Исследование ранних стадий образования гибридных клеток, получаемых при слиянии эмбриональных стволовых клеток и фибробластов
На правах рукописи
ГРИДИНА МАРИЯ МИХАЙЛОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ СТАДИЙ ОБРАЗОВАНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧАЕМЫХ ПРИ СЛИЯНИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ФИБРОБЛАСТОВ 03.02.07 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Новосибирск 2010
Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики сибирского отделения РАН, г. Новосибирск.
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Серов О.Л.
Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Кикнадзе И.И.
Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск доктор биологических наук, Лебедев И.Н.
Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики СО РАМН, г. Томск Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН, г. Москва
Защита диссертации состоится 2010 года на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева 10, тел/факс: (383) 3331278, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.
Автореферат разослан "_" 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Развитие начинается с деления-дробления оплодотворенной яйцеклетки – зиготы. Программа развития, заложенная в этой тотипотентной клетке, реализуется в процессе онтогенеза через дифференцировку, в результате которой формируется более 200 типов специализированных клеток, представленных во взрослом организме. Процесс дифференцировки сопровождается потерей первоначальной тотипотентности, которую можно условно градуировать: плюрипотентность, мультипотентность, коммитированность и терминальная детерминация. Важным элементом потери потенциала является ее одновекторность и, в большинстве случаев, необратимость. В нормальном развитии эукариот примеры восстановления дифференцированной клеткой утраченного потенциала чрезвычайно редки. В связи с этим исследователями не раз предпринимались попытки экспериментальным путем восстановить утраченный потенциал соматических клеток.
Одним из способов восстановления потенциала (репрограммирования) генома соматической клетки является ее слияние с эмбриональной стволовой (ЭС) клеткой. В 1996 году было обнаружено, что слияние мышиных ЭС клеток и спленоцитов приводит к формированию гибридных клеток, которые обладают многими свойствами ЭС клеток, в том числе способностью участвовать в формировании химерных животных (Матвеева и др., 1996;
Matveeva et al., 1998).
Эти данные нашли подтверждение в целом ряде экспериментов по слиянию ЭС клеток с В- и Т-лифмоцитами (Tada et al., 2001;
Kimura et al., 2004), незрелыми нейральными клетками (Do et al., 2004), незрелыми гемопоэтическими клетками (Ying et al., 2003) и фибробластами (Sullivan et al., 2006;
Kruglova et al., 2008).
Исследования таких гибридных клеток показали, что в них происходит:
активация генов, неактивных в соматических клетках (таких как Oct4 и Nanog), реактивация неактивной Х-хромосомы, изменения профилей метилирования ДНК и модификаций гистоновых белков (Tada et al., 2001;
Kimura et al., 2004;
Do et al., 2007;
Battulin et al., 2009). Все это является свидетельством репрограммирования, происходящего в геноме соматической клетки после слияния с ЭС клеткой. Изменения профиля экспрессии генов, происходящие в гибридных клетках такого типа, а также приобретение этими клетками плюрипотентных свойств говорит о доминировании генома ЭС клеток над геномом соматических клеток.
Представление о доминировании генома одного партнера по слиянию над другим долгое время было популярным не только для гибридных клеток, получаемых при слиянии ЭС клеток с соматическими клетками, но и для гибридов, получаемых при слиянии двух соматических клеток различной тканевой принадлежности. После слияния двух соматических клеток возможно, используя ингибиторы клеточного деления, оставить клетку на стадии гетерокариона, когда в общей цитоплазме присутствуют два ядра родительских клеток. В таких гетерокарионах, как правило, доминирует партнер с большей по объему цитоплазмой и укороченным клеточным циклом и под его воздействием меняется организация второго ядра и паттерн экспрессии генов на свойственный доминантному ядру. Примерами такого доминирования могут служить гетерокарионы, полученные при слиянии эритроцитов птиц или амфибий с какими-либо растущими и делящимися в культуре клетками млекопитающих (Harris, 1967) или при слиянии кератиноцитов мыши с миобластами мыши (Zhang et al., 2007). Однако недавно появилась работа, в которой показано обоюдное влияние ядер в гетерокарионах между кератиноцитами и мышечными клетками, а не доминирование одного ядра над другим (Palermo et al., 2009).
Таким образом, возникает вопрос – возможно ли альтернативное проявление геномов родительских клеток при слиянии соматических клеток с ЭС клетками или же в данном случае наблюдается строгое доминирование ядер ЭС клеток?
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования является изучение динамики становления фенотипа гибридных клеток на ранних стадиях после слияния диплоидных ЭС клеток мыши с диплоидными эмбриональными фибробластами мыши.
Для достижения целей были поставлены следующие задачи:
Модифицировать метод идентификации гетерокарионов и гибридных 1.
клеток на ранних стадиях после слияния ЭС клеток и фибробластов.
Провести иммунофлюоресцентный анализ маркеров плюрипотентных ЭС 2.
клеток (Oct4 и Nanog), фибробластов (коллагена I типа и фибронектина) и дифференцированных клеток (ламина А/С) в гетерокарионах и гибридных клетках в первые часы (с 4-ого до 20-ого) и дни (с 1-го до 4-го) после слияния ЭС клеток и фибробластов.
Провести анализ профилей метилирования ДНК 5’-регуляторной области 3.
гена Oct4 в гибридных клетках через разные интервалы времени после слияния ЭС клеток и фибробластов.
