Разработка методов детекции нейрональных 7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов

на правах рукописи

Шелухина Ирина Валерьевна Разработка методов детекции нейрональных 7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов Специальность: 03.01.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени Кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова д.х.н., профессор, чл.-корр. РАН

Научный консультант:

Цетлин Виктор Ионович д.х.н., профессор, чл.-корр. РАН

Официальные оппоненты:

Габибов Александр Габибович д.б.н., профессор Евгеньев Михаил Борисович Учреждение Российской Академии Наук

Ведущая организация:

Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита состоится « 20 » апреля 2011 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН

Автореферат разослан «18» марта 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук В.А. Олейников

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Среди нейрональных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) особое место занимает гомопентамерный 7 нАХР. Данный подтип, вероятно, является наиболее широко распространенным нАХР в организме, где он встречается как в нервной системе, так и за ее пределами. Он также уникален своей аминокислотной последовательностью, фармакологическим профилем и наиболее высокой проницаемостью для ионов кальция. Изменение уровня 7 нАХР в головном мозге наблюдается при шизофрении, а также связано с нарушением холинергической передачи и ухудшением когнитивных способностей при таких нейродегенеративных заболеваниях как болезни Альцгеймера и Паркинсона. В последнее время появились работы, указывающие на возможность изменения уровня нАХР на форменных элементах крови при различных патологических состояниях. Таким образом, как для диагностики, так и для исследования механизмов возникновения и протекания заболеваний очевидна необходимость разработки надежных методов для обнаружения и количественного определения уровня 7 нАХР.

При постановке подобных задач классическим подходом является использование антител, однако недавние исследования показали, что многие широко используемые антитела против 7-субъединицы нАХР неспецифически окрашивают ткани нокаутных по данному гену мышей (7–/–). Для повышения надёжности результатов в сочетании с антителами применяют -нейротоксины из ядов змей, являющиеся высокоаффинными специфическими лигандами некоторых подтипов нАХР. В то же время токсины редко имеют сродство только к одному подтипу рецепторов, что часто затрудняет интерпретацию результатов, особенно, учитывая обнаружение в последние годы нАХР в нетипичных для них тканях, а также большее разнообразие их подтипов, чем ранее предполагалось. В связи с этим актуальной является разработка метода избирательной детекции 7 нАХР.

Цель работы. Цель настоящего исследования состояла в разработке методов специфической детекции нейрональных 7 нАХР с использованием антител и токсинов. Задачами представленной работы стали получение и тестирование набора поликлональных антител против синтетических фрагментов 7 субъединицы нАХР и различных производных длинных -нейротоксинов из ядов змей, в том числе их коммерчески доступных конъюгатов. Применимость этих инструментов для поставленной цели исследовалась в ряде методов анализа с использованием как рекомбинантных, так и природных 7 нАХР. Главной задачей стала разработка метода избирательной гистохимической детекции нАХР, основанного на применении флуоресцентно-меченого -нейротоксина длинного типа в качестве маркера и комбинации длинных и коротких нейротоксинов в качестве специфических ингибиторов с последующей его апробацией для исследования экспрессии и транспорта 7 нАХР нейронами спинномозговых ганглиев крыс.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе получен набор поликлональных антител против синтетических фрагментов 7-субъединицы нАХР и впервые проведено комплексное тестирование их специфичности с использованием рекомбинантных экстрацеллюлярного домена 7-субъединицы нАХР и полноразмерного нАХР, природных источников рецепторов, а также тканей мышей, нокаутных по гену 7-субъединицы нАХР. Оптимизирована методика получения мембранных препаратов тканей животных и их стандартизации для последующей количественной оценки содержания 7 нАХР методом радиолигандного анализа. Впервые установлено, что биотинилированный -кобратоксин может быть использован для детекции 7 нАХР в мембранных препаратах нервной ткани. Разработан метод избирательной гистохимической детекции 7 нАХР, основанный на применении флуоресцентно-меченого -нейротоксина длинного типа в качестве маркера и комбинации длинных и коротких -нейротоксинов в качестве специфических ингибиторов. С использованием предложенного метода и дополнительных маркеров впервые были охарактеризованы нейроны спинномозговых ганглиев, экспрессирующие и транспортирующие 7 нАХР.

Обнаружено, что по меньшей мере четверть из них являются ноцицептивными нейронами. В практическом плане разработанные методы детекции важны для изучения роли 7 нАХР в различных патологических состояниях.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), на Восточно-европейском симпозиуме «Центральная и периферическая синаптическая передача» (Варна, Болгария, 2006), конференции «Ионные каналы: структура и функции» (С.-Петербург, 2009), IV российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), на 4-й конференции Европейского нейрохимического общества (Лейпциг, Германия, 2009), на конференции Нейробиологического общества по нАХР (Чикаго, США, 2009), на международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва-Пущино, 2009), на международном конгрессе «Молекулярные механизмы неврологических и психических расстройств» (Мартин, Словакия, 2009), на 4-й конференции Международного нейрохимического общества (Эриче, Италия, 2010), на немецко-российском симпозиуме «Молекулярная нейробиология сегодня и завтра» (Берлин, Германия, 2010). По теме диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста и включает 48 рисунков и 6 таблиц, состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 323 наименования.

Содержание работы Исследования с использованием антител На первом этапе данной работы была протестирована специфичность набора поликлональных антител против синтетических фрагментов различных доменов 7-субъединицы нАХР (табл. 1). В качестве контроля были использованы иммуноглобулины преиммунной сыворотки кроликов, антитела к аналогичным участкам других нейрональных субъединиц нАХР и рекомбинантного экстрацеллюлярного домена 1-субъединицы нАХР мышечного типа (табл. 1).

