Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями р. streptococcus
На правах рукописи
Белодед Андрей Васильевич Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями р. Streptococcus Специальность: 03.00.23 – Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва, 2008 г.
Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева и в ГУ научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Научный консультант: кандидат технических наук, доцент Марквичев Николай Семенович Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Самойленко Игорь Иннокентьевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Складнев Дмитрий Анатольевич доктор биологических наук, вед. научн. сотр.
Михальчик Елена Владимировна
Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной био технологии (МГУПБ).
Защита состоится 21 октября 2008 г. в 10.30 часов на заседании Диссертационного Совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им.
Д.И. Менделеева по адресу: 125047 г. Москва, Миусская пл., д. 9, в аудитории (конференц-зал), тел. (499) 978-74-66.
С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И.Менделеева.
Автореферат диссертации разослан _ сентября 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета Шакир И.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Прогресс в понимании биологических функций гиалу роновой кислоты (ГК) [Toole, 2000] привел и, безусловно, еще приведет к расши рению сфер применения данного гликозаминогликана в составе различных меди цинских, косметических, ветеринарных препаратов и дальнейшему увеличению спроса на биополимер. При этом уже сейчас наблюдается определенный дефицит ГК высокой и относительно небольшой молекулярной массы, что отражается на высокой цене этого полисахарида, особенно по сравнению с аналогичными соеди нениями растительного, животного или микробного происхождения.
В последнее время появляется все больше сведений о размероспецифичности биологических функций и свойств ГК [McKee et al., 1996;
Horton et al., 1998, 1999;
Ohkawara et al., 2000]: препараты ГК различной молекулярной массы стимулируют ангиогенез или проявляют антиангиогенные и противовоспалительные свойства, обладают иммуномодулирующими и антиоксидантными свойствами. Полисахарид, фракционированный по молекулярной массе, может найти разнообразное примене ние в медицине, ветеринарии, косметологии, поэтому работы по совершенствова нию методов получения ГК и препаратов из ее отдельных фракций с заданной мо лекулярной массой имеют большое научное и практическое значение.
Традиционный способ получения ГК основан на экстракции биополимера из различных органов млекопитающих и птиц, например, из стекловидного тела глаза крупного рогатого скота, гребней кур или пупочных канатиков новорожденных. Да же при беглом анализе животных источников ГК видно, что сырьевая база промыш ленного получения данного полисахарида весьма ограничена и не может полностью удовлетворить постоянно растущий спрос на ГК. Кроме того, выделение ГК из жи вотного сырья часто осложняется тем, что в тканях и органах млекопитающих и птиц биополимер находится в комплексе с белками;
присутствие родственных гли козаминогликанов также затрудняет выделение ГК. Этих недостатков лишен био технологический способ получения ГК, основанный на культивировании микроор ганизмов-продуцентов ГК. Сырьем для получения полисахарида микробиологиче ским синтезом являются доступные соединения и компоненты: глюкоза, дрожжевой экстракт (ДЭ), минеральные соли и т. п. Производство ГК на основе микробиологи ческого синтеза не зависит от поставок животного сырья, а также легко масштабиру ется и перепрофилируется в случае изменения конъюнктуры рынка.
В силу данных причин можно полагать, что биотехнологическое производство постепенно будет вытеснять получение ГК методом традиционной экстракции из животного сырья. Следует отметить, что в настоящее время биотехнологическое производство ГК в России отсутствует. Отечественная ГК представлена препара тами, полученными экстракцией из гребней кур, а объем производимой ГК не удовлетворяет внутреннему спросу, что приводит к зависимости от импорта био полимера. Поэтому исследование процессов синтеза и деградации ГК микроорга низмами может лечь в основу создания биотехнологического производства ГК в России.
Цель исследований. Изучить физиологические и биохимические аспекты ме таболизма (биосинтеза и деградации) ГК бактериями р. Streptococcus, а также раз работать научные основы управляемого культивирования и оптимизировать про цесс микробиологического синтеза ГК штаммом-продуцентом, подобрав питатель ную среду, физико-химические условия и режимы культивирования. Исследовать процесс ферментативной деполимеризации ГК стрептококковыми гиалуронатлиа зами для получения фракций полисахарида с заданной молекулярной массой и ана лиза ГК в биопробах сложного состава.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Методом индуцированного мутагенеза получить высокопроизводительный штамм-продуцент ГК.
2. Произвести выбор среды для культивирования штамма-продуцента ГК, оптими зировать состав среды и физико-химические условия культивирования с целью увеличения выхода ГК.
3. Исследовать связь синтеза ГК с физиологическим состоянием культуры микро организмов и выявить возможные механизмы регуляции синтеза ГК. Изучить влияние степени аэрации ферментационной среды на биосинтез ГК.
4. Исследовать кинетику деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой.
Разработать метод получения препаратов ГК различной молекулярной массы, по добрав оптимальные условия проведения деполимеризации как для получения ГК низкой молекулярной массы, так и для осуществления полного гидролиза ГК.
5. Разработать метод определения концентрации ГК в сложных многокомпонент ных смесях и биологических объектах, включающих разнообразные сопутствую щие биополимеры, используя специфичность энзиматической деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой.
Научная новизна работы.
1. Установлено, что потеря капсул, состоящих из ГК, штаммом Streptococcus equi subsp. zooepidemicus В-8014 на поздней экспоненциальной и стационарной фазах культивирования происходит вследствие проявления штаммом гиалуронатлиазной активности. Этим же явлением объясняется снижение концентрации ГК в культу ральной жидкости (КЖ) и “немукоидный” характер колоний, формируемых штам мом на агаризованной среде. УФ-индуцированным мутагенезом получен штамм S.
equi subsp. zooepidemicus КБ-04, характеризующийся стабильностью формируемых капсул и мукоидной морфологией колоний.
2. Выявлено влияние основных компонентов предложенной питательной среды (источника углерода, азота, фосфора, солей органических и неорганических ки слот) на биосинтез ГК. Обнаружено, что наибольшее отрицательное влияние на биосинтез ГК бактериями S. equi subsp. zooepidemicus оказывают ионы Mg2+.
3. Показано, что улучшение аэрации ферментационной среды способствует увели чению удельного выхода ГК, что связано, по-видимому, с окислением избыточных восстановительных эквивалентов NADH2, образующихся в процессе биосинтеза ГК и затрудняющих ее дальнейший синтез, а также нарушающих окислительно восстановительный баланс молочнокислого брожения.
4. Исследована кинетика деградации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой и по казано, что незавершенность реакции деполимеризации обусловлена необратимой инактивацией стрептококковой гиалуронатлиазы, которая вызвана частичным авто протеолизом фермента. Предложен способ получения препаратов ГК различной молекулярной массы, используя метод ферментативной деполимеризации ГК. Раз работан метод определения ГК в сложных биологических образцах, содержащих мешающие примесные биополимеры со сходной с ГК структурой, основанный на ВЭЖХ продуктов энзиматической деградации ГК.
