попова надежда викторовна взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером trip8b
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук на правах рукописи Попова Надежда Викторовна Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером TRIP8b специальность – 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена в лаборатории клеточной биологии рецепторов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН) Научный руководитель доктор химических наук, руководитель лаборатории клеточной биологии рецепторов ИБХ РАН Петренко Александр Георгиевич кандидат физ.мат. наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточной биологии рецепторов ИБХ РАН Деев Игорь Евгеньевич Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории клеточных взаимодействий ИБХ РАН Сапожников Александр Михайлович доктор биологических наук, руководитель лаборатории молекулярной онкогенетики ИБГ РАН Коробко Игорь Викторович Ведущая организация: Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова Защита состоится «14» марта 2012 года в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: г. Москва, ул. МиклухоМаклая, 16/10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Автореферат разослан « » февраля 2012 г. Учёный секретарь Диссертационного совета, доктор физикоматематических наук В.А. Олейников ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Эндоцитоз является фундаментальным процессом, обеспечивающим поступление в цитоплазму внеклеточных или расположенных на мембране макромолекул. Эндоцитоз необходим для поступления в клетку питательных веществ, регуляции активности трансмембранных рецепторов, а также рециркуляции синаптических пузырьков. Основным механизмом, по которому происходит интернализация липидов, белков и макромолекул, является клатринопосредованный эндоцитоз. При передаче сигнала для обеспечения цикличности процесса требуется баланс двух явлений – экзоцитоза и эндоцитоза. Экзоцитоз необходим для выброса нейромедиатора в синаптическую щель. В свою очередь, эндоцитоз требуется как для поддержания постоянства поверхности пресинаптической мембраны и повторного заполнения синаптических пузырьков нейромедиатором, так и для повторной активации рецепторов постсинаптической мембраны. Эндоцитоз синаптических пузырьков после сильной стимуляции нейромышечного синапса происходит по клатринзависимому механизму. При эндоцитозе активированных рецепторов по клатрин зависимому механизму с рецептором взаимодействуют различные белки адаптеры, в частности адаптерный комплекс AP2, которые опосредуют связывание мембранных белков с молекулами клатрина, образующими оболочку пузырька. На настоящий момент известны многие адаптерные белки, принадлежащие к разным классам. Хотя механизм эндоцитоза в общих чертах известен, постоянно появляются новые данные о регуляции этого процесса, и поиск и изучение новых адаптерных белков, которые могут обеспечивать направленность процесса, является актуальной на сегодняшний день задачей. Цели и задачи исследования Целью настоящей работы являлся поиск и идентификация белков, взаимодействующих с адаптерным белком TRIP8b, а также дальнейшая характеристика этого взаимодействия. Первоначальный поиск показал, что мажорным белком, связывающимся с TRIP8b, является клатрин, поэтому были сформулированы следующие задачи: 1. Найти в молекуле TRIP8b структурные детерминаты, отвечающие за связывание с клатрином;2. Получить очищенные препараты клатрина и TRIP8b, чтобы подтвердить их прямое взаимодействие;
3. Подтвердить совместную локализацию TRIP8b и клатрина с использованием живых клеток. Научная новизна и практическая ценность работы Были найдены и идентифицированы 16 белков и белковых комплексов, взаимодействующих с TRIP8b, и показано, что клатрин и субъединицы адаптерного комплекса AP2 являются мажорными белками в элюатах с TRIP8bСефарозы. Проведены эксперименты, подтверждающие, что белок TRIP8b напрямую взаимодействует с клатрином. Так, компьютерным анализом аминокислотной последовательности TRIP8b было выявлено два потенциальных сайта связывания с тяжёлой цепью клатрина, а эксперименты по связыванию очищенного клатрина и мутантов TRIP8b, в которых аминокислотные остатки этих сайтов были заменены остатками аланина, подтвердили, что такая замена приводит к нарушению связывания. Также была выделена фракция клатринпокрытых пузырьков и обнаружено, что TRIP8b присутствует в этой