Образование активных форм кислорода под влиянием ионов уранила и их токсическое действие
На правах рукописи
ГАРМАШ СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПОД ВЛИЯНИЕМ ИОНОВ УРАНИЛА И ИХ ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ Специальность 03.01.02. – Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пущино – 2013
Работа выполнена в Лаборатории изотопных исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук и в Учебном центре биофизики и биомедицины Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Пущинский государственный естественно-научный институт.
доктор биологических наук
Научный консультант:
Гудков Сергей Владимирович доктор физико-математических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Акатов Владимир Семенович зав. лабораторией тканевой инженерии ИТЭБ РАН, г. Пущино доктор биологических наук Пашовкин Тимофей Николаевич зав. лабораторией биологических эффектов неионизирующих излучений ИБК РАН, г. Пущино Федерального государственного бюджетного
Ведущая организация:
учреждения науки Института общей физики им.
А.М. Прохорова Российской академии наук
Защита диссертации состоится « » 201 г. в ч. _ мин. на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г.
Пущино, ул. Институтская,
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.
Автореферат разослан «» _ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук Ланина Н.Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В результате хозяйственной деятельности человека концентрация урана в природе достигает достаточно высоких концентраций и может варьировать в пределах от 0,01 мкг/л до 12,4 мг/л [Depleted Uranium:
Sources, Exposure and Health Effects, 2001]. В почве и воде уран преимущественно встречается в виде свободных ионов уранила (UO22+) или в виде их комплексов [Duquene et al., 2010]. Давно известно, что ионы уранила представляют непосредственную опасность для экосистем [Sheppard et al., 2005], на организменном уровне могут быть причиной ряда патологий [Hu et al., 1990], проявляя существенные мутагенные и канцерогенные свойства [Miller et al., 2002]. Подавляющее большинство известных работ сосредоточено на описании феноменологии повреждающего действия ионов уранила [Smith et al., 2009, Cheng et al., 2010, Trenfield et al., 2011, Orona & Tasat, 2012]. Причиной повреждающего действия ионов уранила на организм считают с одной стороны ярко выраженную радиоактивность изотопов урана [Бекман, 2009], с другой - их химическую токсичность, а именно способность обратимо взаимодействовать с боковыми группами белков и аминокислот (например, с сульфгидрильными), что может приводить к инактивации ряда ферментов [Pible et al., 2010], а так же способность к образованию комплексов, что негативно сказывается на обмене биологически значимых анионов и катионов [Baker, 2012]. Нужно отметить, что механизму химической токсичности ионов уранила традиционно отводится меньшее внимание, так как он наблюдается при остром воздействии и при достаточно высоких концентрациях [Cheng et al., 2010]. Образование активных форм кислорода и окислительных повреждений биополимеров за счет радиоактивности изотопов урана, а так же ингибирование ряда ферментов антиоксидантной защиты и репарации в большинстве случаев приводит к развитию окислительного стресса [George et al., 2011, Orona & Tasat, 2012]. В нашей лаборатории было высказано предположение о том, что существует дополнительный механизм инициации окислительного стресса ионами уранила, который связан преимущественно с физико-химической генерацией АФК под действием этих ионов [Смирнова и др., 2011]. В связи с вышеизложенным, исследование альтернативных процессов лежащих в основе развития окислительного стресса, индуцированного ионами уранила, представляет собой актуальную научную проблему.
Цель и основные задачи исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании образования активных форм кислорода под влиянием ионов уранила в водных растворах и их токсического действия в различных биологических системах.
В соответствии с целью были поставлены основные задачи:
1 Исследовать влияние ионов уранила в микромолярных концентрациях на генерацию АФК в водных растворах под действием тепла или видимого света, выявить факторы, влияющие на этот процесс и оценить вклад естественной радиоактивности урана.
2 Изучить влияние ионов уранила в микромолярных концентрациях на образование окислительных повреждений ДНК и белков in vitro и in vivo.
3 Исследовать влияние ионов уранила на основные физиологические параметры митохондрий, оценить возможный вклад митохондрий в развитие индуцированного ионами уранила окислительного стресса.
4 Оценить радиомодифицирующий потенциал микромолярных концентраций ионов уранила на организменном уровне.
Научная новизна.
Показано, что в присутствии ионов уранила в микромолярных концентрациях в водных растворах происходит существенное усиление образования АФК под действием тепла, видимого света или рентгеновского излучения. Выявлены ключевые факторы, влияющие на этот процесс. Установлено, что увеличение интенсивности генерации АФК в присутствии ионов уранила по большей части обусловлено их физико-химическими свойствами, а не природной радиоактивностью. С помощью метода индуцированной хемилюминесценции белка впервые показано образование долгоживущих радикальных продуктов белка под влиянием ионов уранила. Установлено, что при внутрибрюшинном введении ионов уранила в микромолярных концентрациях мышам наблюдается высокий уровень окислительных повреждений белков плазмы крови. Показано, что в присутствии ионов уранила в растворе с ДНК происходит интенсивное образование 8-оксогуанина – ключевого биомаркера окислительных повреждений ДНК. Установлено, что при внутрибрюшинном введении мышам ионов уранила в микромолярных концентрациях в костном мозге наблюдается увеличение уровня полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ), содержащих микроядра (МЯ). Показано, что ионы уpанила в микромолярных концентрациях не влияют на функционирование митоxондpий. Показано, что ионы уранила в существенной мере модифицируют повреждающее действие ионизирующей радиации при тотальном облучении мышей.
Научно-практическая ценность.
В работе показано, что ионы уранила в микромолярных концентрациях обладают значительными прооксидантными, генотоксическими и цитотоксическими свойствами. При этом наблюдаемые эффекты по большей части связаны с физико-химическими свойствами ионов уранила, а не с их радиоактивностью. Полученные результаты могут быть использованы при научном обосновании безопасных санитарно-гигиенических нормативов концентрации ионов уранила в среде и указывают на необходимость корректировки «Требований к защите от природного облучения в производственных условиях» (СП 2.6.1. 758-99).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 14–16-й конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010– 2012), на Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2010), на IX Конференции, посвященной дню космонавтики (Москва, 2010), на III Всероссийском конгрессе «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010), на Международной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2011), на Международной конференции «Современные проблемы радиобиологии» (Гомель, 2011), на конференции «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2011-2012), на VII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2012), на I Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы биологии и химии» (Пущино, 2012). Материалы конференций опубликованы в виде тезисов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, из них статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 рецензируемая статья в иностранном журнале и 11 тезисов докладов.
Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (№ 10-04-01264-а и 10-04-00969-а).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 97 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (2 главы), методической части, изложения полученных результатов и их обсуждения ( главы), выводов, списка цитируемой литературы (123 источников). Работа иллюстрирована 14 рисунками и содержит 5 таблиц.
Список принятых сокращений. АФК – активные формы кислорода, ККК – кумарин-3-карбоновая кислота, 7-ОН-ККК – 7-гидроксикумарин-3-карбоновая кислота, ОУ – обедненный уран, ПХЭ – полихроматофильные эритроциты, МЯ – микроядра, ФИД – фактор изменения дозы, ДЖРБ – долгоживущие радикалы белка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Определение продукции гидроксильных радикалов осуществляли с помощью их реакции с ККК, продукт гидроксилирования которой – 7-ОН-ККК – является удобным флуоресцентным маркером для определения образования этих радикалов [Черников, Брусков, 2002]. Флуоресценцию 7-ОН-ККК измеряли на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Австралия) с ex = 400 нм, em = 450 нм [Гудков и др., 2012].
Определение концентрации перекиси водорода в водных растворах осуществляли с помощью высокочувствительного метода усиленной хемилюминесценции в системе люминол–4-йодофенол–пероксидаза [Bruskov et al., 2002]. Регистрацию величины хемилюминесценции проводили на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Бета-1» (СССР), работающем в режиме счета одиночных фотонов [Bruskov et al., 2012].
Определение концентрации растворенного в воде кислорода проводили с помощью оксиметрического электрода ДКТП 02.4 на приборе «Эксперт-001» (Эконикс, Россия). Изменение концентрации кислорода в воде проводили путем барботирования кислородом или аргоном в течение 20 мин [Гудков и др., 2010].
Измерение индуцированной рентгеновским излучением люминесценции белковых растворов проводили на хемилюминометре «Биотокс 7А» (Россия).
Измерение люминесценции всех образцов проводилось не менее чем в течение 30 с [Гудков и др., 2010а;
Гудков и др., 2010б].
Иммуноферментный анализ. Для количественного определения 8-оксогуанина в ДНК использовали иммуноферментный анализ с применением моноклональных антител специфичных к 8-оксогуанину [Bruskov et al., 2002].
Оценка функциональных параметров митохондрий. Состояние дыхательной цепи митохондрий исследовали полярографически, используя кислородный электрод типа Кларк [Mironova et al., 2007]. Количество Са2+, необходимого для образования циклоспорин А-чувствительной Ca2+-индуцируемой поры в митохондриях, оценивали с помощью Са2+-селективного электрода «Нико Аналит» (Россия) [Belosludtsev et al., 2010]. Скорость образования H2O суспензией митохондрий печени измеряли с помощью флуоресцентного индикатора Amplex red (ex = 563 нм, em = 578) на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Австралия) [Белослудцев и др., 2012].
Определение цитотоксических повреждений в культуре клеток карциномы гортани человека НЕр2. Клетки культивировали на стандартных 24-луночных планшетах в среде Игла с уранилнитратом в разных концентрациях. Для окpаcки культуpальную cpеду заменяли на pаcтвоp Xенкcа («ПанЭко», Pоccия) c добавлением 10 мМ HEPES, pH 7,4, cодеpжащий 5 мкг/мл Hoechst 33342 и мкг/мл пpопидия иодида. Чеpез 10 мин клетки пpомывали pабочей cpедой без кpаcителей. Поcле этого получали флуоpеcцентные изобpажения клеток в каналах (проходящий свет, синий канал и повторный канал) c помощью микpоcкопа Aviovert 200M (Carl Zeiss, Геpмания), обоpудованного CCD камеpой AxioCam HSM (Carl Zeiss, Геpмания) для pегиcтpации флуоpеcценции Hoechst 33342 и пpопидия иодида [Asadullina et al., 2010].
Определение окислительных модификаций белков по уровню карбонильных производных под действием ионов уранила осуществляли с помощью 2,4 динитрофенилгидразина. Концентрацию карбонильных групп рассчитывали при длине волны 370 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 2,1 104 М-1 см-1 [Дубинина и др., 1995].
Подготовка животных и облучение. Животных содержали на стандартном рационе и подвергали тотальному рентгеновскому облучению с мощностью дозы 1 Гр/мин, помещая в специальные клетки на рентгеновской терапевтической установке «Рут 15» (Мосрентген, Россия).
Микроядерный тест. Величину цитогенетических повреждений определяли по появлению ПХЭ, содержащих МЯ. Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации через 24 ч после облучения в дозе 1 Гр.
Гистологические препараты готовили и окрашивали по стандартной методике с модифицированным растворением клеточного материала [Гудков и др., 2008;
Карп и др., 2010].
Тест на выживаемость. Выживаемость самцов аутбредных мышей Kv:SHK в возрасте 10 недель массой 28–31 г фиксировали ежедневно в течение 30 суток после воздействия ионизирующего излучения. Контролем служили две группы мышей - инъекцированные изотоническим раствором и облученные в той же дозе или не подвергшиеся облучению [Gudkov et al., 2006].
Подсчет форменных элементов крови. Образцы периферической крови брались из хвостовой вены мышей. Все экспериментальные процедуры описаны ранее [Gudkov et al., 2009].
Статистический анализ. Средние значения в экспериментальных группах сравнивали с контрольной группой, используя непараметрический U-тест (критерий числа инверсий (Манна-Уитни) для малых выборок). В экспериментах на выживание различия между группами сравнивались по точному критерию Фишера. При р 0,05 отличие считалось статистически значимым.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Образование активных форм кислорода под действием тепла и света в растворах содержащих ионы уранила Влияние различных концентраций ионов уранила на образование гидроксильных радикалов in vitro при воздействии тепла представлено на рис.
1. Данные получены с помощью высокоспецифичного флуоресцентного зонда для гидроксильных радикалов – кумарин-3-карбоновой кислоты. Показано, что в присутствии уранилнитрата в водных растворах наблюдается существенно более интенсивное образование гидроксильных радикалов. Так при воздействии уранилнитрата в концентрациях 1, 2, 5, 10, 50 мкМ и тепла количество образующихся гидроксильных радикалов увеличивается относительно контроля в 3;
7;
10;
13 и 28 раз.
UO22+ Рис. 1. Влияние ионов * NO уранила в различных 200 концентрациях на [.OH], нМ * • образование ОН in vitro под действием тепла * (80°C, 120 мин) в 20 мМ * фосфатном буфере рН 7, * (n=3-5,, - значение * медианы, I - 25%-75%, * p0.05, U-тест).
