авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Картирование регуляторных последовательностей в составе ретротранспозонов herv-k (hml-2) и l1.

Учреждение Российской Академии Наук ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

Александрова Елена Александровна Картирование регуляторных последовательностей в составе ретротранспозонов HERV-K (HML-2) и L1.

Специальность – 03.01.03 – молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2011

Работа выполнена в группе геномного анализа сигнальных систем клетки Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им.

академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный консультант:

доктор биологических наук Буздин Антон Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Крамеров Дмитрий Александрович доктор биологических наук Калмыкова Алла Ивановна

Ведущая организация:

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится «12» октября 2011 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-7 г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « » сентября 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Мобильные генетические элементы составляют значительную часть гено мов большинства эукариот. Они занимают свыше 50% ДНК человека, тогда как последовательностям экзонов функциональных генов принадлежит лишь 3-5% генома. Ретроэлементы (РЭ), считаются единственной транспозиционно актив ной группой мобильных элементов млекопитающих. Их распространение про исходит в результате обратной транскрипции РНК-матрицы с образованием кДНК-копии элемента, которая затем интегрируется в новое место генома. РЭ делят на две группы: LTR-содержащие и LTR-не содержащие ретроэлементы (LTR – Long Terminal Repeat). Эндогенные ретровирусы (ЭРВ) и LINE-элементы (Long Interspersed Nuclea Elements, LINE) принадлежат группам содержащих и не содержащих LTR РЭ соответственно и являются автономными мобильными элементами (т.е. кодируют белки, необходимые для обратной транскрипции и встраивания в геном).

ЭРВ имеют строение, аналогичное строению обычных ретровирусов и, как считается, представляют собой остатки активных миллионы лет назад ретрови русов, закрепившихся в геноме путем инфицирования клеток зародышевой ли нии. В геномах ЭРВ представлены провирусами, а также одиночными LTR. LTR ЭРВ содержат функциональные энхансеры, промоторы и сигналы полиаденили рования. Семейство ЭРВ HERV-K (HML-2) уникально тем, что содержит чело век-специфические элементы (чсЭРВ), а также является одним из самых биоло гически активных ретровирусных семейств генома человека.

Ретротранспозоны LINE являются наиболее многочисленной группой ав тономных мобильных элементов в геномах млекопитающих. Так, например, в геноме человека ретротранспозоны LINE-1 (L1) представлены более чем 500. копий, занимающих ~17% геномной ДНК. Полноразмерный L1 имеет длину 6- тысяч пар оснований и состоит из 5’-нетранслируемой области (5’ НТО) и двух открытых рамок считывания (ОРС). Транскрипция мРНК L1 управляется уни кальным внутренним промотором РНК-полимеразы II расположенным в 5’НТО ретротранспозона. Механизм действия этого промотора пока остается неясным.

РЭ являются важнейшими регуляторами структуры и функции геномов, поэтому разработка новых методов поиска транскрипционно-активных РЭ, ана лиз их промоторной активности в контексте геномного окружения, а также ис следование структурной организации их промоторов являются важными и акту альными задачами современной молекулярной биологии.

Цели и задачи исследования Целями данной работы являлось детальное изучение транскрипционной активности человек-специфичных ЭРВ, а также исследование уникального внутреннего промотора ретротранспозона L1.

Были поставлены следующие задачи:

1. разработать метод полногеномной идентификации транскриптов, промо торами которых служат геномные повторы, с его помощью осуществить полно геномное картирование транскрипционно-активных чсЭРВ.

2. провести сравнительный анализ промоторной активности чсЭРВ в двух типах тканей – нормальной и соответствующей ей раковой.

3. картировать точку начала транскрипции в составе LTR чсЭРВ.

4. при помощи метода делеционного картирования выявить участки 5’ НТО L1, имеющие наибольшие влияние на промоторную активность ретротранспозо на.

5. определить положение точек начала транскрипции в 5’ НТО L1 с делети рованным «минимальным промотором».

Научная новизна и практическая ценность работы.

Разработан метод полногеномной идентификации транскрипционно активных повторяющихся элементов - GREM (англ. Genomic Repeat Expression Monitor - GREM). Метод GREM применим как для качественной, так и для ко личественной оценки промоторной активности исследуемой группы повторяю щихся элементов.

С использованием GREM впервые проведено полногеномное картирова ние промоторно-активных чсЭРВ и показано, что по крайней мере 50% чсЭРВ являются транскрипционно активными. Выявлено снижение активности 3' провирусных чсЭРВ в случае их расположения в непосредственной близости от генов или в интронах генов. Показана повышенная транскрипционная актив ность 5’-провирусных LTR чсЭРВ по сравнению с одиночными и 3’ провирусными LTR независимо от ткани.

Проведено картирование альтернативной, отличающейся от канонической, точки начала транскрипции в LTR чсЭРВ. Показано преимущественное исполь зование найденной точки начала транскрипции для экспрессии генов провируса чсЭРВ.

С использованием метода делеционного картирования показано, что наи более важным регуляторным участком 5’ НТО L1 является область +390…+526, а не «минимальный промотор», как считалось ранее. Проведено картирование точки начала транскрипции в 5’ НТО с делецией «минимального промотора» L и показано, что в этом случае происходит смещение старта транскрипции с + нуклеотида 5’ НТО в её 3’- конец или в самое начало ОРС1 L1. Сделано предпо ложение о роли внутренней области 5’ НТО L1 в инициации транскрипции, что может способствовать пониманию механизмов инициации транскрипции не со держащих ТАТА-бокс промоторов.

