Механизм формирования комплексов -лактальбумина с олеиновой кислотой и молекулярные аспекты их цитотоксического действия
На правах рукописи
КНЯЗЕВА ЕКАТЕРИНА ЛЕОНИДОВНА МЕХАНИЗМ ФОРМИРОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ -ЛАКТАЛЬБУМИНА С ОЛЕИНОВОЙ КИСЛОТОЙ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ 03.01.02 – биофизика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пущино 2010
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологического приборостроения РАН.
доктор биологических наук, профессор Научные руководители:
Пермяков Евгений Анатольевич кандидат физико-математических наук Пермяков Сергей Евгеньевич доктор физико-математических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Хечинашвили Николай Николаевич доктор биологических наук Орлов Николай Яковлевич Биологический факультет
Ведущая организация:
Московского Государственного Университета
Защита диссертации состоится « 30 » июня 2010 г. в 11-00 часов на заседании совета Д 002.066.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте фундаментальных проблем биологии РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Институтская ул., 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Институтская ул., 2.
Автореферат разослан «» мая 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Г.Н. Назарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы В настоящее время известен целый ряд белков природного происхождения, обладающих селективной цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам. Одним из таких препаратов является мультимерная форма человеческого -лактальбумина (MAL), выделенная из казеиновой фракции молока (Hakansson et al. 1995). Показано, что MAL проявляет цитотоксическую активность по отношению к раковым и недифференцированным клеткам, не затрагивая при этом зрелые и здоровые клетки. MAL также обладает выраженной антибактериальной активностью по отношению к штаммам Streptococcus pneumonia. Группе К.Сванборг удалось получить подобное состояние in vitro с помощью ионообменной хроматографии апо-формы (свободной от Са2+) человеческого или коровьего лактальбумина (-ЛА) на колонке, предварительно кондиционированной олеиновой кислотой (ОК) (Svensson et al. 2000). Это состояние белка получило название HAMLET/BAMLET (human/bovine alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells).
Исследование механизма действия HAMLET на клетки обнаружило удивительную способность комплекса запускать в раковых клетках несколько путей клеточной гибели. Это обстоятельство позволяет надеяться на создание на основе HAMLET лекарственных средств, способных бороться с опухолевыми клетками самыми разными путями.
Несмотря на то, что состояние HAMLET активно изучают на протяжении последнего десятилетия, остаются неразрешёнными многие принципиальные вопросы. До сих пор остается не выясненной структура HAMLET, а также взаимодействия, стабилизирующие комплекс -ЛА с ОК. Многоступенчатая процедура, применяемая для приготовления HAMLET, представляет собой сложный с физико-химической точки зрения процесс, препятствующий исследованию молекулярных основ формирования комплекса -ЛА с ОК. Попытки образования активного комплекса путем простого смешения обоих компонентов в условиях раствора сопряжены с образованием протяженных фаз олеиновой кислоты, что приводит к выраженной гетерогенности системы и высокой степени зависимости результатов от условий смешения компонентов. Согласно некоторым работам, приготовленные таким образом комплексы -лактальбумина с ОК обладают низкой в сравнении с HAMLET цитотоксической активностью, однако систематические исследования процесса формирования комплексов -ЛА с ОК в условиях раствора в литературе отстутствуют. Наконец, несмотря на интенсивное изучение механизмов, лежащих в основе цитотоксического действия комплекса, до сих пор остаётся не выясненным механизм его проникновения в клетку, а также влияние модификации лактальбумина олеиновой кислотой на взаимодействие -ЛА с одной из основных мишеней HAMLET в клетке - гистонами.
Цели и задачи исследования Целью настоящей работы было изучение механизма формирования в условиях раствора активных по отношению к раковым клеткам комплексов-ЛА с олеиновой кислотой в отсутствие протяженных фаз ОК, а также выяснение влияния модификации-ЛА олеиновой кислотой на взаимодействие белка с мембранами и гистонами.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) Изучить влияние условий раствора на эффективность образования комплекса ЛА с олеиновой кислотой, с учётом критической концентрации мицеллообразования (ККМ) ОК.
2) Исследовать роль различных взаимодействий в стабилизации комплекса -ЛА с олеиновой кислотой.
3) Провести сравнительное исследование структурных, физико-химических и цитотоксических свойств состояния HAMLET и комплексов -ЛА - ОК, получаемых в оптимизированных условиях раствора.
4) Исследовать влияние модификации-ЛА олеиновой кислотой на взаимодействие белка с искусственными и природными мембранами, а также гистонами, на примере гистона Н1.
Научная новизна В работе впервые проведено исследование взаимодействия -лактальбумина с олеиновой кислотой в условиях раствора с учётом критической концентрации мицеллообразования жирной кислоты. Подобраны оптимальные условия раствора, обеспечивающие максимальную ёмкость белка по отношению к ОК. Обнаружено, что -лактальбумин обладает множественными центрами связывания олеиновой кислоты.
Показано, что стабилизация комплекса-ЛА - ОК достигается за счет гидрофобных взаимодействий между белком и ОК. Связывание ОК не вызывает олигомеризации белка, не изменяет его эффективного сродства к ионам Са2+, однако приводит к снижению термостабильности апо--ЛА, а также к увеличению содержания в нем спиралей. Изучение структурных, физико-химических и цитотоксических свойств комплексов -ЛА - ОК, полученных в оптимизированных условиях раствора, обнаружило сходство этих комплексов с состоянием HAMLET.
Впервые показано, что комплексы -лактальбумина с ОК наряду с интактным белком взаимодействуют как с искусственными фосфолипидными мембранами, так и с природными мембранами клеток водорослей Chara corallinа. При этом модификация -ЛА олеиновой кислотой приводит к усилению наблюдаемых эффектов. Комплексы -ЛА - ОК вызывают изменения ионных токов через плазмалемму клеток Chara corallinа, приводя к развитию неспецифической проницаемости мембраны за счёт нарушения её целостности. Также показано, что модификация белка олеиновой кислотой повышает его сродство к гистону H1 in vitro, однако не является необходимым условием взаимодействия-ЛА с гистоном.
