Безопасность и противоопухолевая активность кандидатного терапевтического препарата канцеролизин, созданного на основе делеционного аденовируса человека 5-го типа
На правах рукописи
ВДОВИЧЕНКО Галина Владимировна
БЕЗОПАСНОСТЬ И ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ
КАНДИДАТНОГО ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА
«КАНЦЕРОЛИЗИН», СОЗДАННОГО НА ОСНОВЕ ДЕЛЕЦИОННОГО
АДЕНОВИРУСА ЧЕЛОВЕКА 5-ГО ТИПА
03.02.02 – вирусология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
КОЛЬЦОВО – 2012
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Научные руководители:
Сергеев Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор Святченко Виктор Александрович, кандидат биологических наук
Официальные оппоненты:
Коровкин Сергей Анатольевич доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Научно исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН», ведущий научный сотрудник Рыжиков Александр Борисович кандидат биологических наук, ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», зав. отделом изучения вакцин и противовирусных препаратов, старший научный сотрудник
Ведущая организация Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск
Защита состоится «14» декабря 2012 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: р.п.
Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, 630599;
тел:
(383) 336-74-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Автореферат разослан «9» ноября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Трошкова Галина Павловна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Проблема заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований - одна из основных в современной медицине. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, ежегодно в мире умирает от рака более 7 млн. человек [СМИ ВОЗ, 2012].
Онкологические заболевания имеют полиэтиологичное происхождение.
Причинами могут быть канцерогенные вещества, вирусы, производственные процессы, ультрафиолетовое и ионизирующее излучение, радон и др.
[Трапезников Н. Н., Аксель Е. М., 1996;
Белицкий Г.А., 2006]. Канцерогенез представляет многоэтапный процесс накопления различных генетических повреждений, возникающих под действием мутагенных факторов.
Клеточный ген супрессор p53 (tumor supressor gene) кодирует специфический транскрипционный фактор, функция которого заключается в поддержании целостности генома путем предотвращения накопления в организме аномальных клеток [Чумаков П.М., 2007;
Вардосанидзе К.В., 2010;
Levine A.J., 1997;
Zauberman A. et al., 1995;
Waterman J.L. et al., 1995]. Наиболее типичными для злокачественных новообразований человека являются соматические мутации в гене р53. Они обнаружены в ДНК более 50% всех раковых опухолей человека различной локализации [Киселев С.Л., 2003;
Nemunaitis J. et al., 2010;
Lubin R. et al.,1995;
Chang F. et al., 1995;
Prives C., 1994]. Опухоли, в которых экспрессируется мутантный белок р53, более агрессивны, труднее поддаются лечению, чем те, в которых полностью отсутствует эндогенный р53 [Levine A.J., 1997;
Harris C.C., 1996].
Тот факт, что мутации в гене p53 являются наиболее частыми генетическими повреждениями опухолевых клеток человека, обусловил проведение широких исследований, направленных на поиск эффективных подходов к терапии этого рода опухолей. Активация гена р53 происходит и в случае заражения клеток вирусами. Однако ряд ДНК-содержащих вирусов, таких как аденовирусы, SV40 и вирус папилломы человека, кодируют белки, которые инактивируют ген p53 и тем самым позволяют эффективно реплицироваться им в клетке [Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002].
Геном аденовирусов содержит ген E1B, который кодирует белок Е1В55К, способный связываться с р53 и его инактивировать. Именно это уникальная особенность репликации аденовирусов стала основой для создания принципиально новых противоопухолевых препаратов. Дефектные по гену белка Е1В55К аденовирусные варианты должны потерять способность к эффективному инфицированию и лизису нормальных р функциональных клеток, но в тоже время, сохранить репликативную и литическую активность дикого типа аденовируса в отношении опухолевых клеток с дефектами в р53 гене [Nemunaitis J. et al., 2000;
Heise C. et al., 1997;
Bischoff J.R. et al., 1996]. Таким образом, создание лечебных препаратов на основе мутантных аденовирусов, избирательно размножающихся в р53 дефицитных клетках, позволит успешно лечить ряд опухолевых заболеваний, связанных с дефектами в р53 гене.
Путем проведения cайт-направленного мутагенеза аденовируса 5-го серотипа в ГНЦ ВБ «Вектор» был получен штамм, который несет делецию фрагмента 2309 - 3427 п.о. гена E1B55K и избирательно размножается в р53 дефицитных раковых клетках, вызывая их разрушение. По предложению авторов этот мутантный штамм аденовируса получил название Adel2 [Качко А.В. и др., 2003]. Данный мутантный штамм аденовируса использован нами для создания лечебного противоопухолевого препарата «Канцеролизин». В связи с этим в данной работе были поставлены следующая цель и задачи исследования.
Цель исследования. Целью настоящих исследований явилась разработка и доклиническое изучение кандидатного аденовирусного противоопухолевого препарата “Канцеролизин”.
Задачи исследования:
1. Изучить возможность использования культуры клеток 293 для производства препарата «Канцеролизин» согласно требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим препаратам.
2. В соответствии с проектом ЭПР получить экспериментально производственные серии препарата «Канцеролизин».
3. Изучить подлинность и стабильность мутантного штамма Adel аденовируса, входящего в состав препарата «Канцеролизин».
4. Изучить инфекционную активность препарата «Канцеролизин»
как в опухолевых, так и в нормальных клетках человека in vitro.
5. Исследовать эффективность и безопасность кандидатного аденовирусного противоопухолевого препарата “Канцеролизин” в экспериментах на животных.
6. Установить возможные сроки хранения и условия транспортировки препарата «Канцеролизин».
Научная новизна работы. Впервые проведена аттестация культуры клеток 293, которая не является туморогенной, обладает высокой чувствительностью к мутантному штамму Adel2 аденовируса 5-го серотипа, позволяет нарабатывать вирусную биомассу штамма до высоких концентраций при низкой множественности заражения и разрешена для производства лечебного противоопухолевого вирусного живого культурального очищенного концентрированного жидкого препарата «Канцеролизин» на основе данного штамма аденовируса.
