Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках e.coli
На правах рукописи
ЛЕТУТА Ульяна Григорьевна Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках E.coli 03.01.02 – биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Саратов 2012 1
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образо вательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбург ский государственный университет» в Научно-образовательном центре био химической физики наносистем.
Научный консультант: Бердинский Виталий Львович доктор физико-математических наук, заведующий кафедрой физики конденсированного состояния ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный университет»
Официальные оппоненты: Проскуряков Иван Игоревич доктор физико-математических наук, зав. лабораторией молекулярной спектроскопии Института фундаментальных проблем биологии РАН Щеголев Сергей Юрьевич доктор химических наук, профессор, директор Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики РАН 18
Защита состоится « » _ 2013 года в часов на засе 15: дании диссертационного совета (Д.212.243.05) при Саратовском государст венном университете им. Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, корпус 3, физический факультет СГУ.
С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке им. В.А. Артисевич Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.
Автореферат разослан “ ” 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук, профессор В.Л. Дербов
Общая характеристика работы
Актуальность работы. Большинство химических элементов имеют ста бильные изотопы, отличающиеся и массой, и магнитными характеристиками атом ных ядер. Некоторые изотопы, например, 1H, 13 15 25 P, характеризуются C, N, Mg, наличием ядерных спинов и ядерных магнитных моментов и называются магнит ными. Все бесспиновые изотопы немагнитны.
Различия атомных масс и магнитных свойств изотопов являются причиной масс-зависимых и магнитно-изотопных эффектов, соответственно. Известно мно жество масс-зависимых изотопных эффектов, проявляющихся как изменение ско рости протекания химических реакций (Griffiths, 1998). Магнитно-изотопные эф фекты в химии характерны только для радикальных реакций (Бучаченко, 1978).
Они обусловлены, главным образом, влиянием ядерного магнитного момента на спиновую эволюцию радикальных пар (РП), судьба которых (внутриклеточная ре комбинация или внеклеточные реакции) определяется действием спиновых запре тов и правил отбора.
Вплоть до открытия магнитно-изотопных эффектов в биохимии (Бучаченко, 2008) – в реакциях ферментативного фосфорилирования, - возможное влияние маг нитных изотопов на живые организмы не предполагалось. Это было обусловлено несколькими причинами, главная из которых – отсутствие в живых организмах ра дикальных реакций с участием радикальных пар. Существуют свободно радикальные биохимические реакции, подобные цепным неразветвленным ради кальным реакциям (Toraya, 2003). Но магнитные и спиновые эффекты в таких ре акциях невозможны из-за отсутствия радикальных пар.
Открытие магнитного изотопного эффекта в реакциях ферментативного фосфорилирования для магнитного изотопа магния 25Mg2+ (Бучаченко и др., 2004), а также для 67Zn2+ (Бучаченко и др., 2010) и 43Ca2+ (Бучаченко и др., 2011), показа ло, что скорость ферментативных реакций зависит от наличия ядерного магнитного момента у иона металла, находящегося в активном сайте фосфорилирующего эн зима. До последнего времени все обнаруженные магнитно-изотопные эффекты ферментативного фосфорилирования наблюдались in vitro – на выделенных мито хондриях и чистых ферментах, обогащенных изотопами. Однако открытым оста ётся вопрос, лежащий в основе новой фундаментальной научной проблемы, – влияют ли магнитные моменты атомных ядер на внутриклеточные процессы in vivo, на функционирование целого организма?
Основная цель работы: Установить влияние магнитного Mg и немагнит 24 ных Mg изотопов магния на жизнедеятельность целого организма на при Mg, мере прокариотических бактериальных клеток Escherichia coli и теоретически обосновать возможность проявления магнитно-изотопных эффектов в живых орга низмах.
Задачи:
получить магнитно-полевые зависимости констант скоростей фермен тативных ион-радикальных реакций для g-механизма и механизма сверхтонкого взаимодействия ядерного спина и спина электрона, индуцирующих синглет триплетную конверсию;
оценить возможность использования магнитнополевых зависимостей этих констант для изучения механизма ферментативных реакций, для оценки кон стант скоростей элементарных актов ферментативных реакций и для определения химических и магнитных характеристик интермедиатов;
получить экспериментальные зависимости роста бактериальных кле ток E.coli в присутствии магнитного 25Mg и немагнитных 24Mg, 26Mg изотопов маг ния в питательной среде;
экспериментально оценить влияние магнитного изотопа магния Mg на основные показатели роста и развития бактерий по сравнению с немагнитными 24 изотопами Mg: константу скорости роста, колониеобразующую способ Mg, ность, константу скорости отмирания бактериальной культуры;
исследовать влияние внутриклеточного обогащения изотопами магния на жизнеспособность клеточной культуры и её биохимический состав.
Положения, выносимые на защиту:
Спинзависимые ион-радикальные ферментативные реакции могут 1.
быть «первичным магниторецептором» в живых организмах, не требующим суще ствования специального органа. Продукты этих реакций «превращают» эффекты ядерного спина и магнитного поля в «биохимический отклик» живых организмов.
Внешнее постоянное магнитное поле увеличивает величину эффекта 2.
магнитных изотопов химических элементов за счёт сверхтонкого взаимодействия в слабых полях. Такие эффекты могут проявляться только в ферментативных реак циях, идущих с переносом одного или нескольких электронов, то есть с образова нием ион-радикальных пар.
