Возрастные изменения экспрессии генов vegfa и pedf при развитии дистрофии сетчатки у крыс oxys
На правах рукописи
МАРКОВЕЦ АНТОН МИХАЙЛОВИЧ ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ VEGFA И PEDF ПРИ РАЗВИТИИ ДИСТРОФИИ СЕТЧАТКИ У КРЫС OXYS 03.02.07 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Новосибирск 2011 1
Работа выполнена в секторе геномной и постгеномной фармакологии Учре ждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Научный консультант: доктор биологических наук Колосова Н.Г.
Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Официальные оппоненты: Доктор биологических наук профессор А.Л.Маркель, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Доктор биологических наук профессор А.Ю.Гришанова, Научно-исследовательский ин ститут молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Научно исследовательский институт медицин ской генетики СО РАМН, г. Томск
Защита состоится «_» 2011 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степе ни доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СОРАН, в конференц-зале Института по адресу 630090,г. Новосибирск, проспект ака демика Лаврентьева, 10.
Тел/факс: (383) 3331278, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии игенетики СО РАН.
Автореферат разослан "" 2011г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова Введение Актуальность Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) становится основной при чиной нарушения и потери зрения у людей старше 50 лет в развитых странах.
Наряду с возрастной зависимостью прослеживается генетическая составля ющая ВМД в сочетании с влиянием факторов внешней среды. Значительное количество вовлеченных в развитие ВМД генов и наличие симптомов, харак терных так же и для других комплексных заболеваний, усложняют диагно стику. В основе патогенеза ВМД лежат характерные для старения изменения хориокапилляров, ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и мембраны Бруха, но механизмы, запускающие переход обычных возрастных изменений в патологический процесс, не известны. Считается, что развитие ВМД связа но с гипоксией и воспалением (Feigl, 2007, 2009). В качестве основного по вреждающего звена выступает окислительный стресс - нарушение баланса в системах генерации и детоксикации активных форм кислорода (АФК). Кли нические проявления сильно зависят от формы ВМД: при «сухой» форме – зоны атрофии клеток РПЭ и фоторецепторов, наличие депозитов веществ в сетчатке;
при «влажной» - отеки, кровоизлияния, рост новых сосудов или не оваскуляризация и отслойка пигментного эпителия, которые приводят к ги бели фоторецепторов и потере зрения. Растт количество аргументов в поль зу того, что ключевую роль в развитии заболевания играют повреждения клеток РПЭ в силу множества выполняемых ими функций и уникального расположения во внешней сетчатке (Strauss, 2005, Bonilha, 2008). Клетки РПЭ секретируют множество ростовых факторов, в том числе – эндотелиальный фактор роста А (vascular endothelial growth factor А- VEGF-А, далее VEGF) – главный ангиогенный фактор в сетчатке. Именно с повышенным уровнем VEGF связано развитие неоваскуляризации (главной причины потери зрения при ВМД). Ингибиторы VEGF подавляют процесс патологического роста со судов. Усиление экспрессии гена Vegfa на поздних стадиях заболевания вы зывают гипоксия и воспаление, играющие ключевую роль в патогенезе ВМД.
Основным антагонистом VEGF в сетчатке является фактор пигментного эпи телия (pigment-epithelium derived factor – PEDF), также секретируемый клет ками РПЭ и обладающий ангиостатическими и нейротрофическими свой ствами. Гипоксия является основным регулятором экспрессии гена VEGF че рез фактор транскрипции HIF-1, стабильность которого определяет пролил гидроксилаза 2 (prolyl hyxroxylases 2 –PHD-2). На сегодня вклад изменений экспрессии генов этих ключевых регуляторов ангиогенеза (VEGF, PEDF, PHD2) в процесс нормального физиологичного старения и тем более в разви тие ВМД, особенно на ранних стадиях, остатся до конца не ясным в силу сложности проведения таких исследований у людей.
Создание биологических моделей заболеваний человека – один из под ходов к выяснению их этиологии и патогенеза, к разработке новых способов лечения. В последние годы получены убедительные аргументы в пользу того, что в качестве модели ВМД можно рассматривать созданную в ИЦиГ СО РАН генетическую линию крыс OXYS, для которой характерно преждевре менное старение. Линия получена селекцией и инбридингом крыс Wistar, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы (Соловьева и др., 1975). В 5-ти первых поколениях развитие катаракты провоцировали нагруз кой галактозой, в дальнейшем отбор шл по ранней спонтанной катаракте, сцеплено с которой животные унаследовали синдром преждевременного ста рения, в том числе – ретинопатию, по клиническим проявлениям аналогич ную ВМД у людей. Для доказательства соответствия адекватности модели необходимо установить молекулярные основы развития ретинопатии. Мак симально полная характеристика линии крыс OXYS как модели ВМД имеет как фундаментальное, так и прикладное значение. Е использование позво лит исследовать патогенез заболевания, анализировать генетически детерми нированные особенности его течения и давать объективную оценку эффек тивности новых способов лечения. Примером успешного использования крыс OXYS явилось выявление уникального терапевтического потенциала соединения принципиально нового класса – антиоксиданта, способного про никать и накапливаться в митохондриях - пластохинонил-децил трифенилфосфония (SkQ1, Скулачев, 2007, Neroev et al., 2008). Соединение уже используется в ветеринарии в форме глазных капель, проводятся его клинические испытания, однако молекулярные механизмы действия SkQ при ретинопатии не изучены.