Практическая значимость работы.
1. Впервые в России методом микробиологического синтеза получены препараты ГК. В качестве продуцентов биополимера использовались бактерии р.
Streptococcus, обладающие естественной способностью к биосинтезу данного гли козаминогликана. Штамм S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04, полученный УФ индуцированным мутагенезом родительского штамма S. equi subsp. zooepidemicus В-8014, характеризуется стабильностью образуемых капсул на всем протяжении культивирования. Концентрация ГК в КЖ S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04 пре вышает концентрацию, достигаемую при культивировании штамма S. equi subsp.
zooepidemicus В-8014 в аналогичных условиях, в 3 – 5 раз. Оптимизация состава питательной среды, физико-химических условий и режимов культивирования по зволила многократно увеличить выход ГК.
2. Исследование кинетики деградации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой по зволило предложить схему проведения ферментативной реакции, позволяющую добиться практически полной деполимеризации ГК, что, в свою очередь, позволило разработать метод определения концентрации ГК в сложных многокомпонентных смесях и биологических объектах, включающих разнообразные мешающие биопо лимеры, используя специфичность энзиматической деполимеризации ГК.
3. Методом энзиматической деполимеризации получены препараты ГК различной молекулярной массы. Показано, что вискозиметрия может использоваться для на блюдения за ходом расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой, поскольку падение вязкости растворов и уменьшение молекулярной массы ГК хорошо корре лируют.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на: 15th Interna tional Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis (Флоренция, 2004 г.);
международных конференциях “Успехи в химии и химической технологии” (Мо сква, 2004 г.;
Москва, 2005 г.);
III и IV Московских международных Конгрессах “Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Москва, 2005 г.;
Москва, 2007 г.);
VI научно-практической конференции “Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии” (Москва, 2006 г.);
Всероссийской научно-технической кон ференции “Наука-производство-технологии-экология” (Киров, 2008 г.).
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 2 статьи и 7 материалов докладов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы из 302 наименований. Работа изложена на 174 страницах маши нописного текста и содержит 55 рисунков, 13 таблиц.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 1. Объекты и методы исследования Штамм-продуцент ГК. В работе использован штамм S. equi subsp. zooepi demicus (S. zooepidemicus) B-8014 (ATCC 39920) из коллекции ВКПМ ФГУП “Гос НИИгенетика”. Данный штамм обладает естественной способностью к синтезу ГК, не проявляет гемолитической активности, является аттенуированным штаммом IV группы патогенности, не способным в норме вызывать заболевания человека, что и послужило основанием для его выбора в качестве объекта исследования. Стрепто кокковая гиалуронатлиаза представляет собой очищенный, лиофильно высу шенный ферментный препарат, полученный при культивировании Streptococcus pneumoniae, производства филиала “МедГамал” ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Глубинное культивирование S. zooepidemicus осуществляли (а) в стеклян ных колбах без отбойников на 100 мл с ватно-марлевыми пробками на качалке “New Brunswick” G10 при скорости вращения платформы 150 об/мин и температу ре 37 °C. Аэрацию регулировали степенью заполнения колб питательной средой.
(б) В лабораторном биореакторе на 10 л с обечайкой из стекла, (в) в лабораторном биореакторе на 1,5 л с обечайкой из стекла. Культивирование в ферментерах осу ществляли при температуре 37 °С с автоматическим контролем рН среды подачей стерильного 10 % раствора NaOH. Для культивирования применяли различные среды: МПБ, L-бульон, модифицированная среда MRS [Нетрусов и др., 2005]. При культивировании в ферментере добавлялся пеногаситель структол (0,02 % от рабо чего объема). Объем посевного материала культуры, находящейся в конце экспо ненциальной фазы роста, составлял 5 % от объема среды.
Ферментативную реакцию деполимеризации ГК проводили следующим образом. Гиалуронат натрия в количестве, учитывающем необходимое содержание ГК, растворяли при температуре 80 °C в 0,05 М ацетатном буфере рН 5,5 с содер жанием 10 мМ CaCl2*6H2O и 14,5 мM NaCl в конечном растворе. Охлаждали до °C и добавляли фермент в виде раствора в том же ацетатном буфере до содержания белка 0,08 мг/мл в конечном растворе. За ходом реакции следили 1 – 24 часа с по мощью вискозиметрической, спектроскопической и хроматографической техник.
ГК определяли по реакции глюкуроновой кислоты с карбазолом [Bitter et al., 1962] и по реакции N-ацетилглюкозамина с реактивом Моргана – Элсона [Reissig et al., 1955].
Молекулярную массу ГК определяли вискозиметрическим методом по урав нению Марка-Хаувинка:
М = ([]/K)1/, (1) где [] – характеристическая вязкость ГК, мл/г;
М – средневязкостная молекуляр ная масса ГК, Да;
К и – константы Марка-Хаувинка (для раствора ГК в 0,1 М рас творе NaCl при 25 С К = 0,016, = 0,841 [Armstrong et al., 1995]).
Микробиологические методы исследований. Окраска капсул осуществля лась по методу Омелянского [Нетрусов и др., 2005]. Определение размеров клеток и капсул, характера гемолиза, способности расти в присутствии NaCl, способности сбраживания углеводов и другие микробиологические, физиологические и биохи мические тесты исполнялись по стандартным методикам [Нетрусов и др., 2005].
Глава 2. Биосинтез ГК культурой S. zooepidemicus Кинетика роста и синтеза ГК штаммом S. zooepidemicus В- Наибольшее количе 2,5 ство работ, связанных с мПа*с/мин;
ГК, мг/мл биосинтезом ГК бакте Глюкоза, МК, мг/мл 2 Биомасса;
ОГА, риями р. Streptococcus, указывает на постоянный 1,5 характер образования ГК 1 4 3 в ходе периодического культивирования, которое 0,5 коррелирует с ростом биомассы. На рис. 1 пред 0 ставлены кривые роста и 0 5 10 15 20 25 синтеза ГК и иных мета Время, ч.
болитов штаммом S.
Рис. 1. Глубинное периодическое культивирование штамма S. zooepidemicus В-8014 на zooepidemicus В-8014 на сложной питательной среде № 5. 1 – среде № 5 (глюкоза 10 г/л, кривая роста культуры (здесь и далее биомасса выражена че- ДЭ 10 г/л, пептон 5 г/л, рез единицы оптической плотности бактериальной суспензии триптон 5 г/л, NaCl 2 г/л, при длине волны 540 нм);
2 – кривая биосинтеза ГК;
3 – об- K2HPO4 1 г/л, MgSO4 0, щая гиалуронидазная активность (ОГА) бактериальной сус- г/л) при глубинном пе пензии;
4 – кривая потребления глюкозы;
5 – кривая накоп ления молочной кислоты (МК). ОГА [мПа*с/мин] выражена риодическом культивиро как скорость падения вязкости раствора 5,0 мг/мл высокомо- вании в биореакторе.
