Изучение цитостатических свойств и других биологических эф фектов некоторых синтетических полиаминов в модельных сис темах

На правах рукописи

СОКУЕВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА Изучение цитостатических свойств и других биологических эф фектов некоторых синтетических полиаминов в модельных сис темах 03.01.04 «Биохимия» 03.02.07 «Генетика»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2012 2

Работа выполнена на кафедре биологической химии медицинского факультета Российского университета дружбы народов Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Сяткин С.П.

доктор биологических наук, профессор Шишкин С.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гурвиц Белла Яковлевна, ведущий научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института Биохимии им. А.Н. Баха РАН доктор медицинских наук, профессор Ижевская Вера Леонидовна, заместитель директора Федерального государственного бюджетного учреждения Медико-Генетического Научного Центра РАМН

Ведущая организация: Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук.

Защита состоится «21» декабря 2012 г. в «_» ч. на заседании дис сертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Россий ского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул.

Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан «_» ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Е.В. Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Природные полиамины (ПА) и их синтетические аналоги изучаются уже не одно десятилетие как биологически активные вещества, способ ные оказывать существенное влияние на рост и развитие самых разных организмов путем регуляции клеточной пролиферации у микроорганиз мов, растений и животных, включая человека [Wallace H.M., Niiranen K.

2007;

Huang Y., et al. 2009;

Carmo A.M., et al. 2011] Установлено, что полиамины вовлечены в целый ряд важнейших внутриклеточных про цессов, например, в обеспечение стресс-устойчивости, регуляцию опре деленных метаболических реакций, развитие апоптоза [Huang Y. et al.

2009;

Marco F.,et al 2011;

Minois N. et al. 2011]. При этом некоторые по лиамины нарушают функционирование клеточных геномов на разных уровнях, в частности, отдельные соединения указанного ряда способны достаточно специфично изменять экспрессию генов и влиять на актив ность ферментов [Huang Y., et al. 2009;

Marco F.,et al 2011;

Wu Y. et al.

2012]. Естественно, большой интерес вызывают вопросы, связанные с изучением роли полиаминов в регуляции различных молекулярных процессов у человека и возможностей целенаправленного влияния на эти процессы синтетическими полиаминами. В настоящее время прак тически ежегодно появляются сообщения о создании новых синтетиче ских полиаминов и использовании различных подходов к определению проявлений их биологической активности [Ignatenko N.A. et al. 2009;

Carta F. et al. 2010;

Yoon Y.J. et al. 2011;

Wu Y. et al. 2012]. Как следст вие, возникают объективные потребности в стандартизации условий для определения и сравнительного анализа цитостатических и других функ циональных свойств синтетических аналогов полиаминов в рамках док линических испытаний.

Имеются убедительные данные, свидетельствующие о том, что природные полиамины и их синтетические аналоги способны целена правленно влиять на определенные этапы биосинтеза белков. В частно сти, были опубликованы статьи, в которых эффективно использовались протеомные технологии для определения конкретных клеточных бел ков, подвергающихся различным изменениям после воздействий поли аминов [Yohannes E. et al. 2005;

Ignatenko N.A. et al. 2009;

Kuo W.L. et al.

2009 и др.]. Таким образом, применение протеомного анализа открывает широкие возможности для получения новых сведений о молекулярных эффектах, которые способны вызывать различные синтетические анало ги полиаминов, а также о потенциальных белках - мишенях.

Наконец важно отметить, что синтетические аналоги полиаминов могут найти применение как лекарственные средства или попадать в организм человека с пищевыми продуктами. Соответственно, представ ляется весьма актуальным проведение разработок стандартизированных биотест-систем на основе культивируемых клеток человека, что позво лит оптимизировать программы доклинических исследований новых синтетических аналогов полиаминов и уменьшит риск возможных ос ложнений при последующем изучении.

Цель и задачи исследования.

Основной целью данной диссертационной работы стало изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в различных модельных системах.

В соответствии с данной целью были поставлены следующие зада чи:

1. Исследовать в условиях модельной бесклеточной системы влия ние ряда синтетических аналогов полиаминов (ДФМО, МГБГ и др.) на общий пул природных полиаминов и некоторые показатели их обмена.

2. Проанализировать цитостатическую активность у отдельных син тетических аналогов полиаминов с помощью модельной системы на культивируемых клетках лабораторных животных.

3. Разработать биотест-систему на основе быстро пролиферирую щих, культивируемых клеток человека и с её помощью изучить биоло гические эффекты ряда синтетических аналогов полиаминов 4. Провести сравнительный протеомный анализ белков в культиви руемых клетках человека под действием отдельных синтетических ана логов полиаминов.

5. Исследовать возможность ассоциации отдельных полиморфных ва риантов в двух генах, кодирующих ключевые ферменты метаболизма полиаминов, а также в гене одного из актин-связывающих белков с рис ком рака предстательной железы у этнических русских.

Научная новизна.

Получены новые данные о влиянии ряда синтетических аналогов по лиаминов (ДФМО, МГБГ, О-замещенных гидроксиламинов, алифатиче ских гомологов природных полиаминов) на общий пул природных по лиаминов, а также на соотношение спермидин / спермин и синтез поли аминов в условиях бесклеточной системы.

