группы молекул, формирующих внешний по отношению к подложке монослой, обращены наружу и способны взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами.
3. Впервые обнаружено влияние структуры подложки на ориентацию молекул нуклеиновых кислот, адсорбированных на ленгмюровских монослоях стеариновой кислоты. Молекулы нуклеиновых кислот, перенесенные вместе с монослоем стеариновой кислоты на свежесколотую слюду, формируют домены, внутри которых цепочки нуклеиновых кислот ориентируются параллельно друг другу.
Положения, выносимые на защиту 1. Амфифильные производные азотистых оснований способны формировать стабильные ленгмюровские монослои на поверхности воды, избирательно связывающие полирибонуклеиновые кислоты.
2. Амфифильные производные азотистых оснований могут быть встроены в фотополимеризуемые монослои дииновых кислот и перенесены на твердые подложки с сохранением своей функциональной активности – способности к избирательному связыванию с комплементарными азотистыми основаниями.
3. Структура подложки влияет на ориентацию молекул нуклеиновых кислот, адсорбированных на ленгмюровских монослоях стеариновой кислоты.
Молекулы НК, перенесенные вместе с монослоем стеариновой кислоты на свежесколотую слюду, формируют домены, внутри которых цепочки нуклеиновых кислот ориентируются параллельно друг другу.
Достоверность полученных результатов Достоверность результатов диссертационной работы обеспечивается комплексным использованием широко известных и применяемых экспериментальных методов исследований. Выводы, полученные при использовании различных методов исследования, не противоречат друг другу и согласуются с результатами работ других авторов.
Практическая значимость работы Реализованное нами специфическое связывание нуклеиновых кислот на искусственных молекулярных структурах, сформированных на основе фотополимеризующихся легмюровских монослоев, содержащих нуклеолипиды, формирует новые подходы к созданию биосенсоров на видоспецифичные фрагменты ДНК. Причем для создания таких биосенсоров ДНК нет необходимости знать последовательности оснований ДНК, а достаточно иметь образец ДНК, который будет использоваться в качестве матрицы для создания «распознающего» элемента биосенсора - монослоя смеси нуклеолипидов с липидами, формирующими полимеризующуюся сетку, в которой фиксируется относительное расположение молекул нуклеолипидов, заданное молекулами ДНК.
Обнаруженный эффект формирования упорядоченных структур молекулами нуклеиновых кислот, адсорбированных на монослое стеариновой кислоты (при переносе на твердые подложки), может быть использован при создании биочипов, отличающихся высокой плотностью упаковки и степенью упорядоченности молекул ДНК.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научных конференциях и школах:
- Международный биофизический конгресс – 2005 (15th IUPAB & 5th EBSA International Biophysics congress), Монпелье, Франция.
- II Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА – 2005", Москва, Россия, 2005.
- 14ая Международная конференция аспирантов и молодых ученых (14th Annual Conference of Doctoral Students “Week of Doctoral Srudents 2005”), Прага, Чехия, 2005.
- Международная школа-конференция «Молодые ученые – новой России. Фундаментальнее исследования в области химии и инновационная деятельность», Иваново, Россия, 2005.
- III съезд биофизиков России, Воронеж, Россия, 2004.
- Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005», «Ломоносов-2004», «Ломоносов-2002», Москва, Россия, 2005, 2004, 2002.
- Научная конференция «Ломоносовские чтения 2002», Москва, Россия, 2002.
- XVI международная конференция молодых ученых по химии и химической технологии "МКХТ-2002", Москва, Россия, 2002.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения и выводов, списка литературы. Работа изложена на странице, содержит 60 рисунков и 2 таблицы, список литературы содержит библиографических ссылок.
Основное содержание работы
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и определены задачи исследования, изложены научная новизна и практическая значимость полученных результатов, перечислены положения, выносимые на защиту.
Первая глава содержит обзор литературы по теме диссертации.
В разделе 1.1 кратко изложены основные сведения о ленгмюровских монослоях на поверхности жидкости, а также о пленках Ленгмюра-Блоджетт на твердотельных подложках. Перечислены методы, применяемые для изучения ленгмюровских пленок, в т.ч. используемые для изучения однородности многокомпонентных пленок. Приведены литературные данные о свойствах фотополимеризуемых ленгмюровских пленок диацетиленов.
В разделе 1.2 рассматриваются основы методов зондовой микроскопии, в частности, атомно-силовой микроскопии (АСМ), описываются различные режимы работы АСМ и особенности применения атомно-силовой микроскопии для исследования нуклеиновых кислот.