0 10 20 30 40 [UO ], мкM 2+ [NO ] / 2, мкM Показано, что наличие в среде нитрата натрия в существенной мере не влияет на образование гидроксильных радикалов. Зависимость интенсивности генерации гидроксильных радикалов (Y) от концентрации ионов уранила (Х) аппроксимируется уравнением Y=15,8 + 51,3 lnX (R2 =0,96), тогда как при превалировании радиационной компоненты полученные результате аппроксимировались бы уравнением прямой, чего не происходит на самом деле (R2 =0,63).
Кинетика процесса генерации гидроксильных радикалов под действием тепла описывается уравнением реакции первого порядка и при кратковременном нагревании линейно зависит от времени t: A=A0kt, где A концентрация 7-ОН-ККК, A0 - стационарная концентрация кислорода в растворе при данной температуре, k - константа скорости реакции [Черников и Брусков, 2002]. В таблице 1 представлены значения констант скорости реакции при разных температурах.
Таблица 1. Значения константы скорости (k) генерации гидроксильных радикалов в фосфатном буфере (20 мМ, рН 7,4) содержащем нитрат уранила (10 мкМ) или нитрат натрия (20 мкМ) при разных температурах.
k, c- Т, °C [O2],мкМ Контроль UO2(NO3)2 NaNO 1,5 10-8 1,7 10-7 1,8 10- 80 1,1 10-9 3,4 10-8 3,0 10- 60 1,6 10-10 5,0 10-9 2,0 10- 40 Величину энергии активации процесса образования гидроксильных радикалов определяли как тангенс угла наклона прямой логарифмической зависимости k от обратной температуры на графике Аррениуса (рис. 2):
-lgk = lgk0 + Ea/2,3RT, где Ea - энергия активации, R - газовая постоянная, T абсолютная температура.
Контроль UO2(NO3)2 Рис. 2. График Аррениуса NaNO3 зависимости -lg k от обратной температуры для определения энергии -lg k 8 активации образования гидроксильных радикалов при нагревании (k – 7 константа скорости генерации гидроксильных с-1;
радикалов, Т – температура, К).
2,8 2,9 3,0 3,1 3, (1/T), x 103, K - Энергия активации образования гидроксильных радикалов при нагревании в фосфатном буфере (20 мМ, рН 7,4), содержащем или не содержащем 20 мкМ NaNO3 оказалась равной 25 ккал/моль, в фосфатном буфере (20 мМ, рН 7,4), содержащем 10 мкМ UO2(NO3)2 – 21 ккал/моль. Известно, что удельная радиоактивность не зависит от температуры. Поэтому полученные данные (табл. 1, рис. 2) позволяют утверждать, что наблюдаемые эффекты существенного увеличения интенсивности генерации гидроксильных радикалов в присутствии ионов уранила по большей части обусловлены их физико-химическими свойствами, а не радиоактивностью [Гармаш и др., 2012а, Garmash et al., 2013].
Таблица 2. Значения констант скорости (k) генерации гидроксильных радикалов в фосфатном буфере (20 мМ, рН 7,4) содержащем нитрат уранила (10 мкМ) и/или аскорбиновую кислоту (АК) (100 мкМ) при температуре 40°С (2 ч).
k, c- [O2], Воздействие мкМ Контроль UO2(NO3)2 АК UO2(NO3)2 + АК 203 1,6 10-10 5,0 10-9 1,6 10- Контроль 130 0,9 10-10 2,6 10-9 4,5 10- Барботирование Ar 3,0 10-10 1,910-8 3,7 10- Барботирование О2 Влияние восстановителя на образование гидроксильных радикалов in vitro при воздействии тепла представлено в табл. 2. В качестве восстановителя использовали аскорбиновую кислоту. При наличии 10 мкМ уранилнитрата образование гидроксильных радикалов под действием тепла происходит почти на порядок более эффективно по сравнению с контролем. Показано, что наличие в среде аскорбиновой кислоты в существенной мере ингибирует процесс образования гидроксильных радикалов под действием тепла. При добавлении уранилнитрата совместно с аскорбиновой кислотой наблюдается на три порядка более интенсивное образование гидроксильных радикалов по сравнению с пробами, содержащими только уранилнитрат. Важным является так же тот факт, что при уменьшении, концентрации кислорода в среде интенсивность образования гидроксильных радикалов уменьшается во всех исследуемых группах. Таким образом, образование гидроксильных радикалов в водных растворах под действием ионов уранила зависит от наличия доступного восстановителя и концентрации кислорода в среде.
С помощью высокоспецифичного флуоресцентного зонда для гидроксильных радикалов – кумарин-3-карбоновой кислоты, установлено, что в присутствии уранилнитрата в водных растворах при воздействии видимого света происходит существенное увеличение образования гидроксильных радикалов по сравнению с неосвещенным контролем (Таблица 3). При увеличении концентрации ионов уранила образование гидроксильных радикалов происходит более эффективно. Так при концентрации ионов уранила 100 мкМ образование гидроксильных радикалов относительно освещенного контроля увеличивается в 5 раз. С уменьшением энергетической освещенности образцов наблюдается уменьшение скоростей образования гидроксильных радикалов (данные не пpедcтавлены).
Таблица 3. Влияние ионов уранила в различных концентрациях на образование • ОН in vitro под действием видимого света (83,3 Вт/м2) в течение 2 ч в 20 мМ фосфатном буфере рН 7,4 (20°C) (n=3, * - p0.05 (U-тест)).
[UO2+2], мкМ [•ОН], нМ (медиана (размах) 0 8,9 (7,6-9,6) 10 13,1* (11,5-13,8) с 50 26,0* (23,2-30,0) с 100 44,9* (38,0-46,6) с С помощью высокоспецифичного флуоресцентного зонда для гидроксильных радикалов – кумарин-3-карбоновой кислоты, установлено, что в присутствии уранилнитрата в водных растворах при воздействии рентгеновского излучения в дозе 1 Гр происходит более интенсивное образование гидроксильных радикалов по сравнению с пробами, облученными в дозе 1 Гр, но не содержащими уранилнитрат. Установлена зависимость образования гидроксильных радикалов от концентрации уранилнитрата. При наличии в среде нитрата натрия данный феномен не наблюдается.
Рис. 3. Изменение C1 + UO22+ концентрации перекиси C2 + UO22+ 100 водорода в фосфатном C1 + NO3- буфере (1мМ, рН 7,4) в [Н2O2], нМ зависимости от концентрации ионов уранила и нитрата (n=4,,, - значение медианы, I - 25%-75%, * - p0.05, U тест) (20°C). С1 – при 0 воздействие видимого света (83,3 Вт/м2) в течение 2 ч.
0 20 40 60 80 [UO22+], мкM [NO3-] / 2, мкM С2 – при экспозиции в темноте в течение 2 ч.