Цель и задачи исследования Цель настоящей работы - исследование связи развития ретинопатии у крыс OXYS с изменениями экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 в тканях глазного дна и влияния на не митохондриального антиоксиданта SkQ1.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Провести сравнение возрастных изменений паттернов экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 в тканях глазного дна крыс OXYS и Wistar.
2. Сопоставить изменения экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 с морфоло гическими изменения хориоретирального комплекса сетчатки крыс OX YS.
3. Исследовать возможную связь развития ретинопатии у крыс OXYS с из менениями экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2.
4. Изучить влияние митохондриального антиоксиданта SkQ1 на уровень экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 в тканях глазного дна крыс OXYS.
Научная новизна Впервые изучена экспрессия генов Vegfa, Pedf и Phd-2 в сетчатке преж девременно стареющих крыс OXYS и контрольных крыс Wistar в возрасте от 20 дней до 24 мес. и выявлены межлинейные различия, ассоциированные с развитием ретинопатии у крыс OXYS. Структурно-функциональной основой развития ретинопатии являются изменения клеток ретинального пигментного эпителия (дистрофические на доклинических стадиях заболевания, дегенера тивные – на поздних) и нарушение кровотока в хориокапиллярах. Они выяв ляются у крыс OXYS начиная с возраста 20 дней при наличии молекулярных признаков острой гипоксии в сетчатке и отсутствии характерного для не компенсаторного ответа – изменения экспрессии генов Vegfa и Pedf. Впервые показано, что первые клинические проявления ретинопатии развиваются у крыс OXYS к возрасту 3 месяцев на фоне характерного для хронической ги поксии снижения уровня мРНК гена Phd-2 и значительно сниженного по сравнению с крысами Wistar уровня мРНК и белковых продуктов генов Vegfa и Pedf. При выраженных стадиях заболевания уровень мРНК генов Vegfa и Pedf у крыс OXYS не отличается от крыс Wistar, а содержание белка Vegfa снижено. Установлено, что направленность изменений экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 под влиянием митохондриального антиоксиданта SkQ1 у крыс OXYS и Wistar различна и зависит от возраста животных. Впервые по казано, что и профилактический, и лечебный эффект SkQ1 в отношении ре тинопатии у крыс OXYS связан с нормализацией экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2, характер изменения которой зависит от стадии заболевания.
Теоретическя и практическая значимость Знание закономерностей изменения с возрастом и при развитии рети нопатии экспрессии в сетчатке ключевых регуляторов ангиогенеза - генов Vegfa и Pedf - расширяет представления и о механизмах участия этих генов в процессе старения и в патогенезе ВМД, особенно на ранних стадиях заболе вания. Полученные данные позволяют рассматривать эти гены как потенци альные кандидаты для создания в перспективе диагностической системы, нацеленной на раннее выявление ВМД у людей. Практическая значимость работы определяется доказательством соответствия линии крыс OXYS кри териям модели ВМД на молекулярно-генетическом уровне, возможности е использования для исследования патогенеза заболевания, в том числе на ран них доклинических стадиях их развития, а также для корректной оценки эф фективности терапевтических воздействий, направленных на его лечение и профилактику. Выявленная ассоциация развития ранних стадий ретинопатии со сниженным уровнем экспрессии генов Vegfa и Pedf и нарушениями сосу дов хориоидеи указывает на необходимость выработки объективных крите риев правомерности применения ингибиторов фактора VEGF для лечения атрофической формы ВМД с локальными точечными кровоизлияниями в сетчатке.
Положения выносимые на защиту 1. Развитие ретинопатии у крыс OXYS связано с изменениями экспрессии генов Vegfa и Pedf, в основе которых лежат структурно-функциональные из менения клеток ретинального пигментного эпителия.
2. Характер изменения экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 в сетчатке крыс под влиянием митохондриального антиоксиданта SkQ1 зависит от генотипа животных, их возраста, а его терапевтический эффект в отношении ретино патии у крыс OXYS связан с нормализацией экспрессии этих генов.
Апробация работы и публикация Полученные результаты были представлены и обсуждены на: XLVI и XLVII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология в г. Новосибирске, 2008 и 2010 гг.;
ежегодной научной конференции «Фундаментальные науки – медицине»в г.
Новосибирске, 2008 и 2010 гг.;
XIXth IAGG World Congress of Gerontology and Geriatrics в г. Париже в 2009 г.;
Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно приспособительных процессов» в г. Новосибирске, 2009 г.;
Российском оф тальмологическом форуме в г. Москве, 2009 г.;
The seventh international conference of bioinformatics of genome regulation and structure\systembiology в г. Новосибирске, 2010 г.;
Международной крымской конференции «Окисли тельный стресс и свободнорадикальные патологии» в г. Судаке, 2010 г.
Вклад автора.
Основные результаты получены автором самостоятельно. Автор при нимал личное участие в планировании, проведении и обсуждении всех экс периментов, по результатам которых написана диссертация. Офтальмологи ческие осмотры животных проводились д.м.н. А.Ж.Фурсовой, их результаты анализировались самостоятельно. Гистологическое исследование выполнено в рамках совместных исследований с к.б.н. А.А.Жданкиной.
Структура и объем работы Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и мето ды, результаты, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Ра бота изложена на 151 странице, содержит 27 рисунков.
Материалы и методы Животные. Работа выполнена на 384 крысах-самцах линий OXYS и Wistar в возрасте от 20 дней до 24 мес. на базе ЦКП «Генофонды экспрерименталь ных животных» ИЦиГ СО РАН. Животных содержали при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище группами по 5 особей в клет ках размером 573620 см при температуре 22±20С.