фракции. Полученные данные указывают на независимое взаимодействие TRIP8b с клатрином и мембранными белками, так как это взаимодействие обеспечивается разными частями молекулы белка. Таким образом, способность TRIP8b взаимодействовать как с клатрином, так и с мембранными белками позволяет предполагать, что TRIP8b может осуществлять регуляцию поверхностной экспрессии этих белков за счет модуляции клатринопосредованного эндоцитоза. Полученные в рамках настоящей работы результаты способствуют расширению представлений об участвующих в клатринопосредованном эндоцитозе белкахадаптерах, и результаты данной работы могут быть использованы при дальнейшем исследовании механизмов эндоцитоза. Публикации По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах. Апробация работы Результаты настоящего исследования были представлены на следующих российских и международных конференциях: на 12й и 13й международной Пущинской школеконференции молодых ученых (Пущино, 2008 и 2009);
на ХХI зимней молодежной школе «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009);
на XVI международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2009);
на Международной научной конференции, посвящённой 75летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009);
на IV и V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009;
Петрозаводск, 2011);
на XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Гурзуф, 2010);
на 40й ежегодной конференции Общества по нейронаукам (США, Сан Диего, 2010). Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на страницах;
содержит рисунков и 1 таблицу;
состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и библиографического списка, включающего _ наименований. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Связывание TRIP8b с Cконцевой частью рецептора CIRL Ранее в нашей лаборатории был проведён поиск внутриклеточных молекулярных партнеров рецептора CIRL с помощью дрожжевой SR системы (SOS recruitment system). Скрининг позволил выявить 17 предположительно позитивных клонов. Секвенирование их ДНК показало, что 7 из них кодируют Сконцевые фрагменты белка TRIP8b (AAK38580). S со к CO лы ы то ы м о ат ле ат GST-CT2 с Элю Контроль к из Л TRIP8b GST kDa 100 Рисунок 1. Проверка взаимодействия TRIP8b и CIRL-1.
72 Глутатион-Сефарозу, на которой были сорбированы цитоплазматическая часть CIRL-1 (202 аа), слитого с GST (GST-CT2), или GST (контроль) инкубировали с лизатом клеток COS, экспрессирующих TRIP8b. Связавшиеся белки элюировали буфером с глутатионом. Равные части элюатов разделяли в ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую инкубировали с антителами к TRIP8b.
Для подтверждения взаимодействия CIRL и TRIP8b использовали преципитацию их фрагментов, полученных искусственной экспрессией. В клетках E. coli экспрессировали Сконцевую часть CIRL1 (12691471 аа), соединенную с глутатионSтрансферазой (GSTCT2), и GST. Затем лизат клеток наносили на глутатионСефарозу и промывали фосфатносолевым буфером. Аликвоту смолы, на которой были сорбированы цитоплазматическая часть CIRL1, слитого с GST (GSTCT2), или GST (контроль) инкубировали с лизатом клеток COS, содержащим TRIP8b. Связавшиеся белки элюировали буфером с глутатионом. Равные части элюатов разделяли электрофорезом в SDSПААГ, затем белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, и TRIP8b детектировали специфичными антителами. На представленном рис. 1 видно, что TRIP8b отсутствует в элюате с контрольной смолы, но окрашивается в элюате со смолы, на которой сорбирован Сконцевой фрагмент CIRL1. Поиск и идентификация белков, взаимодействующих с TRIP8b TRIP8b (TPRcontaining Rab8b interacting protein) был впервые найден и идентифицирован как белок, взаимодействующий с малой ГТФазой Rab8b. Также было показано, что TRIP8b взаимодействует с мембранным белком HCN (hyperpolarizationactivated cyclic nucleotideregulated channel). В то же время, физиологическое значение и детальные механизмы функционирования белка TRIP8b остаются неясными. Фракции Фракции элюции с TRIP8b- элюции с Tag Сефарозы Сефарозы kDa Рисунок 2. Результат хроматографии белков солюбилизата мембран мозга крысы на TRIP8b-Сефарозе.
Белки солюбилизата мембран мозга крысы наносили на TRIP8b- или Tag-Сефарозу, смолу промывали стартовым буфером, связавшиеся белки элюировали высокосолевым буфером, разделяли в 24 градиентном ПААГ (8-20%) и детектировали окраской Кумасси R-250.