В разделе 1.3 представлены данные о липид-нуклеиновых взаимодействиях. Описаны результаты изучения комплексов нуклеиновых кислот с цвиттер-ионными, катионными и анионными липидами. Отдельное внимание уделено взаимодействию нуклеиновых кислот с искусственно синтезируемым классом веществ, не встречающимся in vivo - с нуклеолипидами, способными к избирательному связыванию с азотистыми основаниями, входящими в состав нуклеиновых кислот.
Во второй главе подробно описаны материалы и методы, использованные в работе. Описано устройство ленгмюровской ванны и методика формирования, переноса на твердые подложки и исследования комплексов ленгмюровских монослоев с нуклеиновыми кислотами.
В работе были использованы амфифильные вещества - нуклеолипиды, представляющие собой амфифильные производные азотистых оснований (АПАО), рис. 1, специально синтезированные по нашему техническому заданию В.В. Захарычевым и В.В. Мамашиным, РХТУ им. Д.И. Менделеева.
CH N N CH N H2N N N N а) N H2N O N CH HN N б) O в) CH Рис. 1. Структурные формулы нуклеолипидов (АПАО): а) эруциладенин, б) олеиладенин, в) олеилтимин.
Отличительной особенностью синтезированных соединений является то, что липофильный остаток (эруковой или олеиновой кислоты) присоединен к азотистому основанию в том положении, где в нуклеиновых кислотах к азотистому основанию присоединен остаток сахара. Таким образом, группы атомов, отвечающие за образование водородных связей между комплементарными основаниями, не затронуты в ходе синтеза и способны обеспечить возможность специфического узнавания и связывания АПАО с веществами, имеющими в своем составе комплементарные основания (например, аденин для олеилтимина). Липофильная часть молекул нуклеолипидов имеет ненасыщенную двойную связь, что при некоторых специальных условиях (в инертной атмосфере при облучении «вакуумным»
ультрафиолетом) дает возможность их полимеризации.
Для получения легко полимеризующейся сетки (второй компонент для формирования смешанных монослоев) была взята генейкозо-10,12-дииновая кислота (ГДК), рис. 2. Она содержит две сопряженные тройные связи, т.е.
является диацетиленовым амфифилом, а ЛБ пленки диацетиленов легко полимеризуются при УФ-облучении с 300 нм.
O HO CH Рис. 2. Структурная формула генейкозо-10,12-дииновой кислоты (ГДК).
Обратим внимание, что молекулы АПАО и ГКД имеют примерно одинаковую длину (18-22 атома углерода), а также то, что все они имеют в составе липофильной части ненасыщенные связи, расположенные примерно на одном уровне, что облегчает смешение этих веществ в многокомпонентных ленгмюровских пленках.
Нуклеиновыми кислотами, использовавшимися в работе, были гомополимеры рибонуклеиновых кислот, а именно полиадениловая (полиА), полиурациловая (полиУ), полигуаниловая (полиГ), полицитозиновая (полиЦ) кислоты производства компании Sigma.
Для переноса ленгмюровских монослоев ГДК и АПАО использовались подложки из слюды, покрытые монослоем стеариновой кислоты.
Для исследования морфология перенесенных пленок и их комплексов с нуклеиновыми кислотами использовались методы атомно-силовой микроскопии.
Третья глава посвящена исследованию свойств монослоев АПАО на поверхности воды. Изучается возможность формирования истинных смесей АПАО с ГДК в двумерной фазе (возможность встраивания молекул АПАО в монослои полимеризуемой генейкозодииновой кислоты) и закономерности фотополимеризации монослоев таких смесей.
30 1 ГДК без УФ 1 олеилтимин Поверхностное давлене, мН/м облучения Поверхностное давление, мН/м 2 2 ГДК при УФ 2 олеиладенин облучении 3 эруциладенин 1 2 3 а) б) 0 20 40 0 20 40 60 80 100 Площ адь на одну молекулу, Площ адь на одну молекулу, Рис. 3. Изотермы сжатия монослоев (а) нуклеолипидов, (б) генейкозодииновой кислоты.
Из анализа изотерм сжатия АПАО, рис. 3а, делаются выводы, что остатки азотистых оснований обладают достаточной гидрофильностью, чтобы АПАО были способны формировать стабильные ленгмюровские монослои на поверхности воды. Для АПАО площадь, приходящаяся на молекулу в точке коллапса, лежит в интервале 25-36 2. Из этого следует, что гетероциклы азотистых оснований в монослоях нуклеолипидов ориентируются своими плоскостями перпендикулярно к поверхности раствора, как бы становятся «на ребро», и при этом находятся в плотном контакте друг с другом.
Углеводородные цепочки нуклеолипидов, очевидно, обращены в газовую фазу, а группы атомов, отвечающих за образование уотсон-криковских водородных связей, оказываются ориентированными в сторону жидкой субфазы.