Апробация диссертации Основные положения диссертации доложены и обсуждены на III между народной конференции, посвященной Н.В. Тимофееву-Ресовскому «Современ ные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Украина, Алушта, 9-14 октября 2010 г.).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 2 тезиса док ладов на конференциях.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 101 странице машинописного тек ста, содержащих 26 рисунков, и состоит из следующих разделов: введения, об зора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 153 ссылки.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

I. Полногеномная идентификация транскрипционно активных чсЭРВ и анализ их промоторной активности.

Доля чсЭРВ, составляет ~5% от общего количества человек специфических последовательностей, образованных внедрениями ретроэлемен тов. К настоящему времени известно 134 чсЭРВ, что составляет небольшую фракцию (~7%) от общего количества эндогенных ретровирусов семейства HERV-K. Представители этой группы мобильных элементов сохранили не толь ко свою транскрипционную активность, но и, возможно, способность к инфици рованию клеток человека. Для полногеномного картирования транскрипционно активных чсЭРВ, нами был разработан метод полногеномного поиска промо торно-активных повторяющихся последовательностей (GREM - Genomic Repeat Expression Monitor).

I.1. Метод GREM.

В основе метода GREM лежит гибридизация суммарного пула 5’ концевых фрагментов кДНК с полногеномным пулом последовательностей, фланкирующих исследуемую группу повторяющихся элементов. Основными стадиями метода GREM, изображенного на Рис.1, являются: (I) синтез библио тек полноразмерных кДНК, содержащих специфические олигонуклеотидные по следовательности на 5’концах, (II) селективная ПЦР-амплификация фланков по вторяющегося элемента, (III) гибридизация кДНК с фланкирующми повтор по следовательностями и последующая ПЦР-амплификация гетеродуплексов «ге номная ДНК – кДНК». В подписи к рис. 1 дано более детальное описание мето да.

Этот поход комбинирует преимущества методов 5’RACE (rapid amplification of 5’ cDNA ends) и гибридизации нуклеиновых кислот в растворе и основан на следующем принципе: в случае, когда геномный повтор является промотором, инициация транскрипции происходит внутри последовательности элемента, а следовательно, такие транскрипты содержат фрагмент последова тельности ретроэлемента на 5’ конце. Это утверждение справедливо для LTR ретровирусов, а также для элементов LINE и SINE. Метод является как качест венным, так и количественным, поскольку доля мРНК, промотором которой служит отдельно взятый элемент, прямо пропорциональна количеству тэгов в получаемой библиотеке гетеродуплексов.

Рис.1. Схематическое изображение метода GREM, примененного для поиска промоторно активных чсЭРВ. (Стадия I) синтез двухцепочечной кДНК с использованием олиго(dT) затравки на матрице образцов мРНК из тканей, в которых изучается экспрессия повторяюще гося элемента. На этой стадии происходит присоединение маркерной последовательности нуклеотидов (CS) к 5’ концам кДНК (являющимся точками начала транскрипции) по механиз му “cap-switch”. Полученная таким образом кДНК затем обрабатывается эндонуклеазой рест рикции, не имеющей сайтов узнавания в повторяющемся элементе (для ЧС LTR удовлетво ряющей всем необходимым требованиям оказалась рестриктаза AluI). Эта процедура позволя ет избежать амплификации последовательностей, содержащих насквозь транскрибированные LTR в прямой ориентации. (Стадия II) Полногеномная амплификация последовательностей геномной ДНК, фланкирующих исследуемый повтор с 3’- конца, после чего проводится обра ботка ампликонов экзонуклеазой ExoIII для получения выступающих 5’-концевых последова тельностей. (Стадия III) Гибридизация меченой с 5’ конца кДНК с ампликонами геномной ДНК. Полученные в результате гибридизации выступающие одноцепочечные фрагменты ДНК достраивают ДНК-полимеразой, после чего проводится nested ПЦР-амплификация гибридов ( тэгов) с праймерами на фланкирующий геномную ДНК адаптор (А2) и на 5’-концевую мар керную последовательность кДНК (CS).

Важным преимуществом метода GREM является то, что в результате его применения происходит селективная амплификация только гетеродуплексов и не происходит амплификации дуплексов кДНК, не относящихся к экспрессии повторов или содержащих насквозь прочитанные повторяющиеся элементы.

Также не происходит и амплификации гетеродуплексов, содержащих насквозь прочитанные повторы. Это достигается введением стадии обработки кДНК час тощепящей эндонуклеазой рестрикции (см. Стадия II на Рис.1), в результате ко торой происходит расщепление двуцепочечных молекул кДНК, синтезирован ных на матрице насквозь прочитанных транскриптов, в том числе и в 5’ фланкирующей области исследуемого повтора. Этот шаг позволяет значительно снизить уровень фоновых последовательностей в получаемых библиотеках.

Для исследования промоторной активности чсЭРВ в качестве эндонуклеа зы рестрикции был использован фермент AluI, не имеющий сайтов узнавания в последовательности LTR чсЭРВ. Чтобы подтвердить правомерность использо вания AluI в этих целях, был проведен анализ баз данных транскрибируемых по следовательностей человека, среди которых было найдено 38 транскриптов, со держащих насквозь прочитанные чсЭРВ, лишь 4 из которых находились в пря мой ориентации. Моделирование “in silico” рестрикции этих транскриптов эндо нуклеазой AluI показало, что эта стадия способна полностью предотвратить по явление таких транскриптов в библиотеках GREM.