Характер кривой рос лекулярной (1100 кДа) ГК в ходе ее деполимеризации сус та культуры – типичная пензией клеток в стандартных условиях.
для роста микроорганиз мов S-образная кривая. В ходе всего культи вирования из продуктов катаболизма глюко зы образуется преимущественно молочная кислота, что вызывает падение рН с 7,4 до 4,3 – 4,4. ГК в концентрациях, превышаю щих вносимые с инокулятом, начинает об наруживаться в КЖ на стадии экспоненци ального роста культуры. По ходу всей лога рифмической фазы концентрация ГК растет, достигая значения 0,65 мг/мл, однако уже в ходе фазы замедленного роста концентрация ГК в КЖ перестает расти и даже снижается до 0,5 мг/мл. Экономический коэффициент Рис. 2. Микрофотография препарата ферментации составил 0,2 г/г;
экономиче штамма S. zooepidemicus B-8014 (нега- ский коэффициент по продукту (ГК) на тивное окрашивание тушью) на 24 час час культивирования составил 0,077 г/г.
культивирования в аэробных условиях.
Микроскопия препаратов бактерий на Клетки микроорганизмов указаны различных стадиях глубинного аэробного стрелками. Увеличение 10х100.
культивирования с окрашиванием капсул по Омелянскому показала, что штамм S.
zooepidemicus В-8014 характеризуется наличием слабовыраженных капсул, истон чающихся по ходу культивирования и полностью исчезающих на стационарной фа зе роста культуры (рис. 2).
Снижение концентрации ГК в КЖ и истончение капсул клеток S.
zooepidemicus В-8014 может быть связано с синтезом микроорганизмами фермента гиалуронатлиазы (бактериальной гиалуронидазы). Проведенные исследования ферментативной активности культуры микроорганизмов на разных фазах роста по казали, что штамм S. zooepidemicus В-8014 обладает заметной гиалуронидазной ак тивностью, проявляемой в самом конце экспоненциальной фазы роста культуры, что совпадает по времени с уменьшением концентрации ГК в КЖ (рис. 1). При этом на стационарной фазе ферментативная активность бактериальной суспензии довольно быстро снижается, что позволяет говорить о том, что индукция фермента начинается в фазе замедления роста и прекращается с выходом культуры на ста ционар, после чего происходит инактивация фермента.
Получение мукоидных штаммов S. zooepidemicus При высеве на МПА штамма S. zooepidemicus В-8014 на 24 час инкубирования при 37 °С были получены однотипные небольшие круглые колонии (диаметром 1 – 2 мм) с фестончатым краем и с нетипичной для продуцентов ГК “немукоидной” морфологией: шероховатой матовой поверхностью, невязкой консистенцией. Это, также как и отсутствие выраженных капсул при микроскопировании с негативным окрашиванием (рис. 2), свидетельствовало о низком уровне образования ГК клет ками S. zooepidemicus В-8014. Для того чтобы получить мукоидные мутанты S.
zooepidemicus, характеризующиеся повышенной секрецией ГК, исходный штамм В-8014 было ре шено подвергнуть мутагенному воздействию же сткого УФ ( = 254 нм) с последующей селекцией штаммов, колонии которых отличались бы типич ной мукоидной морфологией: крупными размера ми, глянцевой поверхностью, вязкой, слизистой структурой.
Всего в 20 сериях экспериментов по УФ об лучению суспензий клеток S. zooepidemicus В 8014 после высева на МПА было исследовано бо лее 30 тысяч колоний, что позволило отобрать Рис. 3. Микрофотография препа рата штамма S. zooepidemicus КБ- мутантных штаммов мукоидного типа. Наиболее 04 (негативное окрашивание ту- стабильным в отношении сохранения мукоидной шью) на 24 час культивирования морфологии колоний оказался штамм S. zooepi в аэробных условиях. Хорошо demicus, обозначенный КБ-04. Для выявления видны массивные капсулы, окру- особенностей полученного мукоидного штамма S.
жающие цепочки клеток боль zooepidemicus КБ-04 были проведены серии экс шим светлым ореолом. Увеличе периментов по сравнению морфологических, фи ние 15х100.
зиологических и биохимических характеристик штаммов S. zooepidemicus В-8014 и КБ-04. Результаты этих исследований проде монстрированы на рис. 3, 4 и сведены в табл. 1.
Табл. 1. Сравнение некоторых морфологических, физиологических и биохимических характери стик штаммов S. zooepidemicus В-8014 и КБ-04.
Характеристики Штаммы S. zooepidemicus В-8014 S. zooepidemicus КБ- Описание колоний, формируемых штаммами на МПА за 24 часа инкубирования Цвет бежевый бежевый Диаметр 1 – 1,5 мм 4 – 4,5 мм Поверхность матовая, слабошероховатая глянцевая, гладкая Края фестончатые ровные Профиль выпуклый выпуклый Консистенция невязкая вязкая Описание препаратов с окрашиванием капсул на 24 час культивирования % капсулированных клеток 1–2 70 ± Толщина капсулы за пределами измерительной 2 – 4 мкм способности микрометра Физиологические особенности штаммов при культивировании в жидкой питатель ной среде Достигаемая оптическая 2,1 2, плотность культуры на дли не волны = 540 нм при культивировании на среде № Конечный рН ферментаци- 4,36 ± 0,05 4,40 ± 0, онной среды Устойчивость к рН 9,5 – – Устойчивость к прогрева- – – нию при 60 °С в течение мин Гемолиз – – Биохимические особенности штаммов Сбраживание углеводов:
Мальтоза + + Лактоза – – Сахароза + + Сорбитол – – Глицерин – – Манитол – – Синтез ГК + + Качественные реакции на ГК, проводимые с выделенным полисахаридом:
Реакция преципитации с + + раствором БСА в ацетатном буфере Реакция на глюкуроновую + + кислоту Реакция на N- + + ацетилглюкозамин “–” – признак отсутствует;
“+” – признак выражен А Б В Г Рис. 4. Морфология колоний штаммов S. zooepidemicus В-8014 (А и В) и S.
zooepidemicus КБ-04 (Б и Г) при посеве на МПА штрихом (А и Б) и методом Коха (В и Г).
Анализ гиалуронидазной активности суспензии клеток штамма S. zooepi demicus КБ-04 на разных фазах культивирования однозначно показал ее отсутствие (рис. 5). При сравнении рис. 1 и рис. 5 видно, что штамм S. zooepidemicus КБ-04 по характеру роста сущест 2, венно не отличается от Биомасса;
ГК, мг/мл;
ОГА, исходного штамма В 8014, но при этом, по мПа*с/мин видимому за счет отсут 1, ствия гиалуронидазной активности, снижения скорости синтеза или па дения концентрации ГК 0, на пред- и стационарной фазах культивирования не 0 10 20 происходит. Концентра Время, ч. ция ГК при культивиро Рис. 5. Глубинное периодическое культивирование штамма S. вании на среде № 5 дости zooepidemicus КБ-04 на среде № 5. 1 – кривая роста культуры;
гает 1,6 мг/мл, что почти в 2 – кривая биосинтеза ГК;
3 – ОГА бактериальной суспензии. 3 раза выше, чем у исход ного штамма. Экономиче ский коэффициент ферментации составил 0,2 г/г;
экономический коэффициент по продукту (ГК) составил 0,2 г/г.