Мутантный штамм Adel2 аденовируса 5-го серотипа, входящий в состав препарата «Канцеролизин» исследован в процессе многократного пассирования (18 пассажей) на культуре клеток 293. Данный штамм сохраняет свою генетическую стабильность и способность селективно инфицировать и лизировать культуры р53-дефектных опухолевых клеток человека.
Получены три лабораторно-экспериментальные серии препарата «Канцеролизин».
Препарат «Канцеролизин» не обладает пирогенностью, токсичностью, не влияет на центральную нервную систему и иммунологически безопасен.
При исследовании специфической активности лабораторно экспериментальных серий противоопухолевого препарата «Канцеролизин»
показана его избирательная инфекционная активность в отношении р53 дефектных опухолевых клеток человека in vitro, а на модели иммунодефицитных мышей с привитыми опухолями эпидермоидной аденокарциномы человека (А431) показана его способность достоверно ингибировать прогрессию опухолей при интратуморальном введении.
Препарат «Канцеролизин» сохраняет свою специфическую активность в процессе его хранения в течение двух лет при температуре минус 70 0С, в то же время транспортировка препарата с сохранением его специфической активности в течение 5 суток возможна при температуре минус 10-13 0С.
Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований отработана технология производства кандидатного противоопухолевого препарата «Канцеролизин», подготовлен проект производственного регламента. Для контроля качества производимого препарата разработан проект фармакопейной статьи предприятия. С целью обеспечения безопасности производимого препарата аттестованы посевной и рабочий банки культуры клеток 293, используемой в качестве биосубстрата для получения препарата «Канцеролизин» [протокол №14 от 28.10.03.
заседания Ученого Совета ГИСК им. Л.А. Тарасевича;
протокол №9 от 20.11.03. Комитета МИБП]. Таким образом, созданы все необходимые условия для производства стандартизованных, качественных и безвредных серий препарата «Канцеролизин», которые в дальнейшем могут быть использованы в клинических исследованиях у онкологических больных.
Результаты работы позволили успешно пройти 1-ю фазу клинических испытаний и получить разрешение на проведение 2-ой фазы клинических испытаний, что делает возможным последующее внедрение данного препарата в медицинскую практику.
Положения, выносимые на защиту:
1. Культура клеток 293 не является туморогенной, обладает высокой чувствительностью к мутантному штамму Adel2 аденовируса 5-го серотипа и позволяет нарабатывать вирусную биомассу до высоких концентраций при низкой множественности заражения.
2. Препарат «Канцеролизин» не обладает пирогенностью, токсичностью (острой и хронической), не влияет на центральную нервную систему и иммунологически безопасен.
3. Препарат «Канцеролизин» обладает избирательной инфекционной активностью в отношении р53-дефектных опухолевых клеток человека in vitro, а на модели иммунодефицитных мышей с привитыми опухолями человека достоверно ингибирует прогрессию опухолей при интратуморальном введении.
Апробация материалов диссертации. Результаты основных разделов диссертации были представлены на отечественных и зарубежных конференциях: 2-ой Международной конференции «Наука – Бизнес – Образование Биотехнология – биомедицина – Окружающая среда» (Россия, Пущино, 10 – 13 мая 2005 г.);
1-ой Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» (Россия, г. Санкт-Петербург, 29-31 мая г.);
XIII International Congress of Virology, San Francisco, California, USA, July 23 – 28, 2005.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научных статьи, из них 2 – в журнале Биотехнология, 1 – в журнале Вопросы вирусологии и 1 – в журнале Антибиотики и химиотерапия.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах, содержит 11 рисунков, 20 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 38 отечественных и 180 зарубежных источников.
Вклад автора в диссертационную работу. Материал диссертации получен и проанализирован лично автором c помощью научных руководителей д.м.н. профессора Сергеева А.Н. и к.б.н. Святченко В.А., а также зав.отделом к.б.н. Шишкиной Л.Н. Постановку ПЦР и анализ полученных данных проводил автор совместно с к.б.н. Терновым В.А.
Статистическая обработка данных произведена при участии к.м.н. Сергеева А.А. Наработка, ультрацентрифугирование в градиенте плотности CsCl, диализ, фильтрация и разведение трех экспериментально-производственных серий препарата, а также оценка его показателей качества проведена автором работы при участии к.б.н. Плясунова И.В. и к.б.н. Богрянцевой М.П.
Световая микроскопия препаратов проведена при помощи и непосредственном участии профессора Рябчиковой Е.И. и н.с. Таранова О.С.
Вирусологические исследования проведены лично автором с помощью н.с.
Петрищенко В.А. и ст.лаборантов Прудниковой Н.В., Коптевой Е.А.
Всем перечисленным сотрудникам автор выражает огромную благодарность.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Вирус. В работе использовали штамм Adenoid 75 аденовируса человека 5-го серотипа, полученный из Алабамского университета (г. Бирмингем, США) в 1996 году и его мутантный вариант Adel2, сконструированный в ГНЦ ВБ «Вектор» путем сайт-направленного мутагенеза, обладающий селективной онколитической активностью в отношении ряда линий p53 дефектных опухолевых клеток человека.
Препарат. Приготовление серий кандидатного противоопухолевого препарата «Канцеролизин» на основе мутантного штамма Adel2 аденовируса осуществляли путем его культивирования на перевиваемой культуре клеток 293 с последующим концентрированием и очисткой согласно ранее разработанному проекту экспериментально-производственного регламента на препарат. Одна доза препарата содержала 9,5±0,5 lgТЦД50 мутантного штамма Adel2 аденовируса.
Клетки. В работе использовали перевиваемые культуры клеток (клетки почки эмбриона человека, трансформированные генами Е1В и Е1А аденовируса 5-го серотипа), р53-дефектные опухолевые клетки (А431 эпидермоидная карцинома человека, SW480 - аденокарцинома толстой кишки человека, Hep2 - эпидермоидная карцинома гортани человека и C33A – цервикальная аденокарцинома человека) [American Type Culture Collection, 1998], полученные из Алабамского университета (г. Бирмингем, США). Эти культуры клеток были наработаны и заморожены на 5-м пассаже после поступления. Кроме того, в работе использовали нормальные (р53 позитивные) первичные культуры клеток взрослого человека (фибробласты кожи), приготовленные в НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор»
согласно ранее описанной методике [Rheinwald J., 1975].