Конечным результатом применения метода GREM является набор ампли фицированных гетеродуплексов или ELT тэгов (англ. ELT – expressed LTR tag), каждый из которых содержит 3’-концевой фрагмент LTR, участок геномной ДНК, фланкирующий LTR с 3’-конца, и последовательность искусственно вве дённого олигонуклеотидного адаптора. Для определения профиля экспрессии исследуемого повтора, проводят клонирование и секвенирование полученных ELT тэгов.

Разработанный метод GREM был применен для полногеномной иденти фикации промоторно-активных чсЭРВ, LTR которых характеризуются высокой идентичностью нуклеотидных последовательностей (в среднем 98,1%), а ~90% из них являются человек-специфичными. Для исследования были выбраны две ткани, взятые у одного и того же пациента: паренхима яичка и семинома, пред ставляющие собой нормальную ткань и соответствующее ей злокачественное новообразование. Обе ткани содержат клетки зародышевого пути человека.

Надо заметить, что в отсеквенированных библиотеках ELT однозначное картирование транскрипционно-активных LTR было возможно только в случае транскрипции с одиночных или 3’-провирусных LTR. Точное картирование ге номного расположения 5’-провирусных LTR невозможно в связи с тем, что по следовательности генов провируса, транскрибируемые с них, многократно по вторяются в геноме человека и высоко идентичны между собой (Рис.2).

Рис.2. Схематическое изображение одиночного (слева) и провирусных (справа) LTR. Транс крипция c 5’ провирусного LTR приводит к образованию мРНК вирусных генов, тогда как экспрессия с 3’ провирусного или с одиночного LTR приводит к транскрипции уникальных геномных последовательностей, фланкирующих LTR с 3’ конца.

I.2. Картирование точки начала транскрипции в составе чсЭРВ.

При помощи метода 5’ RACE нами были с точностью до нуклеотида кар тированы точки начала транскрипции для пяти случайно взятых одиночных чсЭРВ, являющихся промоторно-активными в нормальной паренхиме яичка че ловека по результатам GREM. Во всех случаях транскрипция LTR была вызвана собственной промоторной активностью LTR, что является подтверждением применимости метода GREM для поиска промоторно-активных повторов. Ока залось, что точка начала транскрипции совпадает для всех пяти проанализиро ванных элементов и находится в положении 816 консенсусной последовательно сти LTR чсЭРВ, опубликованной А.А. Буздиным и др. в 2003г. В этой консенус ной последовательности были найдены две предполагаемые базовые регулятор ные элементы, типичные для промоторов эукариот: (1) последовательность ААТАААТ, напоминающая ТАТА-бокс (консенсусная последовательность ТАТА(А/Т)А(А/Т)), расположенная в положении -20 от точки начала транс крипции и (2) инициаторная последовательность СТСА(+1)GA, расположенная в точке начала транскрипции (консенсусная последовательность YYСА(+1)RR).

Кроме того, выше точки начала транскрипции были найдены еще два дистально расположенных предполагаемых промоторных элемента: последовательность GACACATCC, сходная с консенсусной последовательностью контролирующего промотор гена бета-глобина элемента (ATGCAAAT) в положении -57 и предпо лагаемый сайт связывания фактора транскрипции OTF-2 – ATGCAAAG (кон сенсусная последовательность ATGCAAAT) в положении -122 (Рис. 3). Вероят но, найденная нами точка начала транскрипции соответствует промотору, кон тролируемому вышеуказанными регуляторными элементами.

Поскольку картированная нами точка начала транскрипции не являлась канонической, интересно было узнать, используется ли она для транскрипции генов провируса HERV-K, которая начинается с 5’ концевых LTR и обуславли вает экспрессию вирусных генов. Для выяснения этого вопроса, были сконст руированы праймеры на последовательность LTR, расположенные на мини мально возможном расстоянии выше или ниже картированной точки начала транскрипции (LTRfor4 и LTRfor3 соответственно) (Рис.3Б). Эти праймеры в па ре с праймером на последовательность вирусного гена gag (праймер Gag) были использованы для ОТ-ПЦР на образцах кДНК, синтезированных на матрице РНК из нормальной паренхимы яичка с использованием случайных гексамерных праймеров в качестве затравки. После электрофореза продуктов ОТ-ПЦР, ото Рис.3. Картирование точки начала транскрипции в последовательнсти LTR. (A) 5’ концевые последовательности кДНК были получены в результате ПЦР амплификации с праймером CS на 5’ конец кДНК и уникальными геномными праймерами G. Картирование проводилось на консен сусную последовательность ЧС LTR HERV-K (HML-2). Курсивом изображены регуляторные по следовательности, предположительно принимающие участие в регуляции транскрипции с данного промотора. (Б) Определение точки начала транскрипции в провирусном LTR, проведенное с по мощью метода ОТ-ПЦР, схема которого изображена на рисунке. (В) Выравнивание фрагмента LTR ~300 п.н., имеющего промоторную активность согласно результатам экспериментов с экс прессией репортерного гена и консенсусной последовательности LTR чсЭРВ.

бранных по истечении разного количества циклов реакции (21, 24, 27, 30, 33, циклов) в агарозном геле, были видны полосы, соответствующие ПЦР продуктам ожидаемой длины, причем в случае ОТ-ПЦР с праймером, лежащим ниже точки начала транскрипции, ПЦР-продукт появлялся на 6 циклов раньше.