Офтальмологические осмотры проводили с помощью прямого офтальмоскопа "Betta" (Германия) после расширения зрачков 1% раствором тропокамида. Наличие и степень выраженности изменений сетчатки оценивали в соответствии с протоколом Age-Related Eye Disease Study (AREDS) (http://eyephoto.ophth.wisc.edu).
ПЦР в реальном времени. Уровень экспрессии генов исследовали методом ПЦР в реальном времени в присутствии красителя SYBR Green I. В качестве гена сравнения использовали «ген домашнего хозяйства» RPL 30 (белок большой субъединицы рибосомы). Использовались следующие праймеры:
для Rpl30- 5ATGGTGGCTGCAAAGAAGAC3 и 5CAAAGCTGGACAGT TGTTGG3;
для Vegfa - 5CTGGCTTTACTGCTGTACCTCCACC3 и 5GGCA CACAGGACGGCTTGAA3;
для Pedf - 5GATTGCCCAGCTGCCTTTGACA и 5GGGACAGTCAGCACACTT GGATAG3 для Phd2 - 5ATAAAGACTG GGACGCCAAG3 и 5TTCAA CCCTCACACCTTTCTC3. По получаемым стандартным калибровочным кривым определяли относительный уровень кДНК исследуемых генов (Nolan et al., 2006).
Определение содержания белков. Содержания белка PEDF проводили методом вестерн блот анализа и после разделения белков сетчатки в 14% полиакриламидном геле. Качество переноса белков контролировали окрашиванием мембраны раствором PonceauS в 1% уксусной кислоте.
Интенсивность полос белка при окрашивании мембраны использовали для последующей нормализации данных (Romero-Calvo et al., 2010, Aranha et al., 2010). После блокирования 5% обезжиренным молоком, мембрана инкубировалась ночь с антителами против PEDF в 5% обезжиренном молоке (1:200, Santa Cruz) при 40С. Инкубация с вторичными антителами в 5% обезжиренном молоке (1:5000, Santa Cruz) проводилась в течение 2 часов при комнатной температуре. Проявленные пленки сканировались, и интенсивность свечения бендов замерялась с помощью программы ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
Содержание белка VEGF оценивали иммуноферментным анализом (ELISA), используя набор Rat VEGF ELISA Kit (RayBiotech), согласно реко мендациям производителя.
Гистологический и морфометрический анализ. Заднюю часть глаза фиксировали в 2,5% глютаральдегиде и 2% OsO4, дегитратировали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, заливали в epon-812. Полутонкие срезы готовили на ультратоме LKB-4 и окрашивали 0,1% толуидиновым синим. Подсчеты проводились на областях от 50 до 250 мкм по 50 полей от каждого животного. Площадь клеток РПЭ и удельная площадь хориоидальных сосудов измеряли с помощью программного обеспечения Axiovision (Zeiss, Thornwood, NY).
Влияние антиоксиданта SkQ1 на развитие ретинопатии у крыс OXYS и экспрессию генов в сетчатке оценивали в двух экспериментах. При оценке профилактического эффекта крысы OXYS и Wistar опытных групп получали ежедневно с кормом по 250 нмоль SkQ1 на кг массы тела с возраста 1,5 до мес., контролем служили интактные животные. При оценке лечебного потен циала крысы OXYS и Wistar с возраста 9 до 12 мес. ежедневно получали SkQ1 в форме глазных капель (250нМ), контрольные - плацебо. До и после начала экспериментов проводились офтальмологические осмотры. По окон чании прима препарата забирали образцы сетчатки.
Статистический анализ результатов проводился с помощью программы Statistica 6.0 («Statsoft», США). Использовали факторный дисперсионный анализ (ANOVA) с post-hoc сравнениями групповых средних (Newman-Keul test). Как независимые факторы рассматривали генотип (Wistar, OXYS), возраст и препарат. Для анализа влияния антиоксиданта SkQ1 на состояние сетчатки использовали зависимые парные сравнения состояния сетчатки до и после воздействия антиоксиданта (T-тест). Результаты Western blot анализа оценивали, используя непараметрический U-тест Манна-Уитни. Данные представлены как M±S.Е. Во всех анализах результат считался статистически значимым при р0.05.
Результаты и обсуждение Возрастные изменения сетчатки крыс Согласно офтальмоскопическим осмотрам, у крыс Wistar первичные патологические изменения сетчатки выявляются только в возрасте 24 мес. и строго не могут быть классифицированы как ретинопатия. У двадцатиднев ных крыс OXYS клинические проявления ретинопатии отсутствуют (Рис. 1).
Первые ВМД-подобные измене ния сетчатки появляются к возрасту 1, мес. у 22% крыс OXYS. Анализ ре зультатов офтальмологических осмот ров позволяет выделить два критиче ских периода развития ретинопатии у крыс OXYS, которые были выбраны для исследования молекулярных про цессов, лежащих в основе дегенера тивных изменений сетчатки. Первый – возраст от 1,5 до 3 мес. – период резко го подъема заболеваемости: к возрасту 3 мес. практически 100% крыс OXYS Рис. 1. Доля глаз крыс OXYS с различ имеют патологические изменения ными стадиями ретинопатии в зависи мости от возраста. 0-3 –стадии ретино- глазного дна, соответствующие 1-й патии по классификации AREDS стадии заболевания (очаги ишемии, зо ны атрофии клеток РПЭ и хориокапилляров). Второй – возраст от 9 до мес. – период активного прогрессирования ретинопатии, которая достигает в основном 2-й стадии (большие «мягкие» и твердые друзы с тенденцией к сливанию, отек центральной зоны сетчатки, серозная отслойка пигментного эпителия и нейроретины). К возрасту 24 мес. необратимые изменения сетчат ки, соответствующие 3-й стадии ретинопатии (геморрагическая отслойка сетчатки, кровоизлияния в центральную область, формирование новых сосу дов – неоваскуляризация – и признаки рубцевания), наблюдались почти у всех крыс OXYS.
