Учебное учреждение белорусский государственный медицинский университет удк 612.014.482:616.69 кузнецова вера борисовна морфо-функциональная характеристика гистаминергических нейронов гипоталамуса крыс
1 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ВЕДУЩЕЕ ВЫСШЕЕ УЧЕБНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» УДК 612.014.482:616.69 КУЗНЕЦОВА ВЕРА БОРИСОВНА МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИСТАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ГИПОТАЛАМУСА КРЫСЫ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Минск - 2004 Работа выполнена в Гродненском государственном медицинском 2 университете Научный руководитель:доктор биологических наук, профессор Зиматкин С.М. за ведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриоло гии Гродненского государственного медицинского уни верситета.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Института физиологии НАН Беларуси Арчакова Л.И.
доктор медицинских наук, профессор кафедры нормальной анатомии Белорусского государственного медицинского университета Руденок В.В.
Оппонирующая организация: Гомельский государственный медицинский университет Защита состоится 31 марта 2004 года в 15 часов на заседании совета по защите диссертаций Д 03.18.03 при Белорусском государственном медицинском уни верситете (220116, г. Минск, пр. Дзержинского, 83, т. 272-55-98).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Белорусского государ ственного медицинского университета.
Автореферат разослан “ ” 2004 г.
Ученый секретарь совета по защите диссертаций, кандидат медицинских наук, доцент Манулик В.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации. Центральный гистамин участвует в регуляции различных функций, систем и реакций организма: нейроэндокрин ной и сердечно-сосудистой систем, кровотока мозга, температуры тела, сна и бодрствования, пищевого и питьевого поведения, памяти и обучения, и др.
Предполагается участие гистамина мозга в патогенезе многих патологических состояний и заболеваний: мышечная слабость, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, эпилепсия, морфиновая наркомания, и др. [Panula P. et al., 2000, Haas H. et al., 2003, Onodera K. et al., 1994, Schwartzt J. C. et al., 1991, Yamato dani A. et al., 1991].
Биохимические и электрофизиологические исследования, методы пере резки мозга и введения метки доказали существование центральной гистами нергической нейронной системы, с расположением тел гистаминергических нейронов и единственного места синтеза нейронального гистамина - в заднем гипоталамусе [Blier R. et al., 1979]. С получением антител против фермента биосинтеза гистамина гистидиндекарбоксилазы (ГДК) и самого гистамина ста ла возможной прямая иммуногистохимическая демонстрация гистаминергиче ских нейронов и описание их локализации в головном мозге [Panula P. et al., 1984, Watanabe T. et al., 1984]. Вместе с тем пространственная организация и морфофункциональные особенности гистаминергических нейронов головного мозга животных и человека в нормальных условиях изучены недостаточно. По этому в настоящей работе выполнялась пространственная реконструкция гис таминергических ядер, оценивались их объём, а также количество, размеры и форма, ультраструктурные и гистохимические особенности расположенных в них нейронов. Это определяет важность и актуальность настоящего исследова ния для современной биологии и медицины, нейрогистологии, нейрохимии и клеточной биологии.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Работа выполнялась в рамках Государственной научной программы фундаментальных исследований «Регуляция и патогенез» (2002-2005 гг., № гос. регистрации 20021620).
Цель и задачи исследования. Выяснить пространственную организацию гистаминергических ядер гипоталамуса крысы, дать структурно метаболическую характеристику их нейронов.
В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:
1. Оценить возможность применения гистохимического метода выяв ления активности моноаминооксидазы Б (МАО Б) для исследования гистами нергических нейронов в мозге крысы.
2. Установить пространственную организацию и топографию гиста минергических нейронов и их скоплений (ядер) в гипоталамусе крысы.
3. Оценить объём гистаминергических ядер гипоталамуса крысы;
дать сравнительную морфометрическую оценку образующих их нейронов.
4. Выявить гистохимические особенности нейронов разных гистами нергических ядер мозга крысы, сравнить их с нейронами аркуатного ядра гипо таламуса.
5. Дать электронно-микроскопическую характеристику нейронам гис таминергических ядер гипоталамуса крысы.
Объект и предмет исследования. Объектом исследования служили кры сы-самцы Вистар. Предметом исследования служили нейроны гистаминергиче ских ядер гипоталамуса. Исследование проведено на 50 животных.
Гипотеза. МАО Б может быть хорошим маркёром гистаминергических нейронов и их скоплений (ядер) в гипоталамусе крысы. Гистаминергические нейроны мозга крысы имеют специфическую пространственную организацию, строение и метаболизм. Их популяция гетерогенна: нейроны разных гистами нергических ядер различаются по плотности расположения, размерам, форме и метаболизму.
Методология и методы проведенного исследования. В работе исполь зованы нейрогистологический, иммуногистохимический (исследование гиста мина в мозге), гистохимический (выявление активности ферментов), цитофото метрический, морфометрический (оценка размеров и формы нейронов при по мощи компьютерного анализатора изображения Биоскан), электронно микроскопический, компьютерное моделирование и статистический методы исследования.
Научная новизна и значимость полученных результатов: Впервые создано интегральное трёхмерное компьютерное изображение гистаминергиче ских ядер гипоталамуса крысы, которое можно изучать в любых проекциях.
Установлено, что эти ядра пространственно взаимосвязаны между собой, по степенно переходят одно в другое и в совокупности образуют геометрическую фигуру сложной конфигурации. Впервые вычислен объём всех гистаминерги ческих ядер, плотность расположения и абсолютное количество в них нейро нов. Впервые установлена неоднородность популяции гистаминергических нейронов гипоталамуса крысы (нейроны разных ядер различались по размерам, форме, активности ферментов). Дана электронно-микроскопическая характери стика нейронам гистаминергического ядра Е2 гипоталамуса крысы, которая подтверждает их высокую метаболическую и функциональную активность.