Научно-практическая значимость Показано, что общепринятый специфический протокол получения состояния HAMLET не является необходимым условием получения комплекса -лактальбумина с ОК, обладающего цитотоксической активностью по отношению к раковым клеткам.
Тот факт, что подобные комплексы могут быть приготовлены в водном растворе без использования ионообменных носителей, облегчает и удешевляет процесс их приготовления, делает его более контролируемым и гибким. Предлагаемая в работе методика открывает дополнительные возможности для создания активных комплексов -ЛА – ОК, обладающих требуемыми свойствами, путем внесения модификаций (добавление дополнительных компонентов в раствор, использование других жирных кислот, и пр.), направленных на увеличение эффективности препаратов, повышение селективности их действия по отношению к раковым клеткам, и пр.
Следует отметить, что предложенная в работе методика определения ёмкости белка по отношению к жирной кислоте, основанная на измерении зависимости величины эффективной критической концентрации мицеллообразования ЖК от концентрации белка, может быть применена для исследования взаимодействия других белков с жирными кислотами и другими амфифильными веществами в отсутствие их протяженных фаз.
Апробация работы Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на симпозиумах и конференциях: 11-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007);
Школа – конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия - 2007» (Пущино, 2007);
12-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008);
2nd Symposium on HAMLET and tumor-killing proteins (Lund, 2009);
14-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010).
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической части, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы ( 151 источник).
Работа иллюстрирована 25 рисунками и содержит 9 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы. Человеческий -ЛА был выделен из молока по методике, описанной в работе (Kaplanas & Antanavichyus 1975). Коровий -ЛА приобретён у фирмы Sigma Chemical Co. Для работы использовали реактивы степени «осч». Проводимость используемой воды составляла не более 0,05 мкСм/см.
Выбор величины рН и температурных условий. В большинстве экспериментов использовали рН 8,3 - величину, используемую при приготовлении состояния HAMLET. Титрование -ЛА олеиновой кислотой выполняли при температурах 17°С (выше температуры плавления ОК, 16°С, и ниже середины теплового перехода апо- ЛА) и 45°С (тепловой переход апо-формы белка завершён).
Приготовление состояния HAMLET проводили согласно методике, описанной в работе (Pettersson et al. 2006), с помощью анионообменной хроматографии на колонке с носителем ДЭАЭ-Трисакрил M.
Приготовление комплексов LA-OA-17 и LA-OA-45. 50 мл 10 мкМ раствора -ЛА, свободного от Ca2+, (pH 8,3, 20 мМ H3BO3-KOH, 150 мM NaCl, 1 мМ ЭДТА) титровали аликвотами 15-20 мкл 50 мМ раствора ОК в 96% этаноле, при постоянном перемешивании до достижения ККМ. Полученные при 17C (LA-OA-17) или 45C (LA-OA-45) комплексы диализовали против дистиллированной воды, лиофилизовали и хранили при -18С.
Приготовление комплекса bLA-OA-45. 2-6 мл 600 мкМ раствора коровьего -ЛА, свободного от Ca2+,(pH 12,0, 5 мМ KOH, 1 мМ ЭДТА) титровали при 45С аликвотами 10-15 мкл 0,994 М раствора ОК в 96% этаноле до достижения ККМ.
Свободную ОК удаляли путём снижения рН до 2,0-2,5 и центрифугирования в течение 30 мин., 12000 g. Нижнюю фазу, не содержащую протяжённых фаз ОК, отбирали и доводили рН до 6. Полученный раствор диализовали против дистиллированной воды и лиофилизовали.
Приготовление малых униламеллярных везикул дипальмитоил фосфатидилхолина (ДПФХ) проводили согласно методике, описанной в работе (Huang 1969). Для разделения смеси везикул использовали носитель Сефароза CL-4В.
Собирали второй пик элюции, соответствующий малым везикулам ДПФХ.
Выделение комплекса -ЛА с липосомами проводили согласно работе (Berliner & Koga 1987). Связавшийся с липосомами -ЛА отделяли от свободного белка при помощи гель-фильтрации на носителе Сефадекс G-200.
Оценки ёмкости белка по отношению к ОК проводили на спектрофотометре Cary 100 (Varian Inc.) с термостатируемым кюветодержателем. 3 мл буфера титровали аликвотами 2-6 мкл 1-100 мМ раствора ОК в 96% этаноле. Появление протяжённых фаз ОК контролировали по росту рассеяния света при 310 нм. ККМ свободной кислоты (ККМ0) оценивали из спектрофотометрической кривой титрования как концентрацию ОК, соответствующую точке пересечения двух линейно аппроксимированных участков титрационной кривой. Аналогичным способом измеряли кажущееся значение ККМ ОК в присутствии -ЛА в концентрации [Р], которое прямо пропорционально ёмкости белка по отношению к ОК (nmax):
ККМ=ККМ0+ nmax·[P] (1) Величину nmax определяли из наклона зависимости ККМ от [P].
Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian Inc.) с термостатируемым кюветодержателем. При измерении температурных зависимостей белковой флуоресценции температуру образца изменяли ступенчатым образом, с шагом 2C. Средняя скорость нагрева составляла 0,5C/мин.
Круговой дихроизм (КД). Измерение КД проводили на спектрополяриметре JASCO J 810 (JASCO Inc.) с термостатируемым кюветным отделением. Конечный спектр являлся результатом усреднения данных трёх измерений за вычетом спектра буфера (20 мM H3BO3-KOH, 150 мM NaCl, 1 мM ЭДТА, pH 8,3). Для количественной оценки содержания элементов вторичной структуры белка использовали пакет ПО CDPro (Sreerama et al. 2000).
Очистка белка от ионов кальция проводилась с помощью гель-фильтрации смеси белка с хелатором ионов Ca2+ на носителе Сефадекс G-25 (Blum et al., 1977).