На рис. 3б представлены изотермы сжатия монослоев ГДК, полученные в разных условиях: при облучении монослоя ультрафиолетом во время сжатия и без такового. Остальные условия при формировании и сжатии монослоев были одинаковы: субфаза – чистая вода, скорость сжатия монослоя составляла 2/молекула*мин. При этом суммарное время сжатия монослоя составляло 30 40 минут (по литературным данным для полимеризации монослоя необходимо 30 минут).
Изотерма, полученная при сжатии без воздействия ультрафиолетом, имеет вид, характерный для дииновых кислот. Средняя площадь, приходящаяся на одну молекулу в коллапсе, А24 2 (что характерно для гомологического ряда COOH(CH2)8CC-CC(CH2)nCH3, n=7-15), поверхностное давление в точке коллапса составляет 16 мН/м.
При УФ облучении характер получаемой изотермы менялся кардинально.
Различие изотерм сжатия при облучении УФ светом и без облучения является доказательством того, что ленгмюровский слой полимеризуется. При облучении в течение 30 минут монослоя, находящегося в «газовой» фазе (средняя площадь на молекулу 100 2) и его последующем поджатии уже без воздействия УФ, никаких изменений в изотерме по сравнению со случаем, когда вообще никакого воздействия УФ не было, не наблюдалось. Это доказывает, что при одновременном поджатии и УФ облучении происходит именно фотополимеризация (которая требует сближения полимеризуемых мономеров), а не, например, фоторазложение ГДК. Если бы при УФ облучении происходила не фотополимеризация, а некий мономолекулярный процесс, например фоторазложение ГДК, то УФ облучение уже в «газовой» фазе монослоя сказывалось бы на изотерме, чего в эксперименте не наблюдается.
Полимеризованные монослои ГДК проявили типичные свойства полимерных монослоев, описанные в литературе: они более стабильны (выдерживали сжатие до большего поверхностного давления ~24 мН/м) и более конденсированные (площадь коллапса монослоя сдвинулась с 24 до 2/молекулу).
УФ облучение монослоев эруциладенина (ЭА) или олеилтимина (ОТ) как до начала движения барьера, так и во время сжатия монослоя не приводило к каким-либо изменениям в изотермах сжатия, что подтверждает (по крайней мере, в условиях проведения данных опытов) 1) фоторезистентность нуклеолипидов, 2) невозможность полимеризации нуклеолипидов между собой по ненасыщенным связям в остатках жирной кислоты, 3) отсутствие фотополимеризации остатков тимина между собой.
Для установления смешиваемости ЭА и ГДК между собой были записаны изотермы сжатия монослоев смесей различного состава в различных условиях:
с облучением УФ во время сжатия или без УФ облучения, рис. 4.
Вид изотерм сжатия монослоев смесей ГДК с ЭА существенно зависит от соотношения компонент, а также от того, производилось ли УФ облучение монослоя во время сжатия. Для смесей с низким содержанием ЭА вид изотерм сжатия (рис. 4а) напоминает изотермы для монослоев чистой ГДК (рис. 3б). С увеличением содержания ЭА на изотермах появляются горизонтальные плато и точки перегиба, которые могут быть объяснены фазовым разделением монослоя на компоненты. Различные участки монослоя ввиду различного состава могут полимеризоваться не одновременно (либо вообще не полимеризоваться), а также обладать разной сжимаемостью. Сначала мы наблюдаем сжатие монослоя как целого, потом одна из компонент монослоя коллапсирует, чему соответствует горизонтальный участок изотермы. Наиболее показательны в этом смысле изотермы сжатия монослоев смеси с соотношение компонент [ГДК]:[ЭА]=1.5к2 (рис. 4б). Когда монослой поджимается без одновременного воздействия ультрафиолетом, то, при поверхностном давлении 16 мН/м, мы видим коллапс участков монослоя, состоящих из ГДК (коллапс монослоев ГДК происходит при 16 мН/м). Если монослой смеси при поджатии облучать УФ, то участки, состоящие из ГДК, полимеризуются и могут выдержать поджим до более высоких давлений, и поэтому первыми коллапсируют участки монослоя, состоящие из ЭА (при поверхностном давлении 24 мН/м, что близко к значениям, при которых коллапсируют монослои ЭА).
Таким образом, меняя условия проведения эксперимента (сжатие монослоя проводили с одновременным УФ облучением или без такового), удалось продемонстрировать наличие в монослое участков различного состава, по разному «реагирующих» на включение/выключение УФ.
а) б) [ГДК]:[ЭА] = [ГДК]:[ЭА] = Поверхностное давление, мН/м Поверхностное давление, мН/м = 1.5: = 3: 1 0 20 40 60 0 20 40 60 2 Площадь,приходящаяся на одну молекулу, Площадь,приходящаяся на одну молекулу, 1 Смесь ГДК и ЭА, сжатие со скоростью 3 2 /молекулу*мин без облучения УФ 2 Смесь ГДК и ЭА, сжатие со скоростью 3 2 /молекулу*мин с УФ облучением Рис 4. Изотермы сжатия монослоев смесей ГДК и ЭА, записанных как при облучении УФ, так и без него.
