Получение рекомбинантных белков-киллеров патологических в-клеток
На правах рукописи
Степанов Алексей Вячеславович ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ-КИЛЛЕРОВ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ В-КЛЕТОК Специальность 03.01.03 – «молекулярная биология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2013
Работа выполнена в лаборатории биокатализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).
Научные руководители: Кандидат химических наук Белогуров Алексей Анатольевич Доктор биологических наук Пономаренко Наталья Александровна
Официальные оппоненты: Доктор химических наук Уткин Юрий Николаевич.
Доктор биологических наук Купраш Дмитрий Владимирович.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук.
Защита состоится «27» июня 2013 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: 117997, г. Москва, ул.
Миклухо-Маклая, д.16/10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.
Автореферат разослан 2013 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор физико-математических наук Олейников В. А.
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
I.
Актуальность проблемы.
Рассеянный склероз - это хроническое воспалительное нейродегенеративное за болевание аутоиммунной природы с неизвестной этиологией. Патогенез данного за болевания включает в себя повреждение миелиновой оболочки нервных волокон, что приводит к постепенной утрате различных функций центральной нервной системы, связанных с физическим и психоэмоциональным состоянием больного. Более мил лиона человек болеет рассеянным склерозом во всем мире. Основную роль в патоло гическом процессе демиелинизации аксонов отводят Т- и В-клеткам, специфичным к компонентам миелиновой мембраны. Список потенциальных аутоантигенов постоян но расширяется и включает в себя различные белки, ассоциированные с мембраной олигодендроцитов. Аутореактивные лимфоциты, специфичные к данным белкам, со вместно с макрофагами проникают через гематоэнцефалический барьер и индуциру ют процессы воспалительной демиелинизации в ЦНС.
Вопреки впечатляющему массиву клинических, иммунологических и биохими ческих данных, а также частично изученным молекулярным механизмам, лежащих в основе возникновения и развития заболевания, на сегодняшний день не существует лекарства, способного полностью остановить патологические процессы при рассеян ном склерозе. Препараты, имеющиеся в распоряжении врачей, могут лишь снизить частоту и тяжесть обострений, а также замедлить темпы накопления неврологическо го дефицита, что подтверждается данными магнитно-резонансной томографии голов ного и спинного мозга.
Таким образом, дальнейшее совершенствование существующих подходов или же разработка новых перспективных методов терапии рассеянного склероза является задачей первостепенной важности.
Цель работы и основные задачи исследования.
Цель данной работы заключалась в разработке подходов антиген-специфичной терапии, включающих в себя индукцию иммунотолерантности, а также селективную элиминацию аутореактивных В-клеток, специфичных к миелиновым антигенам.
Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Определение и сравнительный анализ иммунодоминантных фрагментов ОБМ при рассеянном склерозе и экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.
2. Создание композиций иммунодоминантных фрагментов ОБМ, инкапсулирован ных в однослойные маннозилированные липосомы, и последующая терапия экс периментального аутоиммунного энцефаломиелита у крыс линии DA.
3. Создание панели белков-киллеров, способных к специфической элиминации В клеток, на основе барназы, каталитических доменов псевдомонадного и шига подобного токсинов, а также константных доменов иммуноглобулинов мыши и человека. Сравнительный анализ функциональной активности созданных молекул и выбор наилучшего цитотоксического агента.
4. Направленная элиминация аутореактивных В-клеток in vivo у мышей линии SJL полученными белками-киллерами на основе иммунодоминантного фрагмента ОБМ и выбранного цитотоксического агента.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В настоящей работе впервые были определены иммунодоминантные по В клеточному ответу фрагменты основного белка миелина (ОБМ) у пациентов с рассе янным склерозом (РС) в сравнении с рядом животных моделей, развивающих экспе риментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ). Совместное введение данных пептидов в составе маннозилированных однослойных липосом в DA крыс с ЕАЕ по казало существенное снижение общего течения заболевания, значительно ускорило полное восстановление животных и привело к подавлению демиелинизационного процесса. При терапии липосомированными пептидами ОБМ было обнаружено сни жение уровня провоспалительных цитокинов ИЛ-2, ИФН, а также стимуляция сек реции нейротропного фактора мозга в ЦНС. Полученные результаты послужили ос новой для дальнейшего продвижения разработанных композиций в качестве перспек тивного лекарственного средства для терапии рассеянного склероза, которое на сего дняшний день находится на второй стадии клинических испытаний.
В процессе выполнения работы была создана панель селективных белков киллеров В-клеток на основе РНКазы барназы, каталитических доменов псевдомо надного токсина и шига-подобного токсина E.coli, а также константных доменов им муноглобулинов мыши и человека. После ex vivo экспериментов, проведенных на мо дельных системах, были отобраны наиболее перспективные цитотоксические молеку лы на основе барназы и константного домена иммуноглобулина. Заключительный эксперимент, проведенный in vivo на мышах линии SJL с индуцированным ЕАЕ, под твердил значительный терапевтический потенциал константного домена иммуногло булина мыши, слитного с иммунодоминантным фрагментом ОБМ. Двукратное внут ривенное введение данной молекулы приводило к полному подавлению популяции В клеток, специфичных к выбранным на первом этапе фрагментам ОБМ. Полученные данные могут служить основой для дальнейшего получения препаратов антиген специфичной терапии, способных не только купировать обострение, но и существен но облегчить течение рассеянного склероза.
Публикация и апробация работы.
По теме работы опубликовано 3 статьи в журналах, входящих в список ВАК. Резуль таты работы были представлены на 4 конференциях: Biocatalysis 2009: Fundamentals & Applications, (2007, Архангельск);
Российская школа молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии», (2010, Казань);
V Рос сийский симпозиум «Белки и пептиды», (2011, Петрозаводск);
Научная конференция «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова», (2011, Москва);
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, об суждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изло жена на 107 страницах и содержит 36 рисунков и 7 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
.
II.
Сравнительный анализ иммунодоминантных фрагментов ОБМ при рассеянном склерозе и экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.