Измерение сродства белка к кальцию проводили путём спектрофлуориметрического титрования очищенного от Ca2+ белка стандартным раствором CaCl2. Равновесную константу связывания Ca2+ белком, К, определяли из экспериментальных данных согласно кооперативной схеме связывания:
K [1] Белок + n Ca Белок ·Ca2+n 2+ где n – коэффициент Хилла. Подгонка экспериментальных данных проводилась с помощью программы FluoTitr v.1.2 (ИБП РАН, Пущино), по методу Маркуардта, путём варьирования параметров n и K. Абсолютная ошибка определения К не превышала ±0,25 порядка величины.
Измерение сродства белка к ОК. Для оценки сродства -ЛА к ОК использовали метод, аналогичный описанному выше для оценки сродства к Ca2+. Раствор -ЛА титровали аликвотами раствора ОК до величины ККМ.
Исследование взаимодействия a-ЛА с гистоном Н1 проводили на спектрофлуориметре Cary Eclipse. Триптофановую флуоресценцию -ЛА возбуждали при 304,5 нм, при спектральной ширине 5 нм. Эффективные параметры ассоциации гистона с -ЛА определяли из экспериментальных данных согласно кооперативной схеме связывания [1].
Гель-фильтрационная хроматография для проверки наличия олигомеров белка проводилась с помощью системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Prominence HPLC (Shimadzu) на колонке Superdex S-200, уравновешенной буфером 20 мМ H3BO3-KOH, 250 мM NaCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,3. Образцы растворяли в том же буфере с последующим центрифугированием (1300 об./мин. в течение минут при комнатной температуре). Калибровку проводили в тех же условиях.
Тест на цитотоксичность проводили совместно с сотрудниками Лаборатории тканевой инженерии ИТЭБ РАН, Пущино. Клетки HEp-2 были выращены на модифицированной Дульбекко питательной среде Игла (DMEM), дополненной 10% зародышевой сывороткой крупного рогатого скота, в присутствии 40 мг/мл гентамицина, 35 мМ бикарбоната натрия и 20 мМ HEPES при 37°C, в атмосфере 5% CO2.
Растворы -ЛА и комплексов белка с ОК в ростовой среде, также как и ОК ( М раствор в этаноле), добавляли в культуральную среду спустя 24 часа после посева клеток. Цитотоксичность оценивали, используя анализ с кристаллическим фиолетовым, по отношению оптических плотностей на 560 нм в обработанной и контрольной культуре спустя 48 часов после добавления токсичного агента (Nomizu et al. 1995). Отношение оптических плотностей прямо пропорционально числу выживших клеток. Каждый эксперимент выполняли не менее трёх раз.
Электрофизиологические исследования были выполнены совместно с Жереловой О.М. (Лаб. Ультраструктуры нейрона ИТЭБ РАН, г. Пущино) и Катаевым А.А. (Лаб.
Молекулярной физиологии клетки ИБК РАН, г. Пущино) согласно экспериментальной методике, описанной в работах (Lunevsky et al. 1983) и (Kataev et al. 1984). В работе использовали междоузловые клетки водоросли Chara corallinа.
Представлены усредненные электрофизиологические данные, полученные на 5- отдельных клетках.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Зависимость ККМ олеиновой кислоты от условий раствора Приготовление комплексов -ЛА с ОК в условиях раствора проводили при значении рН 8,3, используемом при получении состояния HAMLET. Карбоксильная группа мономерной ОК в данных условиях полностью депротонированна (рКа 4,8) и способна связывать ионы кальция, что, в свою очередь, может влиять на ККМ олеиновой кислоты. Действительно, значение ККМ в отсутствие ионов Са2+ (1 мМ ЭДТА) более чем в 5 раз превышало значения, полученные в условиях избытка Са2+ (1 мМ СаСl2). Добавление NaCl либо KCl оказывало меньшее влияние на величину ККМ.
Таким образом, условия отсутствия Са2+ наиболее благоприятны для насыщения белка ОК.
Ёмкость -лактальбумина по отношению к олеиновой кислоте Для оценки ёмкости -ЛА по отношению к олеиновой кислоте (nmax) нами была определена зависимость эффективной критической концентрации мицеллообразования ОК от концентрации белка при 17С и 45С. Величина ККМ увеличивается пропорционально концентрации белка, при этом наклон прямой линии соответствует величине nmax (Уравнение (1)). Показано, что максимальная величина nmax достигается в условиях отсутствия Са2+, в присутствии солей и повышенной температуре (Табл. 1). При этом nmax не зависит от типа соли (KCl или NaCl).
Повышение температуры с 17С до 45С сопровождается 40% увеличением nmax.
Важность ионной силы для эффективного связывания ОК -лактальбумином подтверждается снижением nmax в 3-8 раз в отсутствие солей.
Табл. 1. Зависимость ёмкости -ЛА по отношению к ОК (nmax) от условий раствора.
1 мM CaCl2 1 мM ЭДTA Температура nmax, nmax, nmax, nmax, без солей без солей 150 мM NaCl 150 мM KCl 17C 0 3,7 13,5 12, 45C 0 2,2 18,5 18, Критическим условием для ассоциации ОК явилось отсутствие ионов Са2+, что также подтверждается экспериментами по спектрофлуориметрическому и КД- (в дальней УФ-области) титрованию -ЛА олеиновой кислотой, которые не выявили каких-либо спектральных изменений для белка, насыщенного кальцием (данные не представлены). Этот вывод хорошо согласуется с имеющимися в литературе данными о невозможности формирования состояния HAMLET из Ca2+-насыщеного белка (Svensson et al. 2000).
В целом, Табл. 1 свидетельствует о том, что наиболее благоприятные для формирования комплекса между -ЛА и ОК условия, соответствующие максимальной ёмкости белка, достигаются в отсутствие ионов Са2+ при 45С в присутствии 150 мМ NaCl/KCl. Эти условия переводят белок в состояние «расплавленной глобулы», обладающее хорошо выраженной вторичной структурой, но лишенное уникальной пространственной структуры (Dolgikh et al., 1981).