Константа скорости роста и колониеобразующая способность бакте 3.
рий E.coli увеличиваются в присутствии магнитного изотопа магния 25Mg по срав нению с немагнитными изотопами.
Клетки E.coli, обогащенные магнитным изотопом магния Mg, при 4.
пересеве на новую питательную среду оказываются более жизнеспособными по сравнению с бактериями, обогащенными немагнитными изотопами 24,26Mg.
От типа изотопа магния – магнитный/немагнитный – зависит внутри 5.
клеточный элементный состав микроорганизмов E. coli.
В теоретической части работы рассмотрены Научная новизна работы.
два механизма синглет-триплетной конверсии ион-радикальных пар, образующих ся в активном сайте ферментов во время реакции: g-механизм, обусловленный разностью g-факторов ион-радикалов, и СТВ-механизм, обусловленный сверхтон кими взаимодействиями неспаренных электронных спинов с ядерными спинами.
Показано, что спинзависимые ион-радикальные ферментативные реакции в раз личных участках тел могут быть “первичным магниторецептором“ в живых орга низмах, не требующим создания специального органа. Продукты этих реакций “превращают” эффекты ядерного спина и магнитного поля в “биохимический от клик“ живых организмов. Получены зависимости скоростей ферментативных ре акций от величины констант сверхтонких взаимодействий, от напряженности маг нитного поля и от констант скоростей элементарных актов ферментативных реак ций.
В ходе решения поставленной научной проблемы были получены экспери ментальные результаты, доказывающие магнитно-изотопные эффекты магния 25Mg in vivo в клетках E.coli: на константы скоростей роста и отмирания, на колониеоб разующую способность и внутриклеточный элементный состав бактериальных клеток. Впервые экспериментально надежно и однозначно доказано, что магнит ный изотоп Mg, находясь в составе живых клеток, влияет на их рост, развитие и жизнедеятельность, а его биологические эффекты отличаются от эффектов немаг нитных изотопов 24,26Mg.
Научно-практическая значимость.
Полученные экспериментальные данные и проведенные теоретические рас чёты влияния магнитных полей на живые организмы открывает широкие горизон ты для исследования действия многих жизненно важных элементов, имеющих при родные стабильные магнитные изотопы, на внутриклеточные процессы. Подобные исследования станут фундаментом для новых научных направлений в рамках био физики, физико-химической молекулярной и клеточной биологии – спиновой био химии и спиновой микробиологии.
В ходе выполнения работ разработана методика приготовления питательных сред и культивирования микроорганизмов в присутствии изотопов магния, позво ляющая выращивать бактерии с высоким внутриклеточным содержанием изотопов и имеющая большую практическую значимость для дальнейших исследований магнитно-изотопных эффектов. Получены патенты на способ повышения жизне способности клеток E.coli и способ изотопного обогащения.
Личный вклад соискателя. Автор участвовал в постановке задач, в получе нии всех теоретических результатов, самостоятельно проводил все эксперименты и обрабатывал результаты, участвовал в апробации работы.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на следующих международных и российских конференциях: The 12th IInternational symposium on spin and magnetic field effects in chemistry and related phenomena (Нидерланды, Нор двик, 10-15 мая 2011);
2, 3, 4th International conference on Magneto-science (Япония, Хиросима), 2009 (Нидерланды, Наймеген), 2011 (Китай, Шанхай&Сиань);
IV, V Российско-Японский семинар «Магнитные явления в физикохимии молеку лярных систем» (Оренбург, 2009-2010 гг.);
15-я, 16-ая, 18-ая Международная кон ференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (г. Москва, 2008 2012 гг.);
20, 21, 22, 23-й Международный симпозиум «Современная химическая физика» (г. Туапсе, 2008-2011 гг.). Работа выполнена в соответствии с грантами РФФИ № 09-03-09432, 10-03-01203, 10-04-96083, 11-03-09581 и в рамках федераль ной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы, ГК № 02.740.11.0703, П207, 14.740.11.1193.
Публикации. Основные результаты работы опубликованы в 3 статьях и тезисах докладов международных и всероссийских конференций.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх глав, включая литературный обзор, оригинальные теоретические и эксперимен тальные результаты, выводов, списка цитируемой литературы. В конце каждой главы приведены основные результаты и выводы. Работа изложена на 106 страни цах и содержит 46 рисунков.
Содержание работы Во Введении обоснована актуальность работы, приведена структура диссер тации, поставлена цель исследования и сформулированы основные задачи.
В Главе 1 дан обзор биологических функций магния, участвующего более чем в 300 ферментативных процессах. Представлены литературные данные о роли магния для жизнедеятельности всех живых организмов и функциональной значи мости ионов магния для прокариотических микроорганизмов – бактерий. Описаны магнитно-изотопные эффекты в Mg-, Ca- и Zn-зависимых ферментативных реакци ях. Приведены литературные данные, обосновывающие ион-радикальный меха низм ферментативного фосфорилирования с участием ядерных спинов магнитных изотопов. Описаны уже существующие применения магнитно-изотопных эффектов магния в медицинской практике, например, для лечения гипоксии миокарда.
В Главе 2 представлены результаты квантово-механических теоретических расчётов. Рассмотрены g- и СТВ-механизмы спиновой конверсии ион радикальной пары (ИРП), образующейся в активном сайте ферментов.