Практическая значимость полученных результатов. Установлена возможность применения гистохимического метода на выявление активности МАО Б для выявления и исследования гистаминергических нейронов и их ско плений (ядер) в мозге крысы. Разработан способ подготовки тканей для элек тронно-микроскопического исследования гистаминергических ядер и других мелких структур мозга. Предложенный комплекс структурно-метаболических оценок и полученная характеристика гистаминергических нейронов головного мозга могут являться базовыми для дальнейшего изучения гистаминергической нейрональной системы мозга, как в норме, так и при различных эксперимен тальных воздействиях у животных и патологических состояниях у человека.
Возможная область применения: медицина, гистология, цитология, кле точная биология, нейрохимия, нейроморфология, неврология. Результаты ис следования внедрены в научную работу кафедры гистологии и ЦНИЛ ГГМУ и биомедицинского исследовательского центра Университета Хельсинки, оформ лены две заявки на изобретения.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Гистохимический метод выявления активности моноаминооксида зы (МАО) Б может быть использован для исследования гистаминергических нейронов и их скоплений (ядер) в гипоталамусе крысы. Предложенный способ выявления гистаминергических нейронов проще, дешевле, доступней и воспро изводимей, чем классический иммуногистохимический метод на гистамин.
2. Созданное интегральное трёхмерное компьютерное изображение гистаминергических ядер гипоталамуса крысы позволило показать пространст венные взаимосвязи и единство популяции гистаминергических нейронов.
3. Общий двухсторонний объём гистаминергических ядер гипотала муса крысы составляет 499,4х106±27,2х106 мкм3. Размеры отдельных его ком понентов (ядер) значительно различаются. По плотности расположения нейро нов в гистаминергических ядрах выделены компактные (Е1-Е3), промежу точный (Е4) и диффузный (Е5) компоненты. Популяция гистаминергических нейронов неоднородна по их размерам и форме: большинство нейронов группы Е5 отличаются крупными размерами и веретеновидной формой по сравнению с нейронами ядер Е1-Е3, обладающими средними размерами и округлой формой, нейроны ядра Е4 по форм - фактору и фактору элонгации занимают промежу точное положение.
4. Нейроны гистаминергических ядер значительно отличаются по ак тивности окислительных ферментов от нейронов дофаминергического аркуат ного ядра гипоталамуса крысы. Нейроны различных гистаминергических ядер гипоталамуса крысы отличаются по активности дегидрогеназ и МАО Б: актив ность этих ферментов в нейронах ядра Е2 максимальна, а в Е5 - минимальна.
Нейроны внутри каждого гистаминергического ядра также метаболически гете рогенны.
5. Ультраструктура нейронов ядра Е2, изученная на основе разрабо танного метода подготовки образцов мозга для электронно-микроскопического исследования гистаминергических ядер гипоталамуса крысы, подтверждает их высокую метаболическую и функциональную активность.
Личный вклад соискателя. Экспериментальная и методическая часть ра боты выполнены лично диссертантом. Данные, полученные при гистологиче ских, гистохимических, иммуногистохимических, морфометрических, цитос пектрофотометрических и электронно-микроскопических исследованиях обра батывались соискателем самостоятельно. Трёхмерная компьютерная реконст рукция гистаминергических ядер гипоталамуса проводилась совместно с аспи рантом кафедры физики Гродненского государственного университета О. Н.
Стриком. Выбор темы исследования, постановка задач исследования и плани рование экспериментов, обсуждение результатов исследования проводилось совместно с научным руководителем.
Апробация результатов диссертации. Фрагменты работы обсуждались на заседаниях кафедры гистологии ГрГМУ, анатомической конференции, по священной 45-летию кафедры анатомии ГрГМУ, научно-практической конфе ренции студентов и молодых учёных «Актуальные вопросы современной меди цины и фармации» (Витебск, 2003), научно-практической конференции студен тов и молодых учёных, посвященной памяти академика Ю.М. Островского (Гродно, 2003), заседании кафедр медико-биологического профиля и ЦНИЛ ГрГМУ, а также профильных кафедр аграрного биофака ГрГМУ (Гродно, 2004), заседании кафедр медико-биологического профиля БГМУ (Минск, 2004).
Опубликованность результатов. По данной теме опубликовано 8 пе чатных работ: (6 статей и 2 тезиса), поданы 2 заявки на изобретение, 3 статьи находятся в печати.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из «Перечня ус ловных обозначений», «Введения», «Общей характеристики работы», глав I – IV («Обзор литературы», «Материал и методы исследования», «Результаты собственных исследований», «Анализ и обобщение результатов исследова ния»), «Заключения» и «Списка использованных источников». Работа изложена на 98 страницах, включая 16 таблиц и 62 рисунка. Список использованных ис точников литературы включает 134 источников, из них 122 зарубежных.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Исследования проведены на 50 белых крысах – самцах линии Вистар в возрасте 3-4 мес., массой 190-210 г. Животных содержали в стандартных усло виях вивария, на полноценном рационе. Соблюдались все правила гуманного обращения с животными. Декапитацию животных, находящихся под глубоким эфирным наркозом, проводили с 900 до 1100 утра. Быстро вскрывали черепную коробку, извлекали головной мозг и выделяли из него гипоталамус. Образцы мозга, предварительно выдержав в парах азота, замораживали путем погруже ния в жидкий азот, где хранили до начала исследования. Серийные криостат ные фронтальные срезы гипоталамуса толщиной 20 мкм готовили при –150С.