Са2+ Сворачивание -ЛА путём понижения температуры или связывания сопровождается снижением величины nmax.
Механизм связывания олеиновой кислоты -лактальбумином Связывание ОК -лактальбумином в оптимальных условиях сопровождается коротковолновым сдвигом максимума спектра флуоресценции на 2 нм, свидетельствуя о снижении подвижности и полярности окружения остатков Trp белка, указывая на уменьшение их доступности растворителю.
Для выяснения деталей механизма связывания ОК белком нами были построены флуоресцентные фазовые графики, представляющие собой зависимость интенсивности флуоресценции при фиксированной длине волны от интенсивности флуоресценции при другой длине волны (Бурштейн, 1977) (Рис. 1). Каждая прямая линия на фазовом графике соответствует переходу между двумя конформационными состояниями белка. Таким образом, можно выявить точки, соответствующие макси мальной заселённости отдельных состояний белка, а также переходам между этими состояниями.
Фазовый график для спектрофлуориметрического титро вания -ЛА, свободного от Ca2+, Анализ результатов Рис. 1.
олеиновой кислотой до ККМ при 45С спектрофлуориметрического титрования ОК -ЛА, свободного от Ca2+, при 45C, рН представлен на Рис. 1. Видно, что 8,3, с помощью фазового графика. процесс связывания ОК Показаны отношения ОК/белок, лактальбумином протекает с соответствующие ключевым точкам фазового графика. образованием, по меньшей мере, трёх интермедиатов при 45С и двух промежуточных состояний белка при 17С (данные не представлены). Это, в свою очередь, согласуется с оценками ёмкости апо-белка по отношению к ОК и свидетельстует о наличии множественных центров связывания олеиновой кислоты в апо-форме -лактальбумина.
Несмотря на то, что связывание ОК -лактальбумином, свободным от Ca2+, сложный мультистадийный процесс, можно оценить псевдо-равновесную константу связывания ОК K, используя кооперативную схему связывания n молекул ОК на молекулу белка. В результате оценки мы получили значения К=2104 М-1 и n=1,3 при 17С. При 45С наблюдали повышение сродства -ЛА к ОК примерно на порядок величины, что находится в соответствии с данными по увеличению величин nmax с повышением температуры (Табл.1).
Исследование взаимодействий, стабилизирующих комплексы -лактальбумина с олеиновой кислотой Повышение ёмкости и эффективного сродства апо--ЛА по отношению к ОК в результате разворачивания белка, сопровождающегося экспонированием гидрофобных групп белка растворителю, говорит в пользу решающей роли гидрофобных взаимодействий в образовании комплекса белка с жирной кислотой.
Для проверки этой гипотезы нами были выбраны крайне щелочные условия среды (рН 12,0), при которых практически полностью исключается электростатическое взаимодействие между оснвными аминокислотными остатками белка (за исключением одного остатка аргинина) и отрицательно заряженной карбоксильной группой жирной кислоты. Известно, что при щелочных рН коровий -лактальбумин претерпевает структурные изменения, вызванные депротонированием остатков лизина и тирозина (Permyakov et al., 1985). При рН 12,0 щелочной денатурационный переход апо--ЛА полностью завершён.
Спектрофотометрическое Табл. 2. Зависимость ёмкости коровьего -ЛА по измерение величины ККМ отношению к ОК (nmax) от условий раствора при pH 12,0.
ОК при рН 12, 1 мM CaCl2 1 мM ЭДТА показывает значительное Температура nmax, nmax, nmax, увеличение ККМ в 150 мM KCl без солей 150 мM KCl 2+ отсутствии ионов Ca (до 20C 0 14±1 25±2 миллимолей), по cравне 45C 0 34±5 22±3 нию с ККМ при рН 8, (данные не представлены), что согласуется с литературными данными об увеличении растворимости длинноцепочечных жирных кислот с повышением рН раствора (Kanicky et al., 2002).
В то же время, в присутствии 1 мМ CaCl2 величина ККМ олеиновой кислоты остается достаточно низкой (~4 мкM).
Необходимо отметить, что увеличение растворимости ОК при рН 12, приводит, соответственно, к увеличению ошибки при определении ККМ0 до нескольких сотен микромолей. Поэтому для более точного определения ёмкости ЛА по отношению к ОК при рН 12,0 использовали концентрации белка ~600 мкМ.
Полученные в результате величины nmax представлены в Табл. 2.
Показано, что ёмкость Ca2+-насыщенного -ЛА по отношеню к ОК равна нулю.
Для апо-формы белка ёмкость по отношению к ОК была даже выше, чем при рН 8, (см. Табл. 1). Это, с одной стороны, свидетельствует о том, что электростатические взаимодействия не играют существенной роли в процессе формирования комплексов -лактальбумина с ОК, с другой стороны, увеличение nmax в данных условиях, когда гидрофобная поверхность апо-белка экспонирована растворителю за счёт щелочной денатурации, подтверждает гидрофобный характер взаимодействий, стабилизирующих комплексы -ЛА с олеиновой кислотой.
В оптимизированных условиях раствора, обеспечивающих максимальную ёмкость -лактальбумина по отношению к ОК при рН 8,3 и рН 12,0, были приготовлены комплексы LA-OA-45 (LA-OA-17) и bLA-OA-45, соответственно, как описано в главе Методы. Далее необходимо было провести сравнительное исследование структурных, физико-химических и цитотоксических свойств данных комплексов и состояния HAMLET.
Содержание олеиновой кислоты в препаратах LA-OA Для оценки числа молекул ОК, приходящихся на молекулу -лактальбумина в препарате LA-OA-17 (nirr) (после диализа насыщенного ОК белка против воды, с последующей лиофилизацией), некоторые физико-химические параметры LA-ОА- сравнивали с таковыми для комплексов-ЛА с OК, полученных добавлением при 17С олеиновой кислоты до достижения фиксированного молярного отношения ОК к белку. На Рис. 2 представлены результаты экспериментов по тепловой денатурации смеси ОК--ЛА, полученные методом собственной флуоресценции. Как видно из Рис.