Стрелками отмечены: (1) Caspr, (2) субъединица AP-2 комплекса, (3) Ndufa9, 17 (4) цитохром c1, (5) белок, подобный белку NipSnap2, (6) В-цепь АТФ-синтазы, (7) D цепь ATФ-синтазы, (8) О субъединица АТФ синтазы, (9) белок, подобный белку, ассоциированному с рецептором аминомасляной кислоты.
Для получения дополнительной информации о TRIP8b мы провели поиск взаимодействующих с ним белков методом аффинной хроматографии на смоле с ковалентно пришитым TRIP8b, содержащим на Nконце Trxтаг, Hisтаг и Sтаг. В качестве контрольной смолы (TagСефароза) использовали сорбент с пришитыми Trx, His и Sтагами. На смолу наносили фракцию растворимых белков мозга крысы или детергентный экстракт грубой фракции мембран, которая помимо цитоплазматических мембран содержала также ядра и митохондрии. Смолу промывали стартовым буфером, связавшиеся белки элюировали высокосолевым буфером и подвергали электрофоретическому разделению в ПААГ c SDS (рис. 2, 3). А 8b Б 8b зы IP зы IP з ы g з ы g ро с TR ро с TR ро с Ta ро с Ta Се юции и Се юции и Се юции и Се юции и эл акци и эл акци эл акци акц Фр Фр фа фа Фр Фр фа фа эл kDa kDa 170 100 72 Рисунок 3. Результат хроматографии растворимых белков мозга крысы на TRIP8b Сефарозе.
Растворимые белки мозга крысы наносили на TRIP8b- или Tag-Сефарозу в стартовом буфере с 33 Tris-HCl (A) или с Hepes-KOH (Б), смолу промывали стартовым буфером, связавшиеся белки элюировали высокосолевым буфером, разделяли в градиентном ПААГ (8-20%) и детектировали окраской Кумасси R-250.
Стрелками отмечены: (1) тяжелая цепь клатрина, (2) FERM, (3) 1 субъединица AP2-комплекса, (4) субъединица AP2-комплекса, (5) фосфофруктокиназа, (6) гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин H', (7) смесь тРНК 17 нуклеотидилтрансферазы и 2',3'-циклический нуклеотид 3'-фосфодиэстеразы, (8) белок, подобный белку NipSnap2, (9) каталаза.
Из геля вырезали кусочки белковых полос, присутствующих только во фракциях элюции с TRIP8bСефарозы, но не с контрольной смолы, и данные образцы использовали для проведения массспектрометрического анализа. Список белков, которые были достоверно идентифицированы массспектрометрией, приведен в табл. 1, также эти белки указаны стрелками на рис. 2, 3. Нужно отметить, что в присутствии буфера, содержащего Tris, эффективность связывания клатрина с TRIP8b Сефарозой значительно снижается (рис. 3А и 3Б), возможно, это объясняется тем, что Trisбуфер вызывает деполимеризацию клатрина, образующего клатриновые пузырьки. Таким образом, мы идентифицировали 16 белков и белковых комплексов, специфично сорбирующихся на TRIP8bСефарозе. Табл. 1. Результаты массспектрометрического анализа белков, выделенных на TRIP8bСефарозе. Название белка Номер Масса, Score* последователь- kDa ности в PubMed Белки клатриновых пузырьков Тяжелая цепь клатрина P11442 193 2 субъединица AP2-комплекса P18484 104 NP_542150 105 1 субъединица AP2-комплекса Белки дыхательной цепи митохондрий митохондриальная АТФ-синтаза EC 3.6.3. цепь В P19511 29 цепь D P31399 19 субъединица О Q06647 23 Ndufa9 (субкомплекс NADH дегидрогеназы 1 альфа), AAH91192 42 EC 1.6.5. Цитохром с1 Q9D0M3 35 Пероксисомальные белки Каталаза, EC 1.11.1.6 P04762 60 Метаболические ферменты Фосфофруктокиназа, EC 2.7.1.11 Q52KS1 86 Мембранные белки Caspr1, белок, ассоциированный с контактином P97846 157 Сигнальные белки Q3MID Фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназа типа 1, 73 EC 2.7.1. FERM – белок, содержащий плекстриновые и RhoGEF Q91VS8 121 домены Другие белки Белок, подобный белку NipSnap2 мыши Q5RK08 33 Белок, подобный белку, взаимодействующему с Q8R3R8 14 рецептором -аминомасляной кислоты Активированной РНК полимеразы II транскрипционный Q63396 14 коактиватор р тРНК нуклеотидилтрансфераза, добавляющая Q4VBH2 50 последовательность ССА hnRNP H' - Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин H' Q6AY09 49 2',3'-циклический нуклеотид-3'-фосфодиэстераза, P13233 46 EC 3.1.4. *Score – параметр, характеризующий достоверность результатов идентификации конкретного белка. В общем случае, при значении Score60-70, результат идентификации можно считать достоверным.