Методом усиленной хемилюминесценции показано, что при воздействии на растворы уранилнитрата теплом (40°С, 3 ч) наблюдалось в 3-5 раз более интенсивное образование перекиси водорода по сравнению с непрогретыми образцами. Уранилнитрат в концентрациях 50 мкМ в 1мМ фосфатном буфере рН 7,4 под действием тепла (40°С, 3 ч) приводит к образованию 12 нМ перекиси водорода. Эквимолярные концентрации нитрата натрия приводили к незначительному уменьшению образования перекиси водорода по сравнению с контролем.
Методом усиленной хемилюминесценции показано, что уранилнитрат в концентрациях 5-100 мкМ, значительно увеличивает продукцию перекиси водорода при освещении по сравнению с контролем (рис. 3). Эквимолярные концентрации нитрата натрия не приводили к существенному изменению образования перекиси водорода по сравнению с контролем. При концентрации ионов уранила 100 мкМ наблюдается практически в 5 раз более интенсивное фотоиндуцированное образование перекиси водорода. При отсутствии воздействия видимого света ионы уранила проявляют прооксидантные свойства в значительно меньшей степени (рис. 3). Кроме того, показано, что ионы уранила приводят к увеличению радиационно-химического выхода перекиси водорода при воздействии рентгеновского излучения.
UO2(NO3)2 аскорбиновая кислота Рис. 4. Влияние ионов уранила (10 мкМ), [O2], мкМ аскорбиновой кислоты каталаза (100 мкМ) и каталазы (1 ед./мл) на концентрацию кислорода в водных растворах (40°С).
180 Представлен репрезентативный опыт.
0 30 60 90 120 150 Время, мин На рис. 4 представлено влияние ионов уранила, аскорбиновой кислоты и каталазы на концентрацию кислорода в водных растворах (фосфатный буфер, разведенная в десять раз термически инактивированная сыворотка). Показано, что при добавлении уранилнитрата наблюдается тенденция к уменьшению концентрации молекулярного кислорода в исследуемом растворе. При последующем внесении аскорбиновой кислоты наблюдается интенсивное уменьшение концентрации молекулярного кислорода, достаточно хорошо описываемое функцией экспоненциального затухания. При внесении каталазы, фермента разлагающего перекись водорода до воды и молекулярного кислорода, наблюдается увеличение концентрации молекулярного кислорода в растворе. При добавлении нитрата натрия или аскорбиновой кислоты к растворам, не содержащим ионы уранила, существенного изменения концентрации молекулярного кислорода не наблюдается (данные не представлены). Полученные результаты позволяют утверждать, что в результате взаимодействия ионов уранила и восстановителя происходит значительное потребление растворенного молекулярного кислорода и образование существенных количеств перекиси водорода.
UO22+ + hv (kT) *UO22+ (1) *UO22+ + R-(RH) UO2+ + R• + (H+) (2) 2UO2+ + O2 + 2H+ 2UO22+ + H2O2 (3) 2UO2+ + 4H+ + 4H2O UO22+ + U4+ + 6H2O (4) UO2+ (U4+) + H2O2 UO22+(U5+) + •OH + -OH (5) Таким образом, показано, что в присутствии ионов уранила происходит образование АФК, причем при совместном воздействии либо с теплом, либо с видимым светом, либо с рентгеновским излучением в существенной степени более интенсивно. Способность ионов уранила к образованию АФК зависит от 1) интенсивности воздействия физического фактора (рис. 1-3, табл. 1, 3);
2) наличия в среде восстановителя (табл. 2);
3) наличия в среде растворенного молекулярного кислорода (табл. 2). Процесс образования АФК в водных растворах, по всей видимости, происходит следующим образом (1-5).
Известно, что ион уранила поглощает ближнее ультрафиолетовое излучение и видимый свет в синей и частично зеленой области. Фотоактивация ионов уранила приводит к переходу его в возбужденное состояние (*UO22+) (1) [Mao&Bakac;, 1997]. Предполагается, что под действием тепла могут происходить сходные процессы (1). Достаточно давно известно, что ионы уранила даже в основном, невозбужденном состоянии являются акцепторами электрона [Пикаев, 1986]. В возбужденном состоянии ионы уранила, могут более эффективно реагировать с восстановителями, анионами и органическими субстратами (2) [George et al., 2011]. Одним из продуктов этой реакции является UO2+, данное соединение в водных растворах преимущественно вступает в три реакции: реакция с молекулярным кислородом (3), реакция диспропорционирования (4) и реакция с перекисью водорода (5) [Бекман, 2009, George et al., 2011]. Вероятность протекания всех реакций зависит, по сути, от концентрации молекулярного кислорода, перекиси водорода и самого UO2+. Поскольку концентрация молекулярного кислорода в исследуемых нами условиях примерно в 30 раз больше исходной концентрации ионов уранила и на несколько порядков больше концентрации UO2+ и перекиси водорода, можно предполагать, что основной реакцией будет реакция (3). Данная реакция приводит к накоплению перекиси водорода, которая в дальнейшем расщепляется по реакции (5), чему должен U4+, способствовать который является одним из продуктов + диспропорционирования UO2 (4). При этом происходит интенсивное образование гидроксильного радикала [Boncella, 2008].
Н2О + e + •ОН + H+ (6) e + •ОН -OH (7) e + O2 O2•- (8) UO22+ + e UO2+ (9) • ОН + •ОН Н2О2 (10) В случае действия ионизирующей радиации, процесс дополнительного по сравнению с контрольными пробами образования АФК протекает, вероятно, по другой схеме. Процесс радиолиза воды упрощенно представлен в реакции (6). Известно, что сольватированный электрон в растворе преимущественно либо обрывает радикальные реакции (7), либо восстанавливает молекулярный кислород (8) [Ward, 1978]. Как отмечалось выше, ионы уранила являются эффективными акцепторами электрона [Пикаев, 1986] (9), что вероятно приводит к сокращению числа случаев обрыва радикальной цепи реакций.
Итогом является, наблюдаемый нами, повышенный по сравнению с контролем радиационно-химический выход гидроксильных радикалов в шпурах и как следствие небольшое увеличение концентрации Н2О2 (10).