Животные. В качестве лабораторных животных использовали разнополых морских свинок (массой 200 - 230 г), кроликов породы «Шиншилла» (массой 1,5 – 2,0 кг), крыс линии Low (массой 200-250 г), мышей линии BALB/c и BALB/c nude (массой 15 – 17 г) и беспородных мышей (массой 15 – 17 г). Животные содержались на стандартном рационе, с достаточным количеством воды. Животные не имели экзогенной патологической микрофлоры. Все манипуляции с животными при проведении эксперимента проводили с применением седативных средств в соответствии с ветеринарным законодательством.
Исследование инфекционности вирусов. Титрование инфекционности аденовирусного штамма Adenoid 75 и его мутантного варианта Adel2 в составе препарата «Канцеролизин» проводили на культурах клеток 293, SW480, A431, Hep2 и C33A, а также на первичной культуре фибробластов кожи человека микрометодом на 96-луночных культуральных планшетах (Costar, США);
инфекционный титр вируса выражали в ТЦД50/мл (50%-я тканевая цитопатогенная доза/мл).
Доклиническое изучение препарата. Целью доклинических исследований, в соответствии с ФЗ «О лекарственных средствах» №86-ФЗ от 22.06.1998 г., ст. 36 является получение научными методами оценок и доказательств эффективности и безопасности препарата. Препарат «Канцеролизин» исследовали в соответствии с требованиями РД 42-28-10- и СП 3.3.2.561-96, изучая его специфическую активность, токсичность, специфическую безопасность, аллергизирующее действие и влияние на иммунную систему. Работу выполняли в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации», утвержденными приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003.
Статистическая обработка результатов. Оценивали M – среднее, SM – ошибку среднего и доверительный интервал (I95) для 95%-й вероятности общепринятыми методами [Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962].
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Исследование перевиваемой культуры клеток 293 как субстрата для производства кандидатного противоопухолевого препарата «Канцеролизин»
Культура клеток 293 представляет собой наиболее оптимальный субстрат для культивирования мутантного штамма аденовируса Adel2, так как существующая трансформация генома клеток этой культуры генами E1A и E1В аденовируса обеспечивает оптимальные условия для полноценной репликации мутантного штамма с высокой урожайностью.
С целью получения экспериментально-производственных серий препарата «Канцеролизин» были созданы рабочий и посевной банки культуры клеток 293 и проведены исследования кариотипа, возможной микробиологической контаминации и онкогенных потенций данной культуры клеток [Вдовиченко Г.В. и др., 2006;
Колокольцова Т.Д., 2008]. На основании полученных результатов ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича аттестовал посевной и рабочий банки перевиваемой культуры клеток 293, планируемые для использования в производстве аденовирусного препарата, предназначенного для лечения онкологических больных.
Одним из важнейших свойств культуры клеток, используемой в качестве субстрата для производства вирусных медицинских препаратов, является ее высокая вируспродуктивная способность. В связи с этим были изучены вируспродуктивные свойства культуры клеток 293 (табл. 1).
Таблица 1. Оценка урожая штамма аденовируса Ade12 при инфицировании культуры клеток 293 разными дозами вируса Доза заражения Время наступления Концентрация вируса в культуры клеток 50-75%-го ЦПД клеточном лизате, в lg (ТЦД50 на клетку) (часы после ТЦД50/мл (I95=±0,5 lg заражения) ТЦД50/мл) 100 24 10, 10 48 9, 1 72 10, 0,1 120 10, 0,01 144 9, Примечание: ТЦД50 – 50% тканевая цитопатическая доза вируса Наличие вируспродуктивной инфекции отмечено во всем диапазоне используемых инфицирующих доз Adel2. Количество получаемого вирусного урожая (при отборе на указанные сроки для соответствующей множественности инфицирования) не зависит существенным образом от используемых инфицирующих доз.
В результате проведенных исследований показано, что культура клеток 293, заложенная на хранение в виде посевного и рабочего банков, использованная для наработки аденовирусного противоопухолевого препарата имеет: типичную для данной линии морфологию, кариотип и энзимограмму;
культура не контаминирована бактериями, грибами, микоплазмами, вирусами, в том числе онкогенными;
не является туморогенной;
обладает высокими вируспродуктивными свойствами;
сохраняет стабильность биологических свойств в течение длительного культивирования.
2. Получение противоопухолевого препарата «Канцеролизин» и оценка показателей его качества Согласно разработанному проекту экспериментально производственного регламента приготовлены три экспериментально производственные серии препарата «Канцеролизин» (“Cancerolysinum”).
Качество приготовленных препаратов мутантного варианта аденовируса оценивали по ряду показателей, согласно требованиям, предъявляемым к медицинским иммунобиологическим препаратам. Внешний вид, герметичность, механические включения, pH, стерильность, плотность соответствовали нормам [МУК 4.1/4.2.588-96, с.63;
МУК 4.1/4.2.588-96, с.126;
ГФ ХI, вып.1, с.113.;
ГФ ХI, вып.2 и МУК 4.1/4.2.588-96, с. 25]. Три серии препарата «Канцеролизин» были исследованы методом ПЦР с целью установления подлинности штамма, входящего в состав препарата. В результате при использовании видоспецифичных (по последовательности аденовируса человека 5-го серотипа GenBank NC0010960) олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих амплификацию фрагмента 2048-4582 п.о. аденовирусного генома и ДНК Adel2, выделенной из препарата «Канцеролизин» трех экспериментально-производственных серий в качестве матрицы, были амплифицированы фрагменты длиной 1458 п.о. с делецией 1118 п.о. в последовательности гена E1B55K, что свидетельствует о том, что в состав серий препарата «Канцеролизин» входит именно мутантный штамм Adel2. Кроме того, в составе трех серий препарата были оценены содержание остаточной клеточной ДНК, концентрация бычьего сывороточного альбумина, концентрация общего белка [МУК 4.1/4.2.588-96, с. 95, МУК 4.1/4.2.588-96, с. 72].
Результаты проведенных исследований свидетельствовали о том, что все три приготовленные экспериментально-производственные серии препарата «Канцеролизин» соответствуют требованиям, изложенным в нормативно технической документации (НТД) и могут быть использованы для дальнейшего лабораторно-экспериментального (доклинического) изучения.