Для анализа влияния магнитного поля на ферментативные реакции исполь зовалась идеализированная кинетическая схема такой реакции.
Здесь A и В – исходные диамаг k1 ST [A+, B-]T A;
B [A+, B-]S нитные частицы, которые в результате k- k k переноса электрона превращаются в синглетную ион-радикальную пару products products [A• +, B• -]S с константой скорости k1. Для синглетной ион-радикальной пары [A• +, B• -]S возможны три канала эволю ции:
обратный перенос электрона на акцептор с константой скорости k-1;
1) дальнейший перенос электрона или трансформация субстратов, при 2) водящие к образованию продуктов с константой скорости k;
спиновая эволюция, переводящая синглетную ИРП в триплетное со 3) стояние [A•+, B•-]T с частотой ST, определяемой магнитными взаимодействиями неспаренных электронных спинов.
Аналогично системе кинетических уравнений, используемых в обычной хи мической кинетике, была построена система уравнений для спиновых матриц плотности, характеризующих частицы на разных стадиях реакции.
d AB dt = k1 + k 1Tr ( PS PS ) AB I (1) I d [ ] [ ] k = ih 1 H, I 1 PS I + I PS k I + k1 AB (2) dt d P = k I (3) dt Здесь AВ – спиновая матрица плотности для исходных реагентов A и В в синглет ном состоянии, а уравнение (1) описывает, соответственно, превращение исходных частиц, находящихся в активном сайте фермента;
I – матрица плотности для ион радикальных пар в синглетном и триплетном состоянии, а уравнение (2) описывает превращение ион-радикальных пар;
P – матрица плотности для продуктов реак ции, и уравнение (3) описывает образование продуктов реакции;
PS- оператор про ектирования в синглетное состояние, H – спиновый гамильтониан ион-радикальной пары.
Для расчёта магнитнополевых зависимостей констант скоростей фермента тивных реакций впервые использовано квазистационарное приближение, что по зволило считать скорость образования продуктов ферментативной реакции при ближенно равной скорости расходования исходных реагентов. Поэтому вместо расчёта суммарной константы k P скорости образования продуктов рассчитывалась константа скорости исчезновения исходных частиц А или В. Таким образом, для расчёта констант скорости образования продуктов нам достаточно одного матрич ного элемента SS = PS I PS.
I Показано, что для квазистационарного приближения (при t (k1)-1) количест во синглетных ион-радикальных пар описывается выражением k pt SS (t ) = ( ст ) SS е I I, (4) I где ( ст ) SS - амплитуда количества ион-радикальных пар в синглетном состоянии находилась как решение системы алгебраических уравнений, получаемых из урав нения (2), [ ] { } k ih 1 H, ст PS ст + ст PS k ст + k1 S S = 0.
I I I I (5) При подстановке решения (4) в уравнение (1) получается kp k 1 I ( ст ) SS = 1 (6) k1 k Уравнение (6) устанавливает связь константы скорости kр ферментативной реакции с константами элементарных процессов переноса электрона или разделе ния зарядов и с относительной «концентрацией» ион-радикальных состояний I ( cm ) SS. Даже малые изменения количества синглетных ИРП способны оказать сильное влияние на константу kp и на скорость образования продуктов. Можно считать, что отношение констант k 1 / k играет роль «биохимического усилителя», способного существенно увеличить эффект даже малых изменений количества ИРП, вызываемых действием магнитного поля.
Использование квазистационарного приближения позволило получить вы ражение для магнитнополевой зависимости константы скорости магниточувстви тельного ферментативного процесса для g-механизма спиновой конверсии ИРП k p ( ) k 1 / k ( 2 + k 1 / k + ( / k ) 2 ) = 1 (7) ( 2 + k 1 / k )(1 + k 1 / k + ( / k ) 2 ) k На рис.1 показана магнитнополевая зависимость константы скорости магни точувствительного ферментативного процесса. Каждая из кривых на графике соот ветствует разным значениям отношения констант k 1 / k. Верхняя кривая соответ ствует наименьшему значению отношения, нижняя – наибольшему. Здесь снова проявляется действие отношения констант скоростей обратной реакции и образо вания продуктов как «биохимического усилителя».
Рис. 1 Магнитнополевая зависимость k p ( ). Кривая 1 соответствует зна k чению отношения k-1/k = 0.1, кривая 2 - k-1/k = 0.5, кривая 3 - k-1/k = k p ( ) Эта зависимость имеет монотонный характер и возрастает при уве k личении напряженности магнитного поля. При стремлении магнитного поля к бес k p ( ) конечности отношение достигает предельного значения k k p ( ) = (8) 2 + k 1 / k k При определенных значениях констант k 1 / k данная зависимость выходит на насыщение, и дальнейшее увеличение поля не будет влиять на скорость образо вания продуктов.