Для анализа специфичности сывороточных аутоантител использовали созданную ранее эпитопную библиотеку фрагментов ОБМ, слитных с белком-носителем тиоре доксином (Рис. 1). Каждый белок эпитопной библиотеки содержал белок-носитель тиоредоксин (Trx), один из 12 взаимно перекрывающихся фрагментов ОБМ, а также myc эпитоп. Для подтверждения работоспособности созданной библиотеки эпитопов, очищенные белки разделяли в 12% ПААГ, а затем, после переноса на нитроцеллю лозную мембрану, гибридизовали с анти-myc и анти-ОБМ антителами (Рис. 1).
Рис. 1. Схематическое изображение эпитоп ной библиотеки фрагментов ОБМ, слитных с белком-носителем тиоредоксином. Электро форетический анализ белков эпитопной биб лиотеки в 12% ПААГ, окрашенный Кумасси.
Вестерн-блот анализ белков эпитопной биб лиотеки с контрольными анти-myc и анти ОБМ антителами.
После проведенной верификации библиотека эпитопов была использована для дальнейшего тестирования сывороточ ных аутоантител из пациентов с РС и грызунов с индуцированным ЕАЕ (Рис. 2). На личие перекрывающихся последовательностей ОБМ в составе белков эпитопной биб лиотеки позволяет более точно детерминировать предположительный эпитоп ауторе активных В-клеток. В результате анализа полученных данных у мышей линии C57BL/6 был обнаружен один иммунодоминантный эпитоп ОБМ124-147, в то время как у мышей линии SJL/J и у крыс линии DA два (ОБМ24-44, ОБМ72-139 и ОБМ40-60, ОБМ107 170 соответственно). У пациентов с рассеянным склерозом были выявлены три имуно доминантных эпитопа: ОБМ42-65, ОБМ84-100 и ОБМ115-170, что оказалось в значительной степени схоже с данными по связыванию аутоантител, полученных из DA крыс (Рис.
2Б). На основе первичного скрининга для дальнейшего изучения подходов по индук ции толерантности и направленной элиминации В-клеток были выбраны крысы ли нии DA и мыши линии SJL, соответственно.
Для формирования аутоантител у крыс DA с ЕАЕ не только к С-концевой после довательности, но и к иммунодоминантному фрагменту ОБМ83-104, а также для полу чения более стабильно воспроизводимой модели ЕАЕ, для дальнейших иммунизаций нами был выбран пептид ОБМ63-81. Образцы крови, полученные у крыс, иммунизиро ванных ОБМ63-81, были проанализированы на наличие связывания аутоантител с ОБМ и его фрагментами в составе эпитопной библиотеки (Рис. 3А). В результате данного эксперимента были обнаружены 3 иммунодоминантные последовательности ОБМ:
MDHARHGFLPRH, QDENPVVHFFKNIV и IFKLGGRDSRSGSPMARR.
Для количественной оценки аффинности сывороточных аутоантител, полученных из DA крыс c ЕАЕ, к выбранным фрагментам ОБМ нами были произведены измере ния констант диссоциации аутоантител методом поверхностного плазмонного резо нанса на приборе BiaCore T-200. Анализ полученных данных показал, что константа диссоциации сывороточных аутоантител составляет 210-8 М в случае ОБМ как ли ганда, 110-8 М для энцефалитогенного и 0.810-8 М для С-концевого фрагмента ОБМ.
Константу диссоциации процесса взаимодействия аутоантител с пептидом MDHARHGFLPRH посчитать не представлялось возможным (Рис. 3Б). В конечном итоге для дальнейшего создания действующих композиций антиген специфической терапии, Рис. 2. А) Индивидуальный профиль связывания сыво роточных аутоантител, изо лированных из пациентов с РС (градиентная окраска) в сравнении со здоровыми до норами (верхняя левая па нель) и грызунами с индуци рованным ЕАЕ (мыши SJL, крысы линии DA, мыши ли нии C57BL/6;
по часовой стрелке, начиная с правой верхней панели. Профили сравнения представлены го лубым сетчатым полем). Б) Интегральная специфичность сывороточных аутоантител в каждой из исследуемых групп. Латинскими буквами A-G отмечены обнаруженные иммунодоминантные фраг менты ОБМ. Цифрами 1- обозначены перекрываю щиеся фрагменты ОБМ в со ставе эпитопной библиотеки.
индуцирующих иммунотолерантность, нами были отобраны следующие пептиды:
ОБМ46-62 (ОБМ1), ОБМ124-139 (ОБМ2) и ОБМ147-170 (ОБМ3).
При анализе сывороточных аутоантител, выделенных из мышей линии SJL с ЕАЕ, индуцированным ОБМ, уровень гибридизации с 7 фрагментом оказался значи тельно выше по сравнению с 6 и 8 фрагментами библиотеки эпитопов ОБМ (Рис. 2).
Можно предположить, что основной сайт связывания с сывороточными антителами включает в себя полностью последовательность пептида 7 (TQDENPVVHF FKNIVTPRTPPPS), а связывание с 6 и 8 фрагментами объясняется взаимодействием с C-концевой последовательностью 6 пептида (QDENPVVHFFK) и N-концевой после довательностью 8 пептида (FKNIVTPRTPPPSQG). Помимо центральной части ОБМ, высокий уровень сигнала ИФА был обнаружен для 10 пептида ОБМ.
Рис. 3. Анализ специфичности и аф финности поликлональных аутоанти тел изолированных из DA крыс, им мунизированных пептидом ОБМ63-81.
А) Гибридизация с белками эпитопной библиотеки ОБМ сывороточных анти тел, выделенных из крыс DA с инду цированным ЕАЕ. Б) Измерение кон стант диссоциации поликлональных антител из крыс DA с индуцирован ным ЕАЕ по отношению к ОБМ и его иммунодоминантным фрагментам.
Аналогично крысам ли нии DA мы провели оптимиза цию протокола и в случае ин дукции ЕАЕ у мышей линии SJL. Для этого в качестве ос новного нейроантигена был ис пользован гомогенат спинного мозга мыши (ГСММ). Известно, что при индукции ЕАЕ ГСММ у SJL, по сравнению с ОБМ, про исходит более интенсивное развитие симптомов заболевания. Данный способ индук ции приводит к более воспроизводимой модели данной патологии. При индукции ЕАЕ у мышей SJL с применением ГСММ, профиль специфичности аутоантител к ОБМ в большей степени совпадает с сыворотками больных рассеянным склерозом.