На основе представленных выше рассуждений были сделаны выводы о том, что монослои состава [ГДК]:[ЭА]=6:1 представляют собой идеальные двумерные смеси и при их полимеризации не происходит разделения смеси на компоненты, что эквивалентно встраиванию молекул АПАО в полимерную матрицу ГДК. Также было предположено, что ленгмюровский монослой смеси олеилтимина с генейкозодииновой кислотой, взятых в соотношении [ГДК]:[ОТ]=6:1, тоже будет представлять собой идеальный двумерный раствор.
АСМ исследования монослоев смесей различного состава подтвердило выводы о смешиваемости, сделанные на основе анализа изотерм сжатия.
На рис. 5а представлено АСМ изображение монослоя смеси [ГДК]:[ОТ]=6:1. Пленки смесей с низким содержанием нуклеолипидов выглядят так же, как и монослои индивидуальных веществ, т.е. представляют собой достаточно ровную поверхность, однородную по толщине (не считая дефектов монослоя – пор монослоя), без каких либо признаков присутствия в монослое участков различного состава. В отличие от этого, в монослоях смеси с содержанием ЭА 40% ([ГДК]:[ЭА]=1.5:1) были обнаружены участки (домены) различного состава. На рис. 5б хорошо заметны участки, различные по высоте, характерный размер таких областей – сотни нанометров. Перепад высот между такими различными участками составляет около 0.3 – 0.4 нм.
б) а) Рис. 5. А) АСМ изображение монослоя смеси [ГДК]:[ОТ]=6:1, Б) АСМ изображение монослоя смеси [ГДК]:[ЭА]=1.5:1. Монослои переносились с поверхности чистой воды на твердую подложку (свежесколотая слюда, модифицированная монослоем стеариновой кислоты).
Четвертая глава посвящена исследованию избирательного связывания нуклеиновых кислот, растворенных в субфазе, с нуклеолипидами, формирующими монослои на поверхности раствора. Исследуется связывание полиадениловой кислоты со смешанными монослоями генейкозодииновой кислоты и олеилтимина (комплементарного аденину) на поверхности воды и перенесенных на твердую подложку.
Для изучения взаимодействия ленгмюровских монослоев нуклеолипидов с нуклеиновыми кислотами были записаны их изотермы сжатия на субфазе, содержащей синтетические гомополимеры нуклеиновых кислот: полиА, полиУ, полиЦ, полиГ кислоты в концентрации 3 мкг/мл, рис 6.
40 2 1 ОТ на 1М NaCl 1 ЭА на 1M NaCl Поверхностное давление, мН/м Поверхностное давление, мН/м 3 2 ОТ на полиА 2 ЭА на полиУ 25 3 ОТ на полиУ 4 3 ЭА на полиА 1 4 ЭА на полиГ б) а) 0 0 40 80 0 50 100 150 Площадь на одну молекулу, Площадь на одну молекулу, Рис. 6 изотермы сжатия монослоев а) эруциладена и б) олеилтимина на растворах полинуклеотидов в 1М растворе NaCl.
Для монослоев эруциаладенина максимальные изменения в изотермах сжатия происходили при наличии в субфазе молекул полиурациловой кислоты, для монослоев олеилтимина – полиадениловой кислоты, что доказывает образование комплементарных водородных связей между остатками нуклеолипидов в монослое и НК в объеме субфазы.
АСМ исследование комплексов, формируемых ленгмюровскими монослоями нуклеолипидов с растворенными в субфазе нуклеиновыми кислотами подтверждает вывод о комплементарном связывании. ПолиА при одних и тех же условиях в гораздо больших количествах адсорбируется на монослой ОТ (рис. 7а), чем на монослой ЭА (рис. 7б).
б) а) Рис. 7 АСМ изображение молекул полиА, адсорбированных на а) монослое ОТ, б) монослое ЭА, сформированных на растворах полиА концентрации мкг/мл в чистой воде.
Монослои нуклеолипидов, перенесенные на твердые подложки, обладают низкой механической стойкостью, что является препятствием для их практического использования.
Способом преодолеть этот недостаток является использование пленок дииновых кислот, которые после полимеризации отличаются высокой механической прочностью.
Полимеризующиеся ленгмюровские пленки формировались из смеси [ГДК]:[ОТ]=6:1 как идеально смешивающейся.
Рис. 8. АСМ изображение молекул На рис.8 представлено АСМ полиаденина, адсорбированных на изображение монослоя смеси [ГДК] : монослое смеси [ГДК] : [ОТ] = 6:1.