Экспериментальные магнитнополевые зависимости удобнее относить к зна чениям величин, наблюдаемым в нулевом магнитном поле. В данном случае это k P (0) k = эквивалентно нормированию функции (7) на величину. При такой k + k k нормировке магнитнополевая зависимость принимает вид:
k p ( ) k 1 ( ) 2 / k = 1+ (9) (2 + k 1 / k )(1 + k 1 / k + ( / k ) 2 ) k P ( 0) Замечательная особенность этого выражения в том, что оно не зависит от константы скорости прямого переноса электрона k1. Несколько графиков магнит нополевых зависимостей, нормированных таким образом, представлены на рисун ке 2. Относительные изменения увеличиваются с ростом отношения констант k 1 / k. Снова наблюдается эффективность влияния магнитного поля на организмы с большими значениями отношения k 1 / k. В клетках константа скорости k опреде ляется не только свойствами фермента, но и зависит от многих других факторов, в том числе, от скорости сопряженных реакций, температуры и т.д. Неблагоприят ные внешние условия способны уменьшать константу скорости k и увеличивать отношение k 1 / k. Но в таком случае, согласно уравнению (6), будет возрастать эффективность влияния спин-зависимых стадий на протекание ферментативных реакций. Следовательно, влияния внешнего магнитного поля и ядерного спина должны ярче проявляться в живых организмах, находящихся в неоптимальных внешних условиях. Если же изменение условий интенсифицируют ферментатив ные процессы, то соответствующее увеличение константы скорости k будет прояв ляться как ослабление эффектов внешнего магнитного поля.
Рис. 2 Магнитнополевая зависи мость, нормированная на значение в нулевом магнитном поле. Кривая соответствует значению отношения k-1/k = 0.1, кривая 2 - k-1/k = 0.5, кри вая 3 - k-1/k = 1.
При анализе характерных точек, например, точки перегиба, получено, что уменьшение константы скорости k сдвигает магнитнополевую зависимость в сто рону слабых магнитных полей. Очевидно, что в магнитных полях H H1/2 скоро сти магниточувствительных ион-радикальных ферментативных процессов будут слабо зависеть от изменений сильного магнитного поля.
Для механизма сверхтонкого взаимодействия ядерного спина с электронным спином гамильтониан имеет вид:
H = g1 S 1 + g 2 S z2 + a S2 I = 1S 1 + 2 S z2 + a S2 I, (10) z z где a - константа сверхтонкого взаимодействия соответствующего ядерного спина.
Для СТВ-механизма спиновой конверсии ИРП решение системы (1)-(3) с применением квазистационарного приближения принимает вид k p ( ) k 2 + a / 2 + kk 1 k1k 1 a 2 a = 1+ 1 1 2 + +4, (11) 4(k + a + )(a + ) k + ( a / 2) + k ( + a ) 8k a + 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 k1 2 k Для построения магнитно-полевой зависимости констант скоростей фермен тативного процесса были введены следующие обозначения k k k µ= ;
µ1 = 1 ;
µ1 = 1 ;
=. (12) a a a a Тогда µ1 µ 1 1 µµ 1 µ 2 + 2 + 1/ 2 kp = 1+ 1 1 2 + + 4(µ + + 1)( + 1) µ + ( / 2) + µ ( + 1). (13) 8µ + 1 2 µ 2 2 2 2 2 2 2 k График получаемой магнитно-полевой зависимости представлен на рисун ке 3.
Рис. 3 Магнитнополевая зависимость k p ( ). Кривая соответствует следующим зна k чениям µ = 0.1, µ 1µ -1 = 0. k p ( ) Магнитнополевая зависимость, как видно из рисунка 3, быстро воз k растает при 1, то есть для малых значений величины или слабых магнитных полей. Далее следует максимальное значение и медленный спад до определенного значения. То есть, при данная зависимость выходит на насыщение и выра жение (13) принимает вид:
k p ( ) k1k 1 8k 2 + a = 1 (14) 2k 2 4k 2 + a k Очевидно, что характер магнитнополевой зависимости константы скорости ферментативной реакции будет зависеть от соотношения констант прямого и об ратного переноса электрона k1 и k-1 и участвующего в процессе ядерного спина, то есть константы сверхтонкого взаимодействия. Для описания характера магнитно полевой зависимости преобразуем выражение (13) следующим образом:
1 + 8µ 2 2 µ 2 (1 2 µ 2 ) kp 2k 2 1 1 1 = (15) k kk 1 1 8 µ + + 1 1 + 4 µ 1 + 4µ µ + + 3µ 2 /(1 + 4 µ 2 ) 2 2 2 2 2 В полученном выражении первое и третье слагаемые представляют собой кривые Лоренца – обычную и «перевёрнутую» (рисунок 4 а) и б) соответственно).
Второе слагаемое представляет некую поправку, так как не зависит от магнитного поля.
Рис. 4 Кривые Лоренца, описывающие слагаемые магнитнополевой зависимости констант скорости ферментативной реакции (15). Кривая 1 соответствует значению µ=0.1;
кривая 2 - µ=0.5;
кривая 3 - µ= Максимальное значение кривых определяется соотношением константы сверхтонкого взаимодействия ядра и константы скорости самой реакции k/a. При k a и k a магнитно-полевая зависимость принимает вид прямой. Для таких ус ловий наблюдение магнитно-полевых эффектов в ферментативных реакциях ста новится невозможным. Для значений k a магнитно-полевые эффекты в фермента тивных реакциях могут быть обнаружены в слабых магнитных полях, где магнит нополевая зависимость принимает вид, приведенный на рисунке 3.