Так как при индукции ЕАЕ у мышей SJL с помощью ГСММ наибольший титр анти ОБМ антител формируется к иммунодоминантному фрагменту ОБМ (QDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQG), данная аминокислотная последовательность была интегрирована в состав рекомбинантных молекул, способных селективно эли минировать аутореактивные В-клетки. Белки-киллеры, содержащие фрагмент 11 ОБМ (RASDYKSAHKGFKGVDAQGTLSKIFKL), к которому не наблюдается формирова ния аутоантител, были использованы в качестве отрицательного контроля.
Создание липосом, содержащих инкапсулированные фрагменты ОБМ.
Для повышения эффективности антиген-специфичной терапии отобранные ра нее иммунодоминантные пептиды ОБМ были инкапсулированы в однослойные липо сомы (SUV), несущие остатки маннозы на своей поверхности. Основное преимущест во данной композиции заключается в том, что немодифицированные иммунодоми нантные пептиды представлены в нативном виде внутри липосомы, в то время как маннозные остатки на ее поверхности обеспечивают адресную доставку липосомных наноконтейнеров в антиген-представляющие клетки (АПК).
Липосомы состояли из смеси L--фосфатидилхолина (Egg PC) с мономаннозил диолеил глицерином DOG (MannDOG) (Рис. 4А) в молярном соотношении 100 к 1.
Процесс получения наноконтейнеров включал в себя следующие этапы (Рис. 4Б): (1 2) Формирование неупорядоченных липидных слоев при выпаривании органического растворителя с последующей первичной регидратацией, приводящей к формирова нию многослойных липосом. (3) Обработка липосом высоким давлением с образова нием однослойных липосом. (4) Криосушка однослойных липосом с добавленными пептидами. В результате осуществления данной стадии пептиды оказывались распо ложены между сжатыми однослой ными липосомами. (5) Инкапсуля ция пептидов в однослойные липо сомы размера 60-100 нм, содержа щих 1% маннозных остатков на своей поверхности, происходит во время вторичной регидратации.
Рис. 4. Схема создания наноконтейнеров с инкапсулированными фрагментами ОБМ.
А) Химические формулы липидов Egg PC и MannDOG, использованных для создания липосом. Аминокислотные последова тельности пептидов ОБМ1, ОБМ2 и ОБМ3, использованных для создания липосо мальных композиций. Б) Процесс получе ния липосомных наноконтейнеров.
Для подтверждения пре имущества доставки пептидов в со ставе маннозилированных липосом по сравнению с липосомами без остатков манно зы, были созданы липосомные композиции полипептида, содержащего последова тельность myc-эпитопа: myc mSUV и myc SUV (индекс m означает наличие маннозы).
Далее полученные липосомы в различных концентрациях инкубировали 2 часа с ден дритными клетками, изолированными из крови крысы. После этого клетки отмывали, лизировали и далее осветленный гомогенат переносили на нитроцеллюлозную мем брану. Количество myc пептида, интернализованного в дендритные клетки, в зависи мости от изначальной концентрации липосом и наличия или отсутствия маннозы на их поверхности анализировали гибридизацией с анти-myc антителами. Для определе ния эквивалентности количества нанесенных клеточных лизатов мембрану дополни тельно гибридизовали с антителами, специфичными к актину (Рис. 5А). Интенсив ность сигнала после окрашивания была оценена денситометрически на приборе VersaDoc (BioRad) (Рис. 5Б). Как видно из Рис. 5, количество myc пептида в клеточ ном лизате после инкубации дендритных клеток с myc-содержащими маннозилиро ванными mSUV липосомами заметно выше, чем при инкубации с myc SUV. Данное наблюдение подтверждает более высокую эффективность захвата дендритными клет ками маннозилированных липосом, по сравнению с не маннозилироваными.
Рис. 5. Сравнение эффективности ин тернализации полипептида, содержа щего myc эпитоп, в составе липосом с MannDOG и без. А) Гибридизация кле точного лизата дендритных клеток с антителами к myc эпитопу и актину.
Б) Денситометрический анализ коли чества интарнализованного myc пеп тида.
Антиген-специфичная иммуномодулирующая терапия ЕАЕ у крыс линии DA пептидами ОБМ, инкапсулированными в липосомы.
Для проведения дальнейших экспериментов были созданы четыре варианта различных композиций липосом, включающих в себя как индивидуально каждый из трех пептидов, так и эквимолярную смесь пептидов для изучения потенциального си нергетического эффекта. Для изучения терапевтических свойств полученных форму ляций мы проводили подкожные инъекции пептидов в составе липосом крысам линии DA с индуцированным ЕАЕ (Рис. 6А). В качестве положительного и отрицательного контроля нами были использованы терапевтический препарат Copaxone (синтетиче ский сополимер L-аминокислот Glu, Lys, Ala и Tyr) и липосомы, не содержащие пеп тиды ОБМ, соответственно. Терапию начинали в момент проявления первых клини ческих признаков развития заболевания. В группе животных, которым вводили пус тые липосомы, наблюдалась наибольшая смертность (3/20), один смертельный случай был зарегистрирован в группе ОБМ2 mSUV (1/23), в остальных группах смертельных случаев зафиксировано не было (Табл. 1).
Табл. 1. Средние максимальная и кумулятивная степень развития ЕАЕ у крыс линии DA при введении различных липосомальных композиций в сравнении с Copaxone и контрольной группой.
Количество Количество Средняя максимальная степень Средняя кумулятивная степень Инъекции животных в летальных развития заболевания (IQR ) развития заболевания (IQR ) 3 группе исходов без терапии 20 3 (0.5) 22 (12.5) 3/ ОБМ1 mSUV 2 (1)1 17 (5.5) 22 0/ ОБМ2 mSUV 3 (0.75)2 17.5 (26.75) 23 1/ ОБМ3 mSUV 3 (0)2 15 (11) 25 0/ ОБМ1/2/3 mSUV 3 (0.75)1 14 (5.25) 24 0/ 2 (1.25)1 18.5 (12.5) Copaxone 22 0/ ОБМ1 3 (0.5)2 19.5 (22) 21 1/ p0.05 статистически достоверное различие в сравнении с отрицательным контролем;
дисперсионный анализ для непара метрической статистики методом Вилкоксона. 2p0.05 статистически недостоверное различие в сравнении с отрицательным контролем;
дисперсионный анализ для непараметрической статистики методом Вилкоксона. 3Интерквартильное значение.