Данные серии препарата «Канцеролизин» были аттестованы в ГИСК им. Л.А.
Тарасевича.
3. Доклинические исследования кандидатного противоопухолевого препарата «Канцеролизин»
3.1 Исследования генетической стабильности мутантного штамма аденовируса Adel2, входящего в состав препарата «Канцеролизин»
На первом этапе доклинических исследований противоопухолевого лечебного препарата «Канцеролизин» на основе мутантного штамма аденовируса Adel2 была изучена стабильность мутантного штамма аденовируса Adel2, используемого в препарате, в процессе его многократного пассирования.
Методом частичного секвенирования генома мутантного аденовируса Adel2 в образцах культуральных жидкостей, полученных после 5, 10 и 18-го пасcажей на культуре клеток 293 было подтверждено наличие внесенных мутаций. Установлено, что нуклеотидная последовательность гена E1B55K мутантного варианта Adel2 содержит делецию 1118 п.о. (длина интактного гена 1488 п.о.) после сигнала терминации трансляции гена E1B19K. Кроме того, в районе делеции было показано наличие сайта для эндонуклеазы рестрикции SalI, внесенного в процессе конструирования мутантного штамма Adel2.
Для дополнительного подтверждения генетической стабильности штамма Adel2 и отсутствия дикого типа аденовируса в вирусной популяции был проведен ПЦР-анализ ДНК, выделенных из отдельных вирусных клонов после 18-ти последовательных пассажей. Во всех случаях (10 клонов) показано наличие делеции ожидаемой длины в гене E1B55K и отсутствие амплификации фрагмента ДНК, соответствующего родительскому аденовирусу. На основании этих результатов можно утверждать, что в процессе многократного пассирования мутантного штамма Adel2 (до пассажей) в монослое культуры клеток 293 не происходит спонтанного появления дикого варианта аденовируса, что свидетельствует о стабильности штамма Adel2.
На следующем этапе была исследована стабильность инфекционных свойств штамма Adel2, входящего в состав препарата «Канцеролизин», при пассировании на культуре клеток 293. Образцы культуральной жидкости, содержащие штамм Adel2, из 5, 10, 18 пассажей на культуре клеток 293 были использованы для изучения их литической активности на опухолевых p53 дефектных и нормальных p53-позитивных культурах клеток человека.
Инфекционность аденовируса оценивали по цитопатогенному воздействию на культуры клеток (инфекционный титр выражали в lgТЦД50/мл).
Результаты представлены в таблице 2. Показано, что мутантный штамм Adel2 после 5, 10 и 18-го последовательных пассажей на культуре комплементарных клеток 293 сохранил способность селективно инфициро Таблица 2. Цитолитическая активность мутантного (Adel2) и дикого штаммов аденовируса на панели p53 дефектных опухолевых и нормальных клеток человека Штамм аденовируса Титр вируса на соответствующей клеточной культуре (М± I95 lgТЦД50/мл) 293 SW480 A431 ФКЧ Adenoid 75 9,3±0,4 8,5±0,4 5,5±0,3 5,4±0, Adel2 (5-й пассаж) 9,3±0,4 8,3±0,5 5,2±0,4 3,3±0, Adel2 (10-й пассаж) 9,3±0,4 8,4±0,2 5,5±0,4 3,2±0, Adel2 (18-й пассаж) 9,3±0,4 8,4±0,3 5,5±0,3 3,2±0, Примечание: ТЦД50 – 50% тканевая цитопатическая доза вируса, lgТЦД50/мл определяли по методу Кербера;
Adenoid 75 – штамм аденовируса человека 5-го серотипа (дикий тип);
Adel2 – мутантный штамм аденовируса человека 5-го серотипа с делецией в гене E1B55K;
293 - клетки почки эмбриона человека, трансформированные генами E1A и E1B аденовируса 5-го серотипа;
р53-дефектные опухолевые клетки: А431- эпидермоидная карцинома человека, SW480- аденокарцинома толстой кишки человека: Нормальные (р53 позитивные) клетки человека: ФКЧ- фибробласты кожи человека.
вать и лизировать культуры р53-дефектных опухолевых клеток человека.
Таким образом, проведенные исследования показали высокий уровень генетической стабильности мутантного штамма аденовируса Adel2, входящего в состав препарата «Канцеролизин» при многократном пассировании. Полученные данные свидетельствуют о возможности и перспективности использования мутантного штамма Adel2 в качестве основного действующего компонента противоопухолевого препарата «Канцеролизин».
3.2 Исследование реактогенности препарата «Канцеролизин»
Одной из важных характеристик препарата, планируемого для лечения людей, является его безопасность при применении или ареактогенность. В исследованиях были использованы три серии препарата «Канцеролизин».
Показатели, полученные при определении реактогенности различных серий препарата, не отличались достоверно друг от друга.
Оценку пирогенности препарата «Канцеролизин» проводили в тестах на кроликах, в результате было показано, что все серии препарата апирогенны, так как не было отмечено повышения температуры тела у кроликов более, чем на 0,6 0С при внутривенном введении препарата [Вдовиченко Г.В. и др., 2006].
Определение токсичности трех серий препарата «Канцеролизин»
проводили на беспородных мышах-самцах массой 15 - 17 г и крысах линии Low массой 200-250 г. При определении «острой» токсичности значимой потери веса, а также каких либо видимых клинических признаков интоксикации или гибели у животных, инъецированных препаратом, по сравнению с контролем на всем сроке наблюдения не наблюдали [Вдовиченко Г.В. и др., 2006].
При исследовании «хронической» токсичности препарата в тестах при пятикратном подкожном его введении лабораторным животным клинических признаков интоксикации, а также патологических изменений в структуре органов изъятых через 24 часа и 7 суток после последнего введения препарата (головной и спинной мозг, легкие, печень, почки, надпочечники, желудок, тонкий и толстый кишечник, поджелудочная железа, тимус, эпифиз, щитовидная железа, селезенка, региональные лимфатические узлы и ткань в месте введения препарата) выявлено не было.