Суммарное действие внешнего магнитного поля на конкретный живой орга низм будет зависеть: от внутриклеточного природного магнитно-изотопного со держания химических элементов;
от степени участия таких изотопов в физико химических стадиях ферментативных процессов;
от условий протекания фермента тивной реакции, прямым или косвенным образом влияющих на её константу ско рости.
В Главе 3 описаны полученные магнитно-изотопные эффекты магния in vivo в клетках E.coli, свидетельствующие о влиянии ядерного спина магнитного изотопа 25Mg на внутриклеточные ферментативные процессы.
Материалы и методы В качестве объекта исследований использовалась культура клеток Escherichia coli – музейный штамм K12TG1. Бактерии E.coli выращивались в ми нимальных синтетических питательных средах M9, содержащих на 1л дистиллиро 24,25, ванной воды: NH4Cl – 2 г, MgSO4 – 260 мг, глюкоза – 10 г, Na2HPO4 – 12 г, KH2PO4 – 6 г, NaCl – 1 г. Питательные среды различались только изотопной фор мой содержащегося в сульфате магния – немагнитные 24Mg, 26Mg, магнитный 25Mg и природный изотоп *Mg магния. При приготовлении синтетической питательной среды М9 строго контролировался pH = 6.85 ± 0.15. Для приготовления сульфатов магния использовались изотопно-чистые оксиды 24MgO, 25MgO и 26MgO производ ства ФГУП «Электрохимприбор» с рекордно высоким изотопным обогащением 99.8, 98.8 и 97.7 атомных процентов, соответственно.
Музейный штамм Escherichia coli предварительно инкубировался в Lb бульоне (Sigma Aldrich Co.) в течение 16 часов при температуре 37 °С. После клет 24 Mg, 26Mg, соответственно. В качестве ки E.coli пересевались в среды М9 с Mg, контроля использовалась питательная среда с природным содержанием изотопов * Mg, то есть смесь изотопов в их природном соотношении. В одной из эксперимен тальных серий раствор с подобным соотношением изотопов был приготовлен ис кусственно из сульфатов изотопов магния для дополнительного контроля чистоты эксперимента.
При культивировании бактериальных клеток поддерживалась постоянная аэрация путём помещения сред с культурой бактерий на шейкер ST-3 ELMI. Ско рость вращения платформы – 200 об/мин. Ростовые кривые (зависимости оптиче ской плотности суспензий, характеризующей рост бактериальной культуры, от времени культивирования) получались турбидиметрическим методом с помощью измерения оптической плотности суспензий каждый час на спектрофлуориметре «SOLAR 2203» на следующих длинах волн: 450, 492, 540 и 620 нм. Все исходные среды M9 исследовались масс-спектральными (Х-7, Thermo Elemental, США) и атомно-эмиссионными (ICAP-61, Thermo Jarrеll Ash, США) методами анализа на содержание следующих элементов: Li, Be, B, Na, Mg, Al, Si, P, S, K, Ca, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Ge, As, Se, Br, Rb, Sr, Y, Zr, Mo, Nb, Ru, Rh, Ag, Cd, In, Sn, Sb, Te, Cs, Ba, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Hg, Tl, Pb, Bi, Th и U (ИПТМ РАН). Результаты исследований приведены на рисунке 5(а, б). Достоверных различий в содержании основных и примесных элементов в питательной среде не обнаружено. Это означает, что про явление обнаруженных биологических эффектов изотопов магния не связано с влиянием примесных элементов на жизнедеятельность бактерий. Наблюдаемые различия связаны, в первую очередь, с изменением хода метаболических процессов в бактериальных клетках в зависимости от типа – магнитный/немагнитный – изо топа магния.
Рис. 5 Относительное содержание элементов питательных сред М9;
C(mMg) – кон центрация элементов в средах М9, где m – обозначает атомную массу изотопа (24,25 или 26), добавляемого в соответствующую питательную среду. C(24Mg) – концентрация эле ментов в питательной среде М9, содержащей изотоп магния 24Mg.
Для исследования влияния изотопов магния на стационарную фазу роста и на фазу отмирания бактериальной культуры применялся метод измерения коло ниеобразующих единиц (КОЕ) с применением серийных разведений. Подсчёт КОЕ производился после 16 часов инкубации бактерий на Lb-агаре при 37 С.
После 20 часов культивирования в магний-изотопных средах М9 клетки E.coli были пересеяны (в эквивалентных количествах) на аналогичную среду М9, но совершенно не содержащую искусственно добавляемого магния, т.е. концентра ция ионов магния Mg2+ составляла 0 моль/л (состав среды NH4Cl – 2 г. глюкоза – 10 г, Na2HPO4 – 12 г, KH2PO4 – 6 г, NaCl – 1 г). Колониеобразующая способность измерялась через 24, 48, 72 часа после начала культивирования. Данный экспери мент уникален, так как на его результаты не могли повлиять различия в содержа ния примесных элементов в М9 – так как среда, в которой росла культура, одина кова для всех клеток. Этот простой эксперимент позволил определить, какой из изотопов магния наиболее эффективен для роста бактерий уже в качестве внутри клеточного элемента.
Все экспериментальные данные статистически обрабатывались с помощью прикладного программного пакета Origin 8.0 с применением критерия Стьюдента.