Из данных таблицы 1 следует, что в группах животных, которым вводили ОБМ mSUV, ОБМ 1/2/3 mSUV и Copaxone, наблюдалось максимальное статистически дос товерное снижение уровня развития заболевания. Введение ОБМ1 mSUV эффективно подавляло развитие заболевания на начальной стадии (Рис. 6Б), в то время как пепти ды ОБМ2 и ОБМ3 снижали уровень развития заболевания на стадии вторичного обо стрения (Рис. 6Б). Совместное введение пептидов ОБМ1/2/3 значительно снижало степень развития симптомов ЕАЕ на всех стадиях, о чем свидетельствует самое низ кое во всех группах значение средней кумулятивной степени развития заболевания (Табл. 1;
Рис. 6В). Применение Copaxone (Рис. 6) оказалось близким по эффективно сти к действию смеси ОБМ1/2/3 в составе липосом. Основным преимуществом тера пии инкапсулированными пептидами ОБМ над Copaxone является полное восстанов ление крыс после проведения терапии. Как и ожидалось, введение пептида ОБМ1 без предварительной инкапсуляции в липосомы значительно снижает его терапевтиче ский эффект (Рис. 6), что свидетельствует о важности использования процесса липо сомирования в предложенном подходе.
Для подтверждения терапевтического эффекта созданных композиций из каждой экспериментальной когорты нами было отобрано по одному животному со средним профилем развития ЕАЕ, характерным для каждой группы (Рис. 7А). Криосрезы спинного мозга отобранных животных были обработаны красителем гемактоксилин эозин (Рис. 7Б) для визуализации процессов глиозиса и демиелинизации в ЦНС (в баллах от 0 до 3). В результате проведенного гистологического анализа было под тверждено изначальное наблюдение, свидетельствующее об эффективности ОБМ2 по подавлению пиковой тяжести заболевания. Из рисунка 17 очевидно, что ОБМ1 и ОБМ2, в свою очередь, ускоряют выход животных на стадию полного выздоровления.
Дополнительно в опытных группах нами были сопоставлены титры сывороточ ных антител к полноразмерному ОБМ и его иммунодоминантным фрагментам ОБМ81 103 и ОБМ146-170. При введении композиций ОБМ1 mSUV, ОБМ1/2/3 mSUV и Copaxone, в сравнении с контрольной группой, наблюдалось значительное снижение титра антител к ОБМ и его фрагментам (Рис. 8). Несмотря на то, что иммунодоми нантный фрагмент ОБМ81-103 не был включен в состав ни одной из липосомных ком позиций, следует отметить снижение уровня аутоантител к данному эпитопу в сыво ротках леченых крыс. Одновременно с понижением титра аутоантител введение ОБМ1 mSUV, ОБМ1/2/3 mSUV и Copaxone крысам DA с ЕАЕ значительно снижает присутствие в ЦНС провоспалительных цитокинов ИЛ-2 и ИФН, а также повышает концентрацию нейротрофического фактора головного мозга (НФГМ), ответственного за развитие нейронов (Рис. 9). Эти данные находятся в соответствии с гистологиче скими срезами спинного мозга, окрашенными красителем luxol fast blue, который ви зуализирует повреждения миелиновой оболочки аксонов.
Рис. 6. Терапия экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита в крысах линии DA иммуно доминантными петидами ОБМ, инкапсулированными в липосомы. А) Схематическое изображение вводимых композиций с указанием состава и количества инкапсулированных пептидов. Б) Экспери ментальные группы животных оценивали по усредненной степени развития симптомов заболевания.
В) Сравнительный анализ средней кумулятивной и средней максимальной степени развития ЕАЕ у DA крыс в различных экспериментальных группах (В, левая и средняя панель, соответственно). Сопос тавление интегральной терапевтической эффективности (произведение тяжести развития заболева ния на дни) пептидов ОБМ в составе липосом по сравнению с контролем (В, левая панель).
Рис. 7.
А) Из каждой экспериментальной группы было выбрано животное с профилем развития ЕАЕ (сплош ная линия), наиболее приближенным к среднему профилю по всей группе (продольные зеленые и красные линии). Б) Гистологический анализ повреждений в ЦНС у крыс DA с индуцированным ЕАЕ в различных экспериментальных группах.
Рис. 8.
Сравнение титра сыворо точных аутоантител к пол норазмерному ОБМ и его иммунодоминантным фрагментам ОБМ81-103 и ОБМ146-170 у крыс линии DA с ЕАЕ, подвергнутых терапии, в сравнении животными из контрольной группы с ЕАЕ без лечения и интактных животных.
Рис. 9.
Гистологические срезы спинного мозга крыс DA из групп mSUV, Copaxone, ОБМ1 mSUV и ОБМ123 mSUV. Для вы явления повреждений миелиновой оболочки аксонов использовали краситель luxol fast blue. Гибридизация срезов с антителами, специфичными к ИФН, ИЛ-2 и НФГМ, для опре деления цитокинового статуса ЦНС.
Таким образом, в настоящей работе нам удалось впервые определить иммуно доминантные фрагменты ОБМ при развитии ЕАЕ у крыс линии DA. На основании проведенных экспериментов были отобраны пептиды ОБМ для создания препаратов антиген-специфичной терапии ЕАЕ. Совместное введение данных пептидов в составе маннозилированных однослойных липосом существенно снижает общее течение за болевания, улучшает выход опытных животных из стадии обострения, подавляет де миелинизацию, а также снижает уровень провоспалительных цитокинов ИЛ-2, ИФН и стимулирует секрецию нейротропного фактора мозга в ЦНС. Наши данные свиде тельствуют, что введение пептидов ОБМ в составе маннозилированных липосом спо собствует увеличению терапевтического эффекта вследствие экспонированных остат ков маннозы. Так как АПК имеют на своей поверхности большое количество ман нозных рецепторов, адресная доставка антигена в этом случае проходит наиболее эф фективно. В нашем исследовании липосомы вводили подкожно, поэтому представля ется маловероятным, что они могли проникнуть через гематоэнцефалический барьер в ЦНС. Предположительно, после интернализации фрагменты ОБМ презентируются на поверхности АПК в составе MHC II класса, после чего происходит стимуляция об разования популяции регуляторных клеток, способных проникать через ГЭБ и подав лять аутореактивные клетки (Рис. 10).