Можно видеть, что на аффинной смоле сорбируются как белки цитоплазматической мембраны (Caspr) и митохондрий (субъединицы АТФ синтазы, цитохром c1, NADHдегидрогеназа), так и белки клатриновых пузырьков (клатрин, AP2 комплекс), пероксисом (каталаза), белки цитоплазмы (например, фосфофруктокиназа, фосфатидилинозитол фосфат5киназа), ядерные белки (транскрипционный коактиватор р15 активированной РНКполимеразы II), белки, участвующие в процессинге тРНК (тРНК нуклеотидилтрансфераза) и некоторые другие белки. Весьма вероятно, что часть белков взаимодействует с TRIP8b опосредовано;
также нельзя исключать возможность неспецифичной сорбции белков. Б А Элюаты Элюаты TRIP8b-Сефароза TRIP8b-Сефароза Tag-Сефароза Tag-Сефароза Нанесение Нанесение kDa kDa Caspr 170 CHC Рисунок 4. Идентификация белков антителами.
Белки указанных на рисунке фракций разделяли в ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную CLC мембрану, которую затем инкубировали с 33 антителами к (A) тяжёлой (CHC) и лёгким (CLC) цепям клатрина или (Б) белку Caspr.
Так как было обнаружено взаимодействие TRIP8b с мембранными белками, а также получены данные об участии TRIP8b в регуляции поверхностной экспрессии HCN, наибольший интерес среди идентифицированных белков представляли другие мембранные белки (Caspr), а также белки, опосредующие эндоцитоз (клатрин, AP2). Для подтверждения результатов массспектрометрического анализа, а также специфичности взаимодействия обнаруженных белков с TRIP8b, белки фракций элюции после электрофоретического разделения в ПААГ переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую инкубировали с антителами к легким и тяжёлой цепям клатрина или к белку Caspr (рис. 4). На представленном иммуноблоте видно, что антителами детектируются клатрин и Caspr, которые присутствуют только во фракциях элюции с TRIP8bСефарозы, но не с TagСефарозы. Определение в молекуле TRIP8b участка, отвечающего за связывание с клатрином Для подтверждения специфичности взаимодействия TRIP8b с клатрином, а также для определения в молекуле участков, отвечающих за это взаимодействие, были сделаны несколько мутантов белка TRIP8b, содержащие GST в Nконцевой части молекулы (рис. 5). GST-TRIP8b GST 1-237 aa GST-TRIP8b GST TPR-домен TPR-домен 42-567 aa GST-TRIP8b GST TPR-домен TPR-домен 145-567 aa GST-TRIP8b GST TPR-домен TPR-домен 238-567 aa 1 270 GST-TRIP8b GST TPR-домен TPR-домен full DLLDL LDLD 1 GST-TRIP8b GST TPR-домен TPR-домен DCM AAAAA AAAA 1 GST-TRIP8b GST TPR-домен TPR-домен SCM AAAAA 1 GST-TRIP8b GST TPR-домен TPR-домен SCM AAAA Рисунок 5. Схематическое изображение полученных мутантов белка TRIP8b. Белки, полученные экспрессией в клетках E. coli, иммобилизовали на глутатионСефарозе. Аликвоты смолы инкубировали с фракцией растворимых белков мозга крысы, связавшиеся со смолой белки элюировали, разделяли в ПААГ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану для проведения Вестернблота. Видно, что полноразмерный TRIP8b, а также конструкции 1237 и 42567 связывают клатрин из фракции растворимых белков мозга, тогда как с конструкциями 145567 и 238567 он не взаимодействует (рис. 6А). Можно предположить, что сайт связывания с клатрином в молекуле TRIP8b находится между 42м и 145м А GST-TRIP8b GST-TRIP8b Нанесение Нанесение 145- 238- 145- 238- 42- 42- 1- 1- GST GST full full kDa kDa AP- CHC 130 130 AP- AP Б Нанесение Нанесение GST-TRIP8b GST-TRIP8b SCM SCM SCM SCM DCM DCM GST GST full full kDa kDa AP- 170 CHC 130 130 AP- AP Рисунок 6. Определение в молекуле TRIP8b сайтов связывания с клатрином.