Эти результаты позволяют предположить, что инициация с найденной точки на чала транскрипции для одиночного LTR используется для экспрессии провирус ных генов в ~64 раза чаще других точек начала транскрипции. Несмотря на то, что согласно результатам ОТ-ПЦР транскрипция генов провируса начинается преимущественно с картированного нами участка, выше него могут быть распо ложены другие точки инициации транскрипции, например, каноническая точка начала транскрипции.

Интересным является тот факт, что картированная нами точка начала транскриции находится на самом 3’-конце участка LTR R, т.е. в результате транскрипции с LTR в синтезированной мРНК отсутствует область R. В класси ческой модели жизненного цикла ретровируса инициация транскрипции проис ходит на границе областей U3 и R, в результате чего последовательность эле мента R является 5’-концевой в новосинтезированных мРНК провируса. Такой способ транскрипции является необходимым для осуществления жизненного цикла ретровируса, поскольку он обеспечивает возможность переключения об ратной транскриптазы с одной матрицы на другую в ходе синтеза полноразмер ной кДНК ретровируса. Изменение же точки начала транскрипции с канониче ской на картированную нами альтернативную приводит к образованию транс криптов ЭРВ, непригодных для использования в нормальном жизненном цикле ретровируса.

I.3. Применимость метода GREM для количественного анализа промотор ной активности LTR.

Как уже было сказано, метод GREM может быть применен для количест венной оценки уровня экспрессии чсЭРВ. Для того чтобы подтвердить этот факт экспериментально, методом ОТ-ПЦР был измерен уровень экспрессии транс криптов, промотором которых служит LTR, после чего было проведено сравне ние полученных результатов с частотой встречаемости ELT тэгов в библиотеке GREM. ПЦР-амплификация проводилась с парами праймеров, один из которых был специфичен к 3’ концевой последовательности LTR и направлен в окру жающую LTR область генома, тогда как другой праймер был специфичен к фланкирующей LTR уникальной геномной последовательности, располагаю щейся на расстоянии 70-300 п.о. от 3’ конца LTR, и направлен в сторону LTR.

Уровень транскрипции измеряли относительно уровня транскрипции гена до машнего хозяйства – гена бета-актина ACTB. Для 20 проанализированных чсЭРВ, частота встречаемости ELT линейно коррелировала с уровнем транс крипции, измеренным с помощью ОТ-ПЦР. Коэффициенты корреляции для библиотек GREM из паренхимы и семиномы составляли 0,91 и 0,89 соответст венно, что позволило сделать вывод о том, что метод GREM применим как для качественной, так и для количественной оценки промоторной активности иссле дуемой группы повторяющихся элементов.

I.4. Поиск промоторно-активных чсЭРВ.

Из полученных в результате использования метода GREM библиотек ELT было отсеквенировано по 500 клонов для каждой ткани. Для анализа были взяты 395 и 419 качественно прочитанных клонов для паренхимы яичка и семиномы соответственно. В результате было показано, что из ~150 представителей чсЭРВ, 78 (~50%) являются промоторно активными хотя бы в одной из тканей. Количе ственное содежание ELT для многих отдельно взятых LTR в значительной мере различалось в нормальной и опухолевой тканях. Многие LTR имели низкий уро вень экспрессии, в связи с чем они были представлены небольшим количеством ELT тэгов в отсеквенированных библиотеках ELT. Другие же, наоборот, прояв ляли высокий уровень транскрипционной активности и были представлены по вышенным количеством ELT (10 и выше). Для семи одиночных чсЭРВ и для фракции 5’ провирусных LTR частота встречаемости ELT различалась в 5 раз и выше между библиотеками ELT паренхимы яичка и семиномы. Из них 5’ прови русные LTR и четыре одиночных LTR проявляли повышенный уровень экспрес сии в семиноме, тогда как три оставшихся LTR были оверэкспрессированы в па ренхиме яичка. Для пяти одиночных и 5’-провирусных LTR полученные резуль таты были проверены методом ОТ ПЦР на матрицах кДНК паренхимы яичка и семиномы с использованием уникальных геномных праймеров, специфичных к фланкирующим LTR последовательностям. Для всех пяти LTR наблюдалась корреляция уровней транскрипции, определенных на основании результатов ОТ ПЦР с результатами, полученными на основании анализа относительного соста ва ELT. Для двух оставшихся LTR, проявляющих значительную тканеспеци фичность согласно результатам GREM, было проблематично сконструировать уникальные геномные праймеры, поскольку эти LTR были фланкированы ге номными повторами. Ранее было установлено, что экспрессия генов провируса, промотором которых служит 5’ LTR, происходит предпочтительно в герминаль ных опухолевых тканях, то есть в опухолях клеток зародышевой линии. Это подтверждается и полученными нами результатами, согласно которым экспрес сия с 5’-провирусного LTR в семиноме приблизительно в 6 раз превышает экс прессию в нормальной паренхиме яичка.