Полученные результаты послужили основой для дальнейшего продвижения разработанных композиций в качестве перспективного лекарственного средства для терапии рассеянного склероза, которое на сегодняшний день находится во второй стадии клинических испытаний.
Рис. 10. Предположительный механизм терапевтиче ского действия пептидов ОБМ, инкапсулированных в маннозилированные липосомы.
Направленная элиминация В-клеток белками-киллерами.
Вторым перспективным направлением разработки препаратов для лечения РС является создание цитотоксических молекул высокой избирательности, способных направленно удалять популяцию аутореактивных В-клеток с заранее известной спе цифичностью. Молекулы данного класса состоят из двух функциональных частей – цитотоксического агента и сигнальной последовательности, направляющей белок киллер к клетке-мишени.
В результате анализа литературных данных в качестве цитотоксической состав ляющей белков-киллеров были выбраны: РНКаза барназа, каталитические домены псевдомонадного токсина (ЕТА) и шига-подобного токсина E.coli (ШПТ), а также константный до мен иммуноглобулина мыши и человека (Fc домен IgG).
Рис. 11. Схематическое изображение вы бранных механизмов специфической элиминации В-клеток.
Таким образом, нами был отобран ряд цитотоксических белков-киллеров, каж дый из которых приводит к гибели клетки-мишени по различному механизму (Рис.
11).
Для сравнения эффективности различных цитотоксических молекул и под тверждения работоспособности предложенной концепции, нами были созданы ре комбинантные молекулы на основе барназы, ЕТА, ШПТ и Fc домена IgG, слитные с сигнальной последовательностью – пептидом, содержащим myc эпитоп (CEQKLISEEDL) (Рис. 12 и Рис. 13). В свою очередь, в качестве модельной линии В клеток была выбрана гибридома C-MYC, имеющая на своей поверхности БкР, специ фичный к myc эпитопу. Сравнительный анализ эффективности цитотоксических агентов на модельной системе C-MYC позволил выбрать лучший агент для дальней шей элиминации природных антиген-специфичных В-клеток при ЕАЕ.
Создание генетических конструкций рекомбинантных белков-киллеров.
Для получения генетической конструкции, кодирующей рекомбинантный ши га-подобный токсин E.coli, слитный с myc эпитопом, была использована геномная ДНК Е.coli штамма серотипа О157:Н7, которую любезно предоставили Скрябин К.Г.
и Равин Н.В. Источником нуклеотидной последовательности Fc домена человеческо го антитела класса IgG1 послужил вектор pBudCE4.1/CMV LeadH, созданный ранее в нашей лаборатории, в который была дополнительно интегрирована последователь ность myc эпитопа (Рис. 12). Генетические конструкции, кодирующие барназу и псевдомонадный токсин, слитных с myc эпитопом (Рис. 12), были любезно предос тавлены заведующим лаборатории молекулярной иммунологии ИБХ РАН д.б.н. чл-корр. РАН профессором Деевым С.М.
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков-киллеров.
Полученные генетические конструкции были использованы для препаративной наработки рекомбинантных белков-киллеров в клетках E.coli.
Рис. 12. Карты генетических конструкций, со держащих нуклеотидные последовательности, кодирующие рекомбинантный псевдомонад ный токсин А), барназу Б), шига-подобный ток син E.coli В) и константный домен иммуногло булина человека Г), слитных с myc эпитопом.
Рис. 13. Схематическое изображение структуры созданных белков-киллеров В-клеток.
Так как молекулы барназы-myc, ЕТА-myc и ШПТ-myc содержали в своем со ставе 6-ти гистидиновый кластер (Рис. 13), то качестве первой стадии очистки белков из клеточных лизатов применяли металлохелатную хроматографию, с последующей финальной очисткой на гель-фильтрационной колонке Superdex75.
Для получения стабильной линии клеток, продуцирующих рекомбинантную молекулу Fc-linker-myc и контрольную молекулу Fc-linker, клетки линии CHO транс фицировали методом липофекции с помощью набора Lipofectamine LTX (Invitrogen) генетическими конструкциями pBudCE4.1CMV LeadH-linker-c-myc и pBudCE4.1CMV LeadH-linker соответственно. Fc-содержащие молекулы очищали из ростовой среды методом аффинной хроматографии на смоле с иммобилизованным G белком и далее на гель-фильтрационной колонке Superdex200. После очистки наличие рекомбинант ного белка нужного размера определяли с помощью электрофоретического разделе ния очищенных фракций в 12% ПААГ по Лэммли и окраской красителем Кумасси (Рис. 14А).
Рис. 14.
А) Электрофоретический анализ степени гомогенности очищенных молекул.
Б) Гибридизация рекомбинантных молекул с анти-myc и анти-Fc антителами.
Анализ функциональной активности полученных белков-киллеров.
Все очищенные рекомбинантные белки были протестированы на наличие myc эпитопа гибридизацией с моноклональными анти-myc антителами, методом имму ноблоттинга по Вестерну с использованием моноклональных антител к myc эпитопу (Рис. 14Б).
Функциональную активность выделенных рекомбинантных белков на основе барназы подтверждали инкубацией с РНК в отсутствии и с добавлением ингибитора РНКазы А. Было показано, что барназа эффективно гидролизует дрожжевую РНК, при этом ингибитор РНКазы А не оказывает ощутимого влияния на ее ферментатив ную активность (Рис. 15).
Для анализа эффективности подавления трансляции in vitro созданными имму нотоксинами, различные концентрации рекомбинантной барназы, псевдомонадного и шига-подобного токсинов добавляли к S30 экстракту клеток мышиного асцита, содер жащего экзогенную мРНК, кодирующую люциферазу светлячка. После чего измеряли люциферазную активность (Рис. 16).