Таблица 1. Связывание поликлональных антител с нАХР мышечного типа Torpedo californica и экстрацеллюлярным доменом 7-субъединицы нАХР.

Иммунный ответ Расположение эпитопов в аминокислотной нАХР T.californica экстрацеллюлярный последовательности нАХР в Эпитоп домен 7-субъединицы рамках современной ИФА Вестерн- ИФА Вестерн пространственной модели блоттинг блоттинг N-концевая -спираль 7(1–23) – – ++ + и часть следующей за ней 7(8–25) +/– – +/– + петли экстрацеллюлярного 2(11–27) + – – – домена 4(8–22) +/– – +/– + 2(6–22) +/– – + 7(179–190) +/– – ++ + Лигандсвязывающий участок экстрацеллюлярного домена 3(181–192) – – + – 4(181–192) +/– – – 5(180–190) – – – 7(322–338) + – +/– – Фрагмент цитоплазматической петли 4(342–371) +/– – – – 2(330–346) + – – 1(1–209) ++ 1 + + Экстрацеллюлярный домен На первом этапе антитела были протестированы с использованием «модельных систем»: рекомбинантного экстрацеллюлярного домена 7 субъединицы нАХР, мембран электрического органа ската Torpedo californica, содержащих нАХР мышечного типа, и крысиной гипофизарной клеточной линии GH4C1, экспрессирующей рекомбинантный 7 нАХР человека и не содержащей эндогенных нАХР. По результатам ИФА и Вестерн-блоттинга с экстрацеллюляным доменом 7-субъединицы нАХР и мембранами T.californica нами были выбраны антитела против синтетических пептидов 7(1–23) и 7(179–190) как наиболее перспективные для детекции 7 нАХР (табл. 1).

Дальнейшее тестирование данных антител методом ИФА показало их высокое сродство к клеткам GH4C1 на фоне отсутствия связывания антител против 2-субъединицы и иммуноглобулиновой фракции преиммунной сыворотки кролика (рис. 1).

Далее методом Вестерн-блоттинга была исследована способность антител к 7(1–23) и 7(179–190) связываться с природными объектами, отличающимися сравнительно высоким содержанием 7 нАХР: мембранными препаратами гиппокампа и мозга крысы, а также гиппокампа и таламуса человека (рис. 2).

Антитела против 7(1–23) специфично окрашивали белковую полосу с молекулярной массой ~ 62 кДа на всех исследованных мембранных препаратах, в то же время антитела против 7(179–190) обнаруживали белковые полосы массой ~ 53 и 54 кДа (рис. 2). В контрольных опытах при преинкубации антител к 7(1–23) и 7(179–190) с пептидом 7(1–23) и с рекомбинантным экстрацеллюлярным доменом 7(7–208), соответственно, окрашивания данными антителами мембранных препаратов мозга не наблюдалось (рис. 2).

Рис. 1. ИФА связывания поликлональных антител с гипофизарной клеточной линией GH4C1, экспрессирующей 7 нАХР человека.

В связи с неоднозначностью литературных данных нельзя было определить, какая из окрашиваемых белковых полос соответствует 7-субъединице нАХР. Для разрешения противоречивых результатов были проведены эксперименты с тканями мышей, нокаутных по гену 7-субъединицы нАХР (7–/–). Для контрольных опытов использовались ткани мышей из того же помета, гомозиготных по нативному варианту гена 7 субъединицы нАХР (7 +/+).

Рис. 2. Вестерн-блоттинг мембранных препаратов отделов мозга с аффинно очищенными антителами (1) к 7(179–190) и (2) к 7(1–23).

Антитела к 7(179–190) с одинаковой эффективностью связывались с гомогенатами мозга 7+/+ и 7–/– мышей как в ИФА, так и при Вестерн блоттинге (рис. 3). Стоит отметить, что при взаимодействии с мембранным препаратом мозга мыши антитела к 7(179–190) обнаруживали единственную белковую полосу с молекулярной массой ~ 54 кДа, а при использовании гомогената мозга мыши данные антитела дополнительно окрашивали две белковые полосы с большей молекулярной массой (рис. 3).

Рис. 3. ИФА и Вестерн-блоттинг взаимодействия антител к 7(179– 190) с препаратами мозга мышей.

Специфичность антител к 7(1–23) исследовалась с использованием криостатных срезов тканей нокаутных мышей (7–/–). Хотя при разработке иммуногистохимического протокола данные антитела окрашивали тела нейронов в гиппокампе, области мозга с наиболее высоким содержанием нАХР, при дальнейшем тестировании они проявили неспецифическое связывание со срезами пищевода и легких 7–/– мышей (рис. 4).

Рис. 4. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к 7(1-23) криостатных срезов пищевода (верхний ряд) и легких (нижний ряд) 7– /– и 7+/+ мышей.

Таким образом, протестированные антитела к 7(179-190) и к 7(1–23) могут применяться для работ с рекомбинантными белками: экстрацеллюлярными доменами 7 субъединицы нАХР и полноразмерными 7 нАХР. Несмотря на то, что подтип является одним из наиболее распространённых нАХР в организме, содержание этих рецепторов по отношению к другим белкам недостаточно для надежного анализа с помощью антител (например, исходя из литературных данных, содержание ГАМК- или глутаматергических рецепторов превышает содержание 7 нАХР на несколько порядков). В связи с этим далее для разработки метода детекции было решено использовать специфические антагонисты 7 нАХР – трехпетельные длинные -нейротоксины из ядов змей.