Ранее предполагалось, что изменения морфологии сетчатки у крыс OXYS развиваются к возрасту 5 мес., а в 3 мес. отсутствуют. Однако выпол ненный нами морфометрический анализ показал, что уже в возрасте 20 дней в хориоидее незначительно, но достоверно увеличен процент сосудов с при знаками тромбоза и стаза (рис. 2б). При этом у крыс OXYS удельная площадь клеток РПЭ меньше, чем у крыс Wistar (рис. 2а), имеются признаки струк турно-функциональных нарушений: наряду с нормально функционирующи ми клетками выявляются клетки РПЭ с вакуолями в цитоплазме, нарушения ми микроворсинок и базальной складчатости, сниженным количеством фаго сом.
Согласно современным представлениям, развитие сначала структурно функциональных нарушений клеток РПЭ, а затем хориокапилляров харак терно для сухой формы ВМД. В этой связи можно заключить, что у крыс OXYS ретинопатия соответствует атрофической форме ВМД.
Рисунок 2. (а) Средняя площадь клетки РПЭ в срезе и (б) площадь сосудов хориоидеи со стазом и тромбозом. ^ - по сравнению с предыдущим возрастом;
* - по сравнению с кры сами Wistar. n= Профиль экспрессии генов Vegfa и Pedf и развитие ретинопатии у крыс OXYS В литературе отсутствуют сведения об экспрессии генов антагонистов Vegfa и Pedf на ранних, а тем более - доклинических стадиях развития ВМД у людей. Более того, к моменту постановки задачей исследования в литературе не было информации о возрастных изменениях экспрессии генов Vegfa и Pedf в сетчатке. Первая работа об изменениях с возрастом экспрессии этих генов в сетчатке здоровых крыс, появилась в 2008 году (Steinle et al.). Наше исследо вание показывает, что роль фактора VEGF неоднозначна на разных стадиях развития ретинопатии у крыс OXYS и ранние стадии развиваются на фоне сниженной экспрессии генов Vegfa и Pedf, а так же сниженного уровня мРНК гена Phd2.
С возрастом уровень мРНК генов Vegfa и Pedf в сетчатке крыс OXYS и Wistar существенно снижается, начиная с 20-ти дневного возраста (~10 и ~ раз для генов Vegfa и Pedf соответственно, рис. 3а и 4а). Принципиально важно, что у крыс OXYS уровень мРНК значительно снижается уже к возрасту 3 мес., в то время как у крыс Wistar такое снижение происходит лишь к возрасту 12 мес. (рис. 3а и 4а). Отсутствие межлинейных различий в уровне мРНК в возрасте 20 дней косвенно указывает на то, что изменения экспрессии вторичны по отношению к изменениям функционального Рисунок 3. (а) Уровень мРНК гена Vegfa в сетчатке крыс. n=5. (б) Содержания белка VEGF в сетчатке крыс n=4-8. ^ - достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом;
* - по сравнению с крысами Wistar состояния клеток РПЭ. В сетчатке оба фактора – VEGF и PEDF – экспрессируются и секретируются именно клетками РПЭ. Можно полагать, что ускоренное снижение их экспрессии на уровне мРНК в сетчатке крыс OXYS происходит из-за нарушений клеток РПЭ и становится отражением снижения их функциональной активности.
Рисунок 4. (а). Уровень мРНК гена Pedf в сетчатке крыс. n=5. (б) Содержания белка PEDF в сетчатке крыс OXYS. Данные представлены как процент к уровню одновозрастных крыс Wistar. n=3-4. ^ - достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом;
* достоверные различия по сравнению с крысами Wistar. ^ - достоверные различия по срав нению с предыдущим возрастом Таким образом, у крыс OXYS снижение экспрессии ключевых регуляторов ангиогенеза в сетчатке происходит значительно раньше, чем у крыс Wistar, и по времени оно совпадает с периодом нарушения состояния сосудов и ухудшением состояния клеток РПЭ, а также с периодом активной манифестации клинических проявлений ретинопатии.
Следует рассмотреть различия возрастных изменений экспрессии генов Vegfa и Pedf у крыс OXYS и Wistar (у последних мы не выявили патологических изменений сетчатки вплоть до 24 мес.). Если уровень мРНК указанных генов у крыс OXYS существенно не меняется с возраста 3 до мес., то у крыс Wistar уже с возраста 12 мес. она начинает повышаться и в мес. (рис. 3а и 4а) достигает половины уровня, свойственного 20-ти дневным крысам этой линии. Мы полагаем, что у крыс Wistar с возрастом из-за снижения экспрессии генов Vegfa и Pedf также постепенно нарушаются связи между клетками РПЭ и хориокапиллярами и развивается гипоксия. Это провоцирует активацию гипоксия-зависимых сигнальных путей и повышение экспрессии гена Vegfa, но одновременно с уровнем экспрессии Vegfa растет и экспрессия гена его ключевого антагониста – Pedf. Известно, что эти факторы регулируют экспрессию друг друга (Ohno-Matsui et al., 2003). В результате у крыс Wistar сохраняется баланс между про- и антиангиогенными факторами и развивается сбалансированный ответ на регуляторные изменения сетчатки, что препятствует развитию патологических изменений вплоть до 24 мес. У крыс OXYS такой компенсаторной реакции мы не наблюдали, и уровень экспрессии генов Veg fa и Pedf оставался низким, на уровне 3-х мес. животных.