Для подтверждения функциональной активности рекомбинантных Fc в формате ИФА была определена степень их связывания с C1q компонентом системы комплемента в сравнении с полноразмерными антителами (Рис. 17).
Рис. 15. РНК-гидролизующая активность реком бинантных молекул барназы и барназы-myc.
Рис. 16. Влияние барназы, барназы-myc А), псевдомонадного и шига-подобного токси нов Б) на трансляцию люциферазы в кле точном экстракте.
Рис.17. Связывание C1q компонента системы комплемента рекомбинантными молекулами Fc linker и Fc-linker-c-myc.
Исследование цитотоксических свойств белков-киллеров ex vivo.
Для сравнения цитотоксического потенциала полученных иммунотоксинов вы деленные рекомбинантные белки инкубировали с гибридомной линией клеток C MYC, в качестве отрицательного контроля применяли гибридомную линию клеток 1B4F4, не несущую на своей поверхности анти-myc БкР.
Согласно полученным данным были построены кривые зависимости процента живых клеток в зависимости от концентрации цитотоксических молекул (Рис. 18). В качестве отрицательного контроля для молекул барназа-myc и Fc-linker-myc исполь зовали молекулы барназы и Fc-linker, не содержащих myc эпитопа (Рис. 18Б,Г).
Рис. 18. Зависимость процента выживших клеток C-MYC (сплошная линия) и 1B4F4 (пунк тирная линия) от концентрации рекомбинантных белков киллеров. Время инкубации часа.
Анализ функциональной активности панели рекомбинантных белков-киллеров, проведенной на модельных клетках C-MYC, продемонстрировал высокую степень специфической цитотоксичности созданных молекул. На основании полученных ре зультатов была определена LD50 рекомбинантных иммунотоксинов для клеток линии C-MYC (Табл. 2). Наиболее сильным цитотоксическим действием обладал рекомби нантный псевдомонадный токсин, однако данная молекула продемонстрировала и наиболее высокую неспецифическую цитотоксичность. Шига-подобный токсин пока зал средние показатели специфичности и цитотоксичности на модельных клетках.
Поэтому для дальнейшей работы нами были выбраны белки-киллеры на основе бар назы и Fc домена антитела, так как они показали наименьшую степень неспецифиче ского цитотоксического действия, и эффективно элиминировали клетки-мишени (Табл. 2).
Табл. 2. Значения LD50 действия полученных иммунотоксинов на модельную линию клеток C-MYC.
Рекомбинантная молекула Наличие myc эпитопа LD50 для клеток линии C-MYC + псевдомонадный токсин 0,05 мкМ шига-подобный токсин E.coli + 0,44 мкМ + 0,11 мкМ барназа - 10 мкМ + ~0.002 мкМ Fc домен IgG - 10 мкМ Селективная элиминация целевых В-клеток в культуре спленоцитов.
В дальнейшем для достоверного подтверждения разрабатываемой концепции нами был предложен ряд дополнительных экспериментов на нативных В-клетках.
Для идентификации myc-специфичных В-клеток был создан химический конь югат БСА-ФИТЦ-myc (Рис. 19).
Рис. 20. Подтверждение функциональной актив ности молекулы БСА ФИТЦ-myc.
А) Изменения профиля хроматографии молеку лы БСА-ФИТЦ-myc после гибридизации с анти-myc антителами по сравне нию с контрольными разделениями.
Б) Анализ хроматографи ческих фракций в ПААГ на наличие флуоресцент ной группы в составе белковых молекул.
Рис 19. Схематическое изображение получения молекулы БСА-ФИТЦ-myc.
В результате проведенного анализа было подтверждено, что созданный конью гат взаимодействует с анти-myc антителами и несет на себе флуоресцентные группы (Рис. 20). Подобные свойства могут быть использованы для визуализации популяции myc-специфичных В-клеток при анализе на проточном цитофлуориметре.
У мышей линии BALB/c стимулировали иммунный ответ к myc пептиду путем их иммунизации химически конъюгированным белком KLH-myc. Через 3 недели по сле иммунизации из селезенки опытных мышей была получена культура спленоци тов, содержащая популяцию В-клеток, специфичных к myc эпитопу. В качестве ос новных подходов для анализа эффективности действия иммунотоксинов применяли два метода: проточная цитофлуориметрия и анализ концентрации суммарных и myc специфических антител. Для подсчета процента myc-специфичных B-клеток выде ленные спленоциты инкубировали с молекулой БСА-ФИТЦ-myc и анти-B220-APC антителами (B220 – поверхностный маркер В-клеток, eBioscience), после чего клетки анализировали на проточном цитофлуориметре FACSDiva (BD). В результате прове денных экспериментов, нами было показано наличие В-клеток, специфичных к myc эпитопу в культуре спленоцитов из иммунизированной мыши (Рис. 21 секция 1), в то время как в культуре клеток, изолированных из неиммунизированной мыши, данная популяция клеток отсутствовала (Рис. 21 секция 2). Для изучения цитотоксического действия созданных белков-киллеров культуру спленоцитов инкубировали с барназой и константным доменом иммуноглобулина, слитными с myc эпитопом. Как видно из представленных данных, инкубация клеток с контрольными молекулами барназы (Рис. 21 секция 4) и Trx-myc (Рис. 21 секция 5) не приводит к статистически значимо му подавлению целевой популяции. В то время как инкубация клеток с молекулой барназа-myc приводит к значительному, приблизительно трехкратному, уменьшению популяции целевых клеток (Рис. 21 секция 3).
Для изучения цитотоксического действия молекулы Fc-linker-myc на myc специфичные В-клетки данная молекула была аналогичным образом добавлена в культуру спленоцитов, изолированных из мыши линии BALB/c, иммунизированной конъюгатом KLH-myc. В качестве отрицательного контроля цитотоксического дей ствия мы использовали молекулу Fc-linker. Инкубацию спленоцитов с Fc-linker-myc и Fc-linker производили в течение 72 часов, ежедневно отбирая образец культуральной среды. Далее в отобранных образцах методом ИФА был определена тотальная кон центрация иммуноглобулинов, а также концентрация специфических анти-myc анти тел (Рис. 22).