Во всех исследованиях в каждой экспериментальной группе использовали не менее 5 животных с количественной и качественной оценкой не менее 700 ней ронов для морфометрических исследований, 450 нейронов для гистохимиче ских исследований и 100 – для электронно-микроскопических исследований гистаминергических ядер гипоталамуса каждого животного. Это обеспечило достаточный объём выборки для последующего количественного анализа.
Для выяснения того, какая часть нейронов гистаминергических ядер ги поталамуса (Е1-Е5) являются МАО Б-активными (с высокой активностью МАО Б), серийные криостатные срезы окрашивали на МАО Б по методу Зиматкина, Цыдика (1994) и 0,1% раствором толуидинового синего по Нисслю. Получен ные препараты изучали параллельно с помощью микроскопа Biolar при разных увеличениях. Сравнивали расположение, форму, размеры и количество нейро нов в области Е1-Е5 гистаминергических ядер на срезах обработанных на МАО Б и окрашенных по Нисслю. Затем вычисляли % МАО Б-позитивных нейронов по отношению к общему числу нейронов, окрашенных по Нисслю, в соответст вующей зоне и на соответствующей площади ядра.
Для выяснения того, какая часть гистаминиммунопозитивных нейронов в области локализации гистаминергических ядер гипоталамуса (Е1- Е5) соответ ствует МАО Б-активным нейронам, выделенный гипоталамус фиксировался часа в 4% растворе 1-этил-3-(3-диметил-аминопропил)-карбодимида (EDAC) с последующим помещением в 20% р-р сахарозы. Далее материал подвергался быстрому замораживанию в жидком азоте, соседние серийные криостатные срезы гипоталамуса толщиной 20мкм окрашивали на МАО Б и иммуногисто химичеким методом с антителами против гистамина. Использовали метод им мунофлюоресценции: инкубация с FITC-коньюгатом (разведение 1:40 в PBS-T), с предварительным мечением гистаминовыми антителами (НА 19С (разведение 1:1000, 1:2000)). Затем препараты заключали в PBS-глицерол (1:1) и хранили в холодильнике (+4). Полученные гистохимические и иммуногистохимические препараты изучали параллельно с помощью универсального исследовательско го микроскопа Axioplan (Карл Цейс, Германия) при разных увеличениях. Срав нивали расположение, форму, размеры и количество нейронов в области Е1-Е гистаминергических ядер на срезах обработанных на МАО Б и иммунофлюо ресцентным методом с использованием антител против гистамина. Затем вы числяли % МАО Б-позитивных нейронов по отношению к общему числу гис таминергических нейронов, окрашенных на выявление гистамина, в соответст вующей зоне и на соответствующей площади ядра.
Идентификацию структур головного мозга крысы осуществляли по схе мам стереотаксического атласа [Paxinos G. еt al., 1986]. Для идентификации ядер гистаминергической нейронной системы мозга крысы использовали соот ветствующие топографические схемы скоплений (ядер) гистаминергических нейронов [Inagaki N. еt al., 1990].
Для трёхмерной компьютерной реконструкции гистаминергических ядер гипоталамуса, расположение каждого МАО Б-активного нейрона, видимое в гистохимических препаратах, с помощью манипулятора «мышь» вносили на экране монитора компьютера в соответствующие электронные схемы фрон тальных срезов головного мозга крысы из стереотаксического атласа [Paxinos G. et al., 1986]. Таким образом, создавалась база данных пространственного расположения МАО Б-активных нейронов в мозге крысы, которая использова лась компьютерной программой для их интегральной трехмерной визуализации и реконструкции гистаминергических ядер гипоталамуса.
Для определения объёма, гистаминергические ядра рассматривали в виде суммы усечённых конусов, малое и большое основания которых были пред ставлены площадями гистаминергических ядер, выявляемых на соседних сре зах. При этом высоты этих усечённых конусов являлись расстоянием между срезами. Объём каждого гистаминергического ядра, рассчитывался исходя из суммы составляющих его объёмов усеченных конусов.
На серийных криостатных срезах проводился подсчёт количества МАО Б-активных нейронов на 1 мм2 площади среза во всех гистаминергических яд рах гипоталамуса (плотность их расположения).
Подсчёт абсолютного количества нейронов в гистаминергических ядрах проводился с помощью методики определения количества микрообъектов [Ав тандилов Г.Г. и др., 1981].
При помощи компьютерного анализатора изображения Биоскан (Рес публика Беларусь), определяли размеры (максимальный и минимальный диа метры, периметр, площадь, объем) и форму (форм-фактор и фактор элонгации) МАО Б-активных нейронов гистаминергических ядер гипоталамуса крысы.
Для изучения особенностей метаболизма нейронов различных гистами нергических ядер, серийные криостатные срезы гипоталамуса толщиной мкм, монтировали на предметные стекла и обрабатывали на выявление актив ности оксидоредуктаз, связанных с циклом Кребса – сукцинатдегидрогеназы (сукцинат: акцептор – оксидоредуктаза;
КФ 1.3.99.1) [Nachlas M. M., 1957];
с гликолизом – лактатдегидрогеназы (L-лактат: НАДН-оксидоредуктаза;
КФ 1.1.1.27) [Hess R. et al., 1958];
с транспортом электронов – дегидрогеназы вос тановленного НАД (НАДН ДГ) (НАДН: акцептор – оксидоредуктаза;
КФ 1.6.99.3) [Nachlas M. M. et al, 1958] с пентозофосфатным путем –глюкозо-6 фосфат дегидрогеназы (Г-6-Ф ДГ) (D-глюкозо–6-фосфат: НАДФ оксидоредуктаза;
КФ 1.1.1.49) [Hess R. et al., 1958], дегидрогеназы востанов ленного НАДФ (НАДФН ДГ) [Hess R. et al., 1958]. Параллельно, на срезах изу чали активность МАО Б - ключевого фермента метаболизма гистамина [Зимат кин С.М., Цыдик В.Ф., 1994].