В результате проведения 10 независимых экспериментальных серий, 4 из ко торых были «double blind» (в каждой серии было минимум 2 повтора для каждого изотопа), были получены ростовые кривые для клеток E.coli (рисунок 6), отра жающие различное влияние изотопов магния (магнитных и немагнитных) на рост микроорганизмов. Адаптационная фаза роста бактерий E.coli на средах с немаг 24, нитными изотопами магния Mg длилась не менее часа, как видно на экспери ментальных ростовых кривых. Оптическая плотность культуры клеток E.coli, рас тущих на среде с магнитным изотопом магния 25Mg, уже на первом часу увеличи лась вдвое, что свидетельствует об увеличении количества бактериальных клеток – микроорганизмы при пересеве на среду с 25Mg не нуждаются в длительной адапта ции к новым условиям. Это означает, что магнитный изотоп магния оказывается более эффективным на начальном этапе роста бактериальной культуры по сравне нию с немагнитными изотопами.
Рис. 6 Ростовые кривые клеток E.
сoli, выращенных на питательных средах М9 с изотопами магния. 24Mg, 25 Mg и Mg – пит. среда М9 с соот ветствующим изотопом магния;
*Mg – с природным магнием;
**Mg – с магнием, полученным из смеси изо топов в их природном соотношении.
Регистрация оптической плотности производилась на длине волны 492 нм.
С помощью линейной и экспоненциальной аппроксимации ростовых кривых были определены характерные параметры – продолжительность адаптационной фазы (рисунок 7) и константа скорости роста бактериальной культуры (рисунок 8).
Рис. 7 Относительные значения продол жительности адаптационной фазы роста как функция изотопии магния. ti – про должительность адаптационной фазы для клеток, выращенных на среде с i-м изо топом (24Mg, 25 Mg, Mg, *Mg);
t*Mg – продолжительность адаптационной фазы для клеток, выращенных на среде с при родным магнием *Mg.
Рис. 8 Относительные значения констант ско рости роста для клеток как функция изотопии магния. µ i – константа скорости роста для кле ток, выращенных на среде с i-м изотопом (24Mg, 25 Mg, *Mg или **Mg);
µ*Mg – Mg, константа скорости роста для клеток, выра щенных на среде с природным магнием *Mg.
Константы найдены с помощью экспоненци альной (1) и линейной (2) аппроксимации.
Как видно из графика (рис. 8), независимо от способа аппроксимации кон станта скорости роста для бактерий, растущих на средах с Mg, оказывается дос товерно выше на 10-15 % по сравнению с клетками, потребляющих в качестве пи тательного субстрата немагнитные изотопы магния. Качественно полученные экс периментальные зависимости совпадают с данными по влиянию магнитного изо топа магния на скорость ферментативного фосфорилирования (Бучаченко, 2004).
Бактериальная культура при пересеве в среду М9 попадает в совершенно новые для неё условия, что является своеобразным стрессовым фактором. Во время короткой адаптации и начала экспоненциальной фазы функциональные системы перестраи ваются для инициации активного деления. Именно на этом этапе скорость синтеза АТФ играет решающую роль – запуск большинства процессов, связанных с ростом и делением клетки, требует расхода энергии. То есть, полученный магнитно изотопный эффект изотопа магния определяется, в том числе, и скоростью накоп ления бактериями достаточного количества макроэргических молекул АТФ, необ ходимого для активной жизни.
Другим важным микробиологическим показателем, характеризующим рост бактериальной культуры, является колониеобразующая способность (КОЕ). При подсчёте КОЕ на стационарной фазе роста и фазе отмирания бактерий были полу чены результаты, представленные на рисунке 9. Данные экспериментальные зави симости подтверждают полученную кинетику роста микроорганизмов – на среде с магнитным изотопом Mg колониеобразующая способность клеток E.coli выше в 1,5-2 раза в различных экспериментальных сериях по сравнению с немагнитными 24, изотопами Mg вплоть до третьего дня культивирования (рисунок 9). Присутст вие Mg в питательной среде в виде трофического субстрата увеличивает жизне способность клеточной культуры. Её определяет накопленный клетками магний за цикл роста до стационарной фазы – после пересева таких клеток на новую пита тельную среду именно содержащийся в них магний становится основным источни ком двухвалентных ионов, необходимых для активации жизнеобеспечивающей деятельности многих ферментов.
Рис. 9 КОЕ клеток E.coli на начальной фазе Рис. 10 Относительные значения констант отмирания, выращенных на питательных скоростей отмирания клеток E.coli, как 24 средах М9 с изотопами магния Mg, функция изотопии магния. ki – константа Mg, скорости отмирания для клеток, выращен Mg.
ных на среде с i-м изотопом (24Mg, 25Mg или Mg);
k24Mg – константа скорости отмирания для клеток, выращенных на среде с изотопом магния 24Mg.
Константа скорости отмирания бактериальной культуры, культивируемой на питательной среде с магнитным изотопом магния 25Mg, оказывается выше по срав 24, нению с немагнитными изотопами Mg (рисунок 10). Это означает, что измене ние хода метаболических процессов на стадии роста влечёт за собой неизбежные изменения и на стадии отмирания культуры. Константа скорости определялась как показатель убывающей экспоненциальной функции при аппроксимации кривых отмирания.
Необходимо отметить, что практически во всех экспериментах не наблюда 24 лось достоверных различий между немагнитными изотопами магния Mg и Mg.
Это говорит именно о магнитной природе обнаруженных эффектов изотопа Mg, не связанных с различием атомных масс изотопов.