Как видно из Рис. 22, при инкубации изолированных спленоцитов с молекулой Fc-linker-myc в сравнении с контролями происходит значительное снижение продук ции myc-специфичных антител, в то время как общая концентрация IgG остается не изменной. Данный факт однозначно свидетельствует о способности молекулы Fc linker-myc селективно подавлять экспрессию myc-специфичных антител.
Рис. 22. Снижение титра анти-myc антител в Рис. 21. Анализ подавления популяции В-клеток, культуре спленоцитов при инкубации с моле специфичных к myc эпитопу, в культуре спленоцитов кулой Fc-linker-myc (квадраты) по сравнению с после инкубации с рекомбинантными молекулами контрольными белками Fc-linker (треуголь барназа-myc (3), барназа (4) и Trx-myc (5), по сравне- ники) и Trx-myc (круги). Тотальный уровень нию с контрольной культурой (1) и интактными иммуноглобулинов в культуре оставался не спленоцитами из неиммунизированной мыши (2). изменным во всех образцах Элиминация аутореактивных В-клеток in vivo.
Заключительной стадией изучения терапевтического потенциала созданных белков-киллеров являлось проведение селективной элиминации аутореактивных ОБМ-специфичных В-клеток in vivo у мышей линии SJL с индуцированным ЕАЕ. В результате тестирования панели созданных белков-киллеров на предыдущих этапах наиболее перспективными оказались молекулы барназы и константного домена им муноглобулина. Для финального теста из двух озвученных кандидатов нами был вы бран константный домен иммуноглобулина. Основное преимущество Fc при проведе нии экспериментов in vivo состоит в меньшей иммуногенности и в значительной мо лекулярной массе, превышающей 60 кДа, что позволяет молекуле долгое время не отфильтровываться в почечных гломерулах.
При проведении предварительных in vitro и ex vivo экспериментов нами был использован Fc домен иммуноглобулина человека. Для предотвращения иммунной реакции организма мыши на вводимый препарат нами были созданы генетические конструкции, кодирующие Fc домен антитела мыши, слитный с фрагментами ОБМ.
Для этой цели нами был использован коммерчески доступный плазмидный вектор pFUSE (Invivogen), содержащий константный домен иммуноглобулина мыши класса IgG2a. В данный вектор была интегрирована нуклеотидная последовательность фраг ментов ОБМ 7 (QDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQG) и (RASDYKSAHKGFKGVDAQGTLSKIFKL). Рекомбинантные молекулы pFm-7 и pFm 11 были наработаны и очищены по аналогичному протоколу получения молекул Fc linker-myc и Fc-linker. Гомогенность полученных препаратов, согласно электрофоре тическому анализу, составила более 95%. Все выделенные рекомбинантные белки тестировали на наличие пептида ОБМ путем их блоттинга по Вестерну и дальнейшей гибридизации с анти-ОБМ (Рис. 23Б) и анти-Fc (Рис. 23А) антителами. Гибридизация с анти-ОБМ антителами подтвердила, что молекулы pFm-7 и pFm-11 содержат пепти ды ОБМ, в то время как контрольная молекула pFm не содержит его фрагментов в своем составе.
Для формирования популяции аутореактивных В-клеток, специфичных к ОБМ, ЕАЕ был индуцирован у мышей линии SJL. Для этого животным производили двукратные подкожные инъекции гомогената спинного мозга мыши в эмульсии ПАФ, дополнительно для усиления развития ЕАЕ в те же дни живот ным внутривенно вводили раствор Pertussis toxin. В качестве отрицательного контроля была использована группа интактных мышей без заболевания (группа – Контроль). Мышей с индуци рованным ЕАЕ разделили на 5 экспериментальных групп по голов в каждой: (1) без терапии;
(2) животным однократно вво Рис. 23. Гибридизация дили 200 мкг Copaxone (Teva) (группа - Copaxone);
животным в рекомбинантных мо каждой группе дважды внутривенно вводили (3) pFm (группа лекул pFm-7, pFm-11 и pFm с анти-Fc А) и ан pFm), (4) pFm-7 (группа - pFm) или (5) pFm-11 (группа - pFm-11) ти-ОБМ антителами Б).
(Табл. 3).
Табл. 3. Экспериментальные группы.
Животных Количество День мкг/ Группа ЕАЕ Инъекции в группе инъекций инъекции гол Контроль 5 - - - - Без терапии 10 + - - - 200 мкг Copaxone 10 + Copaxone 1 5 и 10 50 мкг pFm 10 + pFm 5 и 10 50 мкг pFm-7 10 + pFm-7 5 и 10 50 мкг pFm-11 10 + pFm-11 На седьмой день с начала индукции ЕАЕ и до окончания эксперимента во всех группах производили оценку развития симптомов ЕАЕ по 5 бальной шкале. На 14- день после индукции заболевания у мышей во всех группах начинали развиваться симптомы ЕАЕ, а на 17-19 дни заболевание достигало пика обострения. На 23 день после начала эксперимента из каждой экспериментальной группы были отобраны мыши SJL с одинаковой клинической картиной развития ЕАЕ (Рис. 24А). Культуры спленоцитов, полученные из этих мышей, анализировали на наличие В-клеток, спе цифичных к иммунодоминантной и С-концевой последовательностям ОБМ. Для это го клетки инкубировали с фрагментами ОБМ 7 и 12, конъюгированных с биотином.
Для визуализации В-клеток использовали конъюгат анти-B220 антител с флуорофо ром APC (eBioscience), в свою очередь биотинилированные пептиды ОБМ, связанные с поверхностными рецепторами, детектировали добавлением конъюгата стрептавиди на с флуорофором Pacific Blue™ (eBioscience). Образцы анализировали методом про точной цитофлуориметрии на приборе FACSDiva (BD), результаты представлены на (Рис. 24Б).
Рис. 24.
А) Степень развития ЕАЕ у мышей линии SJL, ото бранных из каждой экспе риментальной группы.
Б) Анализ изолированных спленоцитов на наличие В клеток, специфичных к 7 и 12 фрагментам ОБМ, ме тодом проточной цитоф луориметрии.