Для обеспечения определения цитостатической биологической актив ности синтетических аналогов полиаминов разработана клеточная био тест-система, использующая в качестве тестируемого объекта быстро пролиферирующие культивируемые клетки рака простаты человека (PC-3 и LNCaP). С помощью этой биотест-системы охарактеризованы четыре новых синтетических аналога полиаминов дифенил-содержащих аминов (ДФСА-1 – ДФСА-4) по их способности подавлять рост опухо левых клеток человека.

По результатам протеомного анализа в клетках линии PC-3 определе ны шесть белков, количественно изменяющихся под действием ДФСА- и 2. При этом, впервые установлено присутствие в этих клетках двух «безымянных белков» - белка, который зарегистрирован в базе данных Protein NCBI под №193783699 (по данным анализа кДНК из ткани мат ки, локус BAG53610 в Genbank) и считается родственным аспартатами нотрансферазам, а также белка, идентифицированного как «безымянный белок» из семейства РНК-связывающих белков с RBD доменом (№16552153 в Protein NCBI).

Впервые установлено, что у этнических русских по результатам изу чения полиморфизма сайты rs61748925 SAT1 и rs1139915 PAOX являют ся мономорфными и они не пригодны для изучения ассоциаций с РП;

в отличие от этого для сайта rs11072170 в гене FMN1 удалось выявить достаточно выраженный полиморфизм со следующими характеристи ками: 19.4 % анализируемых образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% – по аллелю A, и 52.8% - являлись гетерозиготными, Таким обра зом, можно считать, что полиморфизм rs11072170 в гене FMN1 является перспективным для дальнейшего изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.

Научно-практическая значимость.

Апробировано несколько модельных систем для определения биоло гической активности синтетических аналогов природных полиаминов и разработана биотест-система, позволяющая оценивать цитостатические (цитотоксические) свойства указанных соединений (биотест-объекты клетки LNCaP и РС-3;

метод тестирования – витальная система регист рации количества клеток).

Изучены показатели биологической активности 15-ти синтетических аналогов природных полиаминов, включая антипролиферативные свой ства у 6-ти соединений на разработанной биотест-системе, использую щей быстро пролиферирующие клетки рака простаты.

При протеомном анализе белков из клеток PC-3 проведена масс спектрометрическая идентификация 52 белковых фракций в результате чего расширен информационный модуль в отечественной базе данных «Протеомика рака простаты» (версия 2012 г.), которая предназначена для оптимизации поисков белковых биомаркеров этого заболевания.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Из 13 новых синтетических аналогов полиаминов три соединения (1-аминоокси-3-аминопропан, S-(5-дезоксиаденозил)-S-метил--тио этилгидроксиламин, этилендиамин) обладают наибольшими биоэффек тами в бесклеточной тест-системе.

2. В модельных условиях (на культивируемых L-клетках) 1 аминоокси-3-аминопропан и 5-дезоксиаденозил-5-метилтиоэтил гидроксиламин показали себя как антипролиферативные агенты.

3. С помощью биотест-системы на основе быстро пролиферирующих клеток человека определены биологические эффекты ДФМО и МГБГ, а также 4-х новых синтетических дифенил-содержащих аминов (ДФСА 1 4).

4. Показано, что ДФСА-1 является наиболее перспективным цитоток сическим агентов, поскольку для него выявлено наиболее выраженное антипролиферативное действие.

5. Протеомный анализа белков клеток РС-3 выявил два новых («бе зымянных») белка человека и позволил расширить информационный модуль «Белки РС-3» в базе данных «Протеомика рака простаты».

6. Показано, что у этнических русских сайт в гене SAT1 (rs61748925) и сайт в гене PAOX (rs1139915) являются мономорфными, т.е. они не при годны для изучения ассоциаций с РП;

а для сайта rs11072170 в гене FMN1 существует полиморфизм со следующими характеристиками:

19.4 % образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% – по аллелю A, и 52.8% - являлись гетерозиготными, что позволяет считать его пер спективным для изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.

Апробация работы.

Материалы работы докладывались на международных, российских конференциях и на научных съездах, в том числе: XVIII Межд. конф.

«Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармако логии и экологии», 2010. Украина, Ялта-Гурзуф;

Intern. polyamine con fer., 2010, Gotemba, Japan;

I Межд. научно-практ. конф. «Экология и медицина: современное состояние, проблемы и перспективы», 2010, Москва;

Intern. Congress on Polyamines, Istanbul, Turkey, September, и др.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, среди которых 3 статьи в рецензируемых профильных журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также 14 тезисов докладов на отечественных и международ ных научных конференциях.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 128 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (289 ссылок на публикации отечественных и зарубежных авторов). Работа содержит 10 таблиц и 39 рисунков МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Материалами для исследований служили линии культивируемых кле ток рака предстательной железы (РПЖ) человека (LNCaP, РС-3), линия гепатомы человека Г-27, и L-клетки крыс.

Бесклеточные тест-системы получали из образцов регенерирую щей печени здоровых крыс, а также из пролиферирующей ткани гепа томы крыс линии Г27. В полученных образцах определяли активности ОДК и уровень полиаминов методом ВЭЖХ на аппарате AKTABASIC 10 HPLC (Amersham Pharmacia Biotech., Milan, Италия). Для расчета удельных активностей орнитиндекарбоксилазы (ОДК), выраженных в нанокаталах на миллиграмм белка, определяли концентрации белка в каждой пробе ткани гепатомы Г-27. Определение проводили по фарма копейному методу [Государственная Фармакопея СССР, XI, 1998] по Лоури (1951) в модификации С.П. Сяткина (1981).

