Удк 577.151.02, 577.151.042, 579.017.7 особенности функционирования дыхательной цепи bacillus subtilis

на правах рукописи

Наталья Вадимовна Ацаркина УДК 577.151.02, 577.151.042, 579.017.7 ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ BACILLUS SUBTILIS 03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

Работа выполнена в отделе молекулярной энергетики микроорганизмов НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор биологических наук А. А. Константинов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук И. М. Андреев кандидат биологических наук В. Ю. Арцатбанов

Ведущая организация: Воронежский Государственный Университет (кафедра генетики, цитологии и биоинженерии)

Защита состоится 6 декабря 2010 г. в 15 часов 30 минут на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет, Большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «_» ноября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

SQR Мембранная относится к ключевым Актуальность проблемы.

ферментам аэробного метаболизма. C одной стороны, она катализирует одну из стадий цикла Кребса, с другой – представляет собой вход, через который в дыхательную цепь поступают электроны. Мембрана некоторых бактерий содержит особую разновидность хинона – MQ, потенциал полувосстановления которого на 100 мВ ниже, чем у пары сукцинат/фумарат. В таких организмах SQR катализирует энергетически невыгодный перенос электронов с более слабого восстановителя на более сильный. Согласно распространенному мнению, движущей силой процесса служит Н+. Для MQ-зависимых ферментов (тип В семейства SQR/QFR) характерно наличие двух низкоспиновых гемов b, расположенных трансмембранно. По данным рентгеноструктурного анализа, место взаимодействия с MQ находится вблизи гема, дистального по отношению к обращенной в цитоплазму дикарбоксилат связывающей субъединице, и граничит с наружной средой. Если, как следует из структуры, участвующие в образовании MQH2 электроны приходят по электрическому полю, а протоны по градиенту концентрации, то сукцинат:MQ редуктазная и MQН2:фумарат-редуктазная активности должны сопровождаться рассеянием и генерацией Н+, соответственно. Показано, однако, что QFR типа В из W. succinogenes восстанавливает фумарат без образования Н+. С другой стороны, известно, что рассеяние Н+ ингибирует MQ-редуктазную активность двугемовых SQR из бацилл. Таким образом, данные о роли Н+ в работе SQR и QFR В-типа противоречивы и гипотеза о преодолении термодинамического барьера сукцинат:MQ-редуктазной реакции за счет энергии Н+ пока не получила однозначного подтверждения.

Список принятых сокращений: БСА – бычий сывороточный альбумин, ДХФИФ – 2,6 дихлорфенолиндофенол, ДЦКД – N,N-дициклогексилкарбодиимид, КД – круговой дихроизм, ТМФД – N,N,N,N-тетраметил-п-фенилендиамин, ФМС – феназинметасульфат, ХКФ – карбонилцианид-м хлорфенилгидразон, ЭДТА – этилендиаминтетраацетат, Н+ - разность электрохимических потенциалов протона на мембране, рН - разность концентраций протона на мембране, - разность электрических потенциалов на мембране, MQ – менахинон, QFR – хинол:фумарат-оксидоредуктаза, SQR – сукцинат:хинон оксидоредуктаза, UQ - убихинон.

Цели и задачи. Основным объектом исследований являлась MQ-содержащая, преимущественно аэробная бактерия B. subtilis. В наши задачи входило:

проверить, как влияет деэнергизация мембраны на скорость дыхания целых клеток B. subtilis в присутствии различных субстратов;

выяснить причину падения сукцинатоксидазной активности в мембранном препарате B. subtilis;

разработать модельную систему для изучения воздействия Н+ на работу дыхательной цепи B. subtilis;

сопоставить данные о влиянии разобщителей окислительного фосфорилирования на дыхание бактерий из разных систематических групп;

сравнить характеристики кофакторов SQR типа В из нескольких организмов;

прояснить роль Н+ в катализе SQR у B. subtilis.