Образование повреждений белка и ДНК под действием ионов уранила С помощью метода индуцированной хемилюминесценции белка показано образование долгоживущих радикальных продуктов белка при воздействии тепла (45°С, 2 ч) и влияние ионов уранила на этот процесс (рис. 5). Добавление к растворам БСА ионов уранила в концентрации 1 мкМ не приводит к существенному изменению количества долгоживущих радикальных продуктов БСА по сравнению с контролем. При добавлении к растворам БСА ионов уранила в концентрациях 10-100 мкМ происходит более интенсивное образование долгоживущих радикальных продуктов по сравнению с контролем. Тогда как, эквимолярные концентрации нитрата натрия не влияли существенным образом на этот процесс. Суть установленного феномена в достаточной мере описывают уравнения (1) и (2), приведенные выше. Вклад ионов уранила в регистрируемую люминесценцию не превышал нескольких процентов, что позволяет также говорить преимущественно о физико химической природе образования долгоживущих радикальных продуктов БСА [Гармаш и др., 2012а].
люминесценция, имп/мин Контроль Рис. 5. Влияние ионов UO22+ (1 мкМ) уранила на образование 600 UO22+ (10 мкМ) долгоживущих радикалов UO22+ (100 мкМ) БСА in vitro под действием тепла (45°С, 2 часа) (n=3-5,,,, - значение медианы, I - 25%-75%, * p0.05, U-тест).
0 1 2 3 4 Время, ч Далее было исследовано влияние ионов уранила на образование окислительных модификаций белков при внутрибрюшинном введении уранилнитрата в различных концентрациях мышам Kv:SHK. Использованные концентрации ионов уранила 0,1-0,5 мкг/г эквивалентны эффективным концентрациям ионов уранила 2-10 мкМ в системах in vitro. С увеличением концентрации ионов уранила, вводимой мышам, содержание карбонильных производных в сыворотке их крови увеличивается. При максимальной исследуемой концентрации ионов уранила (0,50 мкг/г) содержание карбонильных производных увеличивается почти в два раза по сравнению с интактными животными. При тотальном облучении животных в дозе 1 Гр содержание карбонильных производных увеличился примерно в 1,8 раза.
Воздействие ионов нитрата вплоть до концентраций 0,50 мкг/г существенно не влияло на поврежденность белков. Таким образом, введение около 0,25 мкг/г ионов уранила в организм мыши эквивалентно ее облучению в дозе около Гр (Рис. 6) [Garmash et al., 2013].
Рис.6. Образование карбонильных производных карбонильные производные, под действием ионов 8 уранила в плазме крови * * мкмоль/г белка самцов мышей. (n=3-5, * 6 значение медианы, - 25% 75%, - размах, 1 Гр HBI среднее, * - p0.05, U-тест).
1 Гр HBI - животных облучали тотально в дозе Гр.
0,00 0,10 0,25 0, UO22+, мкг/г живого веса Известно, что ключевым биомаркером повреждения ДНК под действием АФК является 8-оксогуанин. Методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител к 8-оксогуанину было количественно определено образование 8-оксогуанина в ДНК спермы лосося под действием различных концентраций уранилнитрата (рис. 7). С увеличением концентрации уранилнитрата уровень образования 8-оксогуанина в ДНК возрастает. Под действием нитрата натрия не наблюдается увеличения содержания 8-оксогуанина в ДНК. При тепловом воздействии (40°С) на раствор ДНК количество 8-оксогуанина увеличилось по сравнению с ДНК, находившейся при комнатной температуре (20°С) в 7 раз при концентрации уранилнитрата 500 мкМ. При совместном действии тепла и уранила образование 8-оксогуанина увеличивается. Расчетные данные показывают, что радиационный вклад уранила в образование 8-ОГ в ДНК почти на 2 порядка меньше, чем представлено на рис. 6, что также говорит о физико-химической природе повреждения гуанина в ДНК [Гармаш и др., 2012а;
Гармаш и др., 2012б;
Белослудцев и др., 2012].
Как показано выше, основной причиной образования повреждений биомакромолекул под действием окислов урана может быть их высокая химическая активность, приводящая к генерации активных форм кислорода и окислительным повреждениям ДНК. Кроме того, из литературы известно, что положительный заряд ионов уранила способствует их эффективному связыванию с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК [Bruskov & Kiselev, 1968], что в ряде случаев может приводить к разрывам ДНК [Yazzie et al., 2003] и образованию гуанил-анион радикала, который долгое время мигрирует по остаткам гуанина в ДНК (DNA hole hopping) вплоть до окисления одного из остатков гуанина молекулярным кислородом [Conwell, 2005].
молекул 8-ОГ на 105 гуанинов в ДНК 2, молекул 8-ОГ на 10 гуанинов в ДНК Рис. 7. Влияние различных концентраций ионов уранила на 2, образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro (40°C, 120 мин) (n=4, - значение медианы, I 1, 25%-75%). Фоновые значения и эффекты нитрат ионов вычтены из полученных данных.
0 100 200 300 400 1, Вcтавка: влияние ионов 2+ [UO2 ], мкM уpанила (100–500 мкМ) на обpазование 8-окcогуанина в 0, ДНК in vitro под дейcтвием тепла (n=4, - значение 0, медианы, I - 25%-75%).
1 10 [UO22+ ], мкM Цитотоксические и генотоксические свойства ионов уранила На pиc. 8 приведены результаты влияния нитpата уранила на жизнеcпоcобноcть клеток культуры HEp-2. Увеличение количества нежизнеcпоcобныx клеток наблюдается после 48 ч обработки уpанилнитpатом в концентрации выше 10 мкМ. При меньших временах инкубации клеток с уранилнитратом наблюдалось меньшее количество нежизнеcпоcобныx клеток. Напротив, с увеличением концентрации ионов уpанила процент погибших клеток существенно возpаcтал [Garmash et al., 2013]. Воздействие нитрат ионов вплоть до концентраций 200 мкМ не влияло на жизнеcпоcобноcть клеток [Белослудцев и др., 2012]. Стоит отметить, что использованная нами культура HEp-2 является pезиcтентной к воздействию pазличныx повpеждающиx факторов xимичеcкой и физической пpиpоды, вызывающих окислительный стресс, по сравнению с нетрансформированными клетками, особенно клетками костного мозга, тимуса, эпителия ЖКТ и т.д. [Chen, 1988]. Для сравнения, воздействие на клетки HEp-2 рентгеновским излучением в дозе 5 Гp через 48 ч после начала облучения приводит к появлению чуть более 3% нежизнеспособных клеток, что в принципе сопоставимо с реакцией клеток ЦНС, почек, печени, костно мышечной системы и эквивалентно воздействию уpанилнитpата в концентрации 100 мкМ в течение 48 ч [Гармаш и др., 2011, Garmash et al., 2013].
Нежизнеспособные клетки, % Нежизнеспособные клетки, % Pиc. 8. Цитотокcичеcкий 4 50 * эффект ионов уpанила (1– 100 мкM) на клетки * человеческой карциномы * гортани (HEp-2) (n=3, * значение медианы, I - 25% * 0,0 0,5 1, 75%, * - p0.05, U-тест).