В работе проводили исследование биологических эффектов новых синтетических аналогов полиаминов (-дифторметил орнитин (ДМФО), метилглиоксальбис-(гуанилгидразон) (МГБГ), 1 S-(5 аминоокси-3-аминопропан, I, 1,2-диаминооксиэтан, II, S-(5 -дезокси дезоксиаденозил)-S-тиоэтилгидроксиламин, III, аденозил)-S-метил--тиоэтилгидроксиламин, IV, Этилендиамин, V, 1,3-диаминопропан, VI, 1,5-диамино-3-азапентан, VII, 1,9-диамино 3,7-диазанонан, IX, 2-хлоро-N-[(3Z)-3-гидразинилиден-3 фенилпропил]анилин, ДФСА-1, 1-фенил-3-{[3-(трифтор-метил) фенил]амино}пропан-1-он, ДФСА-2, 3-[(2-фторфенил) амино]-1 фенилпропан-1-он, ДФСА-3, 3-[(4-метилфенил)амино]-1 фенилпропан-1-он, ДФСА-4).

Оценку пролиферативной активности веществ на клетках определяли с помощью набора WST-1 фирмы «Millipore» (США) по прописям фир мы-изготовителя. Количество метаболически активных клеток в пробах коррелировало с концентрацией формазана, которую измеряли спек трофотометрически с использованием планшетного ридера при 500 нм.

Для определения цитотоксического действия исследуемых веществ использовали флуоресцентный автоматизированный планшетный ридер CellReporterTM (Genetix/Molecular Devices, Англия). Определение цито токсического эффекта проводили на основании количественного соот ношения популяций живых и мертвых клеток в каждой лунке анализи руемого планшета. С этой целью в каждую лунку планшета добавляли красители DAPI, и йодистый пропидий (окрашивает только мертвые клетки), по протоколам, рекомендуемым производителем.

Фракционирование белков проводили двумерным электрофорезом по О'Фарреллу в модификации [Kovalyov L.I. et al. 1995]. Детекция белков на гелевых пластинах осуществляли Кумасси голубым R-250, азотно кислым серебром и красителем Sypro Ruby.

Для идентификации белковых фракций обработку гелей, гидролиз трипсином и экстракцию пептидов выполняли по протоколам «Центра протеомных исследований» при Институте биомедицинской химии РАМН [Говорун В.М. с соавт. 2003]. Идентификацию белков проводи лась с помощью MALDI-TOF MS, а также в отдельных случаях с по мощью MALDI-TOF MS/MS.

Материалами для ДНК–исследований служили образцы венозной крови жителей России - пациентов с РП (n=79) и здоровых мужчин (n=36), охарактеризованных как этнические русские. Препараты ДНК выделяли фенол-хлороформной экстракцией. Полимеразную цепную реакцию в реальном времени (RT-PCR) в модификации метода выщеп ления 5' концевой метки проводили в приборе фирмы «Applera» (США), модель 7300, используя наборы реактивов - SNP Genotyping Assay Mix (каталожные номера C8339558_10, C_25966232_20, C_1895217_10), а также набор TaqMan Universal PCR Master Mix.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Биотест-системы на основе тканей и культивируемых клеток животных Бесклеточные тест-системы представляли собой цитозольную фрак цию (20 000 g x 20 мин при 4°С) 33% -го гомогената регенерирующей печени или ткани гепатомы белых беспородных крыс - самцов массой 100 - 130 г, содержащихся на стандартном рационе вивария РУДН со свободным доступом к воде, с добавлением необходимых компонентов для проявления активности ОДК. Количество белка в пробах исследуе мых тканей определяли по методу Лоури.

Первую группу исследуемых веществ составили оксиамино аналоги декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина. Вторую группу сформировали из алифатических гомологов путресцина (Пут), спермидина (Сд) и спермина (См).

Эффективность антипролиферативного действия соединений оцени вали по степени торможения синтеза ПА, а также по величине суммар ного пула ПА (ПА) и коэффициента молярного отношения спермиди на к спермину (Сд/См), который положительно коррелирует со скоро стью пролиферации как нормальной, так и опухолевой ткани [Morgan DM, 1999], после одного часа инкубации. Результаты этих исследований представлены в Таблице. 1.

В первой группе тестируемых веществ наиболее активными оказались соединения I и IV. Они не уступали по эффективности действия, а по некоторым показателям даже превосходили ДФМО и МГБГ (Табл. 1).

Соединения второй группы ингибировали синтез ПА в обеих системах с разной степенью эффективности. Но этилендиамин (V) проявил силь ные антипролиферативные свойства по всем выбранным показателям (Сд/См, ПА и уровень Сд), в особенности по отношению к опухолевой ткани.

Таблица. 1. Скорость образования путресцина и ПА на фоне действия синтетических аналогов субстратов и продуктов реакции декарбоксили рования орнитина и S-аденозилметионина в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс.