Научная новизна. Разработана методика получения сопряженных мембранных частиц B. subtilis с высокой сукцинатоксидазной активностью. Предложена кинетическая модель, описывающая процесс окисления сукцината суспензией замкнутых мембранных частиц из бациллы. Обнаружена способность НАДН дегидрогеназы B. subtilis в мембранных препаратах напрямую реагировать с O2.

Впервые показано, что деэнергизация клеточной мембраны ингибирует дыхание B. subtilis и других бацилл от разных субстратов и что эффект не сводится к инактивации SQR. На модельной дыхательной цепи, состоящей из SQR, MQ и терминальной оксидазы bd-типа получены убедительные свидетельства сопряженности работы SQR из B. subtilis в направлении прямой реакции с расходованием Н+. Фумарат-редуктазная активность SQR, впервые исследованная на препарате замкнутых мембранных частиц B. subtilis, найдена не сопровождающейся образованием Н+.

Практическая значимость. Mутации митохондриальной SQR приводят к паталогиям вследствие повышенного уровня образования кислородных радикалов. Структура двугемовых SQR считается наиболее безопасной с точки зрения взаимодействия с О2. Возможность мутагенеза позволяет исследовать данную проблему глубже. Многие SQR типа В способны переключаться в анаэробных условиях на роль QFR. Такое же переключение происходит в митохондриальной SQR из раковых клеток. Модификации белка, вызывающие изменение его функций, удобно изучать на бактериальном аналоге. Двугемовые SQR и QFR встречаются у многих патогенных микроорганизмов (бацилл, хламидий, -протеобактерий) и могут быть мишенью ингибиторов, имитирующих структуру MQ и безопасных для митохондриального фермента.

Ингибирование дыхания бактериальных клеток разобщителями следует принять во внимание при разработке лекарств противобациллярного действия.

Апробация работы. Результаты докладывались на 12ой и 16ой Европейских Биоэнергетических конференциях (EBEC 2002, Франция и EBEC 2010, Польша). Работа также апробирована на заседании Ученого совета НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова 22 июня 2009 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, включая полных статей в рецензируемых журналах.

Диссертация состоит из введения, обзора Структура диссертации.

литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, включает 8 схем, 10 таблиц и рисунков.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Препараты SQR, выделенные из различных бактерий, были любезно предоставлены Л. Хедерштедтом (Лунд), Т. Сулиманом (Лимерик), М. Перейра (Лиссабон) и М. Янюшиным (Пущино). Цитохром bd B. subtilis получали из штамма-сверхпродуцента методами ионообменной и афинной хроматографии с гель-фильтрацией на заключительном этапе. Большая часть штаммов B.

subtilis предоставлена Л. Хедерштедтом и К. фон Вашенфельдтом (Лунд).

Штамм LUH-27 (trpC2 ctaCD::ble sdhCA::cat qoxABCD::kan) получали на основе «дикого типа» путем трех последовательных трансформаций ДНК материалом мутантов по цитохром с оксидазе саа3, SQR и хинолоксидазе аа3.

Штамм LUH-17/pBSD1200 получили, трансформировав клетки LUH-17 (trpC ctaCD::ble qoxABCD::kan galT), мутантные по обеим гем-медным терминальным оксидазам, плазмидой pBSD1200, несущей кодирующий SQR оперон sdhCAB. Менахинон MQ7 экстрагировали из мембран B. subtilis [Krivankova et al., 1980]. Фракционирование глицерин-3-фофосфат дегидрогеназы осуществляли, обрабатывая мембраны B. subtilis ЭДТА либо KCl в высокой концентрации. Выращивание культур B. subtilis проводили при +37о с сильной аэрацией. В качестве энергетического субстрата добавляли сукцинат, малат, глицерин или глюкозу, иногда использовали минимальную среду роста. В выращивании других микроорганизмов любезно помогала Е.

Стром (МГУ). Мембранную фракцию получали, разрушая клеточный материал осмотическим шоком, ультразвуком или продавливанием через Френч-пресс. Выращенные клетки осаждали центрифугированием, промывали лизоцимом (0,5 мг/мл, 45-60 мин, +37о).