Исследования с использованием токсинов -Нейротоксины длинного типа (66–75 а.о., 5 дисульфидных связей) являются селективными конкурентными антагонистами 7, 9 и мышечного типа нАХР. В данной работе были использованы полученные в нашем отделе их меченые производные – биотинилированный -кобратоксин (биот-CTX) и FITC меченый -кобратоксин (FITC-CTX), а также коммерчески доступные производ ные – йодированный -бунгаротоксин ([125I]-Bgt) и Alexa Fluor 488 – меченый Bgt (Alexa-Bgt).

Йодированный Bgt Метод радиолигандного анализа с использованием [125I]-Bgt является традиционным для обнаружения 7 нАХР в гомогенатах и мембранных препаратах тканей. Достоинствами этого метода являются возможность количественной оценки содержания рецепторов и высокая чувствительность.

При этом не следует забывать о трудностях стандартизации образцов для количественного анализа при высокой чувствительности метода и небольших различиях в содержании рецепторов в экспериментальной и контрольной группах животных. В связи с этим нами была критически проанализирована и оптимизирована методика получения мембранных препаратов тканей животных и их стандартизации. С использованием разработанной методики было показано, что иммунизация синтетическим фрагментом 7(173-193) предотвращает снижение уровня 7 нАХР в мозге мышей, вызванного моделированием болезни Альцгеймера (рис. 5).

Рис. 5. Влияние иммунизации пептидом 7(173 193) на уровень содержания 7 нАХР в коре больших полушарий мышей с моделью болезни Альцгеймера (БА). Проведен радиолигандный анализ связывания [125I]-Bgt с мембранными препаратами. К – контрольная группа мышей.

Другим классическим методом детекции нАХР с помощью [125I]-Bgt является авторадиография, существенные минусы которой – низкое разрешение и невозможность выявления нескольких белков одновременно. Для гистохимических задач, требующих детального анализа экспрессии 7 нАХР на уровне отдельных клеток и их отростков, а также изучения сопутствующих веществ, более перспективными казались биотинилированные и флуоресцентные производные -нейротоксинов.

Биотинилированный CTX Ранее методом радиолигандного анализа с использованием [125I]-Bgt было показано, что биотинилированный CTX (биот-CTX) близок к нативному токсину по способности связываться с нАХР мышечного типа T. californica (IC50 (биот CTX) = 257 нM и IC50 (CTX) = 112 нM), а также специфически связывается с экстрацеллюлярным доменом 7(7–208) (Коротина и др., 2003). В данной работе методом твердофазного анализа было показано специфическое связывание биот CTX с мембранами T. californica, с клетками GH4C1, экспрессирующими нАХР, а также мембранами гиппокампа и коры больших полушарий крысы, сорбированными на стандартном планшете для ИФА (рис. 6).

При Вестерн-блоттинге мембран T. californica биот-CTX, так же как и [125I] Bgt, связывался только с -субъединицей нАХР мышечного типа (рис. 6), что подтверждало его селективность. В то же время, в отличие от ткани электрического органа T.californica, обогащенной нАХР мышечного типа (1– нмоль/мг белка), данный метод оказался недостаточно чувствительным для детекции малых количеств 7 нАХР (4 фмоль–1,15 пмоль/мг белка), содержащихся в препаратах клеток GH4C1, гиппокампа и мозга крысы, а также гиппокампа человека (рис. 6). При этом стрептавидин-пероксидаза неспецифически окрашивала ряд белковых полос – вероятно, как результат связывания эндогенного биотина в денатурирующих условиях, но не обнаруживала связанного биот-CTX (рис. 6).

Далее была исследована возможность использования биот-CTX для гистохимического анализа природных объектов. При исследовании экспрессии 7 нАХР в мозге крысы было обнаружено, что фиксация ткани раствором параформальдегида препятствовала связыванию биот-CTX. В то же время на криостатных срезах нефиксированной ткани было показано специфическое окрашивание токсином различных областей гиппокампа (рис. 7), перивентрикулярной области, коры больших полушарий и ядер перегородки. На контрольных срезах, преинкубированных с пятидесятикратным избытком немеченого CTX, связывания биот-CTX не наблюдалось.

Твердофазный анализ и Вестерн-блоттинг связывания Рис. 6.

биотинилированного -кобратоксина (биот-CTX) с нАХР мышечного типа (показаны -, - и -субъединицы) T. californica и с экспрессирующими 7 нАХР клетками GH4C1.

Гиппокамп интересен высоким содержание 7 нАХР по сравнению с другими отделами ЦНС. Мы показали, что биот-CTX преимущественно окрашивал слои гиппокампа, обогащенные отростками, но не телами нейронов, что видно на микрофотографии зубчатой фасции (ЗФ) и поля СА4 (рис. 7).

Рис. 7. Гистохимическое окрашивание зубчатой фасции (ЗФ) и полей CA1 и СА (hilus) гиппокампа крысы с использованием биот-CTX (красный цвет), ядерного красителя Hoechst (синий цвет) и антител к GFAP (glial fibrillary acidic protein – маркер астроцитов, зеленый цвет).

Аналогичное связывание было показано для CA1–CA3 полей гиппокампа.

Наблюдаемое окрашивание располагалось вблизи ядер нейронов и в большинстве случаев не совпадало с окрашиванием астроцитов, однако некоторые участки связывания биот-CTX были удалены от ядер, что могло свидетельствовать о присутствии рецепторов на телах и отростках нейронов, соответственно (рис. 7).