Таким образом, методом УФ-индуцированного мутагенеза удалось получить стабильный штамм-продуцент ГК, отличающийся от исходного штамма S. zooepi demicus В-8014 отсутствием гиалуронидазной активности и характеризующийся наличием выраженных капсул из ГК, не исчезающих по ходу культивирования, мукоидной морфологией колоний на МПА и большим выходом ГК при культиви ровании в периодических условиях.
Оптимизация состава питательной среды и режимов культивирования S.
zooepidemicus КБ- На первом этапе исследования влияния состава питательной среды на синтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04 по методу Плакетта-Бурмана были выявлены значимые компоненты среды MRS, оказывающие наиболее существенное влия ние на синтез ГК. Причем установлено, что ДЭ, пептон, триптон, К2HPO4, MnSO положительно влияют на синтез ГК, а ацетат натрия и MgSO4 – отрицательно.
Дальнейшую оптимизацию питательной среды и режима культивирования было решено проводить по методу раздельной оптимизации каждого фактора при посто янном фоне. Культивирование осуществлялось в колбах на 100 мл (заполнение средой 35 мл) с ватными пробками. По ходу культивирования и через 24 часа ин кубирования при постоянном перемешивании на качалке и термостатировании при 37 °С анализировалось содержание ГК, биомассы микроорганизмов, а также оста точное содержание сахаров и рН, если это было необходимо.
Исследование влияния концентрации глюкозы на рост культуры и био синтез ГК проводилось путем варьирования начального содержания глюкозы в пи тательной среде от 0 до 4,5 75 г/л. Результаты экспе содержание глюкозы, г/л риментов представлены Биомасса;
ГК, мг/мл 1 3, на рис. 6. Оптимальная Остаточное для роста микроорга 2, низмов начальная кон центрация глюкозы в пи 1, тательной среде состав ляет 15 – 20 г/л. При та 0,5 ком начальном содержа нии глюкозы еще сохра 0 0 20 40 60 няется линейная зависи Глюкоза, г/л мость между концентра Рис. 6. Зависимость выхода биомассы, концентрации ГК и ос- цией образовавшейся таточного содержания глюкозы в КЖ штамма S. zooepidemicus биомассы и потреблен КБ-04 от начального содержания глюкозы в питательной сре- ного субстрата: эконо де. 1 – оптическая плотность бактериальной суспензии;
2 – мический коэффициент концентрация ГК;
3 – остаточная концентрация глюкозы.
равен 0,2 г/г (рис. 7).
С ростом начальной концентрации глюкозы в среде экономический коэффици ент по продукту постепенно снижается (рис. 7), и, хотя выход ГК и увеличивается вплоть до концентрации глюкозы 25 г/л (рис. 6), но на каждый следующий потреб ленный грамм глюкозы синтезируется все меньше полисахарида. Максимумы зави симостей выхода био массы и концентрации 0, ГК от концентрации 0, глюкозы в питательной коэффициент, г/г Экономический 0,25 среде практически сов падают. Дальнейшее 0, увеличение начальной 0,15 концентрации глюкозы 0,1 в питательной среде ве дет к ингибированию 0, роста культуры микро организмов и уменьше 0 20 40 60 нию выхода ГК. Это Глюкоза, г/л проявляется в сниже Рис. 7. Зависимость экономического коэффициента (1) и эконо- нии удельной скорости мического коэффициента по продукту (2) от начальной концен- роста культуры, выхода трации глюкозы в питательной среде.
биомассы и уменьше нии экономического коэффициента. Количество недоутилизированной глюкозы при этом резко возрастает, а концентрация ГК в ферментационной среде снижается (рис. 6).
Влияние катионов двухвалентных металлов на синтез ГК штаммом S.
zooepidemicus КБ-04. Предполагается, что оперон синтеза ГК входит в группу ге нов, определяющих па Биомасса;
ГК, мг/мл 2, тогенность бактерий р.
Для Streptococcus.
стрептококков группы 1,5 ГК А вероятным эффекто Биомасса ром экспрессии данных генов являются ионы 0, Mg2+ [Gryllos et al., 2003]. Возможно, что катионы Mg2+ являются 9, 9, 4, = = = = = = = = + + + + + a g + + + эффекторами сенсорно a a g a a g C M C M C C C M регуляторной системы, 4, = = подавляющей экспрес + + g g M M сию генов синтеза ГК и Рис. 8. Влияние ионов двухвалентных металлов (Mg2+ и Са2+) на у стрептококков груп рост культуры и синтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04. По пы С, к которым отно оси абсцисс отложена концентрация вводимых в питательную сится S. zooepidemicus.
среду ионов Mg2+ и Са2+ в ммоль/л.
Для выявления количе ственной зависимости влияния ионов двухвалентных металлов на синтез ГК было проведено исследование, в котором рост штамма S. zooepidemicus КБ-04 и биосин тез ГК оценивались при различных концентрациях ионов Mg2+ и Ca2+ в питатель ной среде № 5. Результаты представлены на рис. 8.
Высокие концентрации дополнительно вводимых в питательную среду ионов 2+ Mg оказывали ингибирующее воздействие на синтез ГК, частично снимающееся присутствием в среде ионов Са2+. Сами катионы Са2+ не оказывали достоверно раз личимого влияния на синтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04. На выход био массы изменение концентрации в питательной среде солей MgSO4*7Н2О и СаСl2*6Н2О практически не влияло. Исключение составляет случай совместного присутствия солей в максимальных исследованных концентрациях (10 г/л MgSO4*7Н2О и 10 г/л СаСl2*6Н2О).
Влияние аэрации ферментационной среды на синтез ГК. ГК как фактор защиты от токсического действия кислорода. Бактерии р. Streptococcus осуще ствляют гомоферментативное молочнокислое брожение. Особенностью метабо лизма S. zooepidemicus является то, что при биосинтезе ГК образуются дополни тельные восстанови тельные эквиваленты в Биомасса;
ГК, ОСТ глюкоза, мг/мл форме НАДН2, что на рушает окислительно востановительный ба ланс метаболизма. Это могло бы существенно затруднить дальнейший синтез ГК. В аэробных н.