2 2+ [UO2 ], мM Вcтавка: цитотокcичеcкий эффект ионов уpанила (0,2– 1,0 мM) на клетки HEp (n=3, - значение медианы, I - 25%-75%, * - p0.05, U тест).
1 10 [UO22+], мкM Известно, что система кроветворения является одной из наиболее чувствительных к различным повреждающим воздействиям. Метод микроядерного теста является одним из наиболее эффективных средств для количественной оценки цитогенетических повреждений, таких как ПХЭ с МЯ в костном мозге. Результаты влияния ионов уранила на выход ПХЭ с МЯ в костном мозге мышей представлены на рис. 9. На графике видно, что после воздействия на организм животных ионов уранила в количестве 0,10 мкг/г процент ПХЭ с МЯ увеличился примерно в 2 раза от 0,38 % в отсутствии воздействия до 0,66% при воздействии ионов уранила. При введении животным ионов уранила в концентрациях 0,25 и 0,50 мкг/г количество ПХЭ, содержащих МЯ, увеличивается в среднем в 5 и 9 раз. Зависимость образования ПХЭ с МЯ от концентрации уранила близка к линейной. При тотальном облучении животных в дозе 1 Гр процент ПХЭ с МЯ увеличился примерно в 9 раз от 0,38 % в отсутствии воздействия до 3,49% при воздействии рентгеновского излучения в дозе 1 Гр. Введение ионов нитрата вплоть до концентраций 0,5 мкг/г существенно не влияло на содержание ПХЭ с МЯ в костном мозге мышей. После воздействия на организм животных нитрат ионов в концентрации эквивалентной 0,50 мкг/г концентрации ионов уранила процент ПХЭ с МЯ увеличился примерно в 1,5 раза от 0,38 % при отсутствии воздействия до 0,59% при воздействии нитрат ионов.
Известно, что накопление уранил ионов в организме приводит к появлению различных патологий [Barillet et al., 2011], что, вероятно, связано с их высокой генотоксичностью и цитотоксичностью. Одной из основных причин генотоксичности окислов урана может быть их высокая физико-химическая активность, в частности, приводящая к генерации АФК, окислительным повреждениям ДНК и белков.
4 * * ПХЭ с МЯ, % Рис. 9. Образование ПХЭ с 3 МЯ в костном мозге мышей 1 Гр HBI получавших ионы уранила * (n=3-5, - значение медианы, - 25%-75%, размах, - среднее, * p0.05, U-тест). 1 Гр HBI * животных облучали тотально в дозе 1 Гр.
0,00 0,10 0,25 0, UO22+, мкг/г живого веса Данные, полученные in vivo, согласуются с результатами полученными in vitro и являются косвенным подтверждением того, что процессы происходящие при воздействии ионов уранила и ионизирующей радиации сходны на качественном уровне. Данное сходство, вероятно, опосредовано генерацией АФК, что приводит к развитию окислительного стресса и реализуется, как в резистентных, так и в чувствительных к окислительному стрессу клетках.
Влияние уpанилнитpата на функциональные паpаметpы митоxондpий печени кpыc и мышей Как показано выше, действие ионов уранила приводит к гибели клеток.
Многочисленные исследования механизмов цитотокcичеcкого действия веществ различной природы показали, что в иx оcнове зачастую лежит pазвитие окиcлительного cтpеccа, cопpовождающееcя повpеждением макpомолекул [Miyake & Yamasaki, 2012]. Как известно, митохондрии являются основным поставщиком АФК в клетке [Korshunov et al., 1997]. В связи с этим иccледовано роль митохондрий в развитии окислительного стресса индуцированного ионами уранила. Митохондрии выделяли из печени, так как данный орган является одним из основных дипозитариев ионов уранила в организме млекопитающих. Исследование проводили через 1, 5 и суток после введения ионов уранила в концентрации 0,5 мкг/г. При сравнении двух групп мышей, получивших или не получивших ионы уранила не выявлено каких либо существенных различий в дыхании, Cа2+-емкоcти митохондрий и cкоpоcти обpазования H2O2. Однако, данный результат не доказывает отсутствие возможного влияния ионов уранила на функциональные паpаметpы митоxондpий при более высоких концентрациях.
В связи с этим для установления пороговых концентраций ионов уранила на функциональные паpаметpы митоxондpий проведено исследование этого процесса in vitro. В качестве объекта были выбраны крысы, так как печень крыс гораздо больше мышиной по размеру и дает возможность готовить большое количество проб из одной особи, что гарантирует отсутствие влияния индивидуальных различий особей на получаемые результаты и, безусловно, повышает их достоверность. Как видно из таблицы 4, добавление ионов уранила в концентрации 1 мМ к cуcпензии митоxондpий пpиводит к незначительному уменьшению cкоpоcти дыxания митоxондpий в cоcтоянии 3.
Пpи этом cкоpоcть дыxания митоxондpий в cоcтоянии 4 в пpиcутcтвии ионов уpанила оcтавалаcь на том же уpовне. Cледовательно, паpаметp дыxательного контpоля (V3/V4 – отношение cкоpоcти дыxания в пpиcутcтвии АДФ к cкоpоcти дыxания, когда веcь АДФ уже изpаcxодован) также cнижалcя. Кpоме того, уpанилнитpат в концентрации 1 мМ cнижал cкоpоcть дыxания митоxондpий, cтимулиpованного pазобщителем окиcлительного фоcфоpилиpования – 2,4 динитpофенолом (около 15%). При большей концентрации уранилнитрата (2, мМ) ингибирование дыхания было более выражено. Нитpат натрия в концентpации 5 мМ и меньше, а так же уpанилнитpат в концентрации 0,1 мМ не влияли на дыxание митоxондpий печени кpыc (данные не пpедcтавлены).
Таблица 4. Влияние ионов уранила на дыхание митохондрий печени крыс (n=3 4, данные представлены как медиана (размах)). * - p0,05;
** - Дыхательный контроль (ДК) рассчитан как отношение V3/V4.
UO2(NO3)2 V дыхания (нмоль О2/мин/мг белка) мМ V2 V3 V4 VДНФ ДК** 0 3, 13,1(11,4-16,7) 64,0(52,1-70,3) 16,8(15,6-18,5) 84,4(84,3-84,6) 1 3, 13,8(12,9-14,2) 55,7(54,3-57,6) 16,5(16,3-16,6) 72,1(71,9-72,7)* 2,5 10,5(9,7-11,3) 45,5(43,3-48,1)* 15,0(14,5- 15,4)* 55,9(54,1-57,9)* 3, Индукция митоxондpиальной циклоcпоpин А-чувcтвительной белковой поpы ионами кальция зачастую рассматривается, как важный паpаметp пpи изучении pоли митоxондpий в pазвитии клеточной гибели. Откpытие такой поры оценивалось по изменению Cа2+-емкоcти митоxондpий печени кpыc.