Разрабатываемый препарат «Канцеролизин» может влиять на ЦНС, конкретно на функциональные процессы в головном мозге, торможение и возбуждение. При оценке влияния препаратов на эти процессы был использован тест - коразоловая проба [СП 3.3.2.561-96, п. 5.2, с.24]. При постановке коразоловой пробы мышам линии BALB/с вводили внутрибрюшинно 0,5 мл препарата (активность 109,2 ТЦД50/мл). Коразол животным вводили через 48 часов и через 7 суток после введения препарата «Канцеролизин». Время начала судорог, выраженность судорог и время наступления гибели в опытных группах не отличались достоверно от аналогичных показателей в контрольной группе, на основании чего можно сделать заключение, что препарат мутантного варианта аденовируса не оказывает патологического влияния на функцию ЦНС.
Введение в организм исследуемого препарата неизбежно будет вызывать ответные реакции со стороны иммунной системы, так как в основе препарата «Канцеролизин» находится вирус. В связи с этим очень важно оценить степень выраженности этих реакций организма в ответ на его введение, чтобы исследовать безопасность применения препарата. С этой целью был проведен ряд исследований, направленных на изучение иммунологической безопасности препарата.
Гематологическое и морфологическое исследования органов иммунной системы у животных, обработанных препаратом «Канцеролизин»
При проведении гематологических и морфологических исследований использовали беспородных мышей-самцов, массой 17 г, которым подкожно вводили препарат в дозе 109,0 ТЦД50 однократно и пятикратно с интервалом сутки. Через 1, 7, 10 или 14 суток после введения препарата у животных брали кровь из ретроорбитального синуса для проведения гематологических исследований, а также брали органы иммунной системы для их морфологического исследования.
В крови подсчитывали количество эритроцитов, общее количество лейкоцитов, процент и абсолютное количество форменных элементов крови.
По результатам исследований концентрации эритроцитов в крови у контрольных и опытных животных достоверно не различались между собой при различных кратностях введения препарата «Канцеролизин», также не наблюдалось отличий у контрольных и опытных групп животных в концентрации лейкоцитов. Результаты микроскопического исследования препаратов крови животных показали, что введение препарата «Канцеролизин» не вызывает значимых изменений лейкоцитарной формулы.
При морфологическом исследовании органов иммунной системы (селезенка, тимус, толстая кишка, бронхиальные и мезентериальные лимфатические узлы) в экспериментальных и контрольных группах мышей при однократном и пятикратном введении препарата «Канцеролизин»
основное внимание обращалось на параметры, которые могли свидетельствовать о патологических процессах, нарушениях иммунного ответа и нарушениях гемопоэза.
Результаты исследования клеточного состава красного костного мозга у мышей, как однократно так и пятикратно обработанных препаратом «Канцеролизин», не выявили значимого отклонения от нормальных значений показателей через 1, 7 и 14 суток после последнего введения препарата Проведенное гематологическое и морфологическое исследования органов иммунной системы не выявило значительных отличий в контрольных и опытных образцах. Отмеченные отличия характеризовали реакцию лимфоидных органов на антигенное воздействие. Данные структурные изменения не носили специфического характера и не содержали признаков патологического повреждения органов и тканей. Часть отмеченных особенностей носила видоспецифический характер и являлась нормой для данного вида экспериментальных животных. К этим особенностям можно отнести мегакариоцитоз и лимфоцитоз красной пульпы селезенки;
преобладание малых лимфоцитов в лимфатических узлах и фолликулах кишечника;
преобладание в красном костном мозге зрелых нейтрофилов. В процессе опыта в красном костном мозге наблюдалась стимуляция миело- и лимфопоэза, клеточный состав красного костного мозга варьировал в пределах видовой нормы. Таким образом, структура лимфоидных органов у экспериментальных животных отражала активацию иммунного ответа.
Исследование фагоцитарной активности макрофагов у инъецированных препаратом «Канцеролизин» мышей Фагоцитарную активность макрофагов оценивали по активности клеток перитонеального эксудата по отношению к инактивированным клеткам пекарских дрожжей. Для постановки реакции были использованы три группы мышей линии BALB/c. Животным однократно и двукратно были введены внутрибрюшинно серии препарата. Определение фагоцитарной активности макрофагов проводили на 3, 5 и 7-е сутки после инфицирования. Были определены процент фагоцитирующих клеток и фагоцитарное число. В результате показатели фагоцитарной активности макрофагов животных, инъецированных препаратом «Канцеролизин», достоверно не отличались от показателей контрольной группы животных (p0,05), которым внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Внутрибрюшинное введение препарата лабораторным животным не приводит к негативным изменениям фагоцитарной активности макрофагальной системы.
Изучение изменений содержания ядросодержащих клеток, Т- и B клеток при применении препарата «Канцеролизин»
Определение количества ядросодержащих клеток (ЯСК), Т- и В лимфоцитов в селезенке проводили в экспериментах на мышах линии BALB/c, внутрибрюшинно инъецированных, однократно и двухкратно с интервалом в сутки, препаратом в дозе 109,0 ТЦД50. Определение количества ЯСК в селезенке проводили на 3, 5 и 7-е сутки после последнего введения препарата. Контрольная группа животных была инокулирована физиологическим раствором. Результаты исследования представлены в таблице 3. Результаты определения абсолютного количества ЯСК в селезенке животных опытных и контрольных групп свидетельствуют об отсутствии супрессирующего эффекта исследуемого препарата на клетки селезенки.
Определение количества Т- и В- клеток проводили с использованием цитотоксического теста. Для постановки реакции использовали взвеси лимфоцитов, полученных от вышеотмеченных опытных и контрольных групп мышей. Из полученных результатов следует, что введение мышам высоких доз препарата не приводит к значительным сдвигам в процентном содержании лимфоцитов и не вызывает супрессивного воздействия на Т- и В клеточное звено иммунитета животных. Эксперименты по определению количества ЯСК, Т- и В- лимфоцитов в селезенке животных были проведены с тремя сериями препарата «Канцеролизин» при этом результаты были сходными.