Видимая высота молекул [ОТ] = 6:1, сформированной на приблизительно 0.6-0.8 или 1.6 нм субфазе, содержащей полиаденин (возможно, что молекулы лежат в один или в два слоя), ширина 10-14 нм.
концентрации 3 мкг/мл.
На поверхности образца присутствует большое количество молекул полиаденина, адсорбированных на монослой, содержащий нуклеолипиды, что подтверждает возможность связывания нуклеиновых кислот с полимеризуемыми монослоями, содержащими АПАО.
Далее был исследован вопрос о механической стойкости ленгмюровских пленок генейкозодииновой кислоты со встроенными в нее молекулами АПАО, а также способность таких пленок к связыванию нуклеиновых кислот после переноса на твердую подложку. Для этого сначала монослои смеси [ГДК] : [ОТ] = 6:1 переносили с поверхности чистой воды, а после этого:
• Либо подложку с нанесенным на неё монослоем смеси повторно погружали в раствор, содержащий полиА.
• Либо сначала полимеризовали монослой, перенесенный на подложку, и только после этого повторно погружали в раствор, содержащий полиА.
Схема приготовления образца:
Перенос монослоя смеси [ГДК]:[ОТ]=6:1 на гидрофобизированную слюду Погружение подложки в раствор полиА Неполимеризованный монослой разрушается Рис. 9. АСМ изображение монослоя смеси [ГДК] : [ОТ] = 6:1 после повторного погружения подложки в раствор.
Характеристика полученного изображения: Очень хорошо видна двухслойная структура пленки. Верхний слой сильно разрушен.
Оказалось, что неполимеризованные монослои генейкзодииновой кислоты и нуклеолипидов перенесенные на гидрофобизированную слюду, смываются с подложки при её повторном погружении в жидкость, рис. 9.
Но если монослой смеси ГДК+ОТ после переноса на твердую подложку полимеризовать путем УФ облучения, то при повторном погружении в жидкость он не только не разрушается, но и адсорбирует на себя НК, растворенные в субфазе, рис. 10. Это подтверждает большую механическую стойкость полимеризованных монослоев, и говорит о сохранившейся функциональной активности нуклеолипидов, встроенных в полимерную матрицу.
Схема приготовления образца:
Перенос монослоя смеси [ГДК]:[ОТ]=6:1 на гидрофобизированную слюду УФ-облучение (полимеризация) монослоя, перенесенного на твердую подложку Погружение подложки в 1M р-р NaCl, содержащий полиА (3 мкг/мл) Полимеризованный монослой сохраняется, на его поверхности наблюдаются нитевидные структуры Рис. 10. АСМ изображение полимеризованного монослоя смеси [ГДК] : [ОТ] = 6:1, сформированного на чистой воде, после повторного погружения в раствор, содержащий полиаденин.
Однако, на контрольных изображениях монослоя ГДК, рис.11, полученного с раствор хлорида натрия, содержащего полиаденин, были обнаружены молекулы нуклеиновых кислот. Хотя на монослой ГДК адсорбируется меньшее количество НК, чем на монослой олеилтимина (рис. 7а) или на монослои смеси [ГДК] : [ОТ] = 6:1, Рис. 11. АСМ изображение такое неспецифическое связывание монослоя генейкозодииновой молекул НК с монослоями ГДК кислоты, перенесенного с поверхности раствора, является нежелательным, содержащей полиаденин (3 мкг/мл).
«паразитным», для создания биосенсоров на основе фотополимеризующихся монослоев, содержащих молекулы АПАО.
В пятой главе описаны результаты изучения комплексов нуклеиновых кислот с монослоями жирных кислот. Для формирования ленгмюровских пленок была выбрана 1 субфаза - чистая стеариновая кислота, т.к.
Поверхностное давление, мН/м вода свойства монослоев 3 2 субфаза - мМ раствор NaCl стеариновой кислоты очень подробно описаны в 1 3 субфаза - мМ NaCl + полиА литературе. мкг/мл Вид изотерм сжатия стеариновой кислоты (рис. 12) 10 15 20 25 30 35 Площадь на одну молекулу, на чистой воде и на растворах Рис. 12. Изотермы сжатия монослоев соли отличаются только стеариновой кислоты на растворах, формой коллапса;
наличие содержащих НК.
полиаденина не сказывается на форме изотерм сжатия монослоев. Добавление полиаденина в субфазу под монослой стеариновой кислоты не изменяет среднюю площадь, приходящуюся на одну молекулу в точке коллапса монослоя. Это говорит о том, что молекулы полиаденина, если и адсорбируются на монослой, но не встраиваются между молекулами монослоя, и не образуют стабильных при поджатии монослоя комплексов с молекулами стеариновой кислоты.