Представленные результаты свидетельствуют о принципиальной возможности использования биот-CTX для выявления нАХР на срезах мозга, однако его эффективная концентрация составляла 5 мкM, что потенциально могло привести к реакции с низкоафинными участками связывания, отличными от 7 нАХР. Таким образом, его применимость для гистохимических исследований ограничена.

Флуоресцентно-меченый Bgt Для повышения чувствительности метода по сравнению с биот-CTX, с одной стороны, и для повышения разрешающей способности по сравнению с радиоактивными лигандами, с другой стороны, мы исследовали возможность применения для гистохимических экспериментов флуоресцентно-меченого Bgt.

Из литературных данных известно, что присоединение к токсинам крупных радикалов может приводить к сильному изменению их характеристик и ухудшать их способность связываться с рецептором. В связи с этим перед использованием коммерчески доступного конъюгата Bgt с Alexa Fluor (Alexa-Bgt) в гистохимии было исследовано влияние присоединения флуоресцентной метки на его аффинность и специфичность.

Сначала методом радиолигандного анализа мы сравнили аффинность Alexa Bgt и нативного Bgt к клеточной линии GH4C1, экспрессирующей 7 нАХР человека (рис. 8). Полученные результаты показали, что Alexa-Bgt – высокоаффинный конкурентный антагонист 7 нАХР (IC50 = 56,6 нМ), хотя введение флуоресцентной метки значительно снизило его ингибиторную способность по сравнению с нативным Bgt (IC50 = 1,1 нМ).

Специфичность Alexa-Bgt была также подтверждена его способностью избирательно конкурировать за связывание с рецептором с -нейротоксинами длинного и короткого типа. CTX, обладающий высоким сродством как к нАХР мышечного типа, так и к 7 нАХР, успешно конкурировал с Alexa-Bgt за связывание с клетками GH4C1 (IC50 = 17,5 нМ), тогда как короткий нейротоксин II (NTII), селективный антагонист нАХР мышечного типа, не влиял на связывание вплоть до концентрации 4 мкМ (рис. 9). Ранее наблюдалось аналогичное ингибирование связывания [125I]-Bgt с химерным 7 нАХР для высоких концентраций (3 мкМ – 1мМ) коротких -нейротоксинов. В контрольных экспериментах оба токсина (CTX и NTII) одинаково эффективно ингибировали связывание Alexa-Bgt с нАХР мышечного типа T. californica.

Таким образом, была показана возможность дискриминации между мышечным и 7 нАХР при использовании Alexa-Bgt в комбинации с CTX и NTII в качестве ингибиторов.

Рис. 9. «Флуоресцентный» анализ Рис. 8. Радиолигандный анализ конкуренции CTX () и NTII () с конкуренции Alexa-Bgt () и нативного Bgt () с [125I]-Bgt за Alexa-Bgt за связывание с клеточной линией GH4C1, связывание с клеточной линией экспрессирующей 7 нАХР человека.

GH4C1, экспрессирующей 7 нАХР человека.

Метод гистохимической детекции Данная комбинация токсинов была использована при разработке метода специфической гистохимической детекции 7 нАХР. Производные длинных нейротоксинов широко применяются для выявления мышечного, 7, 9 и 9/ нАХР в связи с высокой аффинностью к перечисленным рецепторам и низкой скоростью диссоциации из комплекса с рецептором. Ранее возможность селективной детекции того или иного подтипа нАХР основывалась на их избирательной экспрессии в различных тканях. Так, нАХР мышечного типа экспрессируется в нервно-мышечных синапсах, 9/10 нАХР – на волосковых клетках внутреннего уха, а в мозге большинство сайтов связывания Bgt соответствует 7 нАХР. В последнее время появляется все больше данных о присутствии нАХР в нетипичных для них тканях: экспрессия нАХР мышечного типа на уровне мРНК была обнаружена в парасимпатических ганглиях кур и спинном мозге человека, на уровне белка – в раковых клетках легких и в спинном мозге эмбрионов кур. 7 нАХР экспрессируется рядом клеток как в нервной системе, так и за ее пределами: астроцитами, клетками микроглии, лимфоцитами, макрофагами и др. 9 субъединица нАХР найдена в кератиноцитах и сперматозоидах, совместно с 10 – в лимфоцитах человека и нейронах спинномозговых ганглиев. Таким образом, актуальной задачей является разработка гистохимического метода избирательной детекции нАХР, основанной на применении комбинации -нейротоксинов для дискриминации между мышечным и нейрональным типом нАХР, а также использовании тканей 7–/– мышей для исключения возможности окрашивания 9/10 нАХР.

Рис. 10. Связывание Alexa-Bgt с нервно мышечными синапсами на криостатных срезах языка 7+/+ и 7–/– мышей. А – временная зависимость эффективности связывания. Б, В (б и в) – ингибирование связывания Alexa-Bgt избытком NTII и CTX.

На первом этапе были подобраны оптимальные условия связывания Alexa Bgt с нАХР мышечного типа, для чего были использованы криостатные срезы языка 7+/+ и 7–/– мышей. Окрашивание нервно-мышечных синапсов, на постсинаптической мембране которых располагаются нАХР мышечного типа, усиливалось с увеличением времени инкубации с Alexa-Bgt до 15 часов, при этом уровень фонового окрашивания не изменялся (рис. 10А). Преинкубация срезов языка с избытком CTX приводила к полному блокированию связывания Alexa-Bgt, доказывая его специфичность (рис. 10В в). Избыток NTII полностью ингибировал связывание Alexa-Bgt с большинством нервно-мышечных синапсов (рис. 10В б), но несколько слабоокрашенных синапсов оставались видны на срезе, что было характерно для ткани как 7+/+, так и 7–/– мышей и не зависело от времени преинкубации с NTII и его концентрации (рис. 10Б).