После 20 часов культивирования на магний-изотопных средах бактерии бы ли обогащены по соответствующему изотопу магния до 99,5 % по сравнению с ис ходной бактериальной культурой, выращенной на питательном бульоне Lb, как видно из данных таблицы 1.
Таблица 1 – Соотношение изотопов магния (%) в клетках E.coli после цикла куль тивирования на изотопных средах М9* Изотоп исходная Клетки, выра- Клетки, выра- Клетки, выра культура щенные на среде щенные на среде щенные на среде М9 с 24Mg М9 с 25Mg М9 с 26Mg Mg 87,8 99,5 6,6 10, Mg 5,9 0,23 92,5 1, Mg 6,3 0,23 0,87 88, * Погрешность определения от 1.2 % отн. для 95 % до 15 % для 0.5% Цикл культивирования бактерий на питательных средах, содержащих изото пы магния в качестве питательного субстрата, приводит к практически полному замещению внутриклеточного магния на конкретный изотоп. Поэтому пересев та ких изотопно-обогащенных клеток на питательную среду с нулевой концентрацией ионов магния покажет, насколько каждый из изотопов эффективен в качестве внутриклеточного элемента.
Измерение колониеобразующей способности при проведении такого экспе римента показало, что бактерии, обогащенные магнитным изотопом магния Mg, формировали большее количество жизнеспособных колоний по сравнению с не 24, магнитными изотопами магния Mg в течение трёх дней (рисунок 11). С вероят ностью, соответствующей степени обогащения бактерий изотопом магния (таблица 1), внутриклеточные системы, в том числе ферментативные, будут использовать именно конкретный изотоп. То есть все процессы, идущие в клетках, обогащенных по магнитному изотопу магния Mg, с вероятностью 92,5 % будут использовать именно его в качестве активного элемента. Увеличение колониеобразующей спо собности бактерий, содержащих Mg, свидетельствует о более эффективной работе ферментативных систем, использующих магний.
Рис. 11 КОЕ клеток E.coli, обога 24 щенных изотопами магния Mg, Mg, Mg природным магнием *Mg, которые культивировались на питательной среде М9 с концентрацией ионов магния ммоль/л После цикла культивирования на питательных средах М9 с магнитным 25Mg 24, и немагнитными Mg изотопами магния, клетки E.coli многократно исследова лись с помощью масс-спектральных методов. Впервые была обнаружена зависи мость между содержащимся в среде изотопом магния и внутриклеточным элемент ным составом зрелых микроорганизмов. На рисунках 12-14 приведены полученные экспериментальные данные.
Рис. 12 Относительное содержание мак роэлементов Na, K, Mg, Ca в клетках E.coli, после цикла культивирования на средах М9 с изотопами магния.
Рис. Относительное содержание роэлементов B, P, S в клетках E.coli, по сле цикла культивирования на средах М с изотопами магния.
Рис. 14 Относительное содержание мак роэлементов Mn, Zn в клетках E.coli, по сле цикла культивирования на средах М с изотопами магния.
На рисунках 12-14 использовались следующие обозначения: Сi – содержание элемента в клетках, выращенных на среде с i-м изотопом (24Mg, 25Mg, 26Mg);
С*Mg – содержание элемента в исходной клеточной культуре, выращенной на питательной среде с природным соотношением изотопов магния.
Полученные зависимости элементного состава от присутствия изотопов маг ния в питательной среде представляют особый интерес. Отсутствие описаний по добных эффектов в литературе не позволяет сделать достоверные выводы о меха низме подобного влияния. Очевидно, что роль магнитных изотопов в клетках не сводится к ускорению отдельных ферментативных процессов. Магнитно изотопное обогащение клеток и изменение биологических процессов включает процессы внутриклеточной регуляции, что приводит к удалению одних химиче ских элементов и накоплению других.
Основные результаты и выводы:
Показано, что спинзависимые ион-радикальные ферментативные ре 1.
акции могут быть “первичным магниторецептором“ в живых организмах без соз дания специального органа. Продукты этих реакций “превращают” эффекты ядер ного спина и магнитного поля в “биохимический отклик“ живых организмов.
Получены зависимости скоростей ферментативных реакций от вели 2.
чины констант сверхтонких взаимодействий, от напряженности магнитного поля и от констант скоростей элементарных актов ферментативных реакций для двух ме ханизмов спиновой конверсии: g-механизма, обусловленного разностью g факторов ион-радикалов, и СТВ-механизма, обусловленного сверхтонкими взаи модействиями неспаренных электронных спинов с ядерными спинами.
Внешнее постоянное магнитное поле должно увеличивать величину 3.
эффекта магнитных изотопов химических элементов за счёт сверхтонкого взаимо действия в области слабых полей.
Получены надежные экспериментальные данные, доказывающие 4.
влияние магнитных моментов ядер изотопов магния на биологические процессы в клетках Escherichia coli. Константа скорости роста и колониеобразующая способ ность бактерий выше в присутствии магнитного изотопа магния Mg по сравне нию с немагнитными изотопами.
Получены экспериментальные данные о влиянии внутриклеточного 5.
обогащения изотопами магния на жизнеспособность клеточной культуры и её био химический состав. Бактерии, обогащенные магнитным изотопом магния 25Mg, при пересеве на новую питательную среду оказываются более жизнеспособными по сравнению с бактериями, обогащенными немагнитными изотопами 24,26Mg.