Несколько иными оказались возрастные изменения содержания продуктов исследованных нами генов – белков VEGF и PEDF. Содержание белка VEGF в сетчатке крыс обеих линий было одинаковым в возрасте дней (рис. 3б), снижалось к 3 мес., а затем росло и достигало максимальных значений у двухгодовалых животных (рис. 3б). Иначе говоря, снижение уровня мРНК гена Vegfa сопровождалось накоплением его белкового продукта, что может являться важной предпосылкой развития ретинопатии:
как известно, поздние стадии ВМД ассоциированы с повышенным уровнем VEGF. В возрасте 20 дней межлинейных различий в содержании белков VEGF и PEDF выявлено не было (рис. 3б и 4б), а в возрасте 3 мес.
содержание обоих белков у крыс OXYS было ниже, чем у крыс Wistar.
Сниженное содержание VEGF в сетчатке крыс OXYS при сравнении с кры сами Wistar сохранялось и в старших возрастных группах. Как отмечалось выше, в возрасте 3 мес. экспрессия генов Vegfa и Pedf на уровне мРНК у крыс OXYS существенно снижена по сравнению с крысами Wistar. Но если на уровне мРНК снижение было 10- и 5-кратным, соответственно, то по содержанию белков VEGF и PEDF межлинейные различия достигали лишь 35% и 30%, соответственно (рис. 3 и 4). Возможно, синтез относительно большого количества белка на меньшем количестве мРНК у крыс OXYS достигается за счет пост-транскрипционной и/или посттрансляционной регуляции.
Как бы то ни было, у крыс OXYS развитие ретинопатии происходит на фоне сниженной как на уровне мРНК, так и на уровне белка экспрессии генов Vegfa и Pedf, что, можно полагать, связано с нарушением кислородного баланса.
Связь системы регуляции кислородного гомеостаза с изменениями экспрессии генов Vegfa и Pedf у крыс OXYS Результаты наших офтальмологических и морфологических исследований свидетельствуют о наличии зон ишемии в сетчатке крыс OXYS, начиная с возраста 3 мес., а нарушений кровотока – с 20 дней.
Подтверждением гипоксического состояния в сетчатке крыс OXYS могут служить данные об экспрессии гена пролил гидроксилазы 2 Phd2. В возрасте 3 и 12 мес. нами обнаружен сниженный уровень мРНК этого гена в сетчатке крыс OXYS по сравнению с крысами Wistar (рис. 5).
В данной ситуации было бы логично ожидать повышения уровня HIF 1 и экспрессии его генов-мишеней, в частности Vegfa. Однако в возрасте мес. экспрессия гена Vegfa в сетчатке крыс OXYS была, как отмечалось, на уровне мРНК на порядок, а на уровне белка - в 1,5 раза ниже, чем у крыс Wistar (рис. 3 и 4). То есть мы не обнаружили у крыс OXYS закономерного ответа на Рисунок 5. Уровень мРНК гена Phd2 в гипоксию е косвенного молекулярного сетчатке крыс. * - достоверные разли чия по сравнению с крысами Wistar. маркера – Vegfa. Такая ситуация указывает на отсутствие у крыс OXYS n=5- адекватного ответа на гипоксию. При этом у крыс Wistar реакция на гипоксию в возрасте 17 и 24 мес.
присутствовала. Аналогичные результаты получены на двухлетних крысах в работе Steinle и соват. (2008), что указывает на то, что развивающиеся в сетчатке крыс Wistar изменения экспрессии гена Vegfa характерны для физиологического старения.
При исследовании экспрессии гена Phd2 в сетчатке 20-дневных животных установлено, что уровень мРНК гена Phd2 у крыс OXYS был выше, чем у крыс Wistar (рис. 5), что характерно для острой стадии гипоксии.
Экспрессии Phd2 может приводить к подавлению пролиферации эндотелия сосудов (Takeda, 2007b), нарушению формирования микроциркуляторного русла, как это недавно показано при ретинопатии, индуцированной кислородом (Duan et al., 2011).
Таким образом, впервые прослежены изменения экспрессии генов Veg fa и Pedf в сетчатке начиная с возраста 20 дней до 24 месяцев у крыс OXYS и Wistar. Выявлены генетически детерминированные отличия изменений экспрессии генов у крыс OXYS, ассоциированные с развитием ретинопатии.
Связь терапевтических эффектов прима SkQ1 с кормом с влиянием на экспрессию генов Vegfa, Pedf и Phd2 в сетчатке В своей работе, мы подтвердили способность митохондриального антиоксиданта SkQ1 полностью предотвращать развитие ранней ретинопатии у крыс OXYS при его включении в рацион молодых животных (с 1,5 мес.) в период активной манифестации первых клинических признаков заболевания (Табл. 1). Важным является тот факт, что антиоксидант не вызвал побочных эффектов в сетчатке здоровых крыс Wistar.