Исследовать состояние Х-хромосом в гетерокарионах и гибридных 4.
клетках посредством иммунофлюоресцентного анализа факультативного гетерохроматина с использованием антител против триметилированного лизина в 27-ом положении в гистоне Н3 (H3K27me3), маркирующего неактивную Х-хромосому.
Научная новизна и практическая значимость.
Модифицирован метод идентификации продуктов слияния ЭС клеток и 1.
фибробластов, позволяющий с 90% точностью дискриминировать гетерокарионы и гибридные клетки от гомокарионов и гибридных клеток, образовавшихся при слиянии двух родительских клеток одного типа (ЭС клетка-ЭС клетка и фибробласт-фибробласт).
Впервые обнаружено существование двух фенотипически контрастных 2.
типов гетерокарионов и гибридных клеток, полученных при слиянии диплоидных ЭС клеток с диплоидными фибробластами – одни имеют признаки ЭС клеток, а другие фибробластов.
Впервые показано, что деметилирование ДНК 5’-регуляторной области 3.
эпиаллеля фибробласта гена Oct4 в гибридных клетках с фенотипом ЭС клеток происходит в течение первых 4-х дней после слияния, в то же время в гибридных клетках с фибробласто-подобным фенотипом происходит метилирование 5’-регуляторной области эпиаллеля ЭС клеток гена Oct4.
Полученные в ходе данной работы результаты используются при чтении 4.
лекций спецкурса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете (НГУ).
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены в работе следующих конференций и симпозиумов: 3-я международная конференция «Наука для медицины» (Новосибирск, 2007);
симпозиум с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза». (Москва, 2007);
всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2007);
международная научная конференция молодых ученых «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007);
4-ая международная конференция сообщества стволовых клеток северной Рейн-Вестфалии (Дюссельдорф, 2007);
LXXIII симпозиум по количественной биологии (Cold Spring Harbor, 2008);
1-ый ежегодный международный конгресс по регенеративной медицине и стволовым клеткам (Фошан, 2008);
V съезд Вавиловского общество генетиков и селекционеров (Москва, 2009);
5-ый международный конгресс по биотехнологии стволовых клеток (Тегеран, 2009);
всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009).
Материалы диссертации изложены в 3-х статьях, опубликованных в отечественном и международных журналах, входящих в перечень ВАК.
Положение, выносимое на защиту. В клетках, получаемых при слиянии диплоидных ЭС клеток мыши и диплоидных фибробластов мыши, начиная со стадии гетерокариона, наблюдается альтернативное проявление родительских геномов. В результате чего формируются гибридные клетки, обладающие двумя контрастными фенотипами: ЭС-подобным и фибробласто-подобным.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах, проиллюстрирована 27 рисунками и содержит 2 таблицы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали следующие культуры клеток:
эмбриональные стволовые клетки линии E14Tg2aSc4TP6.3, полученные из ВКМ бластоцисты мыши Mus musculus линии 129/Ola. Клетки этой линии маркированы GFP, устойчивы к пуромицину и ГФРТ- (Pratt et al., 2000), имеют кариотип 2N = 40,XY. Линия была любезно предоставлена доктором Остином Смит (University of Edinburgh).
первичные культуры эмбриональных фибробластов, полученные из 12,5-дневных эмбрионов мышей линии DD/c M. musculus;
первичные культуры эмбриональных фибробластов с кариотипом 2N = 40,XХ, полученные из 14,5-дневных эмбрионов линии DD/c M. musculus;
первичные культуры эмбриональных фибробластов, полученные из 12,5-дневных эмбрионов мышей Mus caroli.
Культивирование ЭС клеток и гибридных клеток проводили по методу, описанному ранее Матвеевой и др. (Matveeva et al., 1998). Условия культивирования фибробластов и метод слияния клеток описан ранее Кругловой и др. (Круглова и др., 2008). Мечение фибробластов проводили полистироловыми флуоресцентными микросферами (Invitrogen, США) согласно приложенной инструкции.
Иммунофлюоресцентный анализ проводили согласно методу, описанному ранее Кругловой и др. (Kruglova et al., 2010). В анализе использовали следующий набор первичных антител к: Oct4 (1:500;
Abcam, Великобритания), Nanog (1:200;
Abcam, Великобритания), коллагену I типа (1:1000;
Chemicon, США), фибронектину (1:1000;
Abcam, Великобритания), ламину A/C (1:150;
Chemicon, США), триметилированному лизину в 27 положении гистона Н (1:500;
Molecular Probes). Вторичные антитела конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 546 к: IgG мыши, (1:300;
Molecular Probes, США), IgG кролика (1:300;
Molecular Probes, США). Анализ проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope-2 (Carl Zeiss, Германия) и программного обеспечения WinView software (Rooper Scientific Photometrix).
Для дискриминации родительских митохондриальных ДНК (мтДНК) использовали аллель-специфичный полиморфизм мтДНК. Выделение мтДНК из единичных клеток проводили согласно методу, описанному в работе Зукотти и Монка (Zuccotti, Monk, 1995) с описанными в работе модификациями.
Определение нуклеотидной последовательности проводили согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation, США) в Межинститутском центре секвенирования ДНК (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН).
Бисульфитную обработку ДНК проводили с использованием реагентов EZ DNA Methylation-Direct Kit (Zymo Research, США) согласно приложенной инструкции. Субклонирование продуктов ПРЦ проводили с использованием набора реактивов pGEM-T Easy Vector System (Promega, США) согласно приложенной инструкции.