В-во ОДК Эффект Синтез Эффект Синтез Эффект в% спермидина в% спермина в% Бесклеточная тест-система из регенерирующей печени крыс - 0 0 2.7±0.1 1.29±0.04 0.48±0. ДФМО 1.7±0.1* 0.87±0.02* 0.21±0.01* 37 33 МГБГ 0.9±0.02* 0.31±0.01* 0 26 2.7±0. 1.1±0.1* 0.57±0.01* 0.1±0.01* I 59 56 1.7±0.1* 0.63±0.02* 0.26±0.07* IV 37 51 2.3±0.1* 0.98±0.02* V 15 24 0.32±0. Бесклеточная тест-система из гепатомы Г-27 крыс - 0 0 2.6±0.2 1.1±0.04 0.4±0. ДФМО 2.0±0.1* 0.2±0.01* 23 0 1.1±0. МГБГ 0.97±0.02* 0.35±0.02* 4 22 2.7±0. +9а 2.0±0.1* 0.35±0.02* I 23 1.2±0. 1.5±.01* 0.8±0.01* 0.4±0.01* IV 42 27 1.6±0.1* 0.45±0.01* 0.2±0.03* V 38 59 Примечание. Скорость биосинтеза путресцина и ПА представлена в мккат/кг белка.

Результаты даны в виде M±m для 6 параллельных измерений. * - достоверные отличия от контроля, Р0.05. а – знак “+” обозначает увеличение скорости биосинтеза путресцина и ПА.

Сравнительный анализ степени эффективности двух групп тестируе мых соединений, проведенный на двух модельных бесклеточных систе мах с различными биологическими, но с одинаково высокими пролифе ративными свойствами, показал, что потенциально сильные антипроли феративные агенты должны одновременно существенно снижать ПА, отношение Сд/См и уровень Сд до критического значения (70%). Из числа исследуемых соединений этим требованиям удовлетворяют 1 аминоокси-3-аминопропан (АПА), S-(5-дезоксиаденозил)-S-метил- тиоэтилгидроксиламин (АПА) и этилендиамин.

В дальнейшем характер действия АПА и АМА был изучен на L клетках. Эти вещества индивидуально и в сочетании одного с другим показали эффект, сходный с ДФМО и МГБГ, но менее выраженный.

Данные, полученные на бесклеточных тест-системах и на культурах клеток, указывают на перспективность дальнейших исследований дан ной группы оксиаминопроизводных как новых потенциальных проти воопухолевых веществ.

Биотест-система на основе быстро пролиферирующих клеток че ловека.

Для тестирования функциональной активности препаратов полиами нов использовались быстро пролиферирующие культивируемые клетки рака простаты человека линий LNCaP и PC-3.

Оценку пролиферативной активности клеток определяли с помощью набора WST-1. Адекватность работы данной биотест-системы была проверена с помощью акриламида - маркерного амина, для которого известен выраженный цитотоксический эффект. На данной системе препарат акриламида в концентрациях 300 и 350 мкг/мл после 24 часов инкубации оказывал выраженное цитотоксическое действие на клетки LNCaP, проявляющееся в 2-х и 3-х кратном снижении количества мета болически активных клеток, соответственно.

В дальнейшем эту биотест-систему использовали для определения биологических эффектов, вызываемых двумя известными аналогами полиаминов – ДФМО и МГБГ.

Препарат ДФМО в концентрациях 0,1-200 мкМ после 48 часов инку бации не оказывал выраженного действия на культивируемые клетки рака простаты линий LNCaP и PC-3. С другой стороны, для препарата МГБГ выявлен достоверный цитотоксический эффект на данных кле точных линиях в диапазоне концентраций 100-200 мкМ.

На клетках линии РС-3 было проведено тестирование биологических эффектов четырех новых дифенил-содержащих аналогов полиаминов препаратов ДФСА-1-4. Для проведения тестирования готовили стоко вые растворы препаратов с концентрацией 40 мМ на 0,5% растворе ДМСО, стерилизовали в условиях культурального бокса с использова нием 0,22 мкм фильтров. Из стерильного стокового раствора на культу ральной среде RPMI-1640, содержащей 5% ЭТС, готовили растворы с концентрацией 0,1-400 мкМ. * А единицы опт.плотности 3, * 2, 1, * 0, 0,1 1 10 50 100 контроль концентрация препарата, мкМ Б единицы опт.плотности 2, * 1, 0, * 0,1 1 10 50 100 контроль концентрация препарата, мкМ Рис. 1. А. Биологическое действие препаратов ДФСА-1 и ДФСА-2 на клетки линии РС-3. Б. Биологическое действие препаратов ДФСА-3, ДФСА-4 на клетки линии РС-3. По оси абсцисс – концентрация препарата в мкМоль.

* - достоверные отличия от контроля, Р0. Из представленных данных (рисунок 1А, Б) видно, что препараты ДФСА-1, ДФСА-2 и ДФСА-4 оказываю цитотоксический эффект при концентрации 10 мкМ и выше, в то время как для препарата ДФСА- цитотоксическое действие отмечается при концентрации 50 кМ и выше.

Изучение апоптотического действия полиаминов ДФМО и МГБГ так же проводилось на клеточном сортере CellReporter™ с использованием дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток.

Количественный анализ доли мертвых клеток в контрольных лунках и в лунках с добавлением ДФМО показал отсутствие значимых различий, что сопоставимо с данными, полученными при окраске клеток красите лем WST-1, в то время как после воздействия МГБГ регистрировалось дозозависимое увеличение доли умерших клеток при концентрациях МГБГ 100 и 200 мкМ.