Опыт SkQ1 с кормом с 1,5 до 3 мес. из рас- SkQ1 в виде глазных капель (250нМ) чета 250 нмоль/кг веса животного с 9 до 12 мес.
Осмотры 1,5 мес. 3 мес. 9 мес. 12 мес.
глаз Стадия 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 Контроль 78% 22% 0% 0% 83% 17% 35% 60% 5% 0% 50% 50% SkQ1 79% 21% 0% 82% 18% 0% 3% 90% 7% 17% 77% 6% Таблица 1. Влияние SkQ1 на состояние глазного дна крыс OXYS. В таблице представлен процент глаз животных с соответствующей стадией заболевания. 0-2 –стадии ретинопа тии, по международной классификации AREDS.
В этом эксперименте экспрессия генов Vegfa и Pedf в сетчатке контрольных крыс OXYS возрасте 3 мес. была ниже, чем у контрольных крыс Wistar, что качественно соответствует экспериментам, которые обсуждались выше. После приема курса SkQ1 с кор мом уровень мРНК генов Vegfa и Pedf в сетчатке контрольных крыс OXYS в Рисунок 6. Эффект SkQ1 (а) на уровень мРНК гена возрасте 3 месяцев был Vegfa, n=7 (б) на содержание белка VEGF в сетчатке, ниже, чем у контрольных n=4.. ^ - достоверные различия по сравнению с крыса- крыс Wistar, что ми Wistar;
* - эффект препарата.
качественно соответствует данным экспериментам по оценке возрастных изменений экспрессии генов Vegf и Pedf (рис. 3, 4, 6, 7). Содержание белков VEGF и PEDF в сетчатке контрольных крыс OXYS также было ниже, чем у крыс Wistar, однако межлинейные различия в этих независимых опытах были сопоставимы.
Различия кратности между результатами двух экспериментов по уровню мРНК могли быть обусловлены неодинаковой выраженностью патологических изменений сетчатки крыс OXYS: процент животных с выраженной (2-й) стадией ретинопатии при оценке терапевтического эффекта SkQ1 был ниже, чем в опыте по исследованию возрастных изменений экспрессии генов Vegfa и Pedf Рис. 7. Эффект SkQ1 (с кормом с 1,5 до 3 мес, (17 против 25%). Полученные нмоль/кг) на (а) уровень мРНК гена Pedf. n=8-10, и результаты согласуются с (б) на содержание белка PEDF (вестерн блот) в выявленной нами картиной сетчатке. n=3. * - достоверные межлинейные раз развития заболевания: ранние личия.
стадии ретинопатии протекают на фоне сниженной экспрессией гена Vegfa.
Исследования показали, что профилактический эффект SkQ1 на молекулярном уровне связан с предотвращением снижения уровня мРНК гена Vegfa у крыс OXYS (рис. 6а) и, как следствие, с повышением содержания его белка до уровня контрольных крыс Wistar. Подобные данные еще раз подтверждают связь развития ранней ретинопатии у крыс OXYS с нарушением экспрессии Vegfa.
Как и при оценке возрастных изменений возрастных изменений уров ня мРНК гена Phd2, у контрольных крыс OXYS мы выявили сниженный уровень мРНК гена Phd2 (рис. 8а), что указывает на функционирование сетчатки 3-мес. крыс в условиях гипоксии. На фоне прима SkQ1 произошло повышение экспрессии этого гена до уровня крыс Wistar, что предполагает нормализацию напряжения кислорода. Отсутствие признаков гипоксии в сетчатке получавших антиоксидант крыс OXYS объяснимо:
профилактический прим SkQ1, по данным Neroev et al. (2008), существенно Рисунок 8. Эффект SkQ1 на уровень мРНК гена Phd2. улучшает состояние. ^ - достоверные различия по сравнению с крысами Wistar. n=7-8. (а) SkQ1 с кормом с 1,5 до 3 мес. из рас- сосудов хориоидеи, предотвращая развитие чета 250 нмоль/кг веса животного. (б) SkQ1 в виде артериосклероза и глазных капель (250нМ) с 9 до 12 мес.
тромбозов. При этом экспрессия Vegfa на фоне прима препарата у крыс OXYS возросла как на уровне мРНК, так и на уровне белка (рис. 6 и 7), до уровня, характерного для сетчатки здоровых крыс Wistar, иначе говоря - нормализовалась.
Примечательно, что мы не обнаружили какого-либо эффекта SkQ1 на экспрессию Pedf в сетчатке 3-х мес. животных: как у контрольных, так и у получавших антиоксидант крыс OXYS уровень мРНК Pedf оставался более низким, чем у крыс Wistar (рис. 7). Известно, что PEDF обладает антиангиогенными свойствами и является самым сильным эндогенным ингибитором ангиогенеза. Возможно, сниженный уровень экспрессии Pedf у получавших SkQ1 крыс OXYS способствует полноценному функционированию сосудов и поддержанию нормального метаболизма в сетчатке.
Таким образом, способность митохондриального антиоксиданта SkQ предупреждать развитие ретинопатии у крыс OXYS связана с его влиянием на уровень экспрессии генов ключевых регуляторов ангиогенеза Vegfa и Pedf и сенсора кислорода - Phd2.