Однозначно доказано магнитное происхождение обнаруженных маг 6.
нитно-изотопных эффектов: все они обусловлены различиями магнитных свойств ядер изотопов магния, а не различиями их масс.
Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:
Шевченко У.Г., Бердинский В.Л. Ферментативные процессы как ме 1.
ханизм биологической магниторецепции // Хим. физика. — 2011. — Т. 30, № 6. — С. 78–83.
Кольтовер В.К., Шевченко У.Г., Авдеева Л.В., Ройба Е.А., Бердин 2.
ский В.Л., Кудряшова Е.А. Магнитно-изотопный эффект магния в живой клетке // Доклады Академии наук. — 2012. — Т. 442, № 2. — С. 272–274.
Шевченко У.Г., Авдеева Е.И., Бердинский В.Л. Биологические эф 3.
фекты магнитного изотопа магния 25Mg в клетках E.coli // Хим. физика. — 2012. — Т. 31, № 7. — С. 1-8.
4. Shevchenko U.G., Berdinskiy V.L. Enzymatic phosphorylation as example of magnetosensitive spindependent process // ICMS2007, Hiroshima, Japan, 11–15 Nov.
2007. — P. 133.
5. Shevchenko U.G., Berdinskiy V.L. Enzymatic phosphorylation as example of magnetosensitive spindependent process // 15-я Междунар. конф. студентов, аспи рантов и молодых ученых "Ломоносов-2008", Москва, 8–11 апр. 2008 г. — С. 704.
6. Shevchenko U.G., Koltover V.K., Deryabin D.G., Berdinsky V.L.
Magnesium isotope effect on enzymatic phosphorylation and growth of E. coli cells // IV Российско-Японский семинар "Магнитные явления в физикохимии молекуляр ных систем", г. Оренбург, 2009 г. — С. 21.
Кольтовер В.К., Дерябин Д.Г., Бердинский В.Л.
7. Шевченко У.Г., Влияние изотопов магния на рост и развитие клеток E. coli // 21-й Междунар. сим позиум "Современная химическая физика", г. Туапсе, 2009 г. — С. 167.
8. Shevchenko U.G., Koltover V.K., Deryabin D.G., Berdinsky V.L.
Magnesium isotope effect on enzymatic phosphorylation and growth of E. coli cells // 3d International Conference on Magneto science, Netherlands, Nijmegen, 2009. — P. 123.
9. Shevchenko U.G., Royba E.A., Tarasova N.V. The Mg2+ and Zn2+ concentration effects on E. coli growth // V Российско-Японский семинар "Магнитные явления в физикохимии молекулярных систем", г. Оренбург, 2010 г. — С. 79.
10. Royba E.A., Shevchenko U.G., Koltover V.K., Berdinskiy V.L. Magnetic magnesium isotope effect on antibiotic resistance // V Российско-Японский семинар "Магнитные явления в физикохимии молекулярных систем", г. Оренбург, 2010 г. — С. 76.
Шевченко У.Г., Ройба Е.А., Иванова М.А. Влияние концентраций ио 11.
нов металлов Mg2+ и Zn2+ на фазы роста E. coli // 22-й Междунар. симпозиум "Со временная химическая физика", г. Туапсе, 2010 г. — С. 284.
Ройба Е.А., Шевченко У.Г., Кольтовер В.К., Бердинский В.Л. Маг 12.
нитные изотопные эффекты магния in vivo // 22-й Междунар. симпозиум "Совре менная химическая физика", г. Туапсе, 2010 г. — С. 247–248.
Ройба Е.А., Шевченко У.Г. Escherichia coli — тест-организм для ис 13.
следования магнитно-изотопных эффектов в биологии // Материалы Междунар.
науч. форума "Ломоносов-2011", г. Москва, 2011 г.
Авдеева Е.И., Шевченко У.Г., Ройба Е.А. Влияние магнитного и не 14.
магнитных изотопов на жизнедеятельность клеток Escherichia coli // Материалы Междунар. науч. форума "Ломоносов-2011", г. Москва, 2011 г.
15. Shevchenko U.G. Spin-depended enzymatic processes as the origin of biological magnetoreception // The 12th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena "Spin Chemistry Meeting 2011", Noordwijk, Netherlands, 2011. — P. 110.
16. Royba E.A., Shevchenko U.G., Brudastov Yu.A. Escherichia coli — test organism for studying of biological magnetic isotope effects // The 12th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena "Spin Chemistry Meeting 2011", Noordwijk, Netherlands, 2011. — P. 108.
Авдеева Е.И., Шевченко У.Г., Карандашев В.К. Влияние изотопов 17.
магния и постоянного магнитного поля на элементный состав бактерий E. coli // 23 й Междунар. симпозиум "Современная химическая физика", г. Туапсе, 2011 г.
Шевченко У.Г. Биологические магнитно-полевые и магнитно 18.
изотопные эффекты магния // Сб. тезисов XXIII симпозиума "Современная хими ческая физика". — 2011. — С. 143.
19. Shevchenko U., Berdinskiy V., Avdeeva E. Biological magnesium magnetic isotope and magnetic field effects on E. coli cells // Proc. of The 4th International conference on Magneto-science. — 2011. — P. 50.