2, ассоциация ОК приводит к значительному снижению термостабильности апо белка. Дестабилизация -ЛА приводит к сдвигу спектра флуоресценции при 10С в длинноволновую область. Начальную часть зависимости max при 10°C и t1/2 от молярного соотношения [ОК]/[белок] можно аппроксимировать прямой линией (Рис.
2). Сравнивая величины этих параметров для LA-OA-17 с калибровочной кривой, получаем значение nirr равное 6±0,4.
Аналогичным образом, величина nirr для LA-OA-45 составляет ~9. Однако в этом случае зависимость max от молярного соотношения OК/белок теряла линейность выше отношения 10:1 (данные не представлены), что затрудняло точную оценку nirr.
nirr Величина для состояния HAMLET не может быть определено аналогичным способом, вследствие специфи ческих условий формирования данного комплекса. Среднее число молекул олеиновой кислоты, связанных на молекулу HAMLET, по литературным данным варьирует от 0,6-1, (Svensson et al. 2003) до 5,1-5, Зависимость спектральных и Рис. 2. (Pettersson-Katsberg et al. 2009).
-ЛА, термодинамических параметров Снижение термо 2+ свободного от Ca, от молярного соотношения стабильности апо--ЛА при ОК к белку (20 мM H3BO3-KOH, 150 мM NaCl, связывании ОК свидетельствует мM ЭДТА, pH 8,3). Горизонтальные линии указывают значения соответствующих о большем сродстве к ОК параметров для LA-OA-17.
денатурированного состояния белка, что находится в соответствии с полученными оценками сродства белка к ОК, а также дополнительно подтверждает решающую роль гидрофобных взаимодействий в образовании комплексов.
Исследование содержания олигомерных форм в комплексах-лактальбумина с олеиновой кислотой Для проверки возможного наличия олигомерных форм комплексов -ЛА с ОК была применена гель-фильтрационная ВЭЖХ на носителе Superdex S-200.
Из Рис. 3 видно, что все образцы при 17°С элюируются одним симметричным пиком, соответствующим мономерной форме человеческого -ЛА. Тем не менее, при высокой концентрации интактного белка (334 мкМ) Рис. 3. Гель-фильтрационная ВЭЖХ -ЛА ( обнаружен минорный пик, мкМ), HAMLET (155 мкМ), LA-OA-17 (49 мкМ) и LA-OA-45(20 мкМ), свободных от Ca2+ (1 мM соответствующий димеру -ЛА.
ЭДТА), на колонке Superdex S-200, 17C, pH 8,3.
Аналогичные результаты были получены при 40°С, а также в условиях насыщения интакного белка и его ОК комплексов ионами Ca2+ (данные не представлены).
Таким образом, гель-фильтрационный анализ показывает, что модификация лактальбумина олеиновой кислотой не приводит к олигомеризации белка.
Влияние связывания ОК на термостабильность -ЛА, его сродство к Са2+ и вторичную структуру Связывание ОК приводит к заметному снижению термостабильности апо- ЛА, что видно из Рис. 2, а также из спектрофлуориметрических данных по тепловой денатурации различных состояний -ЛА, приведённых на Рис. 4А. В то время как комплекс LA-OA-17 характеризуется сдвигом термостабильности по отношению к интактному -ЛА на 9С (Рис. 2), насыщение белка олеиновой кислотой до величины ККМ при 17С вызывает более значительное изменение термостабильности - на 12С. Более выраженные относительно LA-OA-17 изменения термо стабильности, обнаруженные для LA-OA-45 и белка, насыщенного ОК, коррелируют с бльшим числом молекул ОК, приходящихся на молекулу -ЛА (nirr).
Рис. 4. Термостабильность различных состояний апо- (А) и Са2+-насыщенного (Б) -ЛА при рН 8,3: интактный -ЛА (), HAMLET (), LA-OA-17 (+), LA-OA-45 () и -ЛА, насыщенный ОК до ККМ при 17°C () или 45oC ().
В отличие от апо-белка, насыщенные Ca2+ (1 мМ CaCl2) комплексы HAMLET, LA-OA-17 и LA-OA-45 демонстрировали слабое (менее, чем на 4С) повышение термостабильности, по сравнению с интактным -ЛА (Рис. 4Б).
Для изучения влияния ассоциации ОК на сродство -ЛА к ионам Ca2+ проведено спектрофлуориметрическое титрование кальцием белка, очищенного от катионов, при 45. Несмотря на заметное снижение термостабильности всех комплексов апо--ЛА c ОК (Рис. 4А), их эффективное сродство к ионам Ca2+ снижалось примерно в 2 раза, что находится в пределах погрешности эксперимента (Табл. 3). Исключение составляет белок, титрованный ОК до ККМ при 17С и 45С, для которого наблюдалось снижение величины К на 0,5-1 порядок величины.
Наиболее заметные изменения сродства к Ca2+, обнаруженные для -ЛА, насыщенного ОК, возможно, являются следствием конкуренции между белком и ОК за ионы Ca2+.
Табл. 3. Равновесные константы связывания Ca2+ (K) и коэффициенты Хилла (n) при 45°C для различных состояний-ЛА по данным спектрофлуориметрических титрований (рН 8,2).
K, M- Состояние белка n 0, Интактный -ЛА 1,3 8 HAMLET 0, 7 LA-OA-17 0, 7 LA-OA-45 0, o 2,7 105* Насыщенный ОК при 17 C 1, Насыщенный ОК при 45oC 1,5 105 2, *Обнаружен дополнительный Ca2+-связывающий центр с К около 106-107 M-1.
Измерения спектров КД в дальней УФ-области для разных состояний белка при 5°С и 45°С показали, что все формы апо--ЛА, содержащие ОК, проявляют повышенную отрицательную молярную эллиптичность в области 210-225 нм. Оценка содержания элементов вторичной структуры для различных форм -ЛА, свободного от Ca2+, с использованием ПО CDPro, показала, что изменения, вызванные связыванием ОК при 5°С, выражаются, главным образом, в повышении содержания -спиралей (Табл. 4). Схожие изменения спиральности обнаружены при 45°С.