Связь терапевтических эффектов глазных капель SkQ1 с влиянием на экспрессию генов Vegfa, Pedf и Phd2 в сетчатке Капли – наиболее предпочтительная лекарственная форма при лечении глазных заболеваний. После лечения крыс каплями SkQ1 (250 нМ, прим с до 12 мес.) мы обнаружили у крыс OXYS увеличение доли глаз без признаков ретинопатии (Табл. 1), в то время как в контрольной группе заболевание активно прогрессировало. На крыс Wistar антиоксидант не оказал побочных эффектов.
Мы показали, что лечебный эффект антиоксиданта, как и профилактический, сопряжен с его влиянием на экспрессию генов Vegfa и Pedf и Phd2 в сетчатке крыс OXYS. Как и ранее, у контрольных крыс OXYS в возрасте 12 мес. уровень мРНК Vegfa был таким же, как у крыс Wistar, а уровень белка даже снижен (рис. 3 и 9).
Рисунок 9. Эффект капель SkQ1 (250 нМ, с 9 до 12 мес.) (а) на уровень мРНК гена Vegfa. n=8-10 (б) на содержание белка VEGF в сетчатке. n=4 (в) на уровень мРНК ге на Pedf. n=8-10 ^ -по сравнению с крысами Wistar;
*-эффект препарата.
Прим капель SkQ1 вызвал у крыс OXYS снижение экспрессии гена Vegfa и на уровне мРНК, и на уровне белка, а также повышение уровня мРНК гена Pedf (рис. 9в) по сравнению с контрольными животными. На экспрессию гена Phd2 в сетчатке крыс OXYS антиоксидант никак не повлиял (рис. 8б). У крыс Wistar эффект капель SkQ1 на экспрессию генов оказался противоположным: SkQ1 повысил мРНК и белок гена Vegfa (рис. 9а, б) и снизил, по сравнению с контролем, уровень мРНК генов Pedf и Phd2 в сетчатке (рис. 8б и 9в). Можно полагать, межлинейные различия в реакции на SkQ1 связаны с особенностями состояния сетчатки годовалых животных. У крыс OXYS к этому возрасту развиваются выраженные стадии заболевания.
В такой ситуации снижение уровня VEGF способно предотвратить вызываемые повышенными концентрациями этого фактора нарушения проницаемости сосудов и отеки, неоваскуляризацию.
У крыс Wistar признаки ретинопатии при офтальмоскопических осмотрах не выявляются как в возрасте 12 мес., так и в старших возрастных группах. Тем не менее, у годовалых крыс Wistar на молекулярном уровне появляются молекулярные предпосылки, которые в дальнейшем и приводят к органическим изменениям. SkQ1 создает молекулярные условия для поддержания сосудов хориоидеи в сетчатке через повышение экспрессии Vegfa и снижение Pedf, что препятствует развитию ретинопатии. При этом ответ на SkQ1 включал в себя снижение экспрессии гена Phd2 и повышение экспрессии гена VEGF, что, скорее всего, опосредованно у крыс Wistar HIF 1 сигнальным путм.
Сходные изменения уровня мРНК гена Vegfa после приема SkQ1 с кормом наблюдались у крыс OXYS в возрасте 3 мес., когда у них происходит активная манифестация ретинопатии. И хотя для крыс Wistar не характерно развитие патологических изменений, предпосылки для этого, можно полагать, у годовалых животных уже формируются. Примечательно, что характер изменения - снижение количества белка VEGF у крыс Wistar в возрасте 25 мес. в ответ на SkQ1 (рис. 10) - соответствовал реакции годовалых крыс OXYS. То есть и в этом случае мы видим однонаправленные Рисунок 10. Эффект SkQ1 на со изменения экспрессии генов под влиянием держание белка VEGF в сетчат антиоксиданта у крыс OXYS и Wistar, но в ке в 25 мес. ^ -по сравнению с разные возрастные периоды. В этой связи крысами Wistar;
* - эффект пре представляется закономерным отсутствие парата. n= изменений на уровне белка VEGF у крыс OXYS в ответ на воздействие SkQ в возрасте 25 мес. (рис. 10). К этому возрасту в сетчатке крыс OXYS развивается практически полный фиброз хориоидеи и атрофия слоя РПЭ.
Таким образом, терапевтическая способность SkQ1 снижать выраженность уже развитых признаков ретинопатии у крыс OXYS связана так же связана с нормализацией экспрессии генов Vegfa и Pedf. У крыс Wistar в ответ на SkQ1 наблюдалось изменение экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd2, которое качественно соответствовало изменению экспрессии генов у крыс OXYS при профилактике ранней ретинопатии.
Выводы 1. Впервые проведено сравнение возрастных изменений экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 в сетчатке крыс Wistar и OXYS и выявлены различия, ас социированные с развитием ретинопатии, нарушением регуляции кислород ного гомеостаза и ответа на развивающуюся сетчатке крыс OXYS гипоксию.
2. Установлено, что в развитии у крыс OXYS ретинопатии участвуют те же структуры сетчатки и молекулярно-генетические факторы, что и при воз растной макулярной дегенерации у людей, однако направленность изменений экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 и их вклад в развитие патологических изменений зависит от стадии заболевания.
3. При отсутствии клинических проявлений ретинопатии у крыс OXYS в воз расте 20 дней выявлено характерное для острой гипоксии увеличение уровня мРНК гена Phd-2 и снижение площади клеток ретинального пигментного эпителия при не отличающихся от крыс Wistar уровнях мРНК и белков генов Vegfa и Pedf.