мл мл мл мл мл мл условиях избыточные б ро аэ восстановительные эк Ан виваленты НАДН Объем среды окисляются молекуляр Биомасса ГК ОСТ Глюкоза ным кислородом с по Рис. 9. Влияние аэрации ферментационной среды на рост куль- мощью НАДН туры S. zooepidemicus КБ-04, биосинтез ГК и остаточную кон- оксидазы, поэтому центрацию глюкозы (ОСТ глюкоза) при культивировании в можно предположить, аэробных и анаэробных условиях.
что оптимальная аэра ция ферментационной среды будет существенно влиять на биосинтез ГК. Исследо вание влияния аэрации на синтез ГК культурой S. zooepidemicus проводились в колбах на 100 мл с различным заполнением питательной средой (от 5 до 70 мл), что моделировало различную степень аэрации (для проведения процесса в анаэробных условиях использовались колбы с гидрозатвором). Результаты представлены на рис. 9.
При достаточно малом объеме питательной среды в колбе (5 мл) результаты эксперимента искажались преждевременным пересыханием, поэтому полученые данные исключены из дальнейшего рассмотрения. Результаты исследования свиде тельствуют, что степень аэрации существенно влияет на биосинтез ГК: интенсив ная аэрация увеличивает выход ГК в 4 – 5 раз по сравнению с выходом ГК, дости гаемым в анаэробных условиях (рис. 9).
Необходимо отметить, что для анаэробных по своему метаболизму микроор ганизмов кислород играет немаловажную роль, что наглядно демонстрирует уве личение выхода биомассы культуры с ростом степени аэрации. Степень утилиза ции глюкозы также увеличивается с усилением аэрации среды. Увеличение выхода ГК и биомассы микроорганизмов, а также степени утилизации глюкозы при куль тивировании в аэробных условиях, по-видимому, связано со снижением внутрикле точного пула восстановительных эквивалентов НАДН2 путем их окисления моле кулярным кислородом при участии НАДН-оксидазы. Это существенно облегчает образование предшественников ГК, а также повышает эффективность катаболизма глюкозы.
В то же время, для роста S. zooepidemicus существует определенный оптимум аэрации – чрезмерная аэрация начинает подавлять рост культуры (рис. 9). Поэтому одной из стратегий защиты клеток анаэробных по метаболизму микроорганизмов от избыточного количества молекулярного кислорода может быть образование капсул и слизей из ГК [Cleary et al., 1979]. Дело в том, что секреция культурой ГК существенно повышает вязкость ферментационной среды, что затрудняет массопе ренос кислорода к клеткам, уменьшая таким образом газообмен. Кроме того, мас сивные капсулы из ГК, окружающие клетки S. zooepidemicus КБ-04, (рис. 3) за трудняют диффузию растворенного кислорода непосредственно к поверхности клетки и, возможно, нейтрализуют активные радикалы биотического, химического, фотохимического и механохимического происхождения.
Действительно, повышение аэрации ферментационной среды в наших экспе риментах сопровождается непропорциональным приросту биомассы увеличением концентрации ГК – удельный выход ГК возрастает (рис. 10), что свидетельствует о повышении уровня биосинтеза и секреции 2, Удельный выход ГК, г/г ГК каждой отдельной клеткой S. zooepi биомассы demicus КБ-04, а не 1, всей популяцией за счет увеличения ее числен ности. Возможные при 0, чины данного феномена обсуждались выше, а следствием является н.
мл мл мл мл мл б защита от токсического ро аэ Ан действия активных Объем среды и условия культивирования форм кислорода. Таким Рис. 10. Влияние аэрации ферментационной среды на удельный образом, культуры бак выход ГК при культивировании штамма S. zooepidemicus КБ-04 терий р. Streptococcus, образующие капсулы из в аэробных и анаэробных условиях.
ГК, являются своеоб разными саморегулирующимися системами: при малой аэрации синтез ГК затруд нен, и незначительные количества полисахарида практически не препятствуют диффузии кислорода к клеткам;
как только аэрация усиливается настолько, что может негативно сказываться на росте микроорганизмов, то удельный выход ГК возрастает, и клетки приобретают массивные капсулы, частично защищающие их от избытка кислорода.
Данный вывод подтверждают исследования, проведенные с родительским акапсулированным штаммом S. zooepidemicus В-8014. В анаэробных условиях вы ход биомассы акапсулированного штамма практически не отличался от выхода для штамма КБ-04, зато при интенсивной аэрации рост штамма В-8014 существенно подавлен, тогда как выход биомассы для штамма КБ-04 лишь немного ниже, чем при оптимальной для роста данных микроорганизмов аэрации.
Таким образом, в результате проведенной работы получен штамм S.
zooepidemicus КБ-04, характеризующийся крупными размерами и мукоидной мор фологией колоний, которая обусловлена образованием клетками микроорганизмов массивных капсул, содержащих ГК. В работе также апробированы физико химические условия, состав сред и режимы глубинного культивирования данного штамма. Оптимизация состава питательной среды, физико-химических условий и режимов культивирования (исключение из питательной среды солей магния, ин тенсификация аэрации, проведение периодической ферментации с подпитками по глюкозе) позволили повысить выход ГК с 0,6 до 3,4 г/л, то есть в 5,6 раза.
Глава 3. Деполимеризация гиалуроновой кислоты стрептококковой гиалуронатлиазой Кинетика деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой Для ферментативного расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой, исходя из предполагаемого механизма каталитического действия [Li et al., 2000], предложена кинетическая схема, представленная на рис. 11.
Рис. 11. Кинетическая схема рас щепления ГК стрептококковой гиа луронатлиазой. E – фермент (гиа луронатлиаза);
S – субстрат (ГК);
Р и Р' – продукты расщепления ГК;
D – конечный продукт расщепления ГК стрептококковой гиалуронат лиазой (дисахарид). Стадии реак ции на кинетической схеме соот ветствуют следующим стадиям ме ханизма реакции расщепления ГК:
1 – образование фермент субстратного комплекса;
2 – диссо циация фермент-субстратного ком плекса;
3, 4 – катализ расщепления цепи ГК;
5 – высвобождение про дукта реакции;
6 – протонный об мен;
7, 8 – транслокация субстрата.
Математически можно доказать, что данная кинетическая схема описывается уравнением Михаэлиса-Ментен (2):
(2) Выражение начальной скорости ферментативной реакции формально анало гично классическому уравнению Михаэлиса-Ментен, где КМ = (k2/k1 + (k3*k5)/(k1*(k4+k5+k6))), а Vmax = ((k3*k5)/(k4+k5+k6))*E0.