Табл. 4. Оценка содержания элементов вторичной структуры (%) для различных форм -ЛА, свободного от Ca2+, по данным КД, при 5°С, рН 8,3.
Неупорядоченные - Состояние белка Повороты структуры спирали структуры 34,1 13,5 19,2 32, Интактный -ЛА HAMLET 39,6 11,8 19,2 29, LA-OA-17 35,9 12,6 20,2 31, LA-OA-45 41,2 12,9 18,6 30, Таким образом, модификация апо--ЛА олеиновой кислотой приводит к снижению его термостабильности, сохраняет довольно высокое сродство к ионам Са2+, но вызывает повышение содержания -спиралей.
Сравнение цитотоксических свойств HAMLET и комплексов LA-OA Концентрационная зависимость цитотоксического действия HAMLET и комплексов LA-OA на клетки эпидермоидной карциномы гортани человека HEp-2 in vitro представлена на Рис. 5. Олеиновая кислота обладает токсическим действием на клетки HEp-2 только в концентрациях, превышающих 300 мкМ. Значение IС50 для комплексов LA-OA (50 мкМ) близко к IС50 для HAMLET (40 мкМ), однако цитотоксическое действие состояния HAMLET становится заметным при более низких концентрациях (около 20-30 мкМ).
Интактный -ЛА в концентрации до 1 мМ не прояв ляет токсичности, несмотря на имеющиеся в литературе данные о том, что белок способен оказывать цитотоксическое действие на определённые клеточные линии (см., напр., Lin et al. 2008).
Нужно отметить, что комплекс bLA-OA-45 также проявлял цитотоксическую Рис. 5. Концентрационная зависимость активность по отношению к цитотоксичности по отношению к клеткам клеткам HEp-2 (IС50 около 20 мкМ), HEp-2 комплексов -ЛА-ОК и контролей.
схожую с токсичностью состояния HAMLET (данные не представлены). При этом как интактный, так и контрольный коровий -ЛА, не проявляли токсичности по отношению к данным клеткам.
Таким образом, показано, что комплексы LA-OA-17 и LA-OA-45 по своим физико-химическим свойствам и цитотоксическому действию на клетки Hep-2 схожи с состоянием HAMLET. Тот факт, что образование HAMLET-подобных комплексов -ЛА с олеиновой кислотой возможно в условиях раствора без использования ионообменной хроматографии, облегчает и удешевляет процесс их приготовления, делает его более контролируемым и гибким.
Взаимодействие комплексов -ЛА - ОК с мембранами Ранее было показано, что HAMLET способен проникать в раковые клетки (Duringer et al., 2003), однако механизм переноса экзогенного цитотоксичного комплекса -ЛА с ОК через плазматическую мембрану остаётся невыясненным до сих пор. Нами был исследован процесс взаимодействия комплексов с двумя модельными системами: малыми униламеллярными везикулами ДПФХ и Chara corallina, плазмалеммой клеток водоросли которая обладает электровозбудимыми ионными каналами, структурно и функционально схожими с ион-транспортными системами многих животных клеток (Берестовский et al. 1987;
Hedrich & Jeromin 1992;
Lunevsky et al. 1983).
Взаимодействие комплексов -ЛА-ОК с малыми униламеллярными везикулами дипальмитоилфосфатидилхолина Для исследования влияния модификации -ЛА олеиновой кислотой на его сродство к фосфолипидной мембране мы сравнивали сродство интактного белка и его комплексов с ОК к униламеллярным везикулам модельного фосфолипида, ДПФХ.
Для этого предварительно инкубированная в течение 15 часов при 4С смесь белка с везикулами ДПФХ подвергалась гель-фильтрации на колонке Сефадекс G-200. Общее количество свободного и связанного с везикулами белка определяли спектрофото метрически. Доля апо-LA-OA Табл. 5. Зависимость доли -ЛА, связанного с 17, связанного с везикулами униламеллярными везикулами ДПФХ, от ДПФХ, cоставила 53%, что на концентрации кальция (50 мМ HEPES-KOH, 150 мM NaCl, pH 7,4). 19% выше соответствующего значения для апо-формы Доля -ЛА, связанного с Состояние -ЛА везикулами, % интактного -ЛА. Менее 1 мM ЭДТА 1 мM CaCl2 выраженный эффект наблюдали 34 Интактный -ЛА для апо-LA-OA-45 и апо HAMLET 50 8 HAMLET (Табл. 5).
LA-OA-17 53 Насыщение белка ионами LA-OA-45 40 33 2+ Са приводило к снижению доли -ЛА, связанного с везикулами, для всех исследуемых форм белка. Наименее выраженный эффект наблюдали для состояний LA-OA-45 и LA-OA-17. Для HAMLET, насыщенного Са2+, сродство к везикулам было близко к таковому для интактного апо--ЛА, что, возможно, связано с меньшим количеством молекул ОК, приходящихся на молекулу белка, в данном комплексе.
Эксперименты с везикулами ДПФХ показали, что связывание олеиновой кислоты повышает сродство белка к липосомам независимо от концентрации Ca2+.
Таким образом, связывание ОК стабилизирует конформацию белка, способную к Ca2+ независимому взаимодействию с мембранами.
Действие комплексов a-ЛА с ОК на ионные токи через плазмалемму Chara corallina Электрофизиологические исследования были выполнены нами совместно с сотрудниками Лаборатории ультраструктуры нейрона ИТЭБ РАН и Лаборатории молекулярной физиологии клетки ИБК РАН на междоузловых нативных и перфузи рованных клетках Chara corallina в условиях фиксации потенциала. Потенциал действия этих клеток, как показано на Рис. 6, представляет собой суперпозицию входящего Ca2+ тока, Ca2+-активируемого хлорного тока и K+ тока утечки (Kataev et al. 1984). Добавление к омывающему раствору 10 мкM LA-OA-17 вызывает изменения амплитуды и активационно-инактивационной кинетики развивающегося суммарного тока, в частности, происходит снижение амплитуды Ca2+ тока и Ca2+ зависимого Cl- тока (Рис. 7А). Интересно, что этот эффект сопровождается увеличением неспецифического K+ тока утечки и резким падением сопротивления мембраны (Рис. 7Б). Электропроводность мембраны повышается с увеличением концентрации LA-OA-17.