в среде с рН 8,0 и обрабатывали Осажденные и промытые сферопласты разрушали в присутствии ДНКазы и ингибитора протеаз. Мембраны осаждали и промывали 0,1 М фосфатом калия рН 6,6. Осадок суспендировали в среде опыта, помещали на лед и использовали в экспериментах либо суспендировали в минимальном объеме и замораживали в жидком азоте для долгосрочного хранения. Протеолипосомы с SQR или цитохромом bd из B. subtilis, либо с обоими белками одновременно приготовляли с использованием диализа, ультразвука и гранул Bio Beads.

Липосомальную мембрану получали из азолектина и насыщали MQ7 или MQ [Biel et al., 2002]. Спектральные исследования включали запись спектров оптического поглощения, кинетические измерения в одноволновом и двуволновом режимах, флуориметрию и запись спектров КД (при любезной помощи А.М. Арутюняна, МГУ). Измерения проводили в стандартных кюветах с оптическим путем 1 см. Для создания анаэробиоза применяли глюкозоксидазную систему (глюкоза+глюкозоксидаза+каталаза), которая за время смешивания снижала концентрацию растворенного О2 до нескольких мкМ. Содержание цитохромов и MQ определяли из разностных спектров оптического поглощения. ДХФИФ-редуктазную активность определяли по скорости исчезновения окисленной формы ( = 600 нм). К мембранному препарату добавляли KCN и, в качестве донора, сукцинат либо глицерин-3 фосфат. Собственно дегидрогеназную активность измеряли аналогично, но в присутствии медиатора ФМС. Спектрофотометрически измеряли также ТМФД+, = 612 нм), активности ТМФД-редуктазы (по исчезновению НАДН-оксидазы и НАДН:фумарат-редуктазы (по исчезновению НАДН, = 339 нм). Генерацию супероксида регистрировали в качественной реакции с тетразолием нитросиним ( = 530 нм), в контрольном опыте источником О служила система ксантиноксидаза/гипоксантин. АТФ-азную активность определяли с использованием рН-чувствительного красителя крезолового пурпурного ( = 578 нм). Образование обратного знака определяли по спектральным изменениям оксонола VI (1 = 628 нм, 2 = 587 нм).

Флуориметрически регистрировали образование с прямого знака сафранином (возб. = 485 нм, исп. = 586 нм ) и рН обратного знака (закисление внутри мембранных частиц) с акридиновым оранжевым (возб. = 493 нм, исп. = 530 нм). Концентрацию растворенного О2 измеряли амперометрически, с электродом Кларка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Спектральные характеристики кофакторов двугемовых SQR.

Глава 1 посвящена сравнению SQR из B. subtilis, Chloroflexus aurantiacus, Thermus thermophilus и Rhodothermus marinus. Перечисленные ферменты относятся к типу В мембранных SQR/QFR [Lemos, 2002]. С помощью оптических методов были исследованы некоторые характеристики кофакторов.

На Рис. 1 приведены спектры оптического поглощения образцов SQR в видимой области. Максимумы в районе 558 нм соответствуют -полосам двугемового цитохрома b. Судя по уровню восстановленности в присутствии сукцината, каждый из ферментов содержит высоко- и низкопотенциальный гем.

Можно предположить, что дистальную позицию во всех случаях занимает второй из них, как это установлено для SQR из B. subtilis [Matsson et al., 2000].

Рис. 1. Разностные спектры оптического поглощения SQR типа В.

Пунктир: восстановленный сукцинатом - A, мМ см B. subtilis C. aurantiacus - аэробно окисленный образец.

- Штрих: восстановленный дитионитом восстановленный сукцинатом образец.

Сплошная линия: восстановленный дитионитом - аэробно окисленный образец. Среда опыта с рН 7,6.

Исходя из значений Em, известных для гемов SQR B.

550 600 550 subtilis (-95 мВ и +65 мВ T. thermophilus R. marinus 559 [Hagerhall et al., 1992]), при рН 7, сукцинат должен восстанавливать гем bH практически полностью, а bL гем менее, чем на 10%.