Растворимые белки мозга инкубировали с равным количеством GST, укороченных конструкций GST-TRIP8b (A) или многоточечных мутантов GST-TRIP8b (Б), сорбированных на глутатион-Сефарозе. Связавшиеся со смолой белки анализировали Вестерн-блотом с антителами к тяжёлой цепи клатрина (CHC), -адаптину, -субъединице AP-1 или субъединице AP-2.
аминокислотным остатком. В отличие от тяжёлой цепи клатрина, субъединицы APкомплексов присутствуют во всех элюатах, содержащих GSTTRIP8b белки, но отсутствуют в контроле с использованием GST. Анализ аминокислотной последовательности TRIP8b выявил два потенциальных сайта связывания с тяжёлой цепью клатрина 51DLLDL и LDLD, которые находятся в Nконцевой части молекулы. Мы заменили эти аминокислотные остатки остатками аланина (рис. 5). Аналогичные эксперименты по связыванию клатрина из фракции растворимых белков мозга с полученными мутантами подтвердили, что такая замена приводит к нарушению связывания TRIP8b с клатрином (рис. 6Б). Следует отметить, что мутации этих сайтов не вызывают заметного нарушения связывания с TRIP8b субъединиц адаптерных комплексов. Влияние мутаций сайтов связывания с клатрином в молекуле TRIP8b на поверхностную экспрессию HCN1канала Ранее было показано, что при совместной экспрессии в клетках эукариот TRIP8b вызывает перемещение HCN1 канала с клеточной мембраны в крупные внутриклеточные структуры, предположительно, за счёт эндоцитоза (рис. 7Б). С помощью антител к тяжёлой цепи клатрина мы показали, что клатрин также содержится в этих структурах (рис. 7В). Чтобы исследовать влияние мутаций сайтов связывания с клатрином в молекуле TRIP8b на поверхностную экспрессию HCN1 был использован белок TRIP8b, в котором аминокислоты двух найденных сайтов связывания с клатрином были заменены остатками аланина – TRIP8b DCM. Клетки HEK293 трансфецировали плазмидами, кодирующими GFPHCN1 и TRIP8b дикого типа (WT) или TRIP8b DCM. Оказалось, что мутации сайтов связывания с клатрином в молекуле TRIP8b не блокируют эндоцитоз HCN1 (рис. 7Г), но приводят к исчезновению в этих структурах клатрина (рис. 7Д). A Трансфекция GFP-HCN Merged GFP-HCN1 Clathrin Б GFP-HCN1 & TRIP8b WT GFP-HCN1 TRIP8b Merged В GFP-HCN1 & TRIP8b WT GFP-HCN1 Clathrin Merged Г GFP-HCN1 & TRIP8b DCM Merged GFP-HCN1 TRIP8b DCM Д GFP-HCN1 & TRIP8b DCM GFP-HCN1 Clathrin Merged Рисунок 7. Анализ взаимодействия TRIP8b с клатрином в трансфецированных клетках HEK293.
Клетки трансфецировали плазмидами, кодирующими GFP-HCN1 (А), GFP-HCN1 и TRIP8b (Б,В), GFP-HCN1 и TRIP8b DCM (Г,Д). Клетки после фиксации окрашивали антителами к TRIP8b (Б,Г) или клатрину (А,В,Д).