В работе использовали штамм E. coli XL10-Gold (Stratagene, США).
Приготовление и трансформацию компетентных клеток E. coli проводили согласно протоколу фирмы Stratagene, прилагаемому к данному штамму. После трансформации клеток E. coli, клонированные фрагменты индивидуальных клонов амплифицировали в ПЦР и затем секвенировали.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ Идентификация гетерокарионов и гибридных клеток в первые часы и сутки после слияния ЭС клеток и фибробластов На первом этапе исследования нами был разработан метод идентификации гетерокарионов и гибридных клеток в первые часы и сутки после слияния ЭС клеток и фибробластов. Метод основан на использовании прижизненных флуоресцентных меток: «зеленое» свечение цитоплазмы ЭС клеток благодаря экспрессии в них трансгенного GFP и мечение цитоплазмы фибробластов «синими» гранулами. Такое маркирование родительских клеток позволило дискриминировать обе популяции родительских клеток и продукты слияния между ними.
Для оценки точности предложенного способа идентификации гибридных клеток мы провели анализ родительских мтДНК в гибридных клетках.
Последовательности мтДНК мышей линий 129/Ola и DD/c имеют различие в участке гена третьей субъединицы цитохромоксидазы, которое представляет собой замену в положении 9348. Нами была проведена гибридизация ЭС клеток, линии E14Tg2aSc4TP6.3, полученной из бластоцисты мыши 129/Ola, и фибробластов, полученных из эмбрионов мышей DD/c. Через 48 ч после слияния 20 гибридных клеток были отобраны и перенесены в индивидуальные пробирки, для каждой клетки индивидуально проводили ПЦР с использованием праймеров к участку мтДНК, в котором находится полиморфизм между линиями мышей 129/Ola и DD/с. Продукты ПЦР секвенировали и идентифицировали родительские формы мтДНК (рис. 1А, Б, В). Результаты проведенного анализа показали, что из 20 образцов 18 имели четко выраженные сигналы, соответствующие обоим нуклеотидам, что указывает на присутствие в образце обеих родительских форм мтДНК, а в 2 образцах содержалась мтДНК только клеток линии 129/Ola. Кроме того, был проведен дополнительный анализ продуктов рестрикции, выявляющий тот же полиморфизм мтДНК, результаты которого, подтвердили данные, полученные в ходе секвенирования.
Морфология гетерокарионов и гибридных клеток Используя описанный выше способ идентификации гетерокарионов и гибридных клеток, был проведен морфологический анализ популяции клеток, полученной после проведения слияния ЭС клеток и фибробластов. Через 4 ч после слияния можно было выделить два морфологически различающихся типа гетерокарионов: фибробласто-подобные – крупные клетки с низким ядерно-цитоплазматическим соотношением и большим количеством отростков;
ЭС-подобные – небольшие округлые клетки с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением и без выраженных отростков (таблица 1, рис. 2А и Б). Через 45 ч и 69 ч после слияния встречались гетерокарионы только с фибробласто-подобной морфологией (рис. 2В). Первое деление гетерокарионов происходило в период между 8 ч и 45 ч после слияния.
Среди, появившихся через 21 ч после слияния, гибридных клеток 81% имели фибробласто-подобную морфологию (рис. 2Г), и только 19% клеток обладали морфологическими сходствами с ЭС клетками (таблица 1). ЭС-подобных гибридных клеток.
Таблица 1.
Соотношение гетерокарионов и гибридных клеток различной морфологии в разное время после слиянии ЭС клеток и фибробластов.
Популяция гибридных клеток через 45 ч и 69 ч после слияния сохраняла свою неоднородность: в ней присутствовали как колонии, образованные плотно прилегающими друг к другу клетками, морфологически сходными с ЭС клетками (рис. 2Д), так и колонии, в которых клетки, сходные с фибробластами, располагались на значительном расстоянии друг от друга (рис. 2Г и Е).
Соотношение этих двух типов колоний было приблизительно 1:1 (таблица 1).
Однако следует подчеркнуть, что формирование клонов гибридных клеток происходило только из клеток с ЭС-подобной морфологией, тогда как, по нашим наблюдениям, фибробластно-подобные гибридные клетки не были способны давать начало стабильным клонам гибридных клеток.
Иммунофлюоресцентный анализ экспрессии белков, маркирующих плюрипотентные и соматические клетки, в гетерокарионах и гибридных клетках Существует ряд генов, экспрессия которых характерна только для плюрипотентных клеток, а их активация в гибридных клетках, полученных при слиянии ЭС клеток и соматических клеток, наряду с подавлением экспрессии тканеспецифичных генов, является признаком, прошедшего в гибридных клетках, репрограммирования. В частности, принято считать экспрессию генов Oct4 и Nanog – маркерами ЭС клеток, присутствие ламина А/С в ядерной ламине – маркером дифференцированных клеток (Constantinescu et al., 2006), а наличие цитоскелета, сформированного коллагеном I типа и фибронектином (Smith et al., 1979), – маркером клеток фибробластного ряда.