Как видно из Рис. 24Б у мыши из группы “контроль” отсутствовала популяция В-клеток, специфичных к ОБМ, в то время как в культуре спленоцитов, полученной у животного из группы “без терапии”, существует большая популяция В-клеток, спе цифичных к обоим пептидам ОБМ. При однократном введении препарата Copaxone в культуре клеток оставалась популяция В-клеток, имеющих на своей поверхности БкР, специфичный только к 12 фрагменту. Данное наблюдение в очередной раз подтвер ждает, что терапевтическое действие Copaxone направленно на популяцию В-клеток, специфичных к иммунодоминантному эпитопу ОБМ (7 пептиду). Как и ожидалось, внутривенные инъекции контрольной молекулы pFm, не содержащей пептиды ОБМ, а также контрольной молекулы pFm-11 не привело к подавлению целевой популяции В-клеток. В свою очередь введение молекулы pFm-7 приводило к полной элиминации В-клеток, специфичных не только к 7 фрагменту, который присутствует в составе мо лекулы pFm-7, но и к 12 фрагменту. Таким образом, после терапии молекулой pFm-7, пул В-клеток, специфичных к ОБМ, в культуре спленоцитов из леченой мыши совпа ло с профилем здорового животного. Полученные результаты позволяют предполо жить, что молекула pFm-7 наряду с селективной элиминацией В-клеток, специфич ных к иммунодоминантному фрагменту ОБМ (7), также подавляет формирование В клеток, специфичных к 12 фрагменту ОБМ.
ВЫВОДЫ III.
1. При развитии ЕАЕ у крыс линии DА, а также мышей линии SJL и С57BL/ определены иммунодоминантные фрагменты ОБМ, определяющие вектор экспансии аутореактивных В-клеток. Показано, что характер В-клеточного ответа при рассеянном склерозе наиболее схож с ЕАЕ, индуцированном в крысах линии DA и мышах линии SJL.
2. Иммунодоминантные фрагменты ОБМ, инкапсулированные в однослойные маннозилированные липосомы, существенно снижали тяжесть протекания ЕАЕ в крысах линии DA. Продемонстрировано, что применение липосомных композиций понижает титр сывороточных анти-ОБМ аутоантител, подавляет демиелинизацию, а также снижает уровень провоспалительных цитокинов ИЛ-2 и ИФН и индуцирует выработку нейротропного фактора мозга в ЦНС.
3. Была создана панель рекомбинантных молекул, способных к специфической элиминации В-клеток, на основе барназы, каталитических доменов псевдо монадного и шига-подобного токсинов, а также константных доменов имму ноглобулинов мыши и человека. В результате ex vivo экспериментов на куль туре спленоцитов наиболее перспективными признаны белки-киллеры на ос нове барназы и константного домена иммуноглобулина. Показано, что введе ние мышам линии SJL с индуцированным ЕАЕ рекомбинантной молекулы константного домена иммуноглобулина мыши, слитной с иммунодоминант ным фрагментом ОБМ, селективно подавляет популяцию ОБМ-специфичных аутореактивных В-клеток.
IV. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
Статьи:
Stepanov A.V., Belogurov A.A., Ponomarenko N.A., Stremovskiy O.A., Kozlov L.V., Bichucher A.M., Dmitriev S.E., Smirnov I.V., Shamborant O.G., Balabashin D.S., Sashchenko L.P., Tonevitsky A.G., Friboulet A., Gabibov A.G., Deyev S.M. Design of tar geted B cell killing agents. PLoS One. 2011;
6(6):e20991.
А.В. Степанов, А.А. Белогуров, А.Э. Мамедов, Д. Меламед, И.В. Смирнов, Е.С. Кузи на, Д.Д. Генкин, А.Н. Бойко, С.Н. Шаранова, А. Бэкон, Н.А. Пономаренко, А.Г. Габи бов. Терапевтический эффект иммунодоминантных пептидов основного белка миели на, инкапсулированных в наноконтейнеры, на развитие экспериментального аутоим мунного энцефаломиелита в крысах линии DA. Биоорганическая химия. 2012 Май Июнь;
38(3):306-14.
Belogurov A.A. Jr., Stepanov A.V., Smirnov I.V., Melamed D., Bacon A., Mamedov A.E., Boitsov V.M., Sashchenko L.P., Ponomarenko N.A., Sharanova S.N., Boyko A.N., Dubina M.V., Friboulet A., Genkin D.D., Gabibov A.G. Liposome-encapsulated peptides protect against experimental allergic encephalitis. FASEB Journal. 2013 Jan;
27(1):222- Опубликованные тезисы конференций и доклады:
Stepanov A.V., Belogurov A.A. Jr., Ponomarenko N.A., Kozlov.L.V., Dmitriev S.E., Stremovsky O.A., Deyev S.M. and Gabibov A.G. Approaches to Multiple Sclerosis therapy by selective autoreactive B-cells depletion. Poster. Biocatalysis 2009: Fundamentals & Ap plications, 2007, Arkhangelsk, Russian Federation.
Степанов А.В., Белогуров А.А., Пономаренко Н.А., Козлов Л.В., Дмитриев С.Е., Стремовский О.А., Деев С.М., Габибов А.Г. Подходы к терапии рассеянного склероза путем селективной элиминации аутореактивных В-клеток. Постер. Российская школа молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии», 2010, Казань, Российская Федерация.
Belogurov A.A., Stepanov A.V., Ponomarenko N.A., Gabibov A.G. Myelin basic protein peptide 46-62 ameliorates ongoing experimental allergic encephalomyelitis in DA rats.
FEBS Journal. 2010. 277:54- Степанов А.В., Белогуров А.А. Мл., Пономаренко Н.А., Козлов Л.В., Дмитриев С.Е., Стремовский О.А., Деев С.М., Габибов А.Г. Направленная элиминация аутореактив ных В-клеток. Доклад. V Российский симпозиум «Белки и пептиды», 8-12 августа (2011), Петрозаводск, Российская Федерация.
Степанов А.В., Белогуров А.А. Мл., Пономаренко Н.А., Козлов Л.В., Дмитриев С.Е., Стремовский О.А., Деев С.М., Габибов А.Г. Направленная элиминация аутореактив ных В-клеток. Доклад. Научная конференция «X чтения памяти академика Ю.А. Ов чинникова», 14-17 ноября (2011), Москва, Российская Федерация.