Чтобы установить в каких именно структурах локализуется GFPHCN1, мы использовали внутриклеточные маркеры ранних эндосом (EEA1) и лизосом (LysoTracker Dye). Окрашивание антителами к EEA1 выявило только частичную колокализацию канала с маркером ранних эндосом (рис. 8А, Б), тогда как окрашивание лизосом показало значительную ко локализацию с HCN1каналом (рис. 8В, Г). А Трансфекция GFP-HCN1 & TRIP8b WT GFP-HCN1 EEA1 Merged Б GFP-HCN1 & TRIP8b DCM GFP-HCN1 EEA1 Merged В GFP-HCN1 & TRIP8b WT GFP-HCN1 Lysosomes Merged Г GFP-HCN1 & TRIP8b DCM GFP-HCN1 Lysosomes Merged Рисунок 8. Анализ локализации GFP-HCN1 в трансфецированных клетках HEK293.
Клетки трансфецировали плазмидами, кодирующими GFP-HCN1 и TRIP8b (А,В) или GFP-HCN1 и TRIP8b DCM (Б,Д). Внутриклеточные структуры окрашивали антителами к маркеру ранних эндосом EEA1 (А,Б) или краской для детекции лизосом LysoTracker Red (В,Г). Полученные данные указывают на независимое взаимодействие TRIP8b с клатрином и HCN1, так как это взаимодействие обеспечивается разными частями молекулы белка: с каналом TRIP8b взаимодействует TPR содержащей Cконцевой частью, а с клатрином – с помощью двух сайтов, расположенных в Nконце молекулы. Совместная локализация TRIP8b с клатрином во внутриклеточных структурах Методом дифференциального центрифугирования были выделены клатринпокрытые пузырьки (clathrincoated vesicles, CCV) (рис. 9A). Белки А Б Мозги CCV SGp SGs S S P Гомогенизация, 15 000хg, 30 мин kDa P1 S1 (мембраны, ядра, (растворимые митохондрии) белки) 56 000хg, 60 мин P S (грубая фракция микросом) + сахароза/фиколл 43 000хg, 20 мин SGp SGs +5 V буфер “А” 91 000хg, 60 мин pSGs (CCV) Рисунок 9. Выделение клатрин-покрытых пузырьков (CCV).
(А) Схема выделения CCV. S1 и P1 – супернатант и осадок после низкоскоростного центрифугирования;
SGs и SGp – супернатант и осадок после центрифугирования в градиенте концентрации фиколла/сахарозы. (Б) Аликвоты, равные по количеству белка, разделяли SDS-гель ЭФ в ПААГ и окрашивали Кумасси R-250. Стрелкой указана тяжёлая цепь клатрина. фракций разной степени очистки разделяли в ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, после чего TRIP8b, белки клатриновой оболочки и синаптических пузырьков детектировали соответствующими антителами. Значительная часть TRIP8b окрашивается в микросомальной фракции SGp, которая также содержит синаптотагмин и синаптофизин. Фракции SGs и CCV – фракции, обогащённые клатрином – это препараты сравнительно чистых клатринпокрытых пузырьков (рис. 9Б), в которых TRIP8b также детектируется антителами (рис. 10). CCV SGp SGs CCV SGp SGs S S P kDa S S P kDa 170 CHC AP ST TRIP8b 40 SPh Рисунок 10. Выделение клатрин-покрытых пузырьков (CCV).
Аликвоты, равные по количеству белка, разделяли SDS-гель ЭФ в ПААГ. Белки затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану и детектировали антителами к тяжёлой цепи клатрина (CHC), TRIP8b, -адаптину, синаптотагмину (ST) или синаптофизину (SPh). А Б буфер A Tris-буфер 1 23 4 56 7 8 9 10 1 2 34 56 7 8 9 kDa kDa 170 CHC CHC 130 AP AP 95 72 TRIP8b TRIP8b 55 SPh SPh 34 1 23 4 56 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 низ верх низ верх фракции фракции Рисунок 11. Ассоциация TRIP8b с CCV.
CCV инкубировали в буфере А или Tris-содержащем буфере, а затем разделяли в 20 50% градиенте концентрации сахарозы, приготовленной на буфере А или Tris-буфере, соответственно. Фракции собирали со дна пробирки, белки наносили на SDS-ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и анализировали Вестерн-блоттингом с антителами к тяжёлой цепи клатрина (CHC), TRIP8b, -адаптину и синаптофизину (SPh).