Используемый нами набор первичных антител позволял проводить иммунофлюоресцентный анализ Oct4 и коллагена I типа одновременно, поскольку они имеют разную внутриклеточную локализацию: ядерную и цитоплазматическую соответственно. В результате анализа трех независимых гибридизаций ЭС клеток и фибробластов нами установлено, что через 4 ч после проведения слияния 22% гетерокарионов обладали «ожидаемым» фенотипом (в одном из ядер присутствовал Oct4, а в цитоплазме – коллаген I типа), 57% гетерокарионов обладали фибробласто-подобным фенотипом (не содержали Oct4 ни в одном из ядер, тогда как их цитоплазма была позитивна по коллагену I типа). Через 45 ч и 69 ч после слияния большинство гетерокарионов (57% и 78% соответственно) обладало «промежуточным» фенотипом (в них не обнаруживался ни Oct4, ни коллаген I типа;
рис. 3А). Первые колонии гибридных клеток, состоящие из 2-х клеток, мы обнаруживали через 21 ч после слияния, 77% колоний состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом, 20% колоний состояли из клеток с ЭС-подобным фенотипом и клетки 3% колоний были негативны по обоим маркерам. Через 45 ч и 69 ч после слияния колонии клеток с ЭС-подобным фенотипом (47% и 42% соответственно), наряду с колониями клеток, имеющих крупную цитоплазму и негативных по обоим маркерам (32% и 41%), составляли основную часть популяции гибридных клеток, тогда как колоний клеток с фибробласто-подобным фенотипом было меньшинство (10 и 7% через 45 ч и 69 ч после слияния соответственно;
рис. 3Б).
Используемый нами набор первых антител позволял проводить одновременно иммунофлюоресцентный анализ Nanog и коллагена I типа. Через 4 ч после слияния 87% гетерокарионов имели фибробласто-подобный фенотип (Nanog отсутствовал в обоих ядрах, а цитоплазма была позитивна по коллагену I типа). Сходная ситуация сохранялась через 8 ч и 21 ч после проведения гибридизации. Через 45 ч и 69 ч после слияния большинство гетерокарионов (64% и 79% соответственно) обладали «промежуточным» фенотипом (большой цитоплазмой и были негативны как по Nanog, так и коллагену I типа;
рис. 3В).
Через 21 ч после слияния 81% колоний гибридных клеток состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом, 15% колоний состояли из клеток с ЭС-подобным фенотипом. Через 45 ч после гибридизации в популяции присутствовали примерно в равном соотношении колонии, состоящие из гибридных клеток с ЭС-подобным (36%), фибробласто-подобным (28%) и «промежуточным» фенотипом(30%), а именно: клетки с большой цитоплазмой, в которых не было и Nanog и коллагена I типа. Через 69 ч после слияния колонии, клетки которых обладали фибробласто-подобным фенотипом, встречались лишь в 6% случаев, тогда как возрастало число колоний, клетки которых имели ЭС-подобный фенотип (52%), а число колоний, клетки которых имели «промежуточный» фенотип, существенно не менялось (35%;
рис. 3Г).
Ламин А/С является маркером дифференцированных клеток, его экспрессия полностью отсутствует в ЭС клетках (Constantinescu et al., 2006) и в гибридных клетках между ЭС клетками и спленоцитами (Battulin et al., 2009).
Через 4 ч после слияния 88% гетерокарионов обладали «ожидаемым» фенотипом (то есть в оболочке одного из ядер присутствовал ламин А/С) и 9% гетерокарионов имели «промежуточный» фенотип (клетки имели большую цитоплазму, а оболочки обоих ядер не содержали ламин А/С).
Рис. 1. Секвенограммы фрагмента гена третьей субъединицы цитохромоксидазы ЭС клетки, линии E14Tg2aSc4TP6.3 полученной из бластоцисты мыши линии 129/Ola (А), фибробласта, полученного из эмбриона мыши линии DD/c (Б) и образца, содержащего гибридную клетку (В).
Рис. 2. Морфология гетерокарионов и гибридных клеток через разное время после слияния ЭС клеток с фибробластами (время указано над изображениями). Стрелками указаны флуоросферы. Ядра окрашены DAPI. А и В – гетерокарионы с фибробласто-подобной морфологией;
Б – гетерокарион с ЭС-подобной морфологией;
Г и Е – гибридные клетки с фибробласто-подобной морфологией;
Д – колония ЭС-подобных гибридных клеток.
Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным Oct4 «+» для одного ядра, коллаген «+». фенотипом: маленькая цитоплазма, Oct4 «+», коллаген «-».
Гетерокарины с ЭС-подобным фенотипом: Скопления гибридных клеток с маленькая цитоплазма, Oct4 «+» для обоих фибробласто-подобным фенотипом: большая ядер, коллаген «-». цитоплазма, Oct4 «-», коллаген «+».
Гетерокарионы с фибробласто-подобным Скопления гибридных клеток с фенотипом: большая цитоплазма, Oct4 «-» для "промежуточным" фенотипом: большая обоих ядер, коллаген «+». цитоплазма, Oct4 «-», коллаген «-».
Гетерокарионы с "промежуточным" Скопления гибридных клеток с фенотипом. "промежуточным" фенотипом, прочие.
Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным Nanog «+» для одного ядра, коллаген «+». фенотипом: маленькая цитоплазма, Nanog «+», коллаген «-».
Гетерокарионы с ЭС-подобным фенотипом: Скопления гибридных клеток с маленькая цитоплазма, Nanog «+» для обоих фибробласто-подобным фенотипом: большая ядер, коллаген «-». цитоплазма, Nanog «-», коллаген «+».