Таблица 3. Оценка количества ЯСК в селезенке инъецированных препаратом «Канцеролизин» мышей (M±SM) Группа животных Сутки после Количество ЯСК в селезенке (х107) инъецирования Однократно 3 6,95±0, инъецированная 5 7,30±0, препаратом 7 6,80±0, Двукратно 3 7,15±0, инъецированная 5 7,50±0, препаратом 7 7,30±0, Контрольная 3 6,80±0, (не инъецированные 5 7,05±0, препаратом) 7 6,95±0, Примечание. Клетки селезенки каждой мыши анализировали индивидуально, в таблице приведены среднегрупповые значения.
Исследование функциональной активности регуляторных субпопуляций Т- лимфоцитов с определением спонтанно формирующихся АОК в ответ на введение препарата «Канцеролизин»
Исследование проводили на мышах линии BALB/c подкожно инъецированных сериями препарата «Канцеролизин». Количество АОК в селезенке животных определяли через 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 суток после инфицирования (на каждую точку использовали по 3 мыши) (табл. 4).
Установили, что на протяжении всего времени наблюдения животных после введения исследуемого препарата, статистически достоверного его влияния на активность регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов не наблюдается.
Таким образом, внутрибрюшинное введение животным препарата не оказывает выраженного влияния на функциональную активность регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов.
Исследование иммунореактивности на неродственные антигены у животных, обработанных препаратом «Канцеролизин»
Исследование проводили на мышах линии BALB/c подкожно инъецированных препаратом в дозе 109 ТЦД50. Спустя 7 суток животным вводили внутривенно эритроциты барана, 2x107 кл/животное.
Таблица 4. Определение функциональной активности регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов BALB/c мышей, инфицированных препаратом Adel2 (M±SM) Сутки после Число АОК введения препарата Контроль Опыт 1 75,2±5,3 74,8±5, 3 76,4±5,8 71,3±5, 5 75,9±5,5 67,3±5, 7 72,7±6,2 71,1±6, 9 76,7±6,0 74,1±5, 11 76,7±6,0 74,1±5, 13 73,4±5,2 77,8±6, Примечание. Показатели приведены в пересчете на 106 клеток селезенки.
Иммунный ответ на гетерологичный антиген оценивали через 4 суток после введения эритроцитов. При определении иммунореактивности у животных, обработанных препаратом, на гетерологичный Т-зависимый антиген - эритроциты барана, было установлено, что количество АОК на селезенку составляло 41535±2320. В контрольной группе животных этот показатель не отличался и составил 42780±2450. Аналогичного рода эксперименты с подобными результатами были проведены на других сериях препаратов мутантного варианта аденовируса.
Таким образом, введение препарата «Канцеролизин» животным в дозе 109 ТЦД50 не угнетает иммунный ответ на гетерологичный антиген.
Изучение аллергизирующего действия и аутоиммунных реакций организма в ответ на введение препарата «Канцеролизин»
Для изучения возможного аллергенного действия и патологических аутоиммунных реакций организма в ответ на введение исследуемого препарата были проведены исследования по определению способности препарата вызывать анафилактическую реакцию, продукцию реагиноподобных антител (Ig E) у животных, обработанных препаратом и вызывать косвенный сенсибилизирующий эффект, которые характеризуют реакции гиперчувствительности немедленного типа.
При воспроизведении анафилаксии у морских свинок препарат вводили трехкратно в дозе 109,5 ТЦД50 в следующей схеме: первая инъекция была выполнена подкожно, две последующие - внутримышечно. Интервал между инъекциями составлял одни сутки. Двум группам контрольных животных (положительной и отрицательной) подкожно вводили гетерологичную (лошадиную) сыворотку в объеме 0,1 мл и трехкратно подкожно инъецировали физ. раствором соответственно. Спустя 21 сутки после последней инъекции животным повторно внутривенно вводили исследуемый препарат в той же дозе, а группе положительного контроля вводили гетерологичную сыворотку. Результаты исследования приведены в таблице 5.
Как следует из приведенных в таблице данных, исследуемый препарат «Канцеролизин» не вызывает анафилактической реакции, сравнимой с группой животных положительного контроля. Аналогичного рода эксперименты с подобными результатами были проведены с использованием трех серий препарата «Канцеролизин». Таким образом, инфицирование препаратом «Канцеролизин» не приводит к сенсибилизации организма животных, проявление которой при повторной встрече с ним выражается в реакции гиперчувствительности немедленного типа.
Возможность аллергизирующего влияния препарата «Канцеролизин» на организм оценивали по продукции реагиноподобных антител (Ig E) у инфицированных животных. Исследование проводили на мышах линии BALB/c, которым подкожно двукратно вводили препарат в дозе 109 ТЦД50 с интервалом в 21 сутки.
Животные контрольной группы были инокулированы физ. раствором.
Начиная с пятых суток после повторного инфицирования, у животных с недельным интервалом пятикратно отбирали кровь.
Таблица 5. Изучение реакций гиперчувствительности немедленного типа у морских свинок, сенсибилизированных препаратом «Канцеролизин»
Группа Сенсибилизирую Количество Количество Индекс животных щий агент животных павших Вейгла животных Опытная группа Препарат 10 0* 0, «Канцеролизин»
Положительный Лошадиная 10 6 4, контроль сыворотка Отрицательный Физ. раствор 10 0 0, контроль Примечание: * - отсутствие павших животных в опыте свидетельствует о том, что изучаемый препарат не вызывает анафилаксии у морских свинок.
Полученные данные свидетельствуют о том, что у животных, которым вводили препарат «Канцеролизин», титр реагиноподобных антител не превышает показатели контрольной группы на протяжении всего срока наблюдения. Таким образом, инфицирование животных препаратом не сопровождается формированием аллергического состояния.
Для исследования косвенного сенсибилизирующего эффекта препарата использовали мышей линии BALB/c, мышей подкожно иммунизировали овальбумином дозой 2,0 мкг, спустя 11 суток животным вводили препарат в дозе 109 ТЦД50. На 7, 12, 17 и 22-е сутки после введения препарата у животных отбирали кровь и определяли в полученных образцах сыворотки титры антител к овальбумину. Положительный контроль представлял собой группу животных, иммунизированных овальбумином и инокулированных через 11 суток после иммунизации физ. раствором. Отрицательным контролем являлись животные, иммунизированные культуральной жидкостью (среда культивирования неинфицированных клеток 293) и впоследствии инфицированные препаратом. В результате установили, что титры антител к овальбумину в группе, получавшей препарат «Канцеролизин» не отличались от таковых в группе положительного контроля, что свидетельствует о том, что препарат не ингибирует гуморальный иммунный ответ на предварительную иммунизацию модельным антигеном.