Нами экспериментально показано, что вязкость водных растворов ГК данной молекулярной массы 500 существенно зависит 450 только от концентрации раствора и температуры, Вязкость, мПа*с 350 1 в то время как изменение ионной силы и замена 250 2 ионного окружения с NaCl на CaCl2 в ацетат ном буфере на реологи ческие свойства раство ров практически не по влияли. Поскольку вяз 0 50 100 150 кость раствора ГК дан Время, мин ной концентрации непо Рис. 12. Падение вязкости растворов высокомолекулярной ГК разных концентраций и растворов других биополимеров в ходе средственно зависит от расщепления стрептококковой гиалуронатлиазой. 1 – раствор молекулярной массы по ГК 7,6 мг/мл;
2 – раствор ГК 5,0 мг/мл;
3 – раствор ГК 2,7 лимера, то возможно мг/мл;
4 – раствор альгината натрия 10 мг/мл;
5 – раствор хи- проведение кинетиче тозана 10 мг/мл;
6 – коллагеновая суспензия 10 мг/мл. ского эксперимента по энзиматическому расще плению ГК с использованием вискозиметрической техники для контроля молеку лярной массы получаемых препаратов. На рис. 12 приведены типичные кривые па дения вязкости в ходе энзиматического расщепления ГК. Реакция деполимериза ции проводилась в ячейке ротационного вискозиметра РПЭ-1М, термостатирован ной при 38 °С.
В контрольном опыте в аналогичных условиях проведены реакции с использо ванием в качестве субстратов других биополимеров (альгиновой кислоты, хитоза на, коллоидных растворов крахмала и различных белков). Все они демонстрирова ли стабильность – сохранение вязкости на протяжении 3 – 6 часов эксперимента (рис. 12). Это свидетельствует об отсутствии у препарата существенной протеоли тической активности, выявляемой вискозиметрическими методами анализа, и спе цифичности бактериальной гиалуронатлиазы к ГК.
Для определения состава реакционной смеси по ходу процесса деполимериза ции ГК была использована ВЭЖХ. На рис. 13 представлена типичная хромато грамма продуктов деполимеризации высокомолекулярной ГК (раствор 5 мг/мл) стрептококковой гиалуронатлиазой спустя 1 час ферментативного воздействия.
Наибольшую массовую долю (28,4 % или 1,42 мг/мл) среди продуктов реакции со ставляет 4,5-ненасыщенный дисахарид – конечный продукт деполимеризации ГК гиалуронатлиазой S. pneumoniae. Также представлен весь спектр олигосахаридов, образующихся в ходе ферментативной реакции, разделяющихся при данных усло виях хроматографирования: тетра-, гекса-, и т. д.
Рис. 13. ВЭЖХ продуктов расщепле ния ГК стрептококковой гиалуронат лиазой. Детектирование осуществля лось УФ спектрофотометрией при длине волны 232 нм. Начальная кон центрация образца высокомолекуляр ной ГК 5 мг/мл. Время реакции фер ментативной деполимеризации ГК час. 15 – пик 4,5-ненасыщенного диса харида (4-дезокси-L-треогексозо-4 енопиранозилуроновая кислота--1,3 N-ацетил-D-глюкозамин);
1,2,3 – вы сокомолекулярные компоненты реак ционной смеси (белковая составляю щая ферментного препарата и круп ные неразделяемые фрагменты ГК);
– 14 промежуточные продукты энзи матической деградации ГК.
Инактивация стрептококковой гиалуронатлиазы в ходе деполимеризации ГК Обращено-фазовая ВЭЖХ продуктов реакции расщепления ГК стрептококко вой гиалуронатлиазой показала наличие спектра олигосахаридов (рис. 13). Выход конечного продукта реакции составляет 28 % спустя час проведения ферментатив ной реакции в случае деполимеризации ГК в растворе 5 мг/мл и 55 % спустя 6 ча сов – времени полного самопроизвольного прекращения реакции. Остаточная вяз кость растворов (рис. 12) и пики высокомолекулярной ГК и различных олигосаха ридов на хроматограмме после длительного проведения ферментативной реакции свидетельствуют о неполном протекании реакции расщепления ГК, что может быть вызвано инактивацией фермента либо обратимым или необратимым ингибирова нием ферментативной реакции продуктами внутримолекулярного гидролиза ГК.
Было обнаружено, что реакционная смесь, прошедшая гидролиз, после внесе ния в раствор ГК не способна катализировать ее расщепление. Чтобы выяснить, не является ли этот эффект обратимым ингибированием продуктами реакции, смесь подвергалась суточному проточному диализу против стабилизирующего ацетатно го буфера при 4 С. Гиалуронатлиаза, прошедшая один цикл гидролиза и после дующий диализ, демонстрировала крайне низкую начальную ферментативную ак тивность. В то же время, внесение достаточно большого количества (до 50 % от на чального содержания ГК) продуктов реакции в реакционную смесь в начальный момент времени существенным образом не отражалось на протекании фермента тивной реакции, из чего можно заключить, что падение активности вызвано ис ключительно инактивацией фермента, а не обратимым или необратимым ингиби рованием продуктами реакции.
Кинетика процесса инактивации гиалуронатлиазы в ацетатном буфере в при сутствии ионов кальция при температуре 38 °С описывается экспоненциальной функцией, что определено по характерному снижению начальной активности гиа луронатлиазы в ходе предынкубации фермента без субстрата. Такая потеря актив ности может происходить вследствие, например, тепловой денатурации фермента или протеолиза. Из литературы [Li et al., 2001] известно, что бактериальные гиалу ронатлиазы являются весьма лабильными ферментами, склонными к автодеграда ции. Возможно, что потеря активности в ходе деполимеризации ГК или инкубации в ацетатном буфере у гиалуронатлиазы происходит за счет автопротеолиза – отре зания небольшой аминокислотной последовательности, переводящего фермент в неактивное состояние. Такой механизм инактивации отвечает кинетической схеме первого порядка (Еa Еi) и также может описываться экспоненциальной зависи мостью активности фермента от времени [Варфоломеев и др. 1982].
Для проверки данного предположения электрофоретическим методом были исследованы пробы гиалуронатлиазы, взятые до проведения реакции деполимери зации ГК и спустя 6 часов реакции. Электро форез в ПААГ показал (рис. 14), что фер ментный препарат гиалуронатлиазы S. pneu moniae представлен в основном двумя белка ми с молекулярными массами около 110 и кДа. Ферментативная активность может быть связана с одним из них или с обеими форма ми, на что чаще всего ссылаются в литературе [Li et al., 2001]. В ходе проведения фермента тивной реакции белок с молекулярной массой Рис. 14. Электрофорез в ПААГ препа- 95 кДа постепенно переходит в форму с мас ратов гиалуронатлиазы S. pneumoniae сой около 85 кДа. По-видимому, этим и объ до проведения ферментативной реак- ясняется инактивация стрептококковой гиа ции деполимеризации ГК (справа) и луронатлиазы: наиболее активная форма после 6 часов реакции (слева). фермента с массой 95 кДа подвергается авто деградации, образуя неактивный белок с мас сой 85 кДа.