Известно, что белки оболочки клатринпокрытых пузырьков могут быть удалены с них обработкой щелочным Trisсодержащим буфером. Молекула TRIP8b не содержит гидрофобных участков, и сам белок содержится во фракции растворимых белков, то есть, связывание TRIP8b с мембраной пузырьков может быть опосредовано белокбелковыми взаимодействиями. Клатринпокрытые пузырьки инкубировали в буфере А с pH 6.5 (буфер, используемый при очистке CCV) или в Trisбуфере с pH 7.8, а затем разделяли в градиенте концентрации сахарозы. При седиментации CCV в «нативных» условиях (буфер А) пик клатрина и субъединиц адаптерного комплекса находится в 57 фракциях градиента (рис. 11А). Окрашивание антителами к синаптофизину выявило присутствие в этих фракциях также синаптических пузырьков. Распределение TRIP8b в сахарозном градиенте похоже на распределение синаптофизина, что указывает на возможность связывания TRIP8b как с CCV, так и с синаптическими везикулами. В условиях Trisсодержащего буфера клатрин находится в верхней части градиента (максимум во фракции 10, рис. 11Б). TRIP8b также перемещается в верхнюю область градиента, но значительная его часть мигрирует вместе с синаптофизином. Полученный результат позволяет предположить, что TRIP8b может быть ассоциирован как с клатрином, так и с интегральными белками везикул. клатриновая клатриновая Superose Superose Б A оболочка оболочка пузырьки элюция с элюция с CCV kDa kDa 170 170 CHC CHC 130 адаптины адаптины 72 * CLCs CLCs 26 Рисунок 12. Очистка клатрина из клатрин-покрытых пузырьков.
Клатрин-покрытые пузырьки (CCV) инкубировали в буфере для диссоциации клатриновой оболочки, а затем центрифугировали для отделения от мембран пузырьков («пузырьки»). Супернатант («клатриновая оболочка») использовали для очистки клатрина на Superose 12. Аликвоты, равные по количеству белка, разделяли SDS-гель ЭФ в ПААГ и окрашивали Кумасси R-250 (А) или серебром (Б).
Звездочкой отмечен Hsc70. TRIP8b напрямую взаимодействует с очищенным клатрином Чтобы подтвердить, что взаимодействие TRIP8b с клатрином не опосредовано другими белками, в частности, субъединицами адаптерных комплексов, методом гельфильтрации на Superose 12 клатрин был отделен от других белков оболочки CCV. Чистоту полученного препарата клатрина определяли окрашиванием геля Кумасси R250 или серебром после проведения ЭФ (рис. 12 А,Б), а также Вестернблот анализом с антителами к адаптерным белкам (рис. 13). Видно, что адаптерные белки отсутствуют в препарате очищенного клатрина, но окрашивание серебром показало наличие дополнительной белковой полосы массой примерно 70 кДа (рис. 12Б). клатриновая Superose оболочка элюция с kDa 170 CHC Рисунок 13. Очистка клатрина из клатрин 130 покрытых пузырьков.
Клатрин-покрытые пузырьки инкубировали в буфере для диссоциации клатриновой оболочки, а затем центрифугировали для отделения от мембран пузырьков. Супернатант («клатриновая оболочка») 170 использовали для очистки клатрина на Superose 12.
Аликвоты, равные по количеству белка, разделяли SDS-гель ЭФ в ПААГ и переносили на AP нитроцеллюлозную мембрану. Белки детектировали указанными антителами.
Данный белок был идентифицирован массспектрометрией как Hsc70. Известно, что он связывается с Сконцевой частью тяжёлой цепи клатрина и одной из его функций является участие в диссоциации клатриновой оболочки. Интенсивность полосы Hsc70 составляет примерно 1% от интенсивности полосы тяжёлой цепи клатрина. Очищенный клатрин инкубировали с аликвотами смолы, на которых были сорбированы GSTTRIP8b дикого типа (WT) или GSTTRIP8b DCM, а затем связавшиеся со смолой белки детектировали Вестернблот анализом с антителами к клатрину. Чтобы оценить гипотетический вклад Hsc70 или других белков во взаимодействие клатрина с TRIP8b, в ПААГ разделяли равные части нанесения, проскоков и элюатов. Примерно 2/3 клатрина, используемого в эксперименте, детектируется антителами в элюате со смолы, содержащей TRIP8b дикого типа (рис. 14), но не с контрольной смолы, что указывает на прямое взаимодействие TRIP8b с клатрином. Нанесение проскок элюат DCM DCM WT WT kDa 170 CHC Рисунок 14. Прямое взаимодействие TRIP8b с клатрином.