4. Развитие ранних стадий ретинопатии у крыс OXYS происходит к возрасту 3-х месяцев на фоне значительного снижения уровня мРНК генов Vegfa и Pedf и содержания их белковых продуктов и характерного для хронической гипоксии снижения уровня мРНК гена Phd- 5. Развитие выраженных стадий ретинопатии у крыс OXYS происходит с месяцев на фоне не отличающегося от крыс Wistar уровня мРНК генов Vegfa и Pedf, а содержание белка Vegfa и уровень мРНК гена Phd-2. снижены, что указывает на нарушение регуляции кислородного гомеостаза и ответа на раз вивающуюся в сетчатке крыс OXYS гипоксию.
6. Показано, что характер изменения профиля экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 в сетчатке под влиянием митохондриального антиоксиданта SkQ1 у крыс Wistar и OXYS различен;
при этом масштабы и направленность его из менений зависят от возраста животных, а терапевтический эффект в отноше нии ретинопатии у крыс OXYS ассоциирован с нормализацией экспрессии этих генов.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
Статьи:
1. Марковец А.М., Колосова Н.Г. Обзор. Возрастная макулярная дегене рация и участие фактора роста сосудистого эндотелия в е патогенезе // Российский офтальмологический журнал. – 2009. - Т. 2. - № 3. - С. 51 58.
2. Марковец А.М., Жданкина А.А., Фурсова А.Ж. Возрастные изменения экспрессии генов VEGF и PEDFи развитие клинико-морфологических проявлений хориоретинальной дегенерации у крыс OXYS// Сборник научных трудов Российского офтальмологического форума. - М. – 2009.
– Т. 2. - С. 184-188.
3. Markovets AM, Saprunova VB, Zhdankina AA, FursovaAZn, Bakeeva LE, Kolosova NG. Alterations of retinal pigment epithelium cause AMD-like reti nopathy in senescence-accelerated OXYS rats // Aging (Albany NY). – 2011.
– Vol. 3(1). – P. 44-54.
4. Markovets AM, FursovaAZn, KolosovaNG.Therapeutic Action of the Mito chondria-Targeted Antioxidant SkQ1 on Retinopathy in OXYS Rats Linked with Improvement of VEGF and PEDF Gene Expression // PLoSOne – 2011.
– Vol. 6(7):e21682. Epub 2011 Jul 5.
Тезисы конференций:
5. Марковец А.М. Экспрессия гена VEGF в тканях глазного дна при раз витии дистрофии сетчатки у крыс OXYS. // Материалы XLVI Междуна родной научной студенческой конференции «Студент и научно технический прогресс»: Биология. – Новосиб. гос. ун-т. – Новосибирск – 2008. – с. 114- 6. Марковец А.М., Фурсова А.Ж., Колосова Н.Г.Экспрессия гена VEGF-A в сетчатке крыс OXYS при развитии дистрофии сетчатки в лечении ми тохондриально-направленным антиоксидантом SkQ 1// Тезисы научно практической конференции «Фундаментальные науки – медицине». – Новосибирск. – 2008. – С. 40.
А.М. Марковец, А.А. Жданкина, А.Ж.Фурсова, Н.Г. Колосова. Связь 7.
дистрофии сетчатки крыс OXYS с экспрессией генов VEGF и PEDF.
Эффекты митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1. // Ма териалы Пятого съезда вавиловского общества генетиков и селекционе ров. – Москва. – 2009. – Ч. 1. – с. 8. Markovets A.M., Zhdankina A.A., Fursova A.J., Kolosova N.G. OXYS rat as animal model of age-related macular degeneration: potential for pathogen esis approach and elevation of treatment // XIXth IAGG World Congress of Gerontology and Geriatrics. - J Nutrition, Health &Aging.; – 2009. – V. 13, Suppl. 1. – 2009. P. S Марковец А.М., Жданкина А.А. Перспективы использования митохон 9.
дриально адресованного антиоксиданта SkQl в лечении дистрофических заболеваний сетчатки и связь его эффектов с нормализацией функций пигментного эпителия// Тезисы 4 Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно приспособительных процессов». - Новосибирск. – 2009. – С. 144- Марковец А.М. Сравнение возрастных профилей экспрессии генов 10.
VEGF и PEDF в сетчатке крыс OXYS и Wistar // Материалы XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и науч но-технический прогресс»: Биология. – Новосиб. гос. ун-т. – Новоси бирск – 2010. 10-14 апреля – с. 11. Markovets AM, Zhdankina AA. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression and morphological changes during normal aging and development of retinopathy in Wistar and OXYS rat`s retina // The seventh international conference of bioinformatics of genome regulation and structure\system biology, 2010, June 20-27, Novosi birsk, p. 178.
12. Kozhevnikova OS, Efimov VM, Markovets AM, Kolosova NG. The tran scriptional profile of retinal pigment epithelium/choroid of OXYS rat as a background for the retinopathy development // The seventh international con ference of bioinformatics of genome regulation and structure\system biology, 2010, June 20-27, Novosibirsk, p. 141.
Марковец АМ, Колосова НГ. Молекулярные эффекты антиоксиданта 13.
SkQ1 при лечении возрастной дегенерации сетчатки // Сборник тезисов ежегодной научной конференции «Фундаментальные науки – меди цине», 2010, 7-10 сентября, Новосибирск, С. Марковец А.М.,Жданкина А.А. Механизмы терапевтического эффекта 14.
митохондриального антиоксиданта SkQ1 при лечении дегенерации сет чатки у крыс OXYS // Сборник тезисов Шестой международной крым ской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные па тологии», 2010, 20-29 сентября, г.Судак, Украина, С.