Анализ промоторной активности чсЭРВ в зависимости от геномного окру жения. Для проведения этого анализа, все чсЭРВ были картированы в геноме с помощью сервера UCSC human genome browser. В зависимости от расстояния до ближайшего известного гена или картированной кДНК, чсЭРВ были разделены на 4 группы, схематически изображенные на Рис.4А: группа I расстояние от ге на до элемента (D) 35 т.п.н. (80 элементов);

группа II 35 т.п.о. D 5 т.п.о. ( элемента);

группа III элементы находятся либо в интронах генов, либо на рас стоянии D5 т.п.о. (40 элементов) и группа IV, элементы которой находятся в экзонах известных генов или картированных кДНК, транскрибируемых не с промотора LTR (12 элементов). Подробная информация о геномной локализации LTR, соседних генах и картированных кДНК, размещена в формате MS Exel в Интернет:

http://www.thescientificworld.com/supplements/2007.270/Buzdin_031307_SuppTable 1.xls Рис.4. Доля промоторно-активных LTR в зависимости от геномного окружения. (А) Все чсЭРВ были разделены на 4 группы в зависимости от расстояния до известных генов – группы I, II, III, IV (детали см. в тексте). (Б) Диаграмма изображает долю LTR, промоторно активных хотя бы в одной из двух тканей. (В) Диаграмма изображает долю LTR, промотор но-активных как в паренхиме яичка, так и в семиноме.

Для каждой из четырех групп LTR был проведен анализ промоторной ак тивности, результаты которого представлены на диаграммах, изображенных на рис.4Б и 4В. На рис.4Б показана доля промоторно-активных LTR чсЭРВ по крайней мере в одной из двух тканей. Поскольку каждая группа характеризуется разным количеством элементов, то для сравнения нами использовались норми рованные на количество элементов в группе величины (количество промоторно активных элементов отдельно взятой группы делилось на суммарное количество элементов этой группы). Из диаграммы видно, что доля промоторно-активных элементов в группе I мала (34%), тогда как для элементов группы II она выше в 1,8 раз и составляет 63%. Для LTR, находящихся в непосредственной близости от генов или в интронах генов (группа III) это значение было еще немного выше (68%). И, наконец, самая высокая доля промоторно-активных LTR (75%) была получена для элементов, находящихся в экзонах генов (группа IV).

Диаграмма, изображенная на рис.4В, отражает распределение элементов, функционирующих в качестве промоторов в обоих типах исследуемых тканей – нормальной паренхиме и семиноме. Доля таких “повсеместно” транскрибируе мых LTR была соответственно 10, 29, 20% для групп I, II, III, тогда как для группы IV это значение было гораздо больше значений для остальных групп – 67%, выделяя ее на общем фоне.

На основании полученных результатов можно сделать следующие выво ды: (1) ген-богатые области генома характеризуются наиболее высоким содер жанием промоторно-активных LTR;

(2) эти значения достигают максимума для элементов группы IV, т.е. в тех случаях, когда чсЭРВ частично или полностью перекрывается с экзонной последовательностью в составе гена;

(3) LTR, отно сящиеся к группе IV чаще всего используются в качестве промоторов в обеих тканях. Такая ярко выраженная промоторная активность LTR группы IV может быть связана с лучшей доступностью этих элементов для факторов транскрип ции.

Анализ промоторной активности чсЭРВ в зависимости от геномного окружения и статуса LTR. Был проведен количественный анализ промоторной активности индивидуальных и 3’ – провирусных LTR в зависимости от их при надлежности к группам I-IV. 5’-провирусные LTR, как уже упоминалось ранее, не поддаются детальному исследованию, поскольку невозможно идентифициро вать, какие именно из LTR являются промоторно-активными. Относительная сила промоторов чсЭРВ каждой группы вычислялась как отношение двух вели чин: (1) относительной доли ELT отдельно взятой группы (с I по IV) в суммар ном пуле ELT всех групп (за вычетом 5’ провирусных LTR) и (2) доли чсЭРВ этой группы (за вычетом 5’ провирусных LTR) среди чсЭРВ всех групп (также за вычетом 5’ провирусных LTR).

Рис.5. Относительная промотоная сила 3’ провирусных (обозначены серым цветом) и индиви дуальных (обозначены черным цветом) LTR, сгруппированных в зависимости от расстояния до генов (группы I-IV, детальное описание см. в тексте). (А) Паренхима яичка;

(Б) семинома.

Результаты анализа промоторной активности чсЭРВ изображены на рис.5.

Из диаграмм видно, что 3’-провирусные LTR проявляют сходный характер транскрипции в обеих тканях: представители группы I имеют низкий уровень транскрипции в обоих случаях, для элементов группы II эти значения сильно возрастают (наблюдается увеличение уровня транскрипции в ~30-60 раз), эле менты группы III (как и элементы группы I) проявляют достаточно низкий уро вень транскрипции и, наконец, группа IV характеризуется повышением уровня транскрипции в ~2-2,5 раза. Для индивидуальных LTR эти профили выглядят по-другому: элементы группы I проявляют низкую промоторную активность, элементы групп II и III – умеренную и, наконец, максимальная промоторная ак тивность наблюдается для одиночных LTR группы IV, расположенных в экзонах генов (их промоторная активность в 4-6 раз выше промоторной активности эле ментов группы III).

На основании полученных результатов, можно предположить, что проис ходит избирательное подавление транскрипции 3’-провирусных LTR в случае, когда они располагаются в ген-богатых областях. Надо отметить, что относи тельные силы промоторов как индивидуальных, так и 3’ провирусных LTR группы III были значительно ниже относительной силы промоторов LTR группы II в нормальной ткани (паренхиме яичка). Это также может быть связано с суще ствованием клеточных механизмов избирательной супрессии “лишних” промо торов, находящихся в интронах генов или в непосредственной близости от них.

Такой способ регуляции экспрессии LTR может служить для минимизации воз можных разрушительных эффектов фоновой транскрипции, таких как экспрес сия антисмысловых РНК, способных оказывать влияние на нормальную экс прессию генов по механизму РНК-интерференции. Поскольку ~90% располо женных в интронах генов чсЭРВ находятся в обратной ориентации по отноше нию к направлению транскрипции гена, транскрипция с этих элементов может привести к образованию пула регуляторных интерферирующих РНК.