Гетерокарионы с фибробласто-подобным Скопления гибридных клеток с фенотипом: большая цитоплазма, Nanog «-» "промежуточным" фенотипом: большая для обоих ядер, коллаген «+». цитоплазма, Nanog «-», коллаген «-».
Гетерокарионы с "промежуточным" Скопления гибридных клеток с фенотипом. "промежуточным" фенотипом, прочие.
Рис. 3. Анализ данных иммунофлюоресцентного окрашивания: Oct4 и коллагена I типа в гетерокарионах (А) и гибридных клетках (Б), Nanog и коллагена I типа в гетерокарионах (В) и гибридных клетках (Г) через разное время после слияния ЭС клеток с фибробластами. Доверительные интервалы построены для вероятности р = 0,95.
Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным ламин A/C «+» для одного ядра. фенотипом: маленькая цитоплазма, ламин A/C «-».
Гетерокарионы с ЭС-подобным фенотипом: Скопления гибридных клеток с маленькая цитоплазма, ламин A/C «-» для фибробласто-подобным фенотипом: большая обоих ядер. цитоплазма, ламин A/C «+».
Гетерокарионы с фибробласто-подобным Скопления гибридных клеток с фенотипом: большая цитоплазма, ламин A/C "промежуточным" фенотипом.
«+» для обоих ядер.
Гетерокарионы с "промежуточным" фенотипом: большая цитоплазма, ламин A/C «-» для обоих ядер.
Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным фибронектин присутствует в цитоплазме. фенотипом: маленькая цитоплазма, фибронектин отсутствует.
Гетерокарионы с ЭС-подобным фенотипом: Скопления гибридных клеток с маленькая цитоплазма, фибронектин фибробласто-подобным фенотипом: большая отсутствует. цитоплазма, фибронектин присутствует.
Гетерокарионы с "промежуточным" Скопления гибридных клеток с фенотипом: большая цитоплазма, "промежуточным" фенотипом: большая фибронектин отсутствует. цитоплазма, фибронектин отсутствует.
Рис. 4. Анализ данных иммунофлюоресцентного окрашивания: ламина А/С в гетерокарионах (А) и гибридных клетках (Б), фибронектина в гетерокарионах (В) и гибридных клетках (Г) через разное время после слияния ЭС клеток с фибробластами.
Доверительные интервалы построены для вероятности р = 0,95.
Через 21 ч после слияния 48% гетерокарионов обладали фибробласто-подобным фенотипом (большой объем цитоплазмы и ламин А/С присутствует в оболочках обоих ядер), тогда как гетерокарионы с «ожидаемым» фенотипом и «промежуточным» фенотипом встречались редко (26% и 13% соответственно;
рис. 4А). Через 21 ч после слияния 85% колоний гибридных клеток состояли из клеток, обладающих фибробласто-подобным фенотипом, 15% колоний состояли из клеток с ЭС-подобным фенотипом (клетки с маленькой цитоплазмой и без ламина А/С в оболочке ядра). Через 45 ч после слияния колонии клеток с ЭС-подобным фенотипом и фибробласто-подобным фенотипом составляли большую часть популяции гибридных клеток (38% и 55% соответственно), а клетки с «промежуточным» фенотипом встречались лишь в 7% колоний (рис. 4Б).
Фибронектин, так же как и коллаген I типа, является маркером фибробластов. Через 4 ч после слияния 89% гетерокарионов обладали «ожидаемым» фенотипом (то есть в цитоплазме гетерокарионов присутствовал фибронектин). Через 21 ч после слияния данный тип гетерокарионов сохранял доминирующую позицию, но несколько увеличивалось число клеток с ЭС-подобным фенотипом (17%, гетерокарионы с маленькой цитоплазмой без фибронектина) и «промежуточным» фенотипом (12%, гетерокарионы с большой вытянутой цитоплазмой, в которых отсутствовал фибронектин). Через 45 ч и 69 ч после слияния большинство гетерокарионов имели «промежуточный» фенотип (79% и 51%, соответственно), оставшуюся часть популяции гетерокарионов составляли клетки с «ожидаемым» фенотипом (рис. 4В). Через 21 ч после слияния 58% колоний состояли из клеток с «промежуточным» фенотипом, и 38% колоний состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом. Через 69 ч после проведения гибридизации колонии клеток с ЭС-подобным фенотипом (24%), фибробласто-подобным фенотипом (33%) и «промежуточным» фенотипом (43%) были представлены в примерно равных соотношениях в популяции гибридных клеток (рис. 4Г).
Суммируя полученные данные иммунофлюоресцентных анализов экспрессии белков, маркирующих родительские типы клеток, можно сделать следующие заключения: через 4 часа после слияния ЭС клеток и фибробластов маркеры родительских клеток (Oct4/Nanog для ЭС клеток;
коллаген I типа, фибронектин и ламин А/С для фибробластов) одновременно выявляются в небольшом числе гетерокарионов. Среди первых гибридных клеток, появляющихся через 21 ч после слияния, мы обнаружили альтернативные фенотипы сходные либо с ЭС клетками, либо фибробластами, и промежуточные фенотипы по набору маркеров не сходные ни с одним из родительских типов клеток. После образования первых гибридных клеток во всех клетках с ЭС-подобной морфологией происходила экспрессия Oct4 и Nanog и отсутствовали коллаген I типа, фибронектин и ламин А/С. Такие гибридные клетки формировали колонии, состоящие из плотно прилегающих друг к другу клеток. В отличие от клеток с ЭС-подобной морфологией, среди гибридных клеток с фибробласто-подобной морфологией встречались промежуточные фенотипы.