Действительно, уровень 550 600 550 восстановленности цитохрома b длина волны, нм сукцинатом составляет около 60%.

Похожего результата можно было ожидать и для образца из R. marinus (Em7, гемов = -75 мВ и +75 мВ [Fernandes et al., 2001]), однако в наших условиях сукцинат восстанавливал цитохром b при рН 7,6 лишь на 20%. Дальнейшего восстановления удалось добиться, увеличив силу донора электронов путем защелачивания среды. Несмотря на то, что значения Em гемов при этом также несколько понижаются [Fernandes et al., 2001], относительно слабая рН зависимость (около 30 мВ/pH для bL) позволила при рН 9,6 достичь суммарного восстановления уже на 50%.

В препаратах из B. subtilis, T. thermophilus и R. marinus гемы bН и bL спектрально сходны. В SQR из C. aurantiacus форма спектра зависит от уровня восстановленности цитохрома b: сукцинат и дитионит восстанавливают компоненты с - (-) полосами при 562 (430) нм и 558 (427) нм, соответственно.

Это противоречит данным [Xin et al., 2009], согласно которым оба гема фермента спектрально идентичны и в восстановленном состоянии имеют максимумы поглощения при 558 (424) нм. Различия касаются и окислительно восстановительных свойств: по результатам проведенного нами с помощью пары сукцинат/фумарат редокс-титрования Em7,6 гемов равны +25 и -13 мВ, тогда как в [Xin et al., 2009] приводятся низкие значения (-40 и -190 мВ), типичные для QFR [Lemos et al., 2002]. Наблюдаемую разницу мы связываем с условиями выращивания. В нашем случае фермент был получен из клеток, выращенных в микроаэробных условиях, тогда как в [Xin et al., 2009] исследовался препарат из строго анаэробной культуры. Считается, что функции QFR и SQR у C. aurantiacus выполняет один и тот же белок из семейства двугемовых SQR/QFR [Xin et al., 2009]. Изменение характеристик редокс центров может объясняться модификацией фермента, переключаемого с одной роли на другую. Цитохромная субъединица в QFR-форме C. аurantiacus фосфорилирована [Xin et al., 2009], что могло бы быть следствием подобной регуляции. Показано, например, что фосфорилирование повышает фумарат редуктазную и снижает сукцинатоксидазную активность митохондриальной SQR [Tomitsuka et al., 2009].

Рис 2. Спектры КД SQR типа В.

B. subtilis C. aurantiacus Пунктир: аэробно окисленный образец.

Штрих: восстановленный сукцинатом Сплошная линия:

образец.

восстановленный дитионитом образец.

Среда опыта с рН 7,6.

На Рис. 2 приведены спектры - КД окисленных и восстановленных - 400 500 600 400 500 600 - КД, М см SQR. Во всех случаях - присутствуют ответы вблизи полос T. thermophilus R. marinus оптического поглощения гемов.

Сигнал в присутствии сукцината по форме и амплтуде находится между -25 - полностью окисленным и -50 - полностью восстановленным, за 400 500 600 700 400 500 600 исключением R. marinus, где он длина волны, нм подобен полностью окисленному – это согласуется с абсорбционными данными, демонстрирующими лишь незначительное восстановление цитохрома b сукцинатом при рН 7,6.

Особенности КД-спектров SQR из B. subtilis свидетельствуют о сильном экситонном взаимодействии между восстановленными гемами. На это указывает форма сигнала (почти симметричная «бабочка» в - и -областях), большая амплитуда (150 М-1см-1 для -полосы) и резкое возрастание ответа при восстановлении второго гема. Полученные характеристики совпадают с приводимыми в работе [Palmer et al., 1994] для того же белка, экспрессированного в клетках E. coli. Экситонное сопряжение между гемами окисленного фермента гораздо слабее, что согласуется с общей закономерностью среди гем b-содержащих гемопротеидов [Palmer et al., 1994].