Также было проведено разделение всех LTR на три группы в зависимости от их статуса (индивидуальные, 3’- или 5’-провирусные LTR) и сравнение их промо торной активности между собой. Среднее значение относительной силы промо торов группы чсЭРВ вычислялось как отношение следующих величин: (1) доля ELT выбранной группы LTR от общего числа всех ELT и (2) доля чсЭРВ анали зируемой группы в общем количестве чсЭРВ. Из результатов, предоставленных на Рис. 6, следует, что средние значения промоторной силы индивидуальных и 3’-провирусных LTR были практически одинаковыми для обеих тканей, тогда как сила промоторов 5’-провирусных LTR в паренхиме яичка в ~2.5 раза превы шала силу промоторов 3’-провирусных и индивидуальных LTR и в ~5 раз – в семиноме. Эти результаты согласуются с ранее опубликованными данными о повышенном уровне экспрессии генов провирусов HERV-K (HML-2) в клетках раковых опухолей зародышевого пути. В связи с этим, можно предположить, что последовательности провирусов содержат некоторые до сих пор не охарак теризованные регуляторные элементы, находящиеся в «теле» провируса ниже последовательности LTR, которые обеспечивают повышенный уровень экспрес сии 5’ провирусных LTR, особенно в семиноме.

Рис.6. Сравнение относительной силы промоторов индивидуальных, 5’- и 3’-провирусных LTR. Серые и черные столбцы представляют от носительную силу промоторов LTR в паренхиме яичка и семино ме соответственно.

Рис.7. Сравнение уровней транскрипции некоторых генов человека и LTR. Значения относи тельных уровней транскрипции случайно выбранных чсЭРВ и располагающихся радом с ними генов были измерены методом ОТ ПЦР, за 100% взят уровень транскрипции гена бета актина. (А) Паренхима яичка. (Б) Семинома.

Был проведен сравнительный анализ промоторной активности LTR, распо ложенных вблизи генов, с уровнями экспрессии этих генов. Для этого была про ведена серия ОТ-ПЦР с праймерами на последовательности экзонов генов. Всего были проанализированы уровни экспрессии 16ти случайно выбранных генов, расположенных вблизи промоторно-активных чсЭРВ. (Рис. 7). Для разных чсЭРВ, частота встречаемости транскриптов могла различаться в ~1000 раз, причем уровень экспрессии некоторых из них был сопоставим с уровнем экс прессии гена домашнего хозяйства бета-актина ACTB, взятого за 100%. Какой либо ярко выраженной корреляции между уровнями транскрипции генов и со седних с ними LTR получено не было.

II. Роль внутренней области 5’ НТО ретротранспозона L1 и его «ми нимального промотора» в эффективной инициации транскрипции.

Транскрипция ретротранспозона L1 человека управляется необычным внутренним промотором РНК-полимеразы II, расположенным в его длиной 5’ НТО. Детально механизм действия этого внутреннего промотора пока не изучен, однако к настоящему моменту уже описаны некоторые структурные и функцио нальные характерные черты промотора L1. Так, например, для L1 человека было показано, что первые 668 п.о. его 5’ НТО являются наиболее важным участком для обеспечения промоторной активности 5’ НТО. Эта область содержит сайты связывания различных факторов транскрипции, способных регулировать экс прессию L1 различными способами. В 1990 году Г. Сверголдом были проведены эксперименты, согласно которым делеция 5’-концевого участка длиной ~100 п.о.

приводит к полной потере промоторной активности 5’ НТО. Кроме того, было обнаружено присутствие функциональных сайтов связывания факторов транс крипции YY1 и RUNX3 в положениях +13…+21 и +83…+101 соответственно, что послужило косвенным доказательством правоты наблюдений Сверголда и позволило предположить, что внутренний промотор L1 расположен в первых 100 п.о. его 5’ НТО, названных впоследствии «минимальным промотором».

Однако были опубликованы и некоторые противоречащие этим результа там сообщения, в которых было сделано предположение о том, что 5’-концевой сайт связывания YY1 не является необходимым для эффективной транскрипции и что остальная часть 5’ НТО также способна значительно повлиять на промо торную активность L1. Кроме того, было показано что внутренняя область 5’ НТО человеческого L1 (область с +100 по +668 п.о.), также содержит многочис ленные функциональные сайты связывания различных факторов транскрипции таких как SOX11 (в положениях +472…+477 и +572…+577), RUNX (+526…+508) и p53 (+452…+466), действующих в качестве активаторов транс крипции.

В 2007 г. И.А. Оловниковым и др. была опубликована статья, в которой было продемонстрировано, что 5’ НТО L1 человека в отсутствие 5’-концевой области, все еще способна обеспечивать эффективную транскрипцию репортер ного гена во временно трансфецированных клетках человека. Эти результаты не согласуются с общепринятой теорией о том, что присутствие 5’-концевого уча стка 5’ НТО L1 человека длиной ~100 п.о. критически важно для промоторной активности L1. В сотрудничестве с авторами этой статьи, нами была проведена серия дополнительных экспериментов для прояснения механизма функциониро вания промотора L1 и детального исследования влияния различных участков 5’НТО на эффективность транскрипции L1.

II.1. Влияние делеций в 5’ нетранслируемой области ретротранспозона L на изменение промоторной активности 5’ НТО.