Анализ профилей метилирования ДНК 5’-регуляторной области гена Oct4 в ЭС клетках, фибробластах и клетках гибридного клона Показав наличие экспрессии гена Oct4 в гибридных клетках с ЭС-подобной морфологией и ее отсутствие в гибридных клетках с фибробласто-подобной морфологией, мы направили свое внимание на исследование эпигенетических механизмов регуляции гена Oct4 в гибридных клетках, а именно метилирования его 5’-регуляторной области. Используя метод бисульфитного секвенирования, мы подтвердили, что 5’-регуляторная область гена Oct4 неметилирована в ЭС клетках Mus musculus (1+1%;
проанализированных CpG дуплетов были метилированы), но геперметилирована в фибробластах Mus caroli (42+5%;
рис. 5), в которых отсутствует его экспрессия.
Рис. 5. Профили метилирования 5’-регуляторной области гена Oct4 в ЭС клетках, фибробластах и гибридных клетках. Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными – метилированные. В скобках указан процент метилированных сайтов + стандартная ошибка.
Поскольку последовательность 5’-регуляторной области гена Oct4 у M. musculus и M. caroli имеет различия, метод бисульфитного секвенирования позволяет отдельно исследовать метилирование аллелей родительских видов в гибридных клетках. Анализ клеток высоко плюрипотентного клона гибридных клеток (любезно предоставленного Васильковой А.А.), полученных при слиянии ЭС клеток M. musculus и фибробластов M. caroli, показал, что оба родительских эпиаллеля Oct4 были деметилированы (рис. 5). Эти результаты согласуются с полученными ранее данными по метилированию 5’-регуляторной области Oct4 в межвидовых гибридных клетках типа M. musculus ЭС клетка-спленоцит M. caroli (Battulin et al., 2009).
Рис. 6. Профили метилирования 5’-регуляторной области гена Oct4 в гибридных клетках через 48, 96 часов и 8 дней после слияния (А, Б и В соответственно). Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными – метилированные. В скобках указан процент метилированных сайтов + стандартная ошибка.
Анализ профилей метилирования ДНК 5’-регуляторной области Oct4 в гибридных клетках через 48 ч, 96 ч и 8 дней после слияния Анализ профилей метилирования 5’-регуляторной области гена Oct4 на ранних этапах формирования гибридных клеток проводили отдельно для клеток с ЭС-подобной морфологией и фибробласто-пододобной морфологией. Через 48 ч после слияния в гибридных клетках с ЭС-подобной морфологией эпиаллель гена Oct4 ЭС клетки был неметилирован (1+1%, проанализированных CpG дуплетов были метилированы), эпиаллель гена Oct4 фибробласта был заметно гипометилирован (27+4%), по сравнению с уровнем метилирования 5’-регуляторной области Oct4 в исходных фибробластах, но оставался выше, чем в ЭС клетках (рис. 6А). Через 96 ч после слияния в гибридных клетках с ЭС-подобной морфологией уровень метилирования обоих эпиаллелей Oct4 был сопоставим с таковым в ЭС клетках (1+1% для эпиаллеля M. musculus и 7+2% для эпиаллеля M. caroli;
рис. 6Б).
В гибридных клетках с фибробласто-подобной морфологией через 48 ч после слияния степень метилирования обоих эпиаллелей была сходной с таковой в родительских клетках: 2+1% для эпиаллеля Oct4 M. musculus и 53+5% – для эпиаллеля Oct4 M. caroli (рис. 6А). Через 96 ч и 8 дней после слияния в таких гибридных клетках метилирование обоих эпиаллелей Oct4 было на уровне, характерном для фибробластов (рис. 6Б, В).
Таким образом, метилирование-деметилирование 5’-регуляторной области гена Oct4, как один из механизмов «закрепления» результатов репрограммирования этого гена в гибридных клетках, реализуется в течение 4-х дней после слияния.
Состояние неактивной Х-хромосомы в гетерокарионах и гибридных клетках Наличие двух активных Х-хромосом (для клеток мыши с кариотипом: 2N = 40,ХХ) является одним из признаков плюрипотентного состояния клеток.
После слияния ЭС клеток (с кариотипом: 2N = 40,ХY) и соматических клеток (2N = 40,ХХ) в гибридных клетках происходит реактивация неактивной Х-хромосомы, что является одним из признаков репрограммирования генома соматической клетки (Matveeva et al., 1998;
Tada et al., 2001;
Do et al., 2007;
Do et al., 2008).
Триметилирование гистона Н3 по лизину в 27 положении (H3K27me3) является признаком неактивного хроматина, при проведении иммунофлуоресцентного анализа клеток с кариотипом 2N = 40,ХХ с использованием антител против H3K27me3 в ядрах обнаруживают интенсивно окрашенные тельца, соответствующие неактивной Х-хромосоме (Maherali et al., 2007;
Silva et al., 2008). Иммунофлюоресцентный анализ H3K27me3, проведенный нами на культуре фибробластов (2N = 40,ХХ), показал, что в интерфазных ядрах 85% клеток мы наблюдали сигнал, соответствующий неактивной Х-хромосоме, такого сигнала не было выявлено в ядрах ЭС клеток с кариотипом 2N = 40,ХY (рис. 7А).
Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным в одном из ядер есть один сигнал, фенотипом: маленькая цитоплазма, нет ни одного сигнала, соответствующего соответствующий неактивной Ххромосоме неактивной Ххромосоме Гетерокарионы с ЭС-подобным фенотипом: Скопления гибридных клеток с маленькая цитоплазма, нет ни одного сигнала, фибробласто-подобным фенотипом: большая цитоплазма, есть сигнал, соответствующий соответствующего неактивной Ххромосоме неактивной Ххромосоме Гетерокарионы с "промежуточным" Скопления клеток с "промежуточным" фенотипом: большая цитоплазма, нет ни фенотипом большая цитоплазма, нет ни одного сигнала, соответствующего одного сигнала, соответствующего неактивной Ххромосоме неактивной Ххромосоме Рис. 7. А – Иммунофлюоресцентное окрашивание H3K27me3 в ЭС клетках с кариотипом: 2N = 40,ХY (слева) и фибробластах 2N = 40,ХХ (справа). Стрелками указан сигнал, соответствующий неактивной Х-хромосоме. Антитела против иммуноглобулинов мечены флуорохромом Alexa Fluor 546, ядра окрашены DAPI.
Б и В – Анализ данных иммунофлюоресцентного окрашивания H3K27me3 в гетерокарионах и гибридных клетках, соответственно, через разное время после слияния ЭС клеток 2N = 40,ХY и фибробластов 2N = 40,ХХ. Доверительные интервалы построены для вероятности р = 0,95.
Мы провели иммунофлюоресцентный анализ гетерокарионов и гибридных клеток, полученных в результате трех независимых гибридизаций ЭС клеток (2N = 40,ХY) и фибробластов (2N = 40,ХХ). Через 4 ч после проведения гибридизации 79% гетерокарионов обладали «ожидаемым» фенотипом (то есть в одном из ядер присутствовало одно интенсивно окрашенное тельце), и 18% гетерокарионов имели «промежуточный» фенотип (клетки с крупной многоотростчатой цитоплазмой, а в ядрах нет ни одного сигнала H3K27me3).
Сходная ситуация сохранялась и через 8 ч после слияния. Через 21 ч после проведения гибридизации доля гетерокарионов с «промежуточным» фенотипом возрастала до 30% и продолжала расти. Через 45 ч и 69 ч после слияния гетерокарионы с «ожидаемым» фенотипом и «промежуточным» фенотипом присутствовали в приблизительно равных соотношениях (рис. 7Б). Через 21 ч после слияния клетки 49% колоний имели «промежуточный» фенотип (крупную многоотростчатую цитоплазму, а в ядрах нет ни одного ярко окрашенного тельца), 15% колоний состояли из клеток с ЭС-подобным фенотипом, а оставшиеся колонии состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом.
Через 45 ч и 69 ч после слияния колонии, состоящие из клеток с ЭС-подобным и «промежуточным» фенотипами, составляли в примерно равном соотношении большинство колоний гибридных клеток, тогда как лишь 20% колоний состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом (рис. 7В).
Подводя итог проделанной работе, основываясь на результатах трех независимы анализов (анализе экспрессии генов, метилирования ДНК и активации Х-хромосомы) можно говорить, что репрограммирование генома соматической клетки начинается на стадии гетерокариона. Мы наблюдали не доминирование генома менее дифференцированной клетки (в нашем случае ЭС клетки) в составе гибридной клетки, а альтернативное проявление геномов родительских клеток, в виде гетерогенности популяции гетерокарионов и гибридных клеток, среди которых были как ЭС-подобные клетки, так и фибробласто-подобные клетки. Существование гибридных клеток с двумя контрастными морфологиями не является следствием изменения соотношения родительских геномов, однако механизм формирования альтернативных фенотипов не ясен и требует дальнейшего изучения.
ВЫВОДЫ Модифицирован метод идентификации гетерокарионов и гибридных 1.
клеток в первые часы после слияния ЭС клеток и фибробластов, основанный на использовании флуоресцентных маркеров, дискриминирующих родительские типы клеток. Показано, что надежность такой идентификации составляет не менее 90%. Впервые установлено, что через 21 ч после слияния выявляются два морфологически различных типа гибридных клеток: один, имеющий сходство с ЭС клетками, другой – с фибробластами.
Показано, что через 21 ч после слияния ЭС клеток и фибробластов в 2.
гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с ЭС клетками, есть экспрессия Oct4 и Nanog – генов, характерных для плюрипотентных клеток, но отсутствуют коллаген I типа, фибронектин и ламин А/С, маркеры, типичные для фибробластов. Сигнал, выявляемый антителами к Н3К27me3, маркирующий неактивную Х-хромосому, не обнаружен в гибридных клетках такого типа.
Установлено, что в течение 96 ч после слияния ЭС клеток M. musculus и 3.
фибробластов M. caroli в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с ЭС клетками, происходит деметилирование ДНК 5’-регуляторной области эпиаллеля фибробласта гена Oct4, до уровня характерного для этого района в ЭС клетках.
Впервые показано, что через 21 ч после слияния ЭС клеток и 4.
фибробластов в гибридных клетках морфологически сходных с фибробластами отсутствуют Oct4 и Nanog. Для части гибридных клеток такого морфологического типа показана экспрессия коллагена I типа, фибронектина и ламина А/С, а также выявлен сигнал, маркирующий неактивную Х-хромосому.