Добавление 80 мкМ LA-OA-17 (концентрация, превышающая значение IC50 для цитотоксического Рис. 6. A: Типичные действия комплекса на клетки HEp-2 in vitro) вызывает разви- резкое увеличение K+ тока утечки и полную ионные токи, вающиеся на плазмалемме инактивацию ионных каналов на 20-30 минут (данные не Chara corallina при изме- показаны).
скачкообразном нении напряжения. Б: Исследования, выполненные на перфузированных Протокол изменения клетках, позволили проследить прямое действие LA-OA напряжения на мембране.
17 на Ca2+ каналы плазмалеммы. Зависимость плотности Са2+ тока от напряжения на плазматической мембране измеряли через определенные промежутки времени, используя пилообразное напряжение длительностью 30 мс (Рис. 7В). Добавление в омывающий раствор 4 мкM LA-OA-17 вызывало заметные временные изменения вольтамперных характеристик Ca2+ каналов. Наблюдали краткосрочное усиление Ca2+ тока в ответ на LA-OA-17 (Рис. 7В, кривая 2), что может быть связано с повышением внутриклеточной концентрации Ca2+ в течение первых двух минут после введения LA-OA-17. За начальным ростом Ca2+ тока следовало его постепенное снижение (Рис. 7В, кривые 3-5), вызванное ингибированием кальциевых каналов. Необходимо подчеркнуть, что наличие изобестической точки в вольтамперных характеристиках (Рис. 7В) свидетельствует о прямом и селективном взаимодействии LA-OA-17 с Ca2+ каналами плазмалеммы (Zherelova 1989).
Отмывка плазмалеммы, обработанной LA-OA-17, начальным буферным раствором не восстановливает ионные токи, что свидетельствует о необратимости процесса взаимодействия комплекса с плазмалеммой Chara corallina.
Аналогичные исследования, выполненные для состояния HAMLET, показали качественно схожий результат, однако действие HAMLET на ионные каналы было менее выражено количественно, что, вероятно, является следствием меньшего числа молекул ОК, связанных на молекулу HAMLET.
Поскольку ОК может частично диссоциировать из комплексов LA-OA 17 и HAMLET в условиях, используемых для электрофизиологи ческих измерений, необходимо было исследовать действия на ионные токи, индуцируемые свободной ОК и интактным -ЛА. Экзогенное введение -ЛА вызывает намного менее выраженные изменения в кинетике инактивации тока, нежели LA-OA-17.
Введение 10 мкМ ОК и повышение её концентрации до 20 мкМ вызывает постепенное ускорение блокировки ионных токов, в зависимости от дозы. Kалиевые токи утечки при этом не изменяются.
Отмывка плазмалеммы, обработанной ОК, начальным наружным раствором приводит к эффективному восстановлению амплитуды Ca2+ тока.
Рис. 7. Изменения ионных токов, вызванные Таким образом, полученные LA-OA-17. временные изменения А, данные ясно демонстрируют, что суммарного тока: (1) контроль, (2) 2 мин.
после добавления 10 мкM LA-OA-17, (3) 9 -лактальбумин взаимодействует как с мин., (4) 16 мин., (5) 29 мин. Б, изменения искусственными, так и с природными тока утечки, развивающиеся после добавления LA-OA-17: (1) 1,4 мкM, (2) 2,8 мембранами, причём модификация мкM, (3–5) 10 мкM. В, изменения вольт белка олеиновой кислотой приводит к амперных характеристик Ca2+ тока для усилению наблюдаемых эффектов.
перфузированных клеток: (1) без LA-OA-17, (2) 2 мин. после введения 4 мкM LA-OA-17, Комплексы с ОК блокируют Ca2+ и Ca2+ (3) 9 мин., (4) 16 мин., (5) 29 мин.
активируемые Cl- токи, вызывают неселективную проницаемость мембраны (повышение неспецифических K+ токов утечки), изменяя, таким образом, структурное и функциональное состояние плазмалеммы.
Взаимодействие комплексов -ЛА-ОК с гистоном Н1 in vitro Установлено, что одной из главных мишеней комплекса HAMLET в раковой клетке являются гистоны (Duringer et al., 2003). С помощью спектрофлуориметрических методов нами исследовано влияние модификации -ЛА олеиновой кислотой на взаимодействие с гистонами in vitro на примере гистона Н1.
Благодаря тому, что гистоны не содержат остатков триптофана (Isenberg, 1979), мы селективно возбуждали триптофановую флуоресценцию -ЛА в ходе титрования его гистоном.
Из данных спектрофлуори метрического титрования (Рис. 8) апо-формы интактного -ЛА и его комплексов с ОК гистоном Н видно, что связывание с гистоном при 5С вызывает разворачивание Рис. 8. Спектрофлуориметрическое тит- белка, отражающееся в рование различных состояний апо--ЛА выраженным сдвиге спектра гистоном Н1 при 5°С (10 мМ НЕPES-КОН, 1 мМ флуоресценции в длинно ЭДТА;
рН 7,6).
волновую сторону. При этом добавление в раствор гистона выше эквимолярной концентрации не приводит к дальнейшим изменениям в спектрах флуоресценции. При очень низком молярном соотношении гистона к комплексам -ЛА с ОК (1:20-1:10) наблюдается заметный сдвиг спектра флуоресценции в коротковолновую сторону, не наблюдаемый в случае титрования интактного белка. По Табл. 6. Равновесные константы связывания видимому, данный эффект вызван гистона Н1 (K) и коэффициенты Хилла (n) агрегацией -ЛА вследствие для различных состоянийапо--ЛА при 5°C.