Показано, что пpи добавлении 1 мМ уpанилнитpата Cа2+ емкость митоxондpий незначительно увеличиваетcя 90 мкМ/мг белка против 85 мкМ/мг в контроле.
Извеcтно, что митоxондpии являютcя оcновными поcтавщиками активныx фоpм киcлоpода в клетке [Lenaz, 2012]. В cвязи c этим иccледовано влияние уpанилнитpата на cкоpоcть обpазования H2O2 энеpгоcопpяженными митоxондpиями печени кpыc. Показано, что cкоpоcть обpазования H2O митоxондpиями в пpиcутcтвии 0,1 мМ уpанилнитpата доcтовеpно ниже ( (199-257) пмоль/мин/мг белка (медиана (размах))) по cpавнению cо cкоpоcтью обpазования H2O2 в отcутcтвие ионов уpанила (270 (259-286) пмоль/мин/мг белка (медиана (размах))).
Таким обpазом, уpанилнитpат в микромолярных концентрациях пpактичеcки не влияет на функциональные паpаметpы митоxондpий. По всей видимости, митохондрии не являются причиной развития окислительного стресса под действием ионов уранила [Белослудцев и др., 2012].
Радиомодифицирующие свойства ионов уранила Поскольку ионы уранила приводят к генерации АФК и развитию окислительного стресса было высказано предположение о том, что ионы уранила могут в существенной степени модифицировать действие ионизирующей радиации in vivo. В связи с этим, в данной работе исследовано влияние ионов уранила на мышей, подвергнутых радиационно индуцированному окислительному стрессу путем облучения в дозах 5-6,5 Гр (рис. 10).
6 Гр 100 Рис. 10. Влияние растворов 6 Гр + NO3 UO2(NO3)2 и NaNO3 на Выживаемость, % 6 Гр + UO22+ выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении этих соединений после воздействия рентгеновского излучения в дозе 6 Гр.
P=0. 40 (Функция Каплан-Мейера, каждая группа состояла из 20 животных).
P=0. 0 5 10 15 20 25 Время после облучения, сут Животным внутрибрюшинно через 15 мин после облучения вводили изотонический раствор (контроль) или уранилнитрат (0,75 мкг/г UO2(NO3) (UO2+2 ~0,50 мкг/г + ~0,25 мкг/г NO3-) или нитрат натрия (0,32 мкг/г NaNO (Na+ ~7 мкг/г + 0,25 мкг/г NO3-). Нужно отметить, что ионы уранила при введении их интактным мышам в концентрациях (0,1 – 1,0 мкг/г) не вызывают заметных краткосрочных последствий [Смирнова и др., 2011]. В группе контрольных, облученных в дозе 6 Гр мышей, которым вводили изотонический раствор, 55% животных оставались живы до конца эксперимента, т.е. в течение 30 суток после облучения (рис. 10). В группе облученных в дозе 6 Гр мышей, получивших нитрат натрия, средняя продолжительность жизни составила 17 сут и 30% животных оставались живы в течение 30 суток после облучения. В группе облученных в дозе 6 Гр мышей, получивших уранилнитрат, средняя продолжительность жизни составила сут и только 5% животных оставались живы на 30 сутки после облучения.
Таким образом, показано, что ионы уранила в существенной мере модифицируют воздействие ионизирующей радиации.
В связи с тем, что ионы уранила проявляют существенные радиомодифицирующие свойства была предпринята попытка охарактеризовать их количественно. Для этого исследована способность ионов уранила модифицировать индуцированную различными дозами ионизирующего излучения гибель животных (рис. 11). Установлено, что уранилнитрат увеличивал вероятность летального исхода во всех исследуемых группах. Так при дозе 5 Гр вероятность смертельного исхода к 30 дню при введении уранилнитрата увеличивалась на 25% по сравнению с контролем (животные, облученные в дозе 5 Гр). При дозе 6 Гр вероятность смертельного исхода к 30 дню при введении уранилнитрата увеличивалась на 35%.
NaNO3 Рис. 11. Влияние растворов UO2(NO3)2 и NaNO3 на UO2(NO3) Cмертность, % выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении этих соединений после воздействия рентгеновского излучения. График представлен в координатах 10 доза – пробит. На каждую точку на графике приходится не менее чем 20 мышей.
5 6 6, за, Гр На основе полученных экспериментальных данных была вычислена полулетальная доза ионизирующего излучения для исследуемых животных.
Для мышей, которым вводили изотонический раствор, LD50/30 составила порядка 6 Гр.
После введения UO2(NO3)2 и NaNO3 величина LD50/30 снизилась до 5,3 и 5, Гр соответственно. Из полученных данных вычислен фактор изменения дозы (ФИД), который рассчитывается как соотношение доз LD50/30 в присутствии или отсутствии изучаемых соединений. ФИД для UO2(NO3)2 составил 0,88;
для NaNO3 - 0,98.
ФИД [UO2+2] = 1 – ((1- ФИД[UO2(NO3)2]) - (1- ФИД[NaNO3])) Исходя из полученных данных, ФИД для ионов уранила UO2+2 составил 0,90.
Наиболее вероятным, в случае самцов мышей Kv:SHK и доз облучения до Гр представляется летальный исход, обусловленный радиационным поражением тканей, ответственных за образование и cозревание клеток крови, а также повреждением иммунных клеток, находящихся в составе крови, лимфы и других тканей. В связи с этим исследовано влияние ионов уранила на количество форменных элементов крови у мышей, тотально облученных в дозе 6 Гр. Количество лейкоцитов в контрольной группе животных составило 9, 109 кл/л. В группах облученных животных (изотонический раствор и нитрат натрия) количество лейкоцитов к 12-му дню снизилось на ~ 95% относительно количества лейкоцитов в периферической крови интактных мышей. В группе животных, получивших уранилнитрат, уровень лейкоцитов уменьшился к 12 му дню до 99%. Количество гранулоцитов и тромбоцитов в периферической крови облученных мышей изменялось сходным образом. Таким образом, уранилнитрат при введении его облученным в дозе 6 Гр животным негативным образом влияет на гемопоэз, что проявляется в существенном снижении количества форменных элементов крови, более выраженной лейкопении и тромбопении, что в итоге приводит к снижению выживаемости животных.