Таким образом, слабое остаточное окрашивание не может объясняться присутствием 7 нАХР, а скорее всего, является следствием более быстрой кинетики диссоциации NTII по сравнению с Alexa-Bgt из комплекса с рецептором.

Рис. 11. Связывание Alexa-Bgt (А) с телами нейронов на срезах спинномозговых ганглиев и (Б) с отростками нейронов на срезах в переднем роге спинного мозга 7+/+ и 7–/– мышей. (б), (в) – ингибирование связывания Alexa-Bgt избытком NTII и CTX, соответственно. (г) – отсутствие связывания Alexa-Bgt со срезами нервной ткани 7–/– мышей. Стрелкой и острием стрелки показаны окрашенная плазматическая мембрана и внутриклеточные структуры, соответственно.

Далее специфичность детекции 7 нАХР по разработанному на ткани языка гистохимическому протоколу проверялась на срезах нервной ткани 7+/+ и 7– /– мышей. Основным объектом исследования были выбраны спинномозговые ганглии, скопления тел первичных афферентных нейронов. Такой выбор был продиктован большим разнообразием нАХР, представленных в этих ганглиях. В них, судя по литературным данным, были найдены мРНК всех нейрональных субъединиц нАХР, в том числе 9 и 10, которые способны образовывать Bgt чувствительные ионные каналы. Целью данного этапа работы было выяснить, может ли Alexa-Bgt служить специфическим инструментом для гистохимической детекции 7 нАХР в тех участках нервной ткани, где потенциально могут присутствовать и другие Bgt-связывающие мишени.

Alexa-Bgt окрашивал небольшой процент тел нейронов в спинномозговом ганглии 7+/+ мышей (рис. 11А (а)). Интенсивность окрашивания возрастала при увеличении времени инкубации с токсином, что наблюдалось ранее и для срезов языка (рис. 10А). Избыток NTII не оказывал влияния на взаимодействие Alexa-Bgt со срезами ганглиев (рис. 11А (б)), а избыток CTX полностью его подавлял (рис. 11А (в)), доказывая, что наблюдается специфическое окрашивание нейрональных нАХР. Срезы спинномозговых ганглиев 7–/– мышей не окрашивались Alexa-Bgt (рис.11А (г)). Полученные результаты свидетельствуют, что 7 нАХР являются основными Bgt-связывающими центрами в спинномозговых ганглиях мышей и могут быть специфически выявлены с помощью представленного гистохимического метода.

Спинномозговые ганглии – удачный объект для исследования тел нейронов, но они содержат мало отростков и в них практически отсутствуют синаптические контакты. Чтобы убедиться, что разработанный метод позволяет выявлять 7 нАХР на уровне отдельных отростков нейронов, мы включили в наше исследование срезы спинного мозга 7+/+ и 7–/– мышей. Alexa-Bgt окрашивал отдельные нервные волокна на срезах 7+/+ мышей, располагавшиеся, в основном, в переднем роге спинного мозга рядом с телами мотонейронов (рис. 11Б (а)), что согласуется с ранее опубликованными данными ауторадиографии. Результаты контрольных экспериментов были аналогичны опытам со спинномозговыми ганглиями: NTII не затрагивал связывания Alexa Bgt, тогда как CTX его полностью подавлял и 7–/– ткань не окрашивалась (рис. 11Б (б), (в), (г), соответственно).

Применение флуоресцентно-меченого Bgt для гистохимической детекции 7 нАХР Спинномозговые ганглии Данный объект интересен тем, что нейроны спинномозговых ганглиев являются первым звеном в восприятии болевых, тактильных и других ощущений – следовательно, вещества, способные модулировать их активность, потенциально могут стать лекарственными препаратами. Одними из таких веществ являются агонисты нАХР, например, эпибатидин, которые оказывают анальгетическое действие при болях разной этиологии. Механизм их действия не до конца ясен. Имеются сведения о том, что на разных уровнях проведения болевого сигнала анальгетический эффект может обеспечиваться разными подтипами нАХР. Наше исследование было посвящено 7 нАХР, доминирующему в спинномозговых ганглиях крыс.

Окрашивание Alexa-Bgt срезов спинномозговых ганглиев мышей (рис.

11А) и крыс (данные не приведены) было сходным: окрашивался небольшой процент средних и крупных нейронов, избыток NTII не оказывал влияния на связывание Alexa-Bgt, а CTX полностью его подавлял. Alexa-Bgt связывался как с плазматической мембраной нейронов, так и с внутриклеточными структурами, расположенными вокруг ядра, вероятнее всего, с эндоплазматическим ретикулумом (рис. 11А (а)). Накопление 7 нАХР внутри тела нейрона, видимо, необходимо для последующего аксонального транспорта (см. раздел Аксональный транспорт 7 нАХР). Иногда рядом с телами нейронов были заметны специфично меченные Alexa-Bgt структуры, напоминающие дуги (рис. 12б). Двойное окрашивание срезов ганглиев с использованием Alexa Bgt и антител к цитоплазматическому белку нейронов PGP 9.5 (protein gene product 9.5) (рис. 12в и г) не выявили никаких дополнительных Alexa-Bgt связывающих структур помимо аксонов и тел нейронов (рис. 12г и в, соответственно). Вероятно, обнаруженные дуги являлись изогнутой плазматической мембраной нейронов. Таким образом, разработанный протокол позволяет надежно детектировать 7 нАХР, расположенные на нейронах спинномозговых ганглиев.