Результаты АСМ исследования монослоев стеариновой кислоты, перенесенных на свежесколотую слюду с субфазы, содержащей полиадениловую кислоту (1 мкг/мл), представлены на рис. 13. Если в субфазу с растворенным в ней полиА добавлялся NaCl в концентрации 1 мМ (или не добавлялся вообще), то перенесенный на подложку монослой ничем не отличается от монослоя, перенесенного с чистой воды.
При увеличении концентрации одновалентных ионов (10 мМ раствор NaCl, но, по-прежнему, без специально добавленных солей 2-х валентных металлов) на поверхности образцов начинают обнаруживаться одиночные молекулы нуклеиновых кислот, рис. 13а. При концентрации хлорида натрия в 100 мМ, рис. 13б, молекулы нуклеиновых кислот уже стремятся образовывать некие агрегаты на поверхности образца, но такие «скопления» расположены по поверхности образца хаотичным образом.
При концентрации NaCl в субфазе 500 или 1000 мМ (рис. 13в и рис. 13г) на поверхности образца в больших количествах обнаруживаются молекулы нуклеиновых кислот, при этом поверхность образца (каждый образец исследовался не менее чем в 3х различных точках) однородна, т.е. схожие картины получались при сканировании различных участков образцов.
Молекулы полиаденина находятся по подложке в вытянутом состоянии и образуют на поверхности домены с поперечными размерами несколько сотен нанометров (т.е. с размерами близкими к длине молекул использовавшихся НК), внутри одного домена нити НК расположены параллельно друг другу.
а) б) в) г) Рис. 13. Стеариновая кислота, перенесенная на свежесколотую слюду с поверхности раствора, содержащего полиА (1 мкг/мл). Концентрация NaCl (USP grade) а) 10 мМ, б) 100 мМ, в) 500 мМ, г) 1000 мМ. Без специального добавления ионов Mg. Содержание двухвалентных катионов в использовавшемся NaCl (USP grade) не более 0.001%.
а) б) в) Рис. 14. Стеариновая кислота, перенесенная на свежесколотую слюду с поверхности раствора, содержащего полиА (1 мкг/мл).
Концентрация NaCl 500 мМ, концентрация специально добавленных ионов Mg а) 0.01 мМ, б) 0.1 мМ, в) 1 мМ.
При увеличении в субфазе концентрации двухвалентных ионов (при постоянной концентрации NaCl 500 мМ) количество нуклеиновой кислоты, связанной с монослоем увеличивается, рис. 14. Добавление 10-5 M ионов Mg не приводит к заметному росту количества НК, связанных с монослоем, а вот уже при наличии в субфазе 10-4 М ионов Mg с монослоем связывается гораздо большее количество полиА. При добавлении в субфазу 1 мМ количество НК, связанных с монослоем, продолжает увеличиваться (молекулы полиА на рис.
14в лежат в 2 слоя), но никаких нематически подобных структур, как это было при концентрации ионов Mg 0.01 мМ и менее, не обнаруживается.
Образец, представленный на рис. 15 был получен при тех же условиях, что и на рисунке 13в (субфаза – раствор полиадениловой кислоты концентрации мкг/мл в 500 мМ растворе хлорида натрия), за одним исключением: монослой стеариновой кислоты с адсорбированными на него молекулами полирибонуклеотидов переносился не на свежесколотую слюду, а на слюдяную подложку, предварительно покрытую монослоем стеариновой кислоты.
Никаких закономерностей в расположении молекул полиаденина на рис. 15 не наблюдается. Предварительно нанесенный на слюду монослой стеариновой кислоты нейтрализует влияние слюды на последующие слои, что подтверждает предположение о влиянии структуры подложки на упаковку переносимого монослоя и связанных с ним молекул НК.
Рис. 16. АСМ изображение Рис. 15. АСМ изображение монослоя стеариновой кислоты, монослоя СК, перенесенного с перенесенного с раствора 1М раствора, содержащего полиА.
NaCl + 0.001 мг/мл полиаденин + На подложку был предварительно 10 мМ ЭДТА.
нанесен монослой стеариновой кислоты.
Если при формировании ленгмюровского монослоя в субфазу (1М раствор NaCl USP grade + 1 мкг полиА) добавлялся хелатирующий агент (10 мМ ЭДТА), рис. 16, то поверхность образца при АСМ исследовании выглядела почти так же, как монослой стеариновой кислоты перенесенный с чистой воды, если не считать небольшого количества глобул и редких нитевидных образований – редких молекул полиадениловой кислоты, все-таки связавшихся с монослоем. Резкое уменьшение числа молекул НК, связавшихся с монослоем стеариновой кислоты в присутствии ЭДТА является сильным аргументом в пользу того, что 2-х валентные катионы действительно играют роль мостиков между молекулами НК и жирных кислот.