Для количественной оценки активности изучаемых ферментов проводили цитофотометрию всех гистохимических препаратов на максимуме поглощения окрашенного продукта реакции - формазана (длина волны - 580 нм) с использо ванием микроабсорбциометр-флюориметра для тонкослойной хроматографии адаптированного для изучения биологических объектов МФТХ – 2М (ЛОМО, Россия).
Для электронно-микроскопического исследования выбрано гистаминер гическое ядро Е2, как самое репрезентативное (с наибольшим количеством гис таминергических нейронов). После декапитации крысы, быстро вскрывали че репную коробку, извлекали головной мозг, выделяли гипоталамус, заморажи вали в жидком азоте. Два фронтальных криостатных среза гипоталамуса, тол щиной 20 мкм и 60 мкм, готовили при –150С на уровне Р – 3.80 (3,8 мм кзади от Брегмы). Первый срез монтировали на предметное стекло, быстро расправ ляли и размораживали, а затем подсушивали при комнатной температуре. Затем его окрашивали на выявление МАО Б [Зиматкин С.М., Цыдик В.Ф.,, 1994].
Второй срез в камере криостата помещали в предварительно охлаждённый до +4 оС 1% Os-фиксатор. После чего его извлекали из камеры криостата во фла коне с фиксатором и фиксировали в течение 2 часов при +4 оС в двух порциях 1% Os-фиксатора, приготовленного на буфере Миллонига (рН 7,4) [Millonig G.
et al., 1961]. В дальнейшем, после промывки в растворе (буфер Миллонига (рН 7,4) (20мл) + сахароза (900мг)), проводили обезвоживание этих срезов в 50% и 70% спиртах. После этого, под контролем маркированного среза (окрашенного на выявление МАО Б), в них выделяли зоны содержащие изучаемое гистами нергическое ядро Е2 гипоталамуса. Далее материал выдерживали 12 часов в холодильнике при +4оС в 2% уранилацетате на 70 спирте. Обезвоживание ма териала проводили в спиртах возрастающей концентрации, смеси ацетона и спирта, ацетоне, после чего его заключали в заливочную смолу, с предвари тельной проводкой через смеси смолы (аралдит М + аралдит Н + дибутилфта лат + ДМР-30) и ацетона. Срезы изготавливали на ультрамикротоме МТ- (США). На окрашенных метиленовым синим полутонких срезах уточняли ло кализацию гистаминергического ядра Е2. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом [Watson M. L. et al., 1958] и цитратом свинца [Reynolds E. S. et al, 1963]. Сеточки со срезами опускали в каплю уранилацетата на 30 мин. под темной крышкой при комнатной температуре. Затем промывали 500 спиртом сек. и двух порциях бидистилированной воды по 5 сек. Контрастировали цитра том свинца – 10 мин. Затем срезы промывали в 3-х порциях воды по 5 сек. По лученные препараты изучали в электронном микроскопе ПЭМ-100 (Украина).
Микрофотографии изготавливали при помощи цифровой видеокамеры Cannon S45 (Япония) с разрешением 4 мегопикселя.
Результаты морфометрических и цитофотометрических исследований об рабатывали статистически с помощью лицензионной компьютерной программы Statistiсa 6.0 для Windows.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Гистотопография и количественный анализ МАО Б-активных (гис таминергических) нейронов гипоталамуса крысы.
Установлено, что МАО Б является ключевым ферментом метаболизма гистамина в мозге, где отсутствует гистаминоксидаза (гистаминаза), окисляю щая до 40% гистамина на периферии. Метаболизм является единственным спо собом удаления гистамина после завершения нейропередачи гистаминергиче скими нейронами мозга, поскольку система обратного захвата гистамина в них отсутствует [Panula P. et al., 1984, Schwartz J.-C. et al., 1991], в отличие от дру гих аминергических нейронов, имеющих специфические транспортёры своих медиаторов. Это послужило предпосылкой изучения возможности использова ния МАО Б в качестве меркёра гистаминергических нейронов. Результаты на ших исследований показали практически полное совпадение МАО Б-активных (с высокой активностью МАО Б, выявляемой гистохимически) и гистаминим мунореактивных нейронов (выявляемых иммуногистохимически) в гипотала мусе крысы, как по количеству, так и по качественным признакам (форме, раз меру, расположению). Следовательно, МАО Б является хорошим маркёром гистаминергических нейронов мозга крысы, в частности для их подсчёта, оцен ки размеров и формы. Результаты наших исследований также показали, что почти все нейроны (90 - 100%) известных гистаминергических ядер (Е1 -Е5) мозга крысы являются МАО Б-активными. Поэтому, гистохимический метод выявления активности МАО Б может быть использован в качестве маркёра для компьютерной реконструкции гистаминергических ядер гипоталамуса (Рис. 1) и вычисления их объёма.
А.
Рис. 1.
А. Компьютерные изобра жения гистаминергиче ских ядер гипоталамуса в трёх плоскостях.