Для анализа промоторной активности 5’ НТО L1 человека in vivo, нам был любезно предоставлен набор генетических конструкций, содержащих различные делеционные варианты 5' НТО. Эти конструкции были созданы на основании коммерческой плазмиды pGL3 и непосредственно за последовательностью 5’ НТО с делециями или без, содержат репортерный ген люциферазу светлячка (Рис.8). В совокупности, делеции перекрывают область 5’ НТО L1 с +1 по + нт., тогда как длина всего 5’ НТО составляет 907 п.о. Клетки линий HEK 293 и NTera2/D1 были временно трансфецированы вышеупомянутыми конструкциями в паре с нормализационным вектором pCMV-lacZ, содержащим репортерный ген бета-галактозидазу под контролем промотора цитомегаловируса и необхо димым для минимизации ошибок, вызванных различиями в эффективности трансфекции. Для анализа промоторной активности делетантов 5’ НТО, для ка ждой из конструкций были проведены измерения уровней люминисценции лю циферазы, после чего полученные результаты были нормализованы на уровень активности бета-галактозидазы. Значения, полученные для конструкций с деле циями, были затем нормализованы на значение, полученное для конструкции, содержащей полноразмерный 5’ НТО L1.

Клеточная линия NTera2/D1 была выбрана для проведения экспериментов, поскольку ранее она была успешно использована для функциональных тестов по изучению 5’ НТО L1, а также в ней экспрессируются эндогенные L1. Клеточная линия HEK293 была выбрана в качестве альтернативной.

Согласно результатам проведенных экспериментов, делеция 5’-концевого участка 5’ НТО L1 длиной 98 п.о., являющегося «минимальным промотором» и «крайне важного» для промоторной активности, приводит лишь к 1.3- и 2.4 кратному снижению промоторной активности 5’ НТО L1 в клетках HEK293 и NTera2/D1 соответственно (Рис.8Б). Кроме того, транскрипционная активность отдельно взятого «минимального промотора» (конструкция L1(133-887)) была достаточно низкой и составила лишь 24 и 30% от промоторной активности пол норазмерной 5’ НТО в клетках NTera2/D1 и HEK293 соответственно. Наиболь шее падение промоторной активности наблюдалось для конструкции, содержа щей делецию внутренней области 5’ НТО 390-526 (конструкция L1(390-526)), промоторная активность которой составила 29 и 28% от активности полнораз мерной 5’ НТО в клеточных линиях NTera2D1 и HEK293 соответственно. Под тверждением этих результатов служит еще и то, что промоторная активность конструкции L1(1-386) была в 11 и 8.5 раз выше по сравнению с промоторной активностью конструкции L1(1-664) в клетках NTera2/D1 и HEK293 соответст венно.

Рис.8. Влияние делеций в 5’ НТО на эффективность транскрипции L1 по результатам измере ний люминисценции репортерного белка люциферазы. A – Схематический вид конструкции L1wt, содержащей полноразмерную 5’ НТО L1. Б – Схематическое изображение конструкций, полученных на базе конструкции L1wt (слева);

относительные значения активности люцифе разы в лизатах трансфецированных клеток (справа), нормализованные на уровень экспрессии бета-галактозадазы. Уровень активности полноразмерной 5’ НТО взят за единицу.

Для того подтверждения результатов, полученных на основании измере ний активности репортерного белка люциферазы, были проведены измерения уровней экспрессии мРНК этих же репортерных генов с использованием ОТ ПЦР в реальном времени. Как и в предыдущем эксперименте, уровень экспрес сии мРНК гена люциферазы был нормализован на уровень экспрессии мРНК бе та-галактозидазы, а относительная активность полноразмерной 5’НТО была взя та за 1. В общем и целом, результаты, полученные с помощью ОТ-ПЦР в реаль ном времени аналогичны полученным на основании измерений уровней экс прессии репортерных белков (Рис.9). Так, собственная промоторная активность «минимального промотора» в обеих клеточных линиях была невысокой (38 и 23% для клеток HEK293 и NTera2/D1 соответственно), а делеция области, соот ветствующей «минимальному промотору» приводила к 3.8 и 2.2-кратному сни жению транскрипционной активности в клетках HEK293 и NTera2/D1 соответ ственно. Снижение же промоторной активности в результате делеции внутрен ней области с 390 по 526 нт. было 4.8 и 5.5-кратным для тех же клеточных линий соответственно. Эти результаты подтверждают важность присутствия внутрен ней области (390-526) для транскрипционной активности промотора, содержа щегося в 5’ НТО L1 человека и противоречат сложившемуся на сегодняшний день мнению о ключевой роли «минимального промотора». Различия в активно Рис.9. Влияние делеций в 5’ НТО на эффективность транскрипции L1 по результатам измере ний количественного содержания мРНК репортерного гена. В левой части рисунка схематиче ски изображены конструкции, содержащие пошаговые делеции в 5’ НТО L1. В правой части рисунка приведены результаты измерений количества мРНК репортерного гена люциферазы.

Уровень активности полноразмерной 5’ НТО взят за единицу.

сти одних и тех же участков 5’ НТО, наблюдаемые для использованных в экспе рименте клеточных линий, могут быть объяснены ткане-специфичностью регу ляции промотора L1.

II.2. Картирование точек начала транскрипции в конструкциях, содержа щих 5’ НТО L1 с делецией «минимального промотора».