Образования комплексов между монослоями октадеканола (стеаринового спирта) и нуклеиновыми кислотами ни с помощью изотерм сжатия, ни при АСМ исследовании монослоев октадеканола обнаружить не удалось.
После того, как было обнаружен факт формирования нематически упорядоченных структур нуклеиновыми кислотами, адсорбированными на монослоях стеариновой 60 1 субфаза - чистая кислоты при высоких вода Поверхностное давление, мН/м значениях ионной силы 2 суфаза - раствор субфазы, было решено полиА (1 мкг/мл) в чистой воде провести несколько опытов по формированию при тех же 1 условиях ЛБ пленок октадециламина (ОДА), рис. 0 10 20 30 40 Площадь на одну молекулу, 17. Вид изотерм сжатия октадециламина на чистой Рис. 17. Изотермы сжатия монослоев октадециамина на чистой воде и растворе полиА воде и на растворе полиадениловой совпадает с описанными в кислоты.
литературе.
Результаты АСМ исследований ленгмюровских пленок ОДА, сформированных на растворах полиаденина в чистой воде, рис. 18, совпадают с результатами, описанными в работах Г.Б. Хомутова для комплексов ОДА с ДНК, сформированных на 1 мМ растворе хлорида натрия. Катионные молекулы ОДА «обвалакивают» противоположно заряженные молекулы молекулы нуклеиновых кислот, в результате чего молекулы НК адсорбируются на поверхость монослоя в виде глобул.
Рис. 19. АСМ изображение Рис. 18. АСМ изображение ленгмюровских пленок ОДА, ленгмюровских пленок ОДА, перенесенных с раствора перенесенных с раствора полиА полиА (1 мкг/мл) в 500 мМ (1 мкг/мл) в чистой воде.
NaCl.
Когда комплексы полинуклеотидов с ленгмюровскими пленками формировались на субфазах высокой ионной силы (500 мМ NaCl), то вид получаемых комплексов менялся кардинально. Вместо глобул (малая концентрация хлорида натрия в субфазе или полное его отсутствие) на АСМ изображении, рис. 19, наблюдается «сеть» из нитей различной ширины (от до 40 нм) и высоты (2-5 нм). Отчетливо видны «толстые» и «тонкие» нити, как будто они переплетаются между собой. «Тонкие» нити – толщиной 20-25 нм, высотой – 2 нм, «толстые» в ширину 35-40 ни, высотой 5 нм (иногда до 7 нм).
В литературе не удалось обнаружить каких-либо сведений о комплексообразовании между ОДА и нуклеиновыми кислотами при высоких значениях ионных силы. Однако, похожие «сетки» были обнаружены в работах Г.Б. Хомутова, посвященных изучению комплексов НК с монослоями катионных полимеров, сформированными на растворах низкой ионной силы ( мМ NaCl). Значительные поперечные размеры «толстых» нитей, наблюдаемых на рис. 19, можно объяснить тем, что мы наблюдаем нити нуклеиновых кислот, «облепленные» слоем аминов.
Заключение Реализовано комплементарное связывание нуклеиновых кислот с двумерными искусственными полимеризуемыми молекулярными структурами.
Разработана технология получения стабильных ультратонких ориентированных молекулярных пленок, содержащих нуклеолипиды с сохранением их функциональной активности.
На основании обширных экспериментальных исследований автором установлены общие закономерности встраивания в полимеризуемые монослои синтезированных по нашему заданию амфифильных производных азотистых оснований с предложенной нами структурой, позволяющей реализовать принципы самоорганизации и молекулярного узнавания на границе раздела фаз. Полученные результаты являются ключевыми в разработке новых методов формирования упорядоченных молекулярных структур в ленгмюровских пленках на основе матричного принципа репликации ДНК. Оригинальность предлагаемой методики состоит в том, что добавляемые под монослой биомакромолекулы используются в качестве матрицы, на которой формируется комплементарный «слепок» из молекул монослоя с последующей фиксацией полученной последовательности нуклеолипидов в полимерной матрице монослоя.
Результаты и выводы 1. Показано, что нуклеолипиды с заданной нами структурой обладают поверхностно-активными свойствами и могут образовывать стабильные монослои на поверхности водной субфазы. Нуклеолипиды способны образовывать уотсон-криковские пары с комплементарными азотистыми основаниями. Реализовано комплементарное связывание молекул РНК с монослоями нуклеолипидов.
2. Определены соотношения компонентов, при которых образуются истинные двумерные растворы смесей нуклеолипидов и генейкозодииновой кислоты в ленгмюровских пленках. Полное смешивание компонентов смеси сохраняется при переносе монослоев на твердые подложки и при полимеризации монослоя, что приводит к фиксации молекул нуклеолипидов в полимерной матрице и повышению механической прочности и однородности монослоя.