Б. Компьютерное изобра жение гистаминергических ядер на схеме сагиттально го среза мозга крысы [Pax inos G. et al., 1986].
Б.
Следует отметить, что гистохимический метод выявления МАО Б активных нейронов является более воспроизводимым, менее трудоёмким и продолжительным, а также более экономичным, чем иммуногистохимические методы выявления гистаминергических нейронов с использованием в качестве маркёров гистамина и гистидиндекарбоксилазы. Кроме того, гистохимический метод на МАО Б не требует предварительной специфической фиксации тканей и использования малодоступных реактивов.
Результаты трёхмерной компьютерной реконструкции гистаминерги ческих ядер гипоталамуса крысы показали, что они взаимосвязаны между со бой, постепенно переходят одно в другое и в совокупности образуют геометри ческую фигуру сложной конфигурации (Рис. 1). На основании этого можно ут верждать, что все гистаминергические нейроны мозга образуют пространст венно единую клеточную популяцию, которая может иметь единый источник клеточного развития в заднем гипоталамусе, из которого могла происходить их миграция в ростральном направлении. Это соответствует мнению других учё ных [Ericson H. et al., 1987, Inagaki N. et al., 1990, Staines W. A. et al., 1987] о том, что гистаминергические нейроны формировались в эмбриогенезе как еди ная группа и имеют сходные гистотопографические проекции и функции.
Общий объём скоплений перикарионов МАО Б-активных нейронов ги поталамуса крысы составляет 499,4х106±27,2х106 мкм3. Объём разных гиста минергических ядер значительно различается (Рис. 2) Рис. Е Е5 Объём отдель Е 3% 9% ных гистаминер Е4 40% гических ядер (в 35% % к их общему объёму) Е 13% Нейроны в ядре Е5 расположены диффузно, по сравнению с более ком пактным расположением нейронов в остальных гистаминергических ядрах, особенно Е1 - ЕЗ. Ядро Е4 по плотности расположения нейронов занимает промежуточное положение.
Абсолютное количество нейронов в гистаминергических ядрах гипо таламуса крысы с обеих сторон составляет в среднем 37164±2760 (Рис. 3).
E5 E E4 Рис. 3.
0,32% 7% 16% Количество МАО Б активных нейронов в различных гистами нергических ядрах гипоталамуса крысы.
E (в % к их общему ко 23% E2 личеству) 54% Морфометрическая характеристика МАО Б-активных нейронов ги поталамуса крысы Установлены средние размеры нейронов гистаминергических ядер гипоталаму са крысы (Таблица 1).
Таблица 1.
Размеры нейронов гистаминергических ядер гипоталамуса крысы.
E1 E2 E3 E4 E 27,4 29,5 27,1 30,4 58, Максимальный ±3,8** ±2,5 ±3,1 ±1,9 ±2,2* диаметр (в мкм) 17,88 17,6 16,4 16,6 16, Минимальный ±1,8 ±1,8 ±2,3 ±1,1 ±2, диаметр (в мкм) 75,54 77,2 71,1 88,1 141, Периметр ±8,3** * ±10,1** 1;
±7,1 ±8,1 ±4, (в мкм) 340,55 349,9 303,4 322,8 431, Площадь ±42,5** ±60,8 ±67,9 ±72,7 ±25,05* (в мкм ) 4937,45 5112,86 4194 4592,96 7023, Объём ±1970* ±1293,2 ±1493,3 ±1552,4 ±540, (в мкм ) *- Различия достоверны (р0,01);
**- Различия достоверны (р0,05);
1 - Разли чия между ядром Е3 и Е4;
2 - Различия между ядром Е1 и Е4;
3- Различия между ядром Е5 и остальными гистаминергическими ядрами.
В гистаминергических ядрах отчётливо выделяются три субпопуляции нейронов: мелкие, средние и крупные. Их вклад в состав разных ядер различен.
Кроме того в 4-ом и в 5-ом гистаминергических ядрах встречаются ещё субпо пуляция гигантских (11000 мкм3) нейронов. Она составляет соответственно и 25% от общего количества нейронов в Е4 и Е5 ядрах, но менее 5% от общего количества гистаминергических нейронов в гипоталамусе крысы.
Установлено, что нейроны различных гистаминергических ядер отли чаются по форме. Так, перикарионы Е1 - ЕЗ ядер гистаминергических ней ронов имеют округлую, овальную, реже веретеновидную. Перикарионы ядра Е4 и, особенно, Е5 имеют значительно более вытянутую - веретеновидную форму.
Гистохимические особенности нейронов гипоталамуса крысы.
Показано, что по активности НАДФН и Г-6-Ф ДГ, внемитохондриальные энергетические процессы наиболее выражены в нейронах ядра Е2 и ЕЗ (Табли ца 2). НАДФН ДГ локализована в эндоплазматической сети и гиалоплазме.
Митохондриальные энергетические процессы (по активности СДГ) также более выражены в нейронах ядер Е2 и ЕЗ, по сравнению с ядрами Е4 и Е5. Об этом свидетельствует более высокая активность СДГ в клетках ядер Е2 и ЕЗ, по сравнению с клетками Е4 и Е5 ядер (Таблица 2).
Процессы анаэробного гликолиза (по активности лактатдегидрогеназы) наиболее выражены в клетках Е2 и Е4, а наименее - в клетках ядра Е1. Об этом свидетельствует высокая активность ЛДГ в клетках ядер Е2, Е4 и низкая в клетках ядра Е1 (Таблица 2).
Таблица 2.
Активность ферментов в нейронах гистаминергических ядер и аркуатного ядра гипоталамуса крысы (в единицах оптической плотности х 103).