Сформированная биотест-система пригодна для определения функ циональной активности синтетических полиаминов и с использованием наборов WST-1, и с помощью флуоресцентного клеточного ридера CellReporter™, что позволило использовать ее для изучения 4-х новых синтетических аналогов полиаминов.

Протеомный анализ клеток линии РС-3 и изучение биологических эффектов синтетических аналогов полиаминов.

Учитывая полученные данных о способности изучаемых синтетиче ских аналогов полиаминов ингибировать клеточную пролиферацию, представлялось целесообразным исследовать изменения протеомного профиля клеток рака простаты. На первом этапе данного цикла иссле дований был проведен протеомный анализ белков в культивируемых клетках линии РС-3. Типичная двумерная электрофореграмма (ДЭ) суммарных белков, экстрагированных из клеток линии РС-3, представ лена на Рис. 2.

Как видно из этих данных, на ДЭ суммарных белков, экстрагирован ных из клеток линии РС-3, удавалось регистрировать более 500 белко вых фракций при окраске нитратом серебра. Основные из них обладали Мм в диапазоне 170 - 11 кДа и pI от 4,5 до 11,5. С помощью масс спектрометрических методов (MALDI-TOF MS и MS/MS) удалось иден тифицировать 52 белковые фракции.

Среди идентифицированных белков, в первую очередь, надо отметить № 18, который оказался фактически новым белком человека, поскольку для него ранее был обнаружен только соответствующий транскрипт.

Сведения об этом транскрипте, присутствующем в матке, трижды пред ставили японские исследователи по результатам изучения cDNA [запись 193783699 Protein NCBI;

прямое представление - KawakamiB. et al. и Isogai T. and Yamamoto J.)].

Вероятный продукт, который может образоваться при считывании информации с указанного транскрипта, включен в базу данных Protein NCBI под названием «неназванный белковый продукт» (unnamed protein product). Анализ его предполагаемой аминокислотной последовательно сти выявил сходство с митохондриальной аспартатаминотрансферазой (ген - GOT2), что дало основание предполагать принадлежность этого «неназванного белкового продукта» к семейству аминотрансфераз.

Среди идентифицированных белков оказалась также дисульфид изо мераза белков или ER-протеаза, которая ранее была включена в пере чень потенциальных биомаркеров РП [Шишкин С.С. с соавт. 2010].

В целом, полученные результаты протеомного анализа суммарных белковых экстрактов из клеток линии РС-3 были использованы для расширения информационного модуля «Белки РС-3» в отечественной базе данных «Протеомика рака простаты» (версия 2012 г.), которая раз мещена на сайте Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, зарегистри рована в Государственном реестре баз данных (регистрационный номер 2012620676 от 13.07.2012) и доступна для пользователей сети «Интер нет» (адрес: ef.inbi.ras.ru).

Эти результаты стали основой для проведения следующего цикла ис следований, направленных на определение изменений протеомного профиля этих клеток после воздействия двумя синтетическими анало гами полиаминов ДФСА-1 и 2.

Рис. 2. Результаты протеомного анализа суммарных белков клеточной линии РС-3. Типичная ДЭ, окрашенная нитратом серебра. Слева показаны белки-маркеры Мм в кДа (набор ) Фиолетовыми стрелками и цифрами обо значены фракции, идентифицированные методами масс-спектрометрии.

В этих экспериментах клетки РС-3 сначала культивировали в пласти ковых матрацах в среде RPMI-1620 с 20% ЭТС. По достижении 80% мо нослоя проводили смену среды на среду с 5% ЭТС, содержащей иссле дуемые препараты ДФСА-1 или ДФСА-2 в конечных концентрациях мкМ, в которых они обладают цитостатическим эффектом.

После 96 часов инкубации со сменой среды со свежеприготовленными аналогами полиаминов по истечении 48 ч инкубации матрацев клетки отмывали трехкратно холодным фосфатно-солевым буфером и снимали с поверхности культурального пластика скребком для клеток (23 см, Thermo Fisher Scientific, США). Получившуюся клеточную суспензию центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин (Elmi, Латвия), супернатант удаляли. Осадок количественно (около 40 млн. клеток) переносили в пробирки Эппендорф и замораживали при -20С.

При сравнении полученных ДЭ белковых экстрактов из клеток, обра ботанных ДФСА-1, с ДЭ контрольных экстрактов были обнаружены су щественные изменения в распределении белков на двух участках, обо значенных А и Б. Для проведения дальнейшего сравнительного анализа с помощью компьютерной денситометрии требовалось выявить на этих участках общие белковые фракции с помощью масс-спектрометрической идентификации ряда белковых фракций, расположенных на выбранных участках.

Важно отметить, что по результатам масс-спектрометрического анали за (MALDI-TOF MS и MS/MS) один из белков на ДЭ экстрактов из РС- клеток, обработанных ДФСА-1, был идентифицирован как «безымянный белок» из семейства РНК-связывающих белков с RBD доменом (16552153 Protein NCBI). Из Рис. 3 видно, что, несмотря на сравнительно небольшое «покрытие» предсказанной аминокислотной последователь ности выявленными триптическими пептидами (17%), полученный вы сокий показатель «счёта очков» (Score = 235) позволяет считать прове денную идентификацию вполне достоверной.