ВЫВОДЫ 1. Способность ионов уранила к индукции образования активных форм кислорода в водных растворах зависит от концентрации ионов уранила, интенсивности воздействия физических факторов и концентрации растворенного молекулярного кислорода. В присутствии аскорбиновой кислоты, как восстановителя, наблюдается на несколько порядков более эффективное образование активных форм кислорода под действием ионов уранила. Вклад естественной радиоактивности урана в процесс образования АФК незначителен.
2. Показано, что в присутствии ионов уранила в микромолярных концентрациях наблюдается более интенсивное образование долгоживущих радикалов белка и 8-оксогуанина в ДНК in vitro относительно контроля. При внутрибрюшинном введении ионов уранила самцам мышей наблюдается увеличение содержания карбонильных производных белков в сыворотке крови и количества полихроматофильных эритроцитов, содержащих микроядра в костном мозге.
3. Показано, что внутрибрюшинное введение ионов уранила самцам мышей в концентрации вплоть до 0,5 мкм/г и добавление ионов уранила к суспензии митохондрий in vitro до конечной концентрации 390 мкг/мл не влияют существенным образом на скорость дыхания, Cа2+-емкоcть митохондрий и cкоpоcть обpазования ими H2O2.
4. Уранилнитрат проявляет радиомодифицирующие свойства, уменьшая выживаемость самцов мышей при внутрибрюшинном введении его вскоре после действия ионизирующей радиации в летальных и сублетальных дозах.
Фактор изменения дозы при таком введении в пересчете на ионы уранила равен 0,9.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Cтатьи в рецензируемых журналах 1. Garmash S.A., Smirnova V.S., Karp O.E., Usacheva A.M., Berezhnov A.V., Ivanov V.E., Chernikov A.V., Bruskov V.I., Gudkov S.V. Pro-oxidative, genotoxic and cytotoxic properties of uranyl ions. // J. Environ. Radioact.
2013 Jan 9. doi: 10.1016/j.jenvrad.2012.12.009 [PubMed & Scopus indexed] 2. Bruskov V.I., Karp O.E., Garmash S.A., Shtarkman I.N., Chernikov A.V., Gudkov S.V. Prolongation of oxidative stress by long-lived reactive protein species induced by X-ray radiation and their genotoxic action. // Free Radical Research. 2012. Vol. 46. P.1280-1290.
3. Белослудцев К.Н., Гармаш С.А., Белослудцева Н.В., Белова С.П., Бережнов А.В., Гудков С.В. Исследование механизмов цитотоксического действия уранил нитрата. // Биофизика. 2012. Т. 57, № 5, с. 789-795.
4. Гармаш С.А., Карп О.Э., Смирнова В.С., Гудков С.В. Прооксидантные свойства ионов уранила, индуцированные видимым светом // Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологическая. 2012.
ч.3. с.44–46.
5. Гармаш С.А. Образование активных форм кислорода при совместном действии низких концентраций ионов уранила и ряда физических факторов. // Фундаментальные исследования. 2012. №9 (4), стр. 961 964.
6. Гудков С.В., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., Черников А.В., Карп О.Э., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы белка, индуцируемые рентгеновским облучением, являются источником активных форм кислорода в водной среде // ДАН. 2010. том. 430, №1, c. 123– 7. Гудков С.В., Гармаш С.А., Карп О.Э., Смирнова В.С., Черников А.В., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы аминокислот, индуцируемые рентгеновским излучением, являются источником образования перекиси водорода в водной среде. // Биофизика. 2010. том. 55, выпуск 4, с. 588– 593.
8. Гудков С.В., Карп О.Э., Гармаш С.А., Иванов В.Е., Черников А.В., Манохин А.А., Асташев М.Е., Ягужинский Л.С., Брусков В.И.
Образование активных форм кислорода в воде под воздействием видимого и инфракрасного излучения в полосах поглощения молекулярного кислорода. // Биофизика. 2012. том. 57, выпуск 1, с. 5–13.
Тезисы докладов 9. Смирнова В.С., Гармаш С.А., Гудков С.В., Брусков В.И.
Генотоксическое и прооксидантное действие ионов уранила.
«Экспериментальная и теоретическая биофизика’10». Пущино. 19- октября 2010. с.33.
10. Гармаш С.А., Гудков С.В. Цитотоксическое действие ионов у ранила «Биология наука XXI века» Пущино. 18-22 апреля 2011. с.122.
11. Гармаш С.А., Бережнов А.В., Смирнова В.С., Гудков С.В., В.И.
Брусков. Цитотоксические свойства ионов уранила. «Медико биологические проблеммы токсикологии и радиологии». Санкт Петербург. 19-20 мая 2011 г. с.126.
12. Гармаш С.А., Бережнов А.В., Смирнова В.С., Гудков С.В. Ионы уранила влияют на выживаемость животных и клеток, а также вызывают окислительный стресс in vitro. Радиация и Чернобыль: Наука и практика.
Белорусь. Гомель. 13-14 октября 2011 г. с.209-210.
13. Гармаш С.А., Смирнова В.С., Гудков С.В. Прооксидантные, гено- и цитотоксические свойства ионов уранила. «Экспериментальная и теоретическая биофизика’11». Пущино. 20-21 октября 2011. с.4- 14. Гармаш С.А., Гудков С.В. Образование активных форм кислорода под действием ионов уранила in vitro. «Ломоносов». Москва. 11-15 апреля 2011. с.35.
15. Гармаш С.А., Гудков С.В. Образование АФК при совместном действии ионизирующей радиации, тепла, света и ионов уранила. «Биология наука XXI века» Пущино. 16 – 21 апреля 2012 г. с. 305.
16. Гудков С.В., Карп О.Э., Гармаш С.А., Иванов В.Е., Черников А.В., Галочкина Е.А., Усачева А.М., Смирнова В.С., Брусков В.И.
Образование активных форм кислорода под действием неионизирующих излучений. «Биологические механизмы старения». Харьков. Украина.
16-19 мая 2012 г. с. 21-22.
17. Гармаш С.А., Гудков С.В. Влияние ионов уранила в концентрациях, содержащихся в окружающей среде и механизм их действия на биологические системы. «Биология – наука XXI века» 24 мая 2012 г.
Москва. c.180-181.
18. Гармаш С.А. Сенсибилизация ионами уранила действия физических факторов окружающей среды. «Актуальные вопросы биологии и химии» Пущино. 30 июля – 03 августа 2012 г. с.141.
19. Гармаш С.А. Исследование прооксидантных свойств ионов уранила и их способности усиливать действие физических факторов окружающей среды. «Экспериментальная и теоретическая биофизика’12». Пущино.
22-24 октября 2012. с.100.