Е1 Е2 Е3 Е4 Е5 Arc 863,33 918,45 863,55 797,8 764,50 МАО Б ±64,84 ±13,63 ±15,77 ±20,9 ±39, 631,33 710,75 682,52 680,20 642,50 НАДН ±54,74 ±40,74 ±44,60 ±50 ±55,16 ±6, ДГ 691,33 748,38 720,76 731,50 729,83 601, ЛДГ ±10.87 ±9.20 ±21.53 ±10 ±13.65 ±5, 428,17 435,57 420,40 414,90 404,66 484, Г-6-Ф ±10.04 ±8.31 ±10.09 ±5.3 ±3.89 ±8, ДГ 433,33 443,10 444,47 405,5 444,00 412, СДГ ±6,24 ±10,2 ±4,47 ±11,7 ±10,19 ±16, 964,67 1059,36 1028,47 959 978,67 780, НАДФ ±38,09 ±29,2 ±21,54 ±19,8 ±6,55 ±12, ДГ Исходя из всего вышесказанного, можно заключить, что энергетические процессы в нейронах гистаминергических ядер Е2 и ЕЗ более выражены по сравнению с таковыми в ядре Е4 и, особенно, Е5. Учитывая то, что в Е1-Е5 яд рах главным образом синтезируется гистамин, то можно предполагать, что эти процессы обеспечивают синтез этого амина в ядрах Е2 и ЕЗ. Интересно, что и процессы окислительного дезаминирования гистамина более выражены в этих же ядрах. Об этом свидетельствует более высокая активность МАО Б в клетках ядер Е2 и ЕЗ и пониженная - в клетках Е4 и Е5 ядер.
Анализ гистограмм позволил установить высокую метаболическую гете рогенность популяций гистаминергических нейронов в гипоталамусе крысы в целом и по отдельным ядрам, а также обнаружены значительные гистохимиче ские особенности гистаминергических нейронов, по сравнению с нейронами дофаминергического аркуатного ядра гипоталамуса (активность НАДН и НАДФН ДГ, ЛДГ, СДГ и МАО Б выше, а активность Г-6-Ф ДГ ниже).
Электронно-микроскопическая характеристика нейронов гистами нергических ядер гипоталамуса крысы.
Предложенный метод подготовки образцов мозга для электронно микроскопического исследования, с использованием криостатных срезов и гис тохимического контроля на МАО Б, позволяет избирательно изучать ультра структуру мелких гистаминергических ядер гипоталамуса крысы.
Полученная нами электронно-микроскопическая картина нейронов ре презентативного гистаминергического ядра Е2 в целом не отличается от тако вой, полученной предыдущими исследователями с использованием других мар кёров гистаминергических нейронов [Haas H. et al., 2003, Hayashi H. et al., 1984, Kaslin J. et al., 2001, Tohyama M. et al., 1991]. Показано, что ядра гистаминерги ческих нейронов складчатые, содержат мелкозернистый хроматин, и ядрышко, прилежащее к ядерной оболочке, имеющей много пор. Цитоплазма богата ор ганеллами: митохондрии многочисленны, хорошо развиты комплекс Гольджи и эндоплазматическая сеть, как гранулярная, так и гладкая. Выявляется значи тельное количество свободных рибосом, большое количество вторичных лизо сом, в том числе и липидолизосом. Часто встречаются мультивезикулярные тельца. В нейропиле гистаминергических нейронов выявляются многочислен ные активные аксо-соматические, аксо-дендритические и единичные аксо аксональные синапсы, причём первые и третьи относятся к симметричным межнейрональным контактам, а вторые - к асимметричным.
Ультраструктура нейронов гистаминергического ядра Е2 хорошо согла суется с высокой метаболической активностью этих нейронов, выявленных в нашем исследовании гистохимически. В частности, высокой активности мар керных ферментов митохондрий, сукцинатдегидрогеназы и МАО, соответству ет большое количество митохондрий в их цитоплазме, а высокой активности дегидрогеназы восстановленного НАДФ - развитая гладкая цитоплазматическая сеть. В целом, ультраструктура гистаминергических нейронов свидетельствует об их высокой метаболической и функциональной активности.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. В 95% нейронов всех гистаминергических ядер (Е1-Е5) гипоталамуса крысы обнаружена высокая активность моноаминооксидазы Б. Все гистами ниммуноположительные нейроны гипоталамуса крысы являются МАО Б активными. Вне гистаминергических ядер МАО Б-активные и гистаминимму нопозитивные нейроны в гипоталамусе не встречаются. Следовательно, гисто химический способ выявления активности МАО Б может быть использован для исследования гистаминергических нейронов и их скоплений (ядер) в гипотала мусе крысы [2, 3, 4, 5, 7].
2. Гистаминергические ядра мозга крысы пространственно взаимосвяза ны между собой, постепенно переходят одно в другое и в совокупности обра зуют геометрическую фигуру сложной конфигурации, что указывает на про странственное единство популяции гистаминергических нейронов гипоталаму са крысы [2, 3, 4, 8].
3. Общий объём гистаминергических ядер мозга крысы равен 499,4х106±27,2х106 мкм3. Ядро Е2 составляет 40% общего объёма, Е4 - 35%, ЕЗ -13%, Е5-9%, Е1-3%. Плотность расположения нейронов в гистаминергических ядрах убывает в последовательности Е1 - ЕЗ (компактные ядра), Е4 (промежу точное), Е5 (диффузное). Общее количество нейронов в гистаминергических ядрах составляет 37162±2760. Е2 содержит 54% от этого числа, ЕЗ -23%, Е4 16%, El - 7%, Е5 - 0,32%.