Регистрация в базе данных Protein NCBI (№16552153) рассматри ваемого «безымянного белка» как представителя семейства РНК связывающих белков с RBD доменом состоялась по материалам изуче ния кДНК, полученных из мононуклеарных клеток периферической кро ви [Isogai T. et al. 24-OCT-2001].

Рис. Результаты масс 3.

спектрометрического анализа белко вой фракции №8 на ДЭ экстрактов из РС-3 клеток, обработанных ДФСА-1, и её идентифицкации с помощью программы Mascot как «безымянный белок» из семейства РНК связывающих белков с RBD доменом А (16552153 Protein NCBI).

Б А- Итоговое сообщение про В граммы;

Б – триптические пепти ды, выявленные при MALDI-TOF MS анализе;

В –– предсказанная последовательность «безымянно го белка», на которой красным цветом выделены выявленные триптические пептиды, синей линией подчеркнуты некоторые пролин (P) и глицин (G) –богатые участки Таким образом, полученные результаты протеомного исследования клеток РС-3 являются первой прямой регистрацией человека белка с указанными свойствами, которые подтверждают сделанное ранее пред положение японских авторов по материалам изучения кДНК.

Рис. 4. Результаты сравнительного протеомного анализа фрагментов Б на ДЭ белковых экстрактов из клеток без воздействия (контроль) и белковых экстрак тов из клеток, подвергавшихся воздействию ДФСА-1 и ДФСА-2. Справа изо бражения ДЭ, слева трехмерные модели, построенные с помощью программы ImageMaster 2D Platinum 7.0 (фирма «Genebio», Швейцария).

Синими стрелками и символами показаны основные реперные белки (SFPQ фактор сплайсинга, содержащий пролин-глутаминовый тракт;

PABP - поли(А) связывающий цитоплазматический белок 1;

зелеными стрелкам и символами SNW – SNW домен содержащий белок 1, количественно увеличившиеся под действием ДФСА-2;

фиолетовыми стрелками – белки №8 и 9, появившиеся под действием ДФСА-1 и ДФСА-2. Пунктирными овалами (фиолетового цвета) вы делены области на контрольной ДЭ, где отсутствуют белковые фракции, инду цируемые ДФСА-1 и ДФСА-2.

В целом, сравнительный протеомный анализ указанных фрагментов А и Б на ДЭ белковых экстрактов из клеток, не подвергавшихся воздейст вию синтетическими аналогами полиаминов (контроль) и белковых экс трактов из клеток, подвергавшихся воздействию ДФСА-1 и 2, пока зал несколько специфичных изменений в белковых профилях, вызванных этими соединениями.

Во-первых, ДФСА-1, обладающий значимым цитостатическим эф фектом при концентрации 10 мкМ, существенно индуцировал синтез винкулина, тогда как ДФСА-2 в той же концентрации с небольшим ци тостатическим действием) не оказывал влияния на содержание винкули на. Во-вторых, под действием ДФСА-1 в клетках РС-3 появлялась до полнительная белковая фракция, которая была идентифицирована как АТФ-аза транзита эндоплазматического ретикулума. В-третьих, этот синтетический аналог полиаминов приводил к исчезновению неиденти фицированного белка, располагавшегося между HSPD1 и HSPA9 на кон трольных ДЭ. При этом белок с близкими электрофоретическими свой ствам выявлялся после воздействия ДФСА-2. На фрагментах Б под дей ствием ДФСА-1 (а также и ДФСА-2) появлялись два дополнительных по сравнению с контролем белка №8 и 9 (Рис. 4). ДФСА-2 обладал более выраженным индуцирующим эффектом в отношении белков №8 и 9.

Кроме того, регистрировалось количественное увеличение ещё одной фракции, идентифицированный как SNW домен содержащий белок 1.

Интересно то, что все три изменяющиеся белковые фракции, которые удалось идентифицировать на фрагментах Б, связаны (или могут быть связаны) с процессами созревания мРНК, включая сплайсинг. Тем са мым эти данные позволяют думать, что ДФСА-1 и ДФСА-2 способны влиять на биосинтез белков.

По результатам модельных экспериментов и протеомного анализа белков клеток РС-3 определены шесть белков, количественно изменяю щихся под действием ДФСА-1 и 2.

Изучение полиморфизма генов PAOX, SAT1 и FMN1 в выборке па циентов c раком простаты и у здоровых россиян.

Изучение однонуклеотидных замен в трех генах - SAT1 и PAOX, коди рующих ключевые ферменты метаболизма полиаминов (сперми дин/спермин N-ацетилтрансферазу и полиаминоксидазу, соответствен но) и FMN1, кодирующего формин 1, проводили методом дискримина ции аллелей на амплификаторе в реальном времени фирмы Applied Bio systems RT-PCR 7300 с использованием наборов TaqMan (C25966232_20, C8339558_10, С_16193337_10) и набора для ампли фикации TaqMan Universal PCR Master Mix, No Am-pEraseUNG.

Проведенное исследование, охватившее более ста лиц (т.е. более соответствующих генов) показало, что в изученных выборках в сайте rs61748925 присутствовал только аллель G, а в сайте rs1139915 только аллель T. Было установлено, что у этнических русских сайты rs SAT1 и rs1139915 PAOX являются мономорфными и не пригодны для изучения ассоциаций с РП. В отличие от этого для сайта rs11072170 в гене FMN1 удалось выявить достаточно выраженный полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % анализируемых образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% – по аллелю A, и 52.8% - являлись ге терозиготными. Соответственно, полиморфный сайт rs11072170 пред ставляется перспективным для изучения у русских возможных ассоциа ций его аллелей с РП.