Поскольку конструкция с делецией области (1-98) 5’ НТО L1 человека не содержит обычной для L1 точки начала транскрипции, расположенной в поло жении +1 5’ НТО, было интересно узнать, что же происходит с точкой начала транскрипции в отсутствие «минимального промотора». Для ответа на этот во прос был применен улучшенный метод 5’ RACE, использующий лигирование РНК-адаптора – 5’-RLM-RACE (RNA Ligase Mediated Rapid Amplification of cDNA Ends).

Для этого клетки были трансфецированы конструкцией L1(1-98), после чего было проведено выделение тотальной РНК из клеток. Метод 5’-RLM-RACE был применен для определения точек начала транскрипции мРНК, кодирующих репортерный белок люцеферазу. Полученные ампликоны были клонированы, после чего было отсеквенировано по двадцать индивидуальных клонов для каж дого типа клеток. Полученные последовательности были картированы на 5’ концевую часть L1 человека, в результате чего были определены точки начала транскрипции.

Местоположения точек начала транскрипции в последовательности L различались для разных клеточных линий (HEK293 и NTera2/D1) (Рис.10). В клетках HEK293, были найдены две различных точки начала транскрипции, рас полагающиеся в непосредственной близости друг от друга в положениях +932 и +936, что соответствует положениям +12- и +16 п.о. от начала ОРС1 L1 соответ ственно. Что касается результатов, полученных для клеточной линии NTera2/D1, то в этом случае был идентифицирована единственная точка начала транскрип ции для всех отсеквенированных клонов. Она находится в положении +786 3’ концевой области 5’ НТО L1.

Рис.10. Картирование точки начала транскрипции в конструкции L1(1-98) в клетках линий HEK293 и NTera2/D1. Схематическое изображение области 5’ НТО, которую содержали конструкции, Делеция первых 98 п.о. в 5’ НТО изображена пунктирной линией. Оставшаяся часть 5’ НТО изображена сплошной черной линией. Шкала на последовательности 5’ НТО показывает положения нуклеотидов с +1 с интервалами в 100 п.о. Местоположение картиро ванных ТНТ показано стрелками.

На основании полученных результатов, можно сделать предположение о том, что роль первых 100 п.о. 5’ НТО L1 человека, заключается в связывании факторов транскрипции, которые взаимодействуют с пре-инициационным комплексом и ответственны за точную инициацию транскрипции с + нуклеотида последовательности L1. В случае же 5’ НТО с делецией «минимального промотора», происходит смещение точек начала транскрипции в ниже расположенные области L1.

ВЫВОДЫ 1. Разработан новый метод полногеномной идентификации промотор но-активных повторяющихся элементов (GREM).

2. Для двух типов тканей – паренхимы яичка и семиномы было прове дено полногеномное картирование промоторно-активных человек-специфичных эндогенных ретровирусов, в результате которого было показано, что по крайней мере 50% человек-специфичных эндогенных ретровирусов (чсЭРВ) обладают промоторной активностью в тканях человека.

3. Было проведено картирование альтернативной точки начала транс крипции в чсЭРВ, с которой в большинстве случаев происходит инициация транскрипции.

4. В результате анализа промоторной активности чсЭРВ в зависимости от геномного окружения и от статуса LTR было показано, что:

а) ген-богатые области генома характеризуются наиболее высоким содер жанием промоторно-активных чсЭРВ.

б) промоторная активность 3'-провирусных чсЭРВ снижена в случае ин тронного расположения LTR.

в) 5’-провирусные LTR имеют более высокую промоторную активность по сравнению с индивидуальными и 3’-провирусными LTR.

5. Транскрипционная активность чсЭРВ не коррелирует с уровнем экс прессии соседних с ними генов.

6. Наиболее важной областью, ответственной за промоторную силу 5’НТО L1, является внутренний участок +390…+526, а не первые 100 нуклеоти дов, как считалось ранее.

7. Выдвинута гипотеза о том, что основная роль «минимального про мотора» 5’НТО L1 заключается в позиционировании точки начала транскрип ции.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

Публикации в научных журналах:

1. E. Kovalskaya, A. Buzdin, E. Gogvadze, T. Vinogradova, E. Sverdlov. Functional human endogenous retroviral LTR transcription start sites are located between the R and U5 regions. Virology, 2006, Mar 15;

346(2):373- 2. A. Buzdin, E. Kovalskaya-Alxandrova, E. Gogvadze, E. Sverdlov. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active re peats. Nucleic Acids Res. 2006 May 12;

34(9):e 3. A. Buzdin, E. Kovalskaya-Aleksandrova, E. Gogvadze, E. Sverdlov. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as ac tive promoters for host nonrepetitive DNA. J Virol, 2006, Nov;

80(21):10752- Публикации в научных книгах:

А. Buzdin, M. Suntsova, O. Bantysh, E. Aleksandrova, A. Zabolotneva, E.

Gogvadze, and N. Gaifullin. Глава №23 в книге «Radiobiology and environmental security», eds. C.E. Mothersill, V. Korogodina and C.B. Seymour. Springer, ISBN 978-94-007-1999-6 (PB) p: 269- Материалы российских и международных научных конференций:

1. E. Gogvadze, E. Kovalskaya, A. Buzdin, T. Vinogradova, E. Sverdlov. Mapping of transcriptional start site within solitary and proviral HERV-K LTRs. 20th IUBMB International congress of biochemistry and molecular biology and 11th FAOBMB con gress, 2006, Kyoto, Japan 2. E. Aleksandrova, S. Dmitriev, A Buzdin. Functional characterization of the transcriptional regulatory elements in human retrotransposons HERV-K (HML-2) and L1. III International conference “Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution”, 2010, Alushta, Ukraine.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.