Рис. 12. Окрашивание срезов спинномозговых ганглиев крысы Alexa-Bgt (зеленый цвет) и антителами к цитоплазматическому белку нейронов PGP 9. (protein gene product 9.5) (красный цвет). Видны окрашенные Alexa-Bgt тела и (а), (г) аксоны нейронов, а также (б) дополнительные структуры.

Характеристика 7 нАХР-экспрессирующих нейронов спинномозговых ганглиев Нейроны спинномозговых ганглиев не являются однородной популяцией.

Они отличаются по размерам, спектру экспрессируемых белков, электрофизиологическим и другим свойствам. Так как различные подтипы нейронов специализированы для восприятия и передачи информации разного типа, то существует корреляция между некоторыми характеристиками нейронов и выполняемой ими функцией. Так, клетки малого размера с тонкими аксонами в основном передают информацию о болевых ощущениях, тогда как нейроны с большим диаметром тел и аксонов участвуют в передаче тактильных ощущений.

Первой задачей для характеристики нейронов, экспрессирующих 7 нАХР, было измерение среднего диаметра их тел, составившего 20 – 65 мкм (рис. 13б).

Сравнив распределение по размерам Alexa-Bgt-связывающих нейронов и всех нейронов в ганглии, мы обнаружили, что первые в среднем на ~ 5 мкм крупнее (рис. 13 а и б). Из гистограммы на рис. 13в видно, что 7 нАХР экспрессирующие клетки отсутствовали среди самых мелких нейронов (15– мкм в диаметре), но составляли до 12% крупных нейронов (45–50, 55–60 и 60– мкм в диаметре). Таким образом, Alexa-Bgt-связывающие нейроны составляют немногочисленную субпопуляцию (~ 4% всех нейронов в ганглии), характеризующуюся особым распределением по размерам, статистически достоверно отличающимся от такового для всей популяции нейронов в спинномозговых ганглиях крыс.

[125I]-Bgt-связывающих Исследования субпопуляции нейронов спинномозговых ганглиев шейного отдела обезьян, выполненные зарубежными авторами, также выявили их небольшую численность (11,7%) и более крупный размер относительно общей популяции нейронов. Электрофизиологические эксперименты, проведенные на первичной культуре нейронов спинномозговых ганглиев новорожденных крыс, показали, что 77% крупных нейронов и 32% мелких нейронов экспрессировали 7 нАХР. Высокий уровень экспрессии 7 нАХР в неонатальный период также характерен для мозга. Таким образом, наши исследования и данные литературы показывают предпочтительную экспрессию 7 нАХР средними и крупными нейронами в спинномозговых ганглиях новорожденных и взрослых крыс.

Рис. 13. Гистограммы распределения (а) всех нейронов спинномозговых ганглиев крыс и (б) Alexa-Bgt связывающих нейронов по размерам. (в) Процентное содержание Alexa-Bgt-связывающих клеток среди нейронов спинномозговых ганглиев разного размера.

Нейроны каких функциональных подтипов экспрессируют 7 нАХР?

Избирательная экспрессия 7 нАХР малой субпопуляцией нейронов предполагает определенную функциональную роль этих рецепторов в спинномозговых ганглиях. Для характеристики данной субпопуляции мы использовали гистохимическую классификацию нейронов спинномозговых ганглиев. Полученные результаты показали, что около половины Alexa-Bgt связывающих нейронов составляли богатые нейрофиламентами крупные клетки с аксонами, окруженными миелиновой оболочкой (рис. 14а и г). Следовательно, вторая половина 7 нАХР-экспрессирующих нейронов состояла из мелких клеток с безмиелиновыми нервными волокнами и низким уровнем экспрессии нейрофиламентов, большинство которых являются ноцицепторами.

В зависимости от пути дифференцировки предшественники ноцицепторов развиваются в пептидергические, экспрессирующие CGRP и вещество P, и непептидергические, связывающие изолектин B4 (IB4), ноцицепторы.

Большинство ноцицепторов обоих классов реагируют на аппликацию капсаицина возникновением токов Ca2+ и экспрессируют его рецептор TRPV1, который служит их гистохимическим маркером.

Можно было ожидать совместной экспрессии TRPV1 и 7 нАХР на основании литературных данных о присутствии 7 нАХР на части капсаицин чувствительных нейронов в спинномозговых ганглиях. Эти данные были получены на первичной культуре нейронов, подвергнутых действию протеолитических ферментов и механическому разделению. Разработанная нами гистохимическая методика позволила изучать нативное распределение 7 нАХР в спинномозговых ганглиях.

Ранее была предпринята попытка изучения совместной экспрессии TRPV и 7 нАХР на срезах спинномозговых ганглиев иммуногистохимически, что, исходя из показанной в последние годы неселективности антител, могло приводить к ложноположительным результатам. Мы использовали Alexa-Bgt, специфически взаимодействующий с 7 нАХР в спинномозговых ганглиях, что было подтверждено опытами с 7–/– тканями.

В нашем исследовании примерно четверть (23%) Alexa-Bgt-связывающих нейронов экспрессировали TRPV1 (рис. 14б и г), т.е. потенциально являлись ноцицепторами. Небольшой процент клеток, продуцирующих оба рецептора, не вызывал удивления, т.к. результаты измерения размера тел нейронов показали, что TRPV1-иммунопозитивные нейроны (TRPV1+) в среднем гораздо мельче нАХР-экспрессирующих клеток.