ВЫВОДЫ 1. Изучено влияние на общий пул природных полиаминов, на соотно шение спермидина к спермину и синтез полиаминов в условиях бескле точной системы у ряда синтетических аналогов полиаминов: ДФМО, МГБГ, o-замещенных гидроксиламинов и алифатических гомологов природных полиаминов. Показано, что соединения 1-аминоокси-3 аминопропан, S-(5-дезоксиаденозил)-S-метил--тиоэтилгидроксиламин и этилендиамин обладают максимальным эффектом по изучавшимся критериям.

2. В модельных условиях (на культивируемых L-клетках) О замещенные производные гидроксиламины (1-аминоокси-3 аминопропан и 5-дезоксиаденозил-5-метилтиоэтилгидроксиламин) по казали себя как антипролиферативные агенты.

3. Разработана биотест-система на основе быстро пролиферирующих, культивируемых клеток человека (биотест-объекты - клетки LNCaP и РС-3;

метод тестирования – витальная система регистрации количества клеток). С её помощью определены биологические эффекты, вызывае мые двумя известными синтетическими полиаминами (ДФМО и МГБГ) и четырьмя новыми синтетическими дифенил-содержащими аминами (ДФСА 1-4).

4. Наиболее выраженное антипролиферативное действие выявлено у ДФСА-1 (80% ингибирование роста клеток при 10 мкМ концентрации), тогда как ДФМО (в диапазоне концентраций 10-400 мкМ) не проявлял функциональной активности, а у МГБГ был зарегистрирован цитотокси ческий эффект только в концентрациях 200-400 мкМ, что позволяет рас сматривать ДФСА-1 как наиболее перспективный цитотоксический агент.

5. По результатам протеомного анализа белков клеток РС-3:

а) выявлено два новых («безымянных») белка человека;

б) определены шесть белков, количественно изменяющихся под действием ДФСА-1 и ДФСА-2;

в) расширен информационный модуль в отечественной базе данных «Протеомика рака простаты».

6. По результатам изучения полиморфизма (однонуклеотидных замен) установлено, что у этнических русских сайты rs61748925 SAT1 и rs1139915 PAOX являются мономорфными и они не пригодны для изу чения ассоциаций с РП;

в отличие от этого для сайта rs11072170 в гене FMN1 удалось выявить достаточно выраженный полиморфизм со сле дующими характеристиками: 19.4 % анализируемых образцов были го мозиготны по аллелю G, 27.8% – по аллелю A, и 52.8% - являлись гете розиготными, что позволяет считать его перспективным для изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.

Работа выполнялась в рамках Государственных контрактов № 2.1.1./ 5939 и № 2.1.1./ 11377 «Исследование технологий по созданию новых классов противоопухолевых средств на базе обмена полиаминов как сис темы опосредованной регуляции химическими веществами процессов клеточной и опухолевой пролиферации и дифференцировки» аналитиче ской ведомственной целевой программы “Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)” ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Гридина Н.Я., Неборак Е.А., Шевкун Н.А., Сокуева Н.А., Устинова Е.В., Сокуев Р.И. Влияние химических аналогов поли аминов, декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина на скорость синтеза полиаминов в тест-системах из тканей с повышенной пролиферацией // Вестник РУДН. Серия МЕДИЦИНА. – 2010. - № 3, С. 9-14.

2. Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Гридина Н.Я. Неборак Е.А., Шевкун Н.А., Со куева Н.А., Устинова Е.В., Сокуев Р.И. Влияние химических аналогов декарбок силированного орнитина и S-аденозилметионина на рост L-клеток в культуре ткани // Вестник РУДН. Серия МЕДИЦИНА. – 2010. - № 4, С. 26-31.

3. Сяткин С.П., Неборак Е.В., Федорончук Т.В., Шевкун Н.А., Левов А.Н., Р.И., Сокуева Н.А. Прогнозирование антипролиферативных свойств производных анилинового ряда диоксаборининопиридина путем оценки их влияния на ско рость окислительного дезаминирования путресцина и полиаминов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии,, 2011. - №10, С. 53-56.

Другие печатные материалы:

4. Сяткин С.П., Левов А.Н., Федорончук Т.В., Неборак К.В., Шевкун Н.А., Усти нова Е.В., Сокуев Р.И., Сокуева Н.А. Прогноз канцерогенных и антипролифера тивных свойств производных диоксаборенинопиридина и анилина // Труды XVIII Международной конференции и дискуссиионного научного клуба Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии.

ТОМ 1. IT + M&Ec;`2010. Украина, Ялта-Гурзуф, c 31 мая по 9 июня 2010 года.

5. Syatkin, S.P., Fedoronchuk, T.V., Gridina. N.Ya., Neborakh, E.A., Shevkhun, N.A., Sokueva, N.A., Ustinova, E.V., Sokuev, R.I. The influence of chemical polyamines analogues, decarboxylated ornithine and S-(adenosyl)-methionine on the polyamine synthesis velocity in test-systems from tissues with high proliferation // International polyamine conference. Gotemba, Shizuoka, Japan, June 14 – June 18, 2010. P. 102 103.