Популяция гистаминергических нейронов неоднородна по размерам и форме. Субпопуляция гигантских (11 тыс. мкм3) нейронов находится только в ядрах Е4 и Е5, где они составляют соответственно 10 и 25% всех нейронов.
Максимальный диаметр, периметр, площадь и объём нейронов ядра Е5 значи тельно больше, чем нейронов остальных гистаминергических ядер.
Большинство нейронов Е5 имеют веретеновидную форму. Нейроны ядер Е1 - ЕЗ имеют преимущественно округлую форму. Нейроны Е4 по форм - фак тору и фактору элонгации занимают промежуточное положение [2, 3, 4, 7].
4. Нейроны гистаминергических ядер значительно отличаются по пока зателям окислительного метаболизма от нейронов дофаминергического арку атного ядра гипоталамуса: в последних активность сукцинат-, лактат- и НАДФН дегидрогеназ достоверно ниже, а Г-6-Ф дегидрогеназы выше, чем в нейронах гистаминергических ядер. Нейроны различных гистаминергических ядер гипоталамуса крысы различаются по активности дегидрогеназ (окисли тельный метаболизм, энергетическое обеспечение процессов биосинтеза гис тамина) и МАО Б (окислительное дезаминирование гистамина). Активность этих ферментов в ядре Е2 максимальна, а Е5 - минимальна. Нейроны каждого гистаминергического ядра также метаболически гетерогенны [2, 5].
5. Метод подготовки образцов мозга для электронно-микроскопического исследования, с использованием криостатных срезов и гистохимического кон троля на МАО Б, позволяет избирательно изучать ультраструктуру мелких гис таминергических ядер гипоталамуса крысы. Ультраструктура нейронов репре зентативного гистаминергического ядра Е2 свидетельствует об их высокой ме таболической и функциональной активности [6].
СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
Статьи:
1. Зиматкин С.М., Кузнецова В.Б., Анищик О.В. Гистаминергическая ней ронная система мозга // Морфология. – 2003.- Т.123.- Вып.2.- С. 97 – 105.
2. Зиматкин С.М., Кузнецова В.Б., Стрик О.Н., Виноградова Л.Е., Лис Р.Е.
Структурно-метаболическая характеристика гистаминергических нейро нов гипоталамуса крысы // Труды Гродненского государственного меди цинского университета (к 45-летию университета). – Гродно: ГрГМУ, 2003.- С.24-26.
3. Зиматкин С.М., Кузнецова В.Б., Стрик О.Н., Лис Р.Е. Гистаминергиче ские нейроны мозга крысы: Морфометрическое исследование // Аспекты клинической анатомии и вопросы конституционально-возрастной и экс периментальной морфологии / Сборник трудов научной конференции под ред. Доцента Е.С. Околокулака. – Гродно: ГГМУ, 2003. - С.74-76.
4. Кузнецова В.Б. Морфометрическая оценка МАО Б-активных нейронов в гипоталамусе крысы // Актуальные вопросы современной медицины и фармации. Материалы научно-практической конференции студентов и молодых учёных. – Витебск: ВГМУ, 2003. -С.7-9.
5. Кузнецова В.Б., Виноградова Л.Е., Зиматкин С.М. Гистохимическая ха рактеристика гистаминергических нейронов мозга крысы // Аспекты кли нической анатомии и вопросы конституционально-возрастной и экспери ментальной морфологии / Сборник трудов научной конференции под ред.
Доцента Е.С. Околокулака. – Гродно: ГГМУ, 2003. - С.105-106.
6. Зиматкин С.М., Кузнецова В.Б., Кравчук Р.И. Электронно микроскопическое исследование нейронов гистаминергического ядра Е гипоталамуса крысы // Журнал Гродненского государственного медицин ского университета. – 2004. - № 5. - C. 46-49.
Тезисы:
7. Кузнецова В.Б. Количество МАО Б-активных нейронов в гистаминерги ческих ядрах мозга крысы // Материалы научно-практической конферен ции студентов и молодых учёных, посвященной памяти академика Ю.М.
Островского. – Гродно: ГрГМУ, 2003. - С.118-119.
8. Кузнецова В.Б., Стрик О.Н. Трёхмерная компьютерная реконструкция гистаминергических ядер гипоталамуса // Материалы научно практической конференции студентов и молодых учёных, посвященной памяти академика Ю.М. Островского. – Гродно: ГрГМУ, 2003. - С.119 120.
РЕЗЮМЕ Кузнецова Вера Борисовна “Морфо-функциональная характеристика гистаминергических нейронов гипоталамуса крысы” Ключевые слова: головной мозг, гистаминергические нейроны, ультра структура, гистохимия, морфометрия.
Объект исследования: крысы-самцы линии Вистар, нейроны гистами нергических ядер гипоталамуса.
Цель исследования: Выяснить пространственную организацию гиста минергических ядер гипоталамуса крысы и дать структурно-метаболическую характеристику их нейронов.
Методы исследования: нейрогистологический, иммуногистохимический (исследование гистамина в мозге), гистохимический, цитофотометрический, морфометрический (оценка размеров и формы нейронов при помощи компью терного анализатора изображения Биоскан), электронно-микроскопический, компьютерное моделирование и статистический.
Полученные результаты и их новизна: Впервые установлена возмож ность применения гистохимического метода на определение активности МАО Б для выявления гистаминергических нейронов. Создано интегральное трёхмер ное компьютерное изображение гистаминергических ядер гипоталамуса крысы.