Рис. 14. Двойное окрашивание срезов спинномозговых ганглиев крысы Alexa-Bgt (зеленый цвет) и антителами к (а) NF200 (высокомолекулярный белок (200 кДа) нейрофиламентов), (б) TRPV1 и (в) CGRP (красный цвет). (г) Внизу рисунка приведено процентное содержание иммунопозитивных среди Alexa-Bgt связывающих нейронов. Масштаб: 40 мкм.

Далее мы решили определить процент пептидергических ноцицепторов среди 7 нАХР-экспрессирующих нейронов. Для этого было проведено двойное окрашивание срезов спинномозговых ганглиев крыс антителами к CGRP и Alexa-Bgt. Неожиданно высокий процент (90%) Alexa-Bgt-связывающих нейронов экспрессировали CGRP (рис. 14в и г). Результаты контрольных экспериментов в совокупности с типичным точечным рисунком окрашивания нейронов спинномозговых ганглиев крыс (рис. 14в), доказывали специфичность использованных антител к CGRP.

Двойное окрашивание среза Рис. 15.

спинномозгового ганглия крысы антителами к TRPV1 (зеленый цвет) и CGRP (красный цвет).

Различие в экспрессии двух гистохимических маркеров ноцицептивных нейронов среди Alexa Bgt-связывающих клеток – 23% (TRPV1) и 90% (CGRP) – могло объясняться тем, что некоторые CGRP-иммунопозитивные нейроны не экспрессируют TRPV1. В связи с неоднозначностью литературных данных мы провели двойное окрашивание срезов спинномозговых ганглиев антителами к TRPV1 и CGRP и показали, что 71,4 % CGRP иммунопозитивных нейронов продуцировали TRPV1 (рис. 15). Таким образом, оставшаяся часть ~ 30% CGRP-иммунопозитивных нейронов не содержат TRPV1 (CGRP+/TRPV1-) и составляют большинство 7 нАХР экспрессирующих нейронов в спинномозговых ганглиях крыс (рис. 15). Их распределение по размерам оказалось наиболее сходно с таковым для субпопуляции Alexa-Bgt-связывающих нейронов, что подтверждает правильность нашего вывода о преобладании CGRP+/TRPV1- нейронов среди экспрессирующих 7 нАХР (рис. 15).

Аксональный транспорт 7 нАХР Основными функциями нейронов спинномозговых ганглиев являются восприятие сигналов и передача сенсорной информации в ЦНС, которые они способны выполнять благодаря своим уникальным аксонам, имеющим две ветви, одна из которых оканчивается на периферии, а вторая – в спинном мозге.

Тело нейрона не участвует в передаче нервного импульса, в нём синтезируются вещества, необходимые для поддержания функционирования аксона. На основании литературных данных и собственных наблюдений мы предположили, что экспрессируемые в телах нейронов 7 нАХР транспортируются по аксонам к месту их функциональной активности.

Двойное окрашивание среза Рис. 16.

спинномозгового ганглия крысы Alexa-Bgt (зеленый цвет) и антителами к NF200 (красный цвет).

Для подтверждения этого предположения и определения типа нервных волокон, выполняющих данную функцию, было проведено их двойное окрашивание антителами к гистохимическим маркерам и Alexa-Bgt как на срезах спинномозговых ганглиев, так и на срезах нервов в месте пережатия, где накопились транспортируемые вещества. Исходя из ранее полученных результатов (рис. 14г), предполагалось, что большинство переносящих 7 нАХР волокон будут CGRP-иммунопозитивны. Из-за низкого содержания мы не смогли детектировать CGRP и TRPV1 в нервных волокнах на срезах спинномозговых ганглиев, но показали, что Alexa-Bgt-связывающие аксоны были иммунонегативны к NF200 (рис. 16) и, следовательно, с высокой степенью вероятности, были тонкими безмиелиновыми ноцицептивными волокнами.

Рис. 17. Связывание Alexa-Bgt со срезами (а) заднего корешка спинного мозга, (б) спинномозгового нерва, (в) седалищного нерва и (г) переднего корешка спинного мозга крысы в месте их пережатия. Видно накопление 7 нАХР, транспортируемых по аксонам нейронов спинномозговых ганглиев (а, б, в), в отличие от аксонов мотонейронов (г). Стрелками обозначены места пережатия.

Пережатие корешков спинного мозга, спинномозгового и седалищного нервов приводило к накоплению переносимых внутри аксонов веществ, что позволило продемонстрировать интенсивный антероградный (от тела нейрона к окончанию аксона) (рис. 17а-в) и более слабый ретроградный (рис. 17б) транспорт 7 нАХР по отросткам нейронов спинномозговых ганглиев, а также показать иммуногистохимически, что часть данных аксонов CGRP-ергические (рис. 18).

Рис. 18. Двойное окрашивание Alexa-Bgt (зеленый цвет) и антителами к CGRP (красный цвет) среза спинномозгового нерва крысы в месте пережатия. Видно накопление транспортируемых по аксонам 7 нАХР и CGRP. Стрелками обозначены места пережатия. Острием стрелки обозначен один из аксонов, переносящих совместно нАХР и CGRP.

Выводы 1. Получен набор поликлональных антител против синтетических фрагментов 7-субъединицы нАХР и показана возможность их использования для детекции рекомбинантных белков: экстрацеллюлярного домена 7 субъединицы нАХР и полноразмерного рецептора.

2. Установлено, что биотинилированный -кобратоксин может быть использован для детекции 7 нАХР в мембранных препаратах нервной ткани, однако его применимость для гистохимических исследований ограничена.

3. Разработан метод избирательной гистохимической детекции 7 нАХР, основанный на применении флуоресцентно-меченого -нейротоксина длинного типа в качестве маркера и комбинации длинных и коротких нейротоксинов в качестве специфических ингибиторов.