Кроме ответов, связанных с гемовыми группами, в SQR из C. aurantiacus и B. subtilis присутствуют редокс-зависимые сигналы КД в области 450– нм. Суммарный ответ (около 25 М-1см-1) складывается из коротковолновой положительной и длинноволновой отрицательной составляющих, синхронно исчезающих по мере восстановления (по результатам окислительно восстановительного титрования парой сукцинат/фумарат значение Em7,6 для одноэлектронного перехода равно +51 мВ). Cудя по спектральным характеристикам, наиболее вероятным источником сигнала является флавиновый кофактор в полностью окисленной форме, ФАД.

2. Торможение MQH2-зависимого переноса электронов в деэнергизованной мембране бацилл.

Глава 2 посвящена исследованию феномена, первоначально обнаруженного нами на целых клетках B. subtilis [Azarkina & Konstantinov, 2002]. Суть явления заключается в том, что, в отличие от митохондрий и большинства аэробных бактерий, рассеяние Н+ не стимулирует, а, напротив, резко подавляет дыхательную активность B. subtilis.

Рис. 3. Ингибирование дыхания клеток B.

клетки 25 мкM O subtilis разобщителями.

1 Клетки выращены на малате. 1 - 4 – «дикий тип», 5 – LUH-16 (не содержит SQR).

Добавки: 10 мкМ ХКФ, 5 мкМ валиномицин, ХКФ 5 мин 1 мг/мл БСА, 0,5 мМ ТМФД (восстановленная валиномицин форма).

клетки 2 клетки Рис. 3 иллюстрирует действие ХКФ, разобщителей окислительного валиномицин валиномицин ТМФД фосфорилирования на дыхание клеток ХКФ B. subtilis от эндогенных субстратов.

клетки Сочетание протонофора ХКФ и клетки SQR калиевого переносчика валиномицина ХКФ вызывает прекращение потребления БСА ХКФ валиномицин кислорода. Добавленные по отдельности, ХКФ и валиномицин ингибируют дыхание в меньшей степени. Значение I50% для ХКФ на фоне валиномицина ниже 100 нМ. Действие ХКФ имеет обратимый характер: БСА, эффективно адсорбирующий гидрофобные соединения, снимает ингибирование. Окисление ТМФД и ДХФИФ, передающих электроны на терминальный участок дыхательной цепи, разобщением не тормозится. В другой серии экспериментов (Рис. 4) исследовался эффект разобщителей на реакцию восстановления клетками B. subtilis ДХФИФ и ТМФД+. Оба акцептора получают электроны от мембранного MQH2. Как и дыхание, редуктазная активность клеток оказалась чувствительна к рассеивающим Н+ ионофорам.

Подавление дыхания B. subtilis при деэнергизации клеточной мембраны отмечали и раньше [Lemma et al., 1990], но только для случая окисления сукцината. Ингибирование, как считалось, затрагивало исключительно сукцинат:MQ-редуктазную реакцию. Представленные на Рис. 3 и 4 данные получены в условиях, когда электроны поступают в дыхательную цепь преимущественно от НАДН. Аналогичная картина наблюдалась и при использовании нами в качестве основного субстрата глицерина, когда непосредственным донором для дыхательной цепи служит глицерин-3-фосфат.

Более того, все результаты по ингибированию эндогенной дыхательной активности клеток разобщителями воспроизводятся на штамме LUH-16, мутантном по SQR.

Рис. 4. Ингибирование разобщителями дикий тип ДХФИФ-редуктазной активности клеток B.

subtilis.

Клетки выращены на малате. Анаэробные ХКФ условия. 1 – «дикий тип», 2 – LUH-16 (не валиномицин содержит SQR). Пунктир – ход реакции в отсутствие дальнейших добавок.

25 мкM ДХФИФ С деэнергизацией мембраны связан, очевидно, еще один феномен:

потеря дыхательной активности B. subtilis 5 мин SQR в процессе выделения из клеток ХКФ мембранной фракции. Эффект наиболее валиномицин выражен в сукцинат-зависимых реакциях (ингибирование на два порядка), однако имеет место и при переносе электронов от НАДН и глицерин-3-фосфата (падение скорости в 10-15 раз). В присутствии медиатора ФМС, передающего электроны с соответствующей дегидрогеназы на искусственный конечный акцептор, удельные скорости окисления НАДН, сукцината и глицерин-3-фосфата практически не различаются между клетками и субклеточными мембранами.