Секретируя гиалуронатлиазу, S. pneumoniae размягчает и растворяет матрикс соединительной ткани, облегчая колонизацию межклеточного пространства и дальнейшую инвазию в ткани хозяина. Однако патогенез заболеваний, вызываемых S. pneumoniae, подчиняется и другим закономерностям, исследование которых вы ходит за рамки данной работы. Можно лишь отметить, что для защиты от клеточ ного и гуморального иммунного ответа хозяина S. pneumoniae формирует капсулу, содержащую ГК. Вполне возможно, что на определенном этапе развития инфекци онного процесса (когда деполимеризация ГК матрикса окружающих тканей уже создала условия для инвазии возбудителя) функция гиалуронатлиазы оказывается исчерпанной, а проявляемая активность даже может снижать защитные свойства бактериальной капсулы из-за деградации содержащейся в ней ГК. Биологическое значение инактивации стрептококковой гиалуронатлиазы по механизму автопроте олиза заключается в том, что молекула фермента в таких случаях самостоятельно выводит себя из дальнейшего участия в жизнедеятельности S. pneumoniae.
Таким образом, у патогенных бактерий р. Streptococcus существуют разнооб разные механизмы инвазии и преодоления иммунного ответа хозяина, включаю щие два на первый взгляд противоположных явления – синтез ГК и ее деградацию гиалуронатлиазами. Тонкий баланс между этими двумя механизмами осуществля ется при помощи регуляции экспрессии и ферментативной активности гиалуронат синтазы с одной стороны и регуляции экспрессии, ферментативной активности и автопротеолиза гиалуронатлиазы с другой.
Получение фракций низкомолекулярной ГК с заданной молекулярной массой путем энзиматической деполимеризации высокомолекулярной ГК Вискозиметрический метод наблюдения за процессом ферментативной депо лимеризации ГК дает возможность определять среднюю молекулярную массу про дуктов расщепления ГК, что является, по сути, методом контроля хода деполиме ризации в реальном времени. Нами построена математическая модель падения вяз кости раствора ГК в ходе расщепления биополимера стрептококковой гиалуронат лиазой, с помощью которой возможно рассчитать изменение относительной моле кулярной массы ГК:
Mt/M0 = ((r0/rt)0,875*(drt/dt)/(dr0/dt))0,543, (3) где Mt и M0 – молекулярные массы ГК в момент времени t и до начала реакции со ответственно, Да;
rt и r0 – относительные вязкости раствора в момент времени t и до начала реакции соответственно;
drt/dt и dr0/dt – скорость падения вязкости раствора ГК в момент времени t и на чальная скорость падения вязкости раствора ГК соответственно, мин-1 (определя ются графически).
В табл. 2 приводится сравнение изменения средней молекулярной массы, оп ределенной экспериментально по характеристической вязкости и рассчитанной по уравнению (3), для растворов с концентрацией ГК 5,0 и 7,6 мг/мл в ходе ее деполи меризации стрептококковой гиалуронатлиазой.
Табл. 2. Изменение средней молекулярной массы ГК в ходе ее деполимеризации стрептококко вой гиалуронатлиазой в растворах различной концентрации по данным математической модели и непосредственного измерения.
ГК, мг/мл Экспериментально Средняя молекулярная масса ГК, кДа определенная (1) или рассчитанная (2) молекулярная Время, мин масса, кДа 0 5 10 15 5,0 (1) 1100 550 320 - (2) 1100 590 393 290 7,6 (1) 1100 650 - - (2) 1100 740 520 360 Экспериментально определенная молекулярная масса высокомолекулярной ГК в процессе деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой уменьшилась с 1100 ± 100 кДа до 650 ± 80 кДа за 5 мин при начальной концентрации субстрата 7, мг/мл, что хорошо согласуется с рассчитанным по уравнению (3) – 740 кДа. За мин молекулярная масса падает до 100 ± 50 кДа (расчетное значение начинает от клоняться от действительного и составляет 270 кДа, что может объясняться принятыми допущениями и накоплением дисахарида, искажающим вискозиметри ческое определение мо лекулярной массы (рис.
1200 Средняя молекулярная 15)). Для деполимериза дисахарида, мг/мл ции ГК стрептококковой Концентрация масса, кДа гиалуронатлиазой в рас творах меньших концен 600 траций, например 5, мг/мл, совпадение экс 400 2 периментально установ ленного значения моле кулярной массы и рас 0 считанного по характеру 0 10 20 30 40 50 падения вязкости по Время, мин Рис. 15. Падение молекулярной массы ГК в процессе деполи- уравнению (3) еще луч меризации стрептококковой гиалуронатлиазой при начальной ше: за 5 мин молекуляр концентрации ГК 5 мг/мл. 1 – молекулярная масса, рассчитан- ная масса падает до ная по уравнению (3);
2 – экспериментально определенная мо- ± 50 кДа, а расчетное лекулярная масса;
3 – дисахарид, определяемый методом значение составляет ВЭЖХ.
кДа (рис. 15).
Таким образом, контролируя вязкость растворов, методом деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой возможно получение препаратов ГК с заданной молекулярной массой, причем процесс деполимеризации довольно эффективен:
уже за 5 мин для раствора ГК 5,0 мг/мл молекулярная масса уменьшается в 2 раза, а за 20 мин – в 14 раз (рис. 15).
Определение ГК по продуктам ее энзиматической деградации стрептококко вой гиалуронатлиазой.
Помимо получения низкомолекулярных продуктов гидролиза ГК для меди цинских препаратов иммуномодулирующего действия метод энзиматической де градации применим для определения содержания ГК в сложных биологических об разцах (тканях и жидкостях) по продуктам расщепления полимера. Полученные данные по кинетике инактивации стрептококковой гиалуронатлиазы позволили оп тимизировать процесс деградации ГК с целью повышения выхода конечного про дукта деполимеризации до 95 – 97 %, для чего была разработана схема проведения реакции, включающая трехкратное внесение фермента через равные промежутки времени (1 час).
Последовательность действий при определении концентрации ГК в биологи ческих образцах методом деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой с дальнейшим определением продуктов расщепления ГК методом ВЭЖХ представ лена на рис. 16. В табл. 3 приведено сравнение разработанного нами метода анали за ГК с известными химическими методами.
Практическое применение данный метод может найти, например, в определе нии содержания ГК в экстрактах куриных гребней, стекловидных тел глаза, ис пользуемых для получения ГК, а также в некоторых тканях и биологических жид костях человека и животных при диагностике заболеваний, сопровождающихся изменением содержания ГК. Нами показана хорошая точность и воспроизводи мость разработанной методики на модельных системах, включающих ГК и ме шающие белки и полисахариды, а также на реальных биообъектах (гребнях кур).
Гомогенизация и Грубое фильтрова- Диализ против растворение (экс- ние или центрифу- ацетатного буфера тракция в случае гирование при 500 – рН=5, твердого образца) 1000 g 80 °С 100 мМ NaCl ВЭЖХ анализ про- Ультрафильтрация Обработка стреп дуктов энзиматиче- (полисульфонные тококковой гиалу ского расщепления мембраны менее 15 ронатлиазой: трех ГК в пермеате кДа) кратное внесение ферментного пре парата, 38 °С, рН 5,5, 3 часа Рис. 16. Схема определения содержания ГК в биологических образцах методом энзимати ческой деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой.