Клатрин, очищенный на Superose 12, инкубировали с аликвотами смолы, с сорбированными GST-TRIP8b WT или GST-TRIP8b DCM. 1/10 части нанесения, проскоков и элюатов разделяли SDS-гель ЭФ в ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую инкубировали с антителами к тяжёлой цепи клатрина (CHC).
ВЫВОДЫ 1. С помощью аффинной хроматографии обнаружено образование комплексов белка TRIP8b с клатрином. 2. Показано, что взаимодействие TRIP8b с клатрином является непосредственным. 3. Локализованы участки, определяющие взаимодействие TRIP8b с клатрином, которые находятся в Nконцевой части TRIP8b. 4. В живых клетках наблюдается синхронное перемещение TRIP8b с клатрином при эндоцитозе мембранного белка HCN1. 5. Полученные данные позволяют предположить роль TRIP8b в нейрональном эндоцитозе путём его независимых взаимодействий с мембранными белками и компонентами оболочки клатринпокрытых пузырьков. Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи 1. Popova NV, Deyev IE, Petrenko AG, “Association of adaptor protein TRIP8b with clathrin”, J Neurochem., 2011, 118: 988–998. 2. Н.В. Попова, А.Н. Плотников, Р.Х. Зиганшин, И.Е. Деев, А.Г. Петренко, "Анализ белков, взаимодействующих с адаптером TRIP8b", Биохимия, 2008, т. 73, вып. 6, с. 804812 3. Н.В. Попова, А. Плотников, И.Е. Деев, А.Г. Петренко, "Взаимодействие кальцийнезависимого рецептора латротоксина с внутриклеточным адаптерным белком TRIP8b", Доклады Академии наук, 2007, том 414, № 5, стр. 710712 Тезисы докладов на конференциях 1. Попова Н.В., Плотников А.Н., Зиганшин Р.Х., Деев И.Е., Петренко А.Г. «Анализ белков, взаимодействующих с адаптером TRIP8b» 12ая международная Пущинская школаконференция молодых ученых, Пущино, 1014 ноября 2008 г. 2. Попова Н.В., Деев И.Е., Петренко А.Г. «TRIP8b новый клатринсвязывающий белок», IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, 2327 июня 2009 г. 3. Попова Н.В., Плотников А.Н., Серова О.В., Деев И.Е., Петренко А.Г., «Анализ белков, взаимодействующих с адаптером TRIP8b», XXI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии», Москва, 911 февраля 2009 г. 4. Попова Н.В. «TRIP8b: белокадаптер, взаимодействующий с клатрином», XVI международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ», Москва, 1318 апреля 2009 г. 5. Popova N.V., Deyev I.E., Petrenko A.G., "TRIP8b is a novel clathrinbinding protein", International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov, Moscow – Pushchino, September 28 – October 2, 2009. 6. Попова Н.В., Деев И.Е., Петренко А.Г. «TRIP8b новый клатринсвязывающий белок», 13ая международная Пущинская школаконференция молодых ученых «Биология наука XXI века», Пущино, 28 сентября 02 октября 2009 г. 7. Попова Н.В., Деев И.Е., Петренко А.Г. «Характеристика взаимодействия белкаадаптера TRIP8b с клатрином» XVIII международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", Украина, Гурзуф, 31 мая 10 июня 2010 г. 8. N.V. Popova, I.E. Deyev, A.G. Petrenko, "Association of brainspecific adapter protein TRIP8b with clathrin." 40th annual meeting society for neuroscience, USA, San Diego, 1013 November 2010. 9. Попова Н.В., Деев И.Е., Петренко А.Г., «Взаимодействие белкаадаптера TRIP8b с клатрином» V Российский симпозиум «Белки и пептиды», Петрозаводск, 812 августа 2011 г.