перенасыщения гистона молекулами - Состояние белка K, M n белка.
2, Интактный -ЛА 1,4 10 Следующий за данным изгибом 1,4 LA-OA-17 1, участок кривой титрования можно 0,8 LA-OA-45 2, описать кооперативной схемой 1,2 HAMLET 2, связывания n молекул -ЛА на молекулу гистона. Полученные в рамках такой модели величины кажущихся констант связывания гистона приведены в Табл. 6. Видно, что модификация -ЛА олеиновой кислотой повышает примерно в 10 раз эффективное сродство белка к Н1 in vitro, однако связывание олеиновой кислоты не является необходимым условием взаимодействия -лактальбумина с гистоном.
Данные по тепловой денатурации различных состояний апо--ЛА, связанных с гистоном Н1 при 5°С (конечное молярное отношение гистона к белку составляло ~5:1), свидетельствуют о том, что взаимодействие с гистоном приводит к заметному снижению термостабильности -лактальбумина независимо от присутствия олеиновой кислоты (данные не приведены).
Полученные данные свидетельствуют о том, что связывание ОК способствует ассоциации -ЛА с гистоном Н1, однако модификация белка олеиновой кислотой не является необходимым условием для взаимодействия -лактальбумина с гистоном in vitro.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что апо-форма -лактальбумина обладает множественными центрами связывания олеиновой кислоты (ОК). Связывание ОК вызывает снижение термостабильности апо--ЛА. Тепловое разворачивание апо--ЛА вызывает увеличение его ёмкости по отношению к олеиновой кислоте, а также повышение эффективного сродства белка к ней. Повышение рН раствора до 12 не вызывает снижения эффективности связывания ОК белком. В целом показано, что образование комплексов -ЛА с олеиновой кислотой определяется гидрофобными взаимодействиями между белком и ОК.
2. Определены оптимальные условия раствора, обеспечивающие максимальную ёмкость белка по отношению к олеиновой кислоте, в условиях отсутствия протяженных фаз ОК. Приготовленные в оптимизированных условиях раствора комплексы LA-OA-17 и LA-OA-45 мономерны, сохраняют нативноподобное сродство к ионам Са2+, однако демонстрируют повышенное содержание спиралей.
3. Показано, что комплексы LA-OA-17 и LA-OA-45 по своим физико-химическим свойствам и цитотоксическому действию на клетки Hep-2 схожи с состоянием HAMLET. Таким образом, образование HAMLET-подобных комплексов -ЛА с олеиновой кислотой возможно в условиях раствора без использования ионообменной хроматографии.
4. Модификация -лактальбумина олеиновой кислотой повышает его сродство к малым униламеллярным визикулам ДПФХ независимо от концентрации Са2+, а также вызывает изменения ионных токов через плазмалемму клеток Chara corallinа, приводя к развитию неспецифической проницаемости мембраны за счёт нарушения её целостности.
5. Показано, что модификация -лактальбумина олеиновой кислотой повышает примерно в десять раз его сродство к гистону H1 in vitro, однако не является необходимым условием взаимодействия -ЛА с гистоном.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ Статьи:
1. Knyazeva EL, Grishchenko VM, Fadeev RS, Akatov VS, Permyakov SE, Permyakov EA. Who is Mr. HAMLET? Interaction of human -lactalbumin with monomeric oleic acid. Biochemistry, 2008, V. 47, N. 49, p. 13127-37.
2. Permyakov SE, Bakunts AG, Denesyuk AI, Knyazeva EL, Uversky VN, Permyakov EA Apo-parvalbumin as an intrinsically disordered protein. Proteins, 2008, Vol. 72, N. 3, P. 822-836.
3. Zherelova OM, Kataev AA, Grishchenko VM, Knyazeva EL, Permyakov SE, Permyakov EA. Interaction of antitumor alpha-lactalbumin-oleic acid complexes with artificial and natural membranes. J. Bioenerg. Biomembr. 2009, V. 41, N. 3, p.
229-37.
Тезисы сообщений:
1. Князева Е.Л., Грищенко В.М., Першикова И.В., Пермяков С.Е. Взаимодействие -лактальбумина с олеиновой кислотой. 11-ая международная школа конференция «Биология – наука XXI века», Пущино, 29 октября – 2 ноября 2007 г., стр. 10.
2. Князева Е.Л., Грищенко В.М., Першикова И.В., Пермяков С.Е. Исследование природы состояния HAMLET. Школа – конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия - 2007», Пущино, 10- декабря 2007 г., стр. 5-9.
3. Князева Е.Л., Грищенко В.М., Пермяков С.Е., Фадеев Р.С., Акатов В.С.
Исследование природы комплексов -лактальбумин-олеиновая кислота, обладающих цитотоксической активностью. 12-ая международная школа конференция «Биология – наука XXI века», Пущино, 10 – 14 ноября 2008 г., стр. 176.
4. Permyakov, S.E., Knyazeva, E.L., Grishchenko, V.M., Zhadan, A.P., Fadeev, R.S., Acatov, V.S., Permyakov, E.A. Interaction of human -lactalbumin with monomeric oleic acid. 2nd Symposium on HAMLET and tumor-killing proteins. May 12-14, Lund, 2009, p.10.
5. Леонтьева М.В., Князева Е.Л., Фадеев Р.С., Акатов В.С., Пермяков С.Е Разработка метода приготовления комплексов -лактальбумина с олеиновой кислотой, обладающих цитотоксической активностью. 14-ая международная школа-конференция «Биология – наука XXI века», Пущино, 19 – 23 апреля 2010 г., стр. 84.
6. Князева Е.Л., Грищенко В.М., Жерелова О.М., Катаев А.А., Жадан А.П., Пермяков С.Е. Молекулярные аспекты цитотоксического действия комплексов -лактальбумина с олеиновой кислотой. 14-ая международная школа конференция «Биология – наука XXI века», Пущино, 19 – 23 апреля 2010 г., стр. 207.