4. С помощью предложенного метода при использовании дополнительных маркеров установлена экспрессия и транспорт 7 нАХР ноцицептивными нейронами спинномозговых ганглиев крыс.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи 1. Шелухина И.В., Крюкова Е.В., Скок М.В., Лыхмус Е.Ю., Жмак М.Н., Мордвинцев Д.Ю., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. Анализ специфичности антител против синтетических фрагментов субъединиц различных нейрональных никотиновых холинорецепторов. Биохимия 2006, 71: 924-935.

2. Tsetlin V., Shelukhina I., Kruykova E., Burbaeva G., Starodubtseva L., Skok M., Volpina O. and Utkin Yu. Detection of 7 nicotinic acetylcholine receptors with the aid of antibodies and toxins. Life Sciences 2007, 80: 2202-2205.

3. Шелухина И.В., Крюкова Е.В., Кашеверов И.Е., Уткин Ю.Н., Цетлин В.И.

Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы нервной и иммунной системы.

Аллергология и иммунология 2008, 9: 436-437.

4. Shelukhina I.V., Kryukova E.V., Lips K.S., Tsetlin V.I. and Kummer W. Presence of 7 nicotinic acetylcholine receptors on dorsal root ganglion neurons proved using knockout mice and selective -neurotoxins in histochemistry. J.Neurochemistry 2009, 109: 1087–1095.

5. Kamynina A.V., Volpina O.M., Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.J., Volkova T.D., Koroev D.O., Samokhin A.N., Nesterova I.V., Shelukhina I.V., Kryukova E.V., Tsetlin V.I., Ivanov V.T., Bobkova N.V. Vaccination with peptide 173-193 of acetylcholine receptor alpha7-subunit prevents memory loss in olfactory bulbectomized mice. J.Alzheimers Dis. 2010, 21: 249-61.

Тезисы докладов:

1. Шелухина И.В., Фуфачева Е.Н., Ильин В.И., Жмак М.Н., Крюкова Е.В., Кашеверов И.Е., Титова М.А., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Алексеев Т.А., Вольпина О.М., Цетлин В.И. Использование антител к иммуноактивным участкам никотиновых холинорецепторов для характеристики их подтипов.

Тезисы докладов и стендовых сообщений научной конференции «Нейрохимия:

фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 2005, 207.

2. Shelukhina I.V., Kryukova E.V., Skok M.V., Zhmak M.N., Kasheverov I.E. and Tsetlin V.I. Analysis of specificity of antibodies produced against synthetic fragments of different neuronal nicotinic acetylcholine receptor subtypes. East-European symposium «Central and peripheral synaptic transmission», Varna, Bulgaria, 2005.

Auton Autacoid Pharmacol. 2006, 26(1), 107.4.

3. Кашеверов И.Е., Уткин Ю.Н., Шелухина И.В., Крюкова Е.В., Кузьмин Д.А., Осипов А.В., Жмак М.Н., Цетлин В.И. Материалы научной конференции «Ионные каналы: структура и функции», С.-Петербург, 2009. Биологические мембраны 2009, 26 (4): 315-316.

4. Шелухина И.В., Крюкова Е.В., Липс К.С., Куммер В. и Цетлин В.И.

Гистохимическая детекция 7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов в нервной ткани. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» Казань, 2009, c.116.

5. Shelukhina I.V., Kruykova E.V., Kasheverov I., Kummer W and Tsetlin V.I. Labeled peptide and protein neurotoxins in detection of nicotinic acetylcholine receptors at normal and pathological states. «The 4th European society for neurochemistry conference on advances in molecular mechanisms of neurological disorders», Leipzig, Germany, 2009. J.Neurochemistry 2009, 110 (1): 80.

6. Kasheverov I., Zhmak M., Khrushchov A., Shelukhina I., Kruykova E., Tsetlin V.

Labeled peptide and protein neurotoxins for basic study on nicotinic acetylcholine receptors and for practical applications. Satellite meeting to the Society for Neuroscience “Nicotinic acetylcholine receptors as therapeutic targets” Chicago, USA, 2009. Biochemical Pharmacology 2009, 78: 902.

7. Шелухина И.В., Крюкова Е.В., Липс К.С., Куммер В. и Цетлин В.И.

Гистохимическое исследование экспрессии 7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов нейронами спинномозговых ганглиев с использованием селективных -нейротоксинов. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75 летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова Москва-Пущино, 2009, 2:

263-266.

8. Shelukhina I.V., Kryukova E.V., Lips K.S., Kummer W. and Tsetlin V.I.

Development of a reliable method for fluorescent histochemical detection of nicotinic acetylcholine receptors in nervous tissue. XII Meeting of the Czech and Slovak neurochemical society. International congress ”Molecular mechamisms of neurological and psychiatric disorders”. Martin, Slovakia, 2009, p. 9. Tsetlin V., Kasheverov I., Shelukhina I., Kuzmin D., Schmalzing G., Laube B. and H.Betz. Extracellular and membrane domains in structure and function of Cys-loop receptors. The fourth ISN special conference “Membrane domains in CNS physiology and pathology”. Erice (Trapani), Sicily, Italy, 2010. J.Neurochemistry 2010, 113 (1), 29.

10. Shelukhina I.V. Alpha 7 nAChRs are expressed by nociceptive neurons in dorsal root ganglia of adult rat. Academies meet: Russian Academy of Sciences and Berlin Brandenburg Academy of Sciences and Humanities. German-Russian symposium:

“Molecular neurobiology today and tomorrow”. Berlin, Germany, 2010.