В течение 96 ч после слияния в гибридных клетках, имеющих 5.
морфологическое сходство с фибробластами, происходит метилирование ДНК 5’-регуляторной области эпиаллеля ЭС клеток гена Oct4 до уровня характерного для этого района Oct4 фибробластов.
Впервые показано, что для гибридных клеток, полученных при слиянии 6.
диплоидных ЭС клеток и диплоидных фибробластов, наблюдается альтернативное проявление родительских геномов и формируются контрастные типы гибридных клеток: в одном из которых, доминирует геном, привнесенный ЭС клетками, другом – доминирует геном фибробласта.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Круглова А.А., Гридина М.М., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Гибридные клетки, 1.
полученные слиянием эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетраплоидными фибробластами, имеют альтернативные родительские фенотипы // Докл. Акад. Наук.
2008. Т. 422. №1. С. 125-127. (Перечень ВАК) 2. Kruglova A.A., Kizilova E.A., Zhelezova A.I., Gridina M.M., Golubitsa A.N., Serov O.L. Embryonic stem cell-fibroblast hybrid cells with near-tetraploid karyotype provide high yield of chimeras // Cell Tissue Res. 2008. V. 334. P. 371-380. (Перечень ВАК) 3. Kruglova A.A., Matveeva N.M., Gridina M.M., Battulin N.R., Karpov A.V., Kiseleva E.V., Morozova K.N., Serov O.L. Dominance of parental genomes in embryonic stem cell/fibroblast hybrid cells depends on the ploidy of the somatic partner // Cell Tissue Res. 2010. DOI:10.1007/s00441-010-0987-3. (Перечень ВАК) Матвеева Н.М., Круглова А.А., Гридина М.М., Кизилова Е.А., Баттулин Н.Р., 4.
Пузаков М.В., Серов О.Л. Доминантность и рецессивность родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетраплоидными фибробластами // 3rd International Conference Basic Science for Medicine. Новосибирск. 2007. С. 66.
Круглова А.А., Гридина М.М., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Влияние плоидности 5.
соматического партнера на фенотип гибридных клеток, полученных при слиянии с эмбриональными столовыми клетками // Тезисы международной научной конференции молодых ученых “Проблемы молекулярной и клеточной биологии”. Томск. 10-12 мая.
2007. С. 106-107.
Кизилова Е.А., Круглова А.А., Голубица А.Н., Железова А.И., Гридина М.М., 6.
Матвеева Н.М., Серов О.Л. Анализ химеризма генерированного инъекцией в бластоцель гибридных клеток, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток с фибробластами // Симпозиум с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза». Москва. 9-11 октября 2007. С. 74-76.
7. Kruglova A.A., Gridina M.M., Matveeva N.M., Serov O.L. Phenotype and chromosome segregation in hybrid cells generated by fusion embryonic stem cells and tetraploid fibroblasts // IV International Meetings Stem Cells Network North Rhine Westphalia. Dsseldorf. Germany. 8-9 October. J. Regenerative Medicine. Nov. 2007. Vol.2.
No. 6. Р.S8.
Круглова А.А., Гридина М.М., Мензоров А.Г., Матвеева Н.М., Серов О.Л.
8.
Фенотип гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых клеток и тетраплоидных фибробластов // Цитология. Тезисы докладов. Санкт Петербург. 16-19 октября 2007. Т. 49, № 9. С. 762.
9. Gridina M.M., Kruglova A.A., Matveeva N.M., Serov O.L. Alternative dominance of parental genomes in embryonic stem cell-fibroblast cell hybrids // Abstracts of papers presented at the LXXIII Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. Control and regulation of stem cell. Cold Spring Harbor, USA. 28 May - 2 June. 2008. P. 10. Gridina M.M., Kruglova A.A., Kizilova E.A., Matveeva N.M., Serov O.L.
Alternative expression of parental genomes in embryonic stem cell-fibroblast cell hybrids // BIT Life Sciences 1st Annual World Congress of Regenerative Medicine and Stem Cells.
Foshan, China, December 2-4, 2008, P. 105.
Круглова А.А., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Гридина М.М., Баттулин Н.Р., 11.
Пристяжнюк И.Е., Серов О.Л.. Сходство ранних стадий перепрограммирования фибробластов после их слияния с эмбриональными стволовыми клетками и при индукции в них плюрипотентности путем транзиторной трансфекции векторами экспрессирующими OCT4/SOX2 // V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва. 21-27 июня 2009. Т. 1. С. 131.
12. Gridina M.M., Serov O.L. Reprogramming of parental genomes in Embryonic stem cell – fibroblast heterokaryons and synkaryons //
Abstract
book of the 5th Royan international on stem cells biology and technology. Tehran. Iran. 23 – 25 September 2009. P.96.
Серов О.Л., Круглова А.А., Матвеева Н.М., Гридина М.М., Кизилова Е.А., 13.
Баттулин Н.Р. Ранние стадии перепрограммирования фибробластов в гетеро- и синкарионах и при индукции в них плюрипотентности с помощью трансфекции векторами экспрессирующими Oct4/Sox2 и Nanog/Lin28 // Тезисы докладов и сообщений, представленных на Всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт Петербург, 12-14 октября 2009 г.) Цитология, 2009, Т.51, №9. С. 785.