6. Syatkin S, Shevkun N, Fedorontchuk T, Neborak E, Sokueva N, Sokuev R, Usti nova E. Activators of polyamine oxidative deamination as the potential antitumor agents // 2nd International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases, Rome, Italy, December, 2010. Р. 213- 7. Syatkin S, Shevkun N, Levov A, Golomazova K, Neborak E, Sokueva N, Sokuev R, Fedorontchuk T, Ustinova E. Prediction of carcinogenic and antiproliferative proper ties of benzimidazole, azofluorene, dioxaboreninopyridine and aniline derivatives by their effects on the polyamine oxidative deamination // 2nd International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases, Rome, Italy, December, 2010. Р. 209- 8. Shevkun N., Neborak E, Sokueva N, Sokuev R, Golomazova K, Fedoronchuk T.

Screening of N-heterocyclic compounds and aniline derivatives for their effects on the aminooxidases in vitro // IV International Scientific Conference Science4health, Mos cow, Russia, April, 2012. P. 53.

9. Shevkun N, Fedoronchuk T, Neborak E, Sokueva N, Sokuev R. Targeting poly amine catabolism in malignant hepatic tissue // IV International Scientific Conference Science4health, Moscow, Russia, April, 2012. P. 54.

10. Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Шевкун Н.А., Неборак К.В., Сокуев Р.И., Со куева Н.А. Противоопухолевая активность активаторов окислительного дезами нирования полиаминов. // XX Юбилейная международная конференция и дис куссионный научный клуб. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 5 – 15 июня 2012 г. - c. 98-99.

11. Syatkin S., Neborak E., Shevkun N., Sokueva N., Sokuev R., Golomazova K., Fedoronchuk T. Screening of n-heterocyclic compounds and aniline derivatives fro their effects on the amine oxidases in vitro as useful tools for prediction of carcino genic and antiproliferative activity // International Congress on Polyamines, Istanbul, Turkey, September, 2012. - P. 34.

12. Syatkin S., Fedoronchuk T., Neborak E., Sokueva N., Sokuev R., Shevkun N. An titumor activity of activators of polyamine oxidative deamination during hepatocar cinogenesis // International Congress on Polyamines, Istanbul, Turkey, September, 2012.

Abstract

book. – p. 225 – 226.

13. Cяткин С.П., Федорончук Т.В., Шевкун Н.А., Неборак К.В., Сокуев Р.И., Со куева Н.А. Противопухолевая активность активаторов окислительного дезами нирования полиаминов // Новые информационные технологии в медицине, био логии, фармакологии и экологии. 2012. С. 19.

14. Шевкун Н., Неборак Е., Сокуева Н., Сокуев Р., Голомазова К., Федорончук Т.

Скрининг N-гетероциклических и анилиновых производных по влиянию на ами нооксидазы in vitro. // SCIENCE4HEALTH 2012. Клинические и теоретические аспекты современной медицины.: Материалы IV Международной научной кон ференции. 18 – 21 апреля 2012 г., РУДН, Москва. – М.: РУДН. 2012. – C. 57-58.

15. Шевкун Н., Федорончук Т., Неборак Е., Сокуева Н., Сокуев Р. Катаболизм полиаминов при карциногенезе печени как мишень для поиска новых противо раковых соединений // SCIENCE4HEALTH 2012. Клинические и теоретические аспекты современной медицины.: Материалы IV Международной научной кон ференции. 18 – 21 апреля 2012 г., РУДН, Москва. – М.: РУДН. 2012. – 58-59 сс.

16. Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Шевкун Н.А., Неборак К.В., Сокуев Р.И., Со куева Н.А. Активаторы окислительного дезаминирования как потенциальные противоопухолевые агенты // Scientific and educational journal: Материалы кон ференции «Health and education millenium»: 2012. РУДН. Москва. – М.: РУДН.

2012. - Т. 14 [2]. С. 58.

17. Сокуева Н.А., Крахмалева И.Н., Лисицкая К.В., Шишкин С.С. Изучение по лиморфизма генов PAOX, SAT1 и FMN1 // Материалы XIV Всемирного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке», 2012. РУДН. Москва. – М.: РУДН. 2012. С. 58.

Сокуева Наталья Александровна Изучение цитостатических свойств и других биологических эффек тов некоторых синтетических полиаминов в модельных системах В данной работе проводилось изучение биологических эффектов ряда синтетических аналогов полиаминов на бесклеточной тест-системе, по лученной из регенерирующей печени и клеток гепатомы крыс и на кле точных тест-системах (клетки линий рака простаты PC-3 и LNCaP). C помощью протеомного анализа было показано влияние 2-х препаратов синтетических аналогов полиаминов на белковый профиль клеток линии PC-3.

Sokueva Natalia Aleksandrovna The study of cytostatic and other biological effects of some synthetic pol yamines in model systems This work is devoted to the study of biological effects of a number of syn thetic polyamine analogues on cell-free test systems obtained from regenerat ing liver and hepatoma cells of rats, as well as on cellular test systems (the cells of prostate cancer cell lines PC-3 and LNCaP). The influence of two preparations of synthetic polyamine analogues on the protein profile of PC- cells was studied using proteomic analysis.