Установлено, что гистаминергические нейроны пространственно образуют единую популяцию. Впервые вычислен их объём, плотность расположения и абсолютное количество в них нейронов. Количественно оценены размеры и форма нейронов во всех гистаминергических ядрах, а также активность в них ряда окислительных ферментов. Впервые установлена неоднородность попу ляции гистаминергических нейронов гипоталамуса крысы (по размерам, форме, интенсивности метаболизма). Разработан способ подготовки тканей для элек тронно-микроскопических исследований мелких структур мозга. Дана элек тронно-микроскопическая характеристика нейронов гистаминергического ядра Е2.
Рекомендации по использованию: Предложенный комплекс структур но-метаболических оценок и полученная характеристика гистаминергических нейронов головного мозга могут являться базовыми для дальнейшего изучения гистаминергической нейрональной системы мозга, как в норме, так и при раз личных экспериментальных воздействиях и патологических состояниях у жи вотных и человека.
Область применения: биология, медицина, гистология, цитология, кле точная биология, нейрохимия, нейроморфология, неврология.
РЭЗЮМЭ Кузняцова Вера Барысаўна “Морфа-функцыянальная характарыстыка гістаминэргічных неўронаў гіпаталамуса пацука” Ключавыя словы: галаўны мозг, гістамінэргічныя неўроны, ультраструктура, гістахімія, морфаметрыя.
Аб'ект даследвання: пацукі-самцы Вістар, неўроны гістамінэргічных ядраў гіпаталамуса.
Мэта даследвання: Атрымаць прасторавую арганізацыю гістамінэргічных ядраў гіпаталамуса пацука і даць структурна-метабалічную характарыстыку іх неўронаў.
Метады даследвання: неўрагісталагічны, імунагістахімічны (даследванне гістаміна ў мозге), гістахімічны, цытафотаметрычны, морфаметрычны (ацэнка памераў і формы неўронаў пры дапамозе камп'ютернага аналізатара відарыса Біяскан), электронна-мікраскапічны, камп'ютернае мадэліраванне і статыстычны.
Атрымынныя вынікі і іх навізна: Упершыню атрымана магчымасць выкарыстання гістахімічнага метада на МАА Б дзеля выяўлення гістамінэргічных неўронаў. Зроблена інтэгральнае трохпамернае камп'ютернае адлюстраванне гістамінэргічных ядраў гіпоталамуса пацука. Сцверджана, што гістамінэргічныя неўроны прастрава ствараюць адзіную папуляцыю.
Упершыню атрыман іх аб'ём, шчыльнасць размяшчэння і абсалютная колькасць у іх неўронаў. Колькасна аценены памеры і форма неўронаў, у ўсіх гістамінэргічных ядрах, таксама актыўнасць у іх акісляльных ферментаў.
Упершыню вызначына неаднароднасць папуляцыі гістамінэргічных неўронаў гіпаталамуса пацука (па памерам, форме, інтэнсіўнасці метабалізма). Распра цован метад падрыхтоўкі тканкі дзеля электронна-мікраскапічных даследван няў малых структур мозга. Дадзена электронна-мікраскапічная характарыстыка неўронаў гістамінэргічнага ядра Е2.
Рэкамендацыі па выкарыстанню: Прапанаваны комплекс структурна метабалічных адметак і атрыманая характарыстыка гістамінэргічных неўронаў галаўнога мозга могуць з'яўляцца базавымі дзеля паслядовага даследвання гі стамінэргічнай неўранальнай сістэмы мозга, як у норме, так і пры разліковых эксперыментальных уздзеяннях і паталагічным стане у жывёл і чалавека.
Вобласць выкарыстання: біялогія, медыцына, гісталогія, цыталогія, клеткавая біялогія, неўрахімія, неўрамарфалогія, неўралогія.
SUMMARY Kuznetsova Vera Borisovna The morpho-functional characteristics of the hypothalamic histaminergic neurons in rats Keywords: brain, histaminergic neurons, ultrastructure, histochemistry, morphpmetry.
Subjects: male Wistar rats, the neurons of the hypothalamic histaminergic nu clei.
Aim: to investigate the spatial organization of the histaminergic nuclei in rat hypothalamus and the structural and metabolic properties of their neurons.
Methods: neurohistology, immunohistochemistry (histamin analysis in brain), histochemistry, cytophotochemistry, morphometry (estimation of neuron sizes and shapes with computer image analyzer “Bioscan”), electronic microscopy, computer modeling and statistics.
The results and their novelty: The possibility to apply the histochemistry method to the determinaition of the MAO B activity revel histaminergic neurons war explored for the first time. The integral three-dimensional computerized image of rat hypothalamic histaminergic nuclei was obtained for the first time. The histaminergic neurons were shown to be spatially interrelated and to form one population. The nu clear volume, neuron density and total neuron amount were calculated in first time.
The sizes and shapes of neurons were quantitatively estimated in all histaminergic nuclei, such as the intracellular activities of some oxidative enzymes. The heteroge neity of the histaminergic neuron population (by size, shape and metabolic activity) was shown in rats in first time. The way for tissue preparation to electron microscopic investigations of the small cerebral structures was developed. The elec tronic microscopy characteristics of the neurons of the Histaminergic nuclei E2 were analyzed.
Recommendations to use: the suggested complex of structural and metabolic scores and the characteristics of the cerebral histaminergic neurons obtained may be come a base for the future studies of the histaminergic neuron system in humans and animals, both in normal conditions and during various experimental treatments and pathologic states.
Field of application: biology, medicine, cytology, cell biology, neurochemis try, neuromorphology, neurology.