3. Разработан способ формирования на твердых подложках стабильных ультратонких ориентированных полимерных молекулярных пленок, содержащих нуклеолипиды с сохранением их функциональной активности.
4. Продемонстрировано комплементарное связывание полирибонуклеотидов с нуклеолипидами, включенными в полимерные пленки на поверхности твердых подложек, что открывает новые возможности в создании биосенсоров нуклеиновых кислот на основе принципа репликации ДНК с фиксацией полученной последовательности нуклеолипидов путём фотополимеризации монослоя.
5. Впервые обнаружено влияние структуры подложки на ориентацию молекул нуклеиновых кислот, адсорбированных на ленгмюровских монослоях стеариновой кислоты. Молекулы нуклеиновых кислот, перенесенные вместе с монослоем стеариновой кислоты на свежесколотую слюду, формируют домены, внутри которых цепочки нуклеиновых кислот ориентируются параллельно друг другу.
Основное содержание диссертационной работы отражено в следующих публикациях:
1. E. V. Dubrovin, S. N. Staritsyn, S. A. Yakovenko, I. V. Yaminsky. Self-organized structures of polyA molecules on the stearic acid LB monolayer. // 15th IUPAB & 5th EBSA International Biophysics Congress – Montpellier, France. European Biophysics Journal, 2005, V 34, №6, p 669.
2. С.Н. Старицын, Е.В. Дубровин, А.М. Ломоносов. Самоорганизация нуклеиновых кислот на ленгмюровских пленках стеариновой кислоты. // Тезисы международной школы-конференции «Молодые ученые – новой России. Фундаментальнее исследования в области химии и инновационная деятельность», стр. 34-35, Иваново, 2005.
3. С.Н. Старицын, Е.В. Дубровин, С.А. Яковенко, И.В. Яминский.
«Самоорганизация молекул нуклеиновых кислот на монослоях жирных кислот». // Тезисы II Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии "Медицинская Физика – 2005", С. 293-294, Москва, 2005.
4. S. Staritsyn, E. Dubrovin. “Self-organized Structures of Polynucleotides on the stearic Acid Monolayers”. // Proceedings of the 14th Annual Conference of Doctoral Students “Week of Doctoral Students 2005”, Prague, P. 535-539.
5. Старицын С.Н., Яковенко С.А., Дубровин Е.В., Ломоносов А.М., Яминский И.В. «Межмолекулярное узнавание на полимеризуемых ленгмюровских монослоях, содержащих нуклеолипиды». // Вестник Университета. Серия 3.
Физика Астрономия. 2005, №4, С. 49-53.
6. С.Н. Старицын, Е.В. Дубровин. «Самоорганизация молекул нуклеиновых кислот на ЛБ-пленках жирных кислот». // Тезисы международной конференции студентов, аспирантов, молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005», секция «Физика», Москва, т.1, С.54-55.
7. С.Н. Старицын, В.В. Мамашин, В.В. Захарычев, И.В. Яминский, Е.В.
Дубровин, А.М. Ломоносов, В.А. Твердислов, С.А. Яковенко «Смешанные монослои амфифильных производных азотистых оснований и дииновых кислот. I. Фазовое состояние на границе вода-воздух и в пленках Ленгмюра Блоджетт». // Биофизика. 2004. Т. 49. С. 635-645.
8. С.Н. Старицын, С.А. Яковенко. «Ленгмюровские монослои, содержащие нуклеолипиды, как модель для изучения межмолекулярного узнавания». // Тезисы III съезда биофизиков России, Воронеж, 2004 г., т. 1, С. 168-169.
9. С.Н. Старицын, В.А. Твердислов, С.А. Яковенко. «Нуклеолипиды как распознающий элемент биосенсоров». // Тезисы международной конференции студентов, аспирантов, молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004», секция «Физика», Москва, С. 103-104.
10. С. Н. Старицын, С.А. Яковенко. «Полимеризация ленгмюровских монослоев амфифильных алкенилзамещенных азотистых оснований». // Успехи в химии и химической технологии, том XVI, 2002, №4 (21), С. 122.
11. С. Н. Старицын, В.В. Мамашин, С.А. Яковенко «Фотополимеризация ленгмюровских монослоев амфифильных производных азотистых оснований». // Тезисы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам “Ломоносов 2002”, секция «Физика», С.11-13.
12. С. Н. Старицын, С.А. Яковенко. «Полимеризация ленгмюровских монослоев амфифильных производных азотистых оснований».// Тезисы научной конференции “Ломоносовские чтения 2002”, Москва, 2002, С. 67-71.