Табл. 3. Содержание ГК в некоторых биологических образцах и модельных смесях, определен ное различными методами. А – карбазольный метод анализа ГК;
Б – метод анализа по реакции N ацетилглюкозамина с реактивом Моргана-Элсона;
В – метод определения концентрации ГК по продуктам деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой.
Образец, содержащий ГК, Концентрация ГК Содержание ГК, определенное методом или модельная смесь биопо- (если известна) А Б В лимеров Высокомолекулярная ГК 95 % 95 % 95 % 94 % Низкомолекулярная ГК 99 % 99 % 99 % 96 % Белок-альгинат-хитозан-ГК 25 % 60 % 74 % 24,5 % КЖ S. zooepidemicus КБ-04* - 1,46 мг/мл 2,1 мг/мл 1,52 мг/мл Куриные гребни** - 1,6 % 6,6 % 1,45 % *ГК осаждалась спиртом. Результат пересчитывался на содержание ГК в КЖ.
**ГК при определении методами А и Б экстрагировалась горячим водно-солевым раствором, оса ждалась спиртом. Результат пересчитывался на массу образца естественной влажности.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 1. Полученный с помощью УФ-индуцированного мутагенеза штамм S.
zooepidemicus КБ-04, характеризуется крупными размерами и мукоидной морфоло гией колоний, формируемых на богатых питательных средах. Установлено, что му коидная морфология штамма S. zooepidemicus КБ-04 обусловлена повышенным уровнем биосинтеза ГК и образованием стабильных капсул, что связано с отсутст вием у штамма S. zooepidemicus КБ-04 какой-либо гиалуронатлиазной активности.
2. Оптимизирован состав питательной среды для культивирования S. zooepidemicus КБ-04 с целью микробиологического синтеза ГК. Определено, что наибольшее влияние на рост культуры и синтез ГК оказывает концентрация источника углеро да. Показано, что на выход ГК положительно влияют ДЭ, пептон, триптон, ионы Mn2+;
отрицательно – ацетат натрия и сульфат магния.
3. Обнаружено, что улучшение массообменных характеристик ферментационного процесса и повышение аэрации питательной среды увеличивает как конечную кон центрацию ГК, так и ее удельный выход. Повышение секреции ГК при интенсив ной аэрации носит регулируемый адаптивный характер, поскольку ГК может уча ствовать в защите клеток бактерий р. Streptococcus от токсичных форм кислорода.
4. Предложена кинетическая схема расщепления ГК стрептококковой гиалуронат лиазой и показано, что данная схема описывается уравнением Михаэлиса-Ментен.
Вискозиметрическим методом исследован процесс деполимеризации ГК стрепто кокковой гиалуронатлиазой.
5. Показано, что незавершенность реакции деполимеризации обусловлена необра тимой инактивацией стрептококковой гиалуронатлиазы, что обусловлено частич ным автопротеолизом фермента. Подобраны оптимальные условия функциониро вания стрептококковой гиалуронатлиазы.
6. Впервые разработан метод анализа ГК в сложных биопробах по продуктам энзи матической деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой с использо ванием ВЭЖХ. Предложен способ получения фракций ГК со средней и низкой мо лекулярной массой с помощью деполимеризации гликозаминогликана стрептокок ковой гиалуронатлиазой и показана применимость вискозиметрического метода контроля молекулярной массы ГК в ходе ее энзиматической деполимеризации.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Белодед, А.В. Деполимеризация гиалуроновой кислоты стрептококковой гиалу ронатлиазой / А.В. Белодед, Н.С. Марквичев, И.И. Самойленко, Р.Н. Цепилов // Биотехнология. – 2007. – №5. – С. 80-87.
2. Beloded, A.V. HPLC Quantification of Hyaluronic Acid by the Products of Its Enzymatic Degradation with Streptococcus Hyaluronate Lyase / A.V. Beloded, S.A.
Mulyashov, N.S. Markvichev, I.I. Samoylenko, F.S. Sirovski // New Research on Biotechnology in Biology and Medicine / Eds. Egorov, A.M., Zaikov, G. – New-York:
Nova Science Publishers, 2006. – Ch. 14. – Р. 133-143.
3. Белодед, А.В. Исследование ферментативной деградации гиалуроновой кислоты стрептококковой гиалуронидазой / А.В. Белодед, С.А. Муляшов, Н.С. Марквичев // Успехи в химии и хим. технол. – 2004. – Т. XVIII. – № 6. – С. 53-55.
4. Белодед, А.В. Культивирование Streptococcus zooepidemicus – продуцента гиалу роновой кислоты на средах, содержащих мясные экстракты / А.В. Белодед, И.Г.
Филиппов, Н.С. Марквичев, И.И. Самойленко // Успехи в химии и хим. технол. – 2005. – Т. XIX. – № 5. – С. 82-85.
5. Белодед, А.В. Анализ гиалуроновой кислоты по продуктам ее энзиматической деградации стрептококковой гиалуронидазой методом HPLC / А.В. Белодед, Н.С.
Марквичев, И.И. Самойленко // Тез. докл. III-го Московского международного кон гресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 14-18 марта 2005. – М.: “Экспо-Биохим-Технологии”, 2005. – Ч. 1. – С. 192-193.
6. Белодед, А.В. Культивирование мукоидного штамма Streptococcus equi subsp.
zooepidemicus – продуцента гиалуроновой кислоты / А.В. Белодед, Н.С. Марквичев, И.И. Самойленко // Тез. докл. IV-го Московского международного конгресса «Био технология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта 2007. – М.: “Экспо Биохим-Технологии”, 2007. – Ч. 2. – С. 44-45.
7. Grechishkina, O. HPLC Quantification of Hyaluronic Acid by the Products of Its Enzymatic Degradation / O. Grechishkina, S. Mulyashov, A. Beloded, F. Sirovski // Proceedings of the 15-th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis, May 2-6 2004. – Florence: PBA, 2004. – P. 114.
8. Самойленко, И.И. Изучение свойств гиалуроновой кислоты для применения в дерматокосметологии / И.И. Самойленко, А.В. Белодед, Р.Н. Цепилов, О.И. Самой ленко // Труды VI-ой научно-практической конференции “Социально-значимые за болевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика”, 28-29 сен тября 2006 г. – М., 2006. – С. 153-154.
9. Белодед, А.В. Синтез гиалуроновой кислоты мукоидным штаммом Streptococcus zooepidemicus / А.В. Белодед, И.И. Самойленко // Сб. мат. Всероссийской научно технической конференции “Наука-производство-технологии-экология”. – Киров:
Изд-во ВятГУ, 2008. – Т. 1. – С. 231-233.