Определение реакции гиперчувствительности замедленного типа при применении препарата «Канцеролизин»
Оценку развития гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) проводили по методике, основанной на изменении массы конечности животных. С этой целью мышам линии BALB/c подкожно вводили препарат в дозе 109 ТЦД50. Спустя 5 суток в подушечку задней правой лапки вводили 2х108 ТЦД50 препарата, а в подушечку задней левой лапки вводили физ.
раствор. Отрицательным контролем являлась группа мышей, инокулированная физ. раствором. Умеренный отек конечности развивался только у тех животных, которые были предварительно сенсибилизированы препаратом, что свидетельствует о том, что физиологический уровень ГЗТ обусловлен аденовирусным антигеном. Аналогичного рода эксперименты с подобными результатами были проведены на других сериях препарата «Канцеролизин».
3.3 Специфическая онколитическая активность препарата «Канцеролизин»
Селективная репликативная активность препарата in vitro Основным свойством препарата «Канцеролизин» является его специфическая инфекционная активность, избирательная в отношении p53 дефектных опухолевых клеток.
Были проведены сравнительные исследования инфекционности препарата «Канцеролизин» для нормальных фибробластов человека и различных p53-дефектных опухолевых клеток (рисунок 1). В результате установили, что препарат обладает способностью к селективной репликации на культурах р53-дефектных опухолевых клеток человека (имеющихся в нашем распоряжении) и является перспективным для проведения дальнейших исследований в системе in vivo.
Онколитическая активность препарата in vivo Исследование терапевтической эффективности препаратов мутантного штамма аденовируса проводили на 8-недельных безтимусных nude мышах, Для прививки животным использовали культуру опухолевых клеток A431.
По достижению опухолями, необходимого объема (100 мкл), который позволял осуществить интратуморальное введение, была проведена их Рисунок 1. Оценка репликации штамма аденовируса Adel2 в р53-дефектных опухолевых клетках в сравнении с нормальными фибробластами кожи человека.
Примечание: Концентрация штамма Adel2, через 72 ч культивирования в клетках была нормализована к концентрации дикого типа аденовируса, продуцированного теми же клетками за тот же период времени и результат представлен в процентном отношении;
количественное определение инфекционного вируса проводили титрованием на культуре клеток 293;
А431, SW480, Hep2 и C33A - p53-дефектные опухолевые клетки человека;
ФКЧ- фибробласты кожи человека.
обработка тремя сериями препарата «Канцеролизин». С этой целью в каждую опухоль был инъецирован исследуемый препарат с инфекционной активностью 108,5 ТЦД50/100мкл (по 25 мкл в каждый квадрант опухоли).
Инъекции проводились ежедневно в течение 5 дней.
Опухоли, привитые контрольным животным, обрабатывали по той же схеме препаратом «Канцеролизин», инактивированным ультрафиолетовым облучением. Полученные результаты свидетельствуют о том, что обработка опухолей препаратом приводит к выраженному ингибированию роста опухолевых клеток, как по средним значениям объемов опухолей, так и по кратности увеличения их объемов с начала наблюдения до его завершения (рисунок 2).
Средний объем опухолей, мкл 0 5 10 15 20 25 Время после введения вируса в опухоли (дни) Рисунок 2. Противоопухолевая активность препарата «Канцеролизин» in vivo при интратуморальном введении.
Примечание: А431- клетки эпидермоидной карциномы человека (107 клеток в 150 l DMEM) инъецировали подкожно в боковую поверхность бестимусных nude мышей. В опухоли (n=5) вводили 108,5 ТЦД50 препарата «Канцеролизин» в 100 мкл фосфатно солевого буфера ежедневно в течение 5 дней ( ). В контрольные опухоли (n=5) по той же схеме вводили инактивированный ультра фиолетовым излучением препарат «Канцеролизин»( ).
3.4 Изучение сохранения активности препарата «Канцеролизин»
при хранении При использовании препарата «Канцеролизин» для лечения онкологических заболеваний немаловажным критерием, характеризующим его эффективность в процессе лечения, является способность препарата сохранять свою специфическую активность при хранении и транспортировке.
Для оценки изменения активности препарата при хранении определяли изменение титра мутантного штамма Adel2 в составе препарата «Канцеролизин» в контрольные временные промежутки при его хранении в различных температурных условиях (табл. 6). Исходя из полученных результатов, хранение препарата без снижения его активности может осуществляться при температуре минус 40 0С в течение не более 12 месяцев или при температуре минус 70 0С в течение двух лет.
Были проведены эксперименты, имитирующие транспортировку «Канцеролизина» при температуре минус 10 – 13 0С в течение 5 суток. При этом замороженный при минус 70 0С препарат (3 ампулы с исходной активностью 9,5±0,5 lg ТЦД50/мл) переместили в морозильный отдел холодильника для хранения при температуре минус 10 – 13 0С на 5 суток, контролируя один раз в сутки температуру в нем после его кратковременного открытия.
Таблица 6. Оценка изменения биологической концентрации вируса в препарате «Канцеролизин» в зависимости от времени его хранения при разных температурных условиях.
Концентрация вируса lg ТЦД50/мл (I95 ±0,5 lg ТЦД50/мл) Срок экспериментал в процессе хранения при разных температурах:
Минус 200С Минус 400С Минус 700С ьного хранения, месяцы 1 7,5* 9,5 н.о.
2 7,2* н.о. н.о.
3 7,2* 9,2 9, 4 7,2* н.о. н.о.
5 7,0* н.о. н.о.
6 6,6* 9,2 9, 9 н.о. 9,2 н.о.
12 н.о. 8,8 9, 15 н.о. 8,5** 9, 24 н.о. н.о. 9, Примечание: cпецифическую активность штамма Adel2 в составе препарата определяли с помощью стандартного метода титрования вирусных частиц по 50% цитопатическому действию на культуре клеток 293;
титр исходного исследуемого препарата на 0 месяцев составил 9,5±0,5 lg ТЦД50/мл.;
* - концентрация вируса в препарате в 100 и более раз ниже по сравнению с концентрацией вируса в исходном препарате на 0 месяцев;
** концентрация вируса в препарате в 10 раз ниже по сравнению с концентрацией вируса в исходном препарате на 0 месяцев (уровень достоверности отличий p0,05);
н.о. – концентрацию в данной точке не определяли.
По истечении 5-ти суток в образцах препарата определяли концентрацию инфекционного вируса. В результате не было отмечено достоверного снижения концентрации вируса в трех ампулах.
Транспортировка препарата без достоверного снижения его активности может быть осуществлена при температуре минус 10 – 13 0С в течение суток.
ВЫВОДЫ 1 Культура клеток 293 не является туморогенной, обладает высокой чувствительностью к мутантному штамму Adel2 аденовируса 5-го серотипа, позволяет нарабатывать вирусную биомассу штамма до высоких концентраций при низкой множественности заражения и разрешена для производства лечебного противоопухолевого вирусного живого культурального очищенного концентрированного жидкого препарата «Канцеролизин» на основе данного штамма аденовируса.
2 В соответствии с проектом ЭПР получены три экспериментально производственные серии препарата «Канцеролизин».
3 Показано, что штамм Adel2 аденовируса, входящий в состав противоопухолевого препарата «Канцеролизин» при многократном пассировании (18 пассажей) на культуре клеток 293, характеризуется высокой степенью генетической стабильности и сохраняет способность селективно инфицировать и лизировать культуры р53-дефектных опухолевых клеток человека.
4 Препарат «Канцеролизин» не обладает пирогенностью, токсичностью (острой и хронической), не влияет на центральную нервную систему, не проявляет аллергизирующего действия, не вызывает аутоиммунных реакций и является иммунологически безопасным. Показана его избирательная инфекционная активность в отношении р53-дефектных опухолевых клеток человека in vitro. На модели иммунодефицитных мышей с привитыми опухолями эпидермоидной аденокарциномы человека (А431) показана его способность достоверно ингибировать прогрессию опухолей при интратуморальном введении.
5 При моделировании условий хранения и транспортировки препарата «Канцеролизин» показано, что он сохраняет свою специфическую активность при хранении в течение двух лет при температуре минус 70 0С, в то же время транспортировка препарата с сохранением его специфической активности в течение 5 суток возможна при температуре минус 10-13 0С.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Вдовиченко Г.В., Радаева И.Ф., Сергеев А.А. и др. Создание банков перевиваемой культуры клеток 293 для производства антиракового вирусного лечебного препарата «Канцеролизин» //Биотехнология. 2006. №1. С.62-67.
2. Радаева И.Ф., Вдовиченко Г.В., Сергеев А.А. и др. Аттестация перевиваемой культуры клеток 293, используемой для культивирования антиракового лечебного препарата «Канцеролизин» //Антибиотики и химиотерапия. 2005.Т.50., №5-6. С.7-10.
3. Вдовиченко Г.В., Петрищенко В.А, Сергеев А.А. и др. Доклинические исследования противоракового лечебного препарата «Канцеролизин» //Вопросы вирусологии. 2006. №6. С.39-42.
4. Вдовиченко Г.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.А. и др. Изучение реактогенности, безопасности и специфической активности на животных противоракового лечебного препарата «Канцеролизин» //Биотехнология. 2006. №2. C. 66-72.
5. Вдовиченко Г.В., Шишкина Л.Н., Сергеев А.А. и др. Разработка лечебного противоракового препарата на основе мутантного штамма аденовируса человека //2-я Международная конференция «Наука – Бизнес – Образование Биотехнология – биомедицина - Окружающая среда», тезисы докладов – 10 – 13 мая 2005 г., Пущино, С. 60.
6. Вдовиченко Г.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.А. и др. Доклинические исследования противоракового лечебного аденовирусного препарата «Канцеролизин» //1 я Российско-американская конференция «Биотехнология и онкология» - 29-31 мая 2005 г., Санкт-Петербург, Россия, С. 94 – 95.
7. Сергеев А.А., Вдовиченко Г.В., Радаева И.Ф. и др. Аттестация перевиваемой культуры клеток 293, используемой для культивирования антиракового лечебного препарата //1-я Российско-американская конференция «Биотехнология и онкология» - 29 31 мая 2005 г., Санкт-Петербург, Россия, С. 131.
8. Терновой В.А., Петрищенко В.А., Вдовиченко Г.В. и др. Изучение возможности культивирования мутантного варианта Adel2 аденовируса на культуре клеток 293 //1-я Российско-американская конференция «Биотехнология и онкология» - 29 31 мая 2005 г., Санкт-Петербург, Россия, С. 138.
9. Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н., Вдовиченко Г.В. и др. Проведение 1-й фазы клинических испытаний противоопухолевого препарата «Канцеролизин», созданного на основе мутантного аденовируса 5-го серотипа // Международная научно-практическая конференция «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», посвященной 50-летию Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности НЦБ МОН РК, Алматы, 20-22 мая 2008, С. 476-477.
10. Вдовиченко Г.В., Шишкина Л.Н, Михайлова И.Н. и др. Доклинические и клинические исследования противоракового лечебного аденовирусного препарата «Канцеролизин»// Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно эпидемиологического благополучия населения. 2012. С.318-325.
11. Иванова М.Ю., Шишкина Л.Н., Шевцов А.Р. и др. Определение токсичности цезия хлорида на животных, перевиваемых и первичных культурах клеток» // Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения. 2012.С.331-338.
12. Vdovichenko G.V., Radaeva I.F., Sergeev A.A. et al. The certification of the continuous cell culture 293 for the cultivation of the mutant adenoviral therapeutic anticancer preparation //Abstracts of the XIII International Congress of Virology, San Francisco, California, USA, July 23 – 28, 2005. -187.V.560. P. 183.
13. Vdovichenko G.V., Sergeev A.A., Shishkina L.N. et al. The development of the therapeutic anticancer preparation based on the Mutant strain of human adenovirus //Abstracts of the XIII International Congress of Virology, San Francisco, California, USA, July 23 – 28, 2005.
– 187.V.561. P. 184.