Чтобы выяснить, на какой стадии выделения мембран развивается ингибирование, мы получили из свежевыращенных клеток лишенные клеточной стенки сферопласты. Препарат обладал такой же эндогенной дыхательной активностью, как и необработанные клетки, которая была столь же, как у клеток, чувствительна к действию пары ХКФ/валиномицин. После разрыва мембраны в результате осмотического шока потребление кислорода полностью прекратилось. Чтобы исключить эффект разведения, к образцу был добавлен 1 мМ НАДН. Дыхание возобновилось, однако с удельной скоростью, не превышающей 15% от исходной, причем дальнейшего ингибирования разобщителями не наблюдалось. Очевидно, торможение переноса электронов по дыхательной цепи B. subtilis происходит в момент, когда мембрана теряет целостность. Главной причиной причиной ингибирования электронного транспорта следует считать рассеяние Н+.

Судя по тому, что деэнергизация не затрагивает работу дыхательной цепи B. subtilis на начальном (активности дегидрогеназ в присутствии ФМС) и терминальном (окисление восстановленных ДХФИФ и ТМФД) участках, можно предположить, что активирующее действие Н+ направлено либо на восстановление MQ до MQH2, либо на последующее окисление MQH2. Чтобы выяснить, какой из вариантов реализуется, был проведен эксперимент на истощенных по эндогенным субстратам сферопластах. В качестве донора электронов для дыхательной цепи использовали глицерин-3-фосфат, поскольку транспорт в клетку глицерина с последующим фосфорилированием не требует затраты Н+.

Рис. 5. Влияние разобщителей на редокс состояние MQ7 в сферопластах B. subtilis.

1 - сферопласты, истощенные по эндогенным субстратам, анаэробно 1 инкубировались с 0,25% глицерином.

Разность между спектрами образца после и A = 0, до восстановления дыхательной цепи.

2 - к сферопластам, аэробно окисляющим глицерин, была добавлена пара 10 мкМ ХКФ/2 мкМ валиномицин. Разность между спектром, записанным сразу после прекращения дыхания и спектром образца в стационарных условиях дыхания.

273 3 – контроль: спектральные изменения, вызванные восстановлением MQ7 в мембранном препарате (нормировано по амплитуде).

250 На Рис. 5 приведены спектры длина волны, нм оптического поглощения препарата. При дыхании в присутствии глицерина уровень восстановленности MQ в сферопластах составлял около 10%.

Добавление пары ХКФ/валиномицин вызвало немедленное и полное прекращение дыхания, при этом восстановления мембранного MQ не произошло (разностный спектр 2). Таким образом, деэнергизация мембраны тормозит, очевидно, не окисление MQ7H2, а восстановление MQ дегидрогеназами.

Чтобы проверить, является ли зависимость дыхательной активности от Н+ уникальным свойством B. subtilis, мы протестировали значительное число аэробных бактерий из разных систематических групп. Из 14-ти грам положительных MQ-содержащих организмов эффект ингибирования эндогенного дыхания разобщителями не был обнаружен лишь у 2-х, тогда как у 7-ми (все из рода Bacilli) он проявлялся столь же сильно, что и у B. subtilis.

Среди грам-отрицательных UQ-содержащих бактерий наблюдалась обратная ситуация: только в 4-х случаях из 13-ти высокие концентрации протонофора вызвали ингибирование дыхания, причем незначительное и скорее всего неспецифичное. Можно думать, что участие Н+ в поддержании дыхательной активности характерно для MQ-содержащих грам-положительных бактерий, в первую очередь, для бацилл.

3. Работа дыхательной цепи B. subtilis в субклетчных мембранных препаратах.

В Главе 3 рассматриваются особенности дыхания мембранных частиц B.

subtilis. Объектом служил штамм 3G18/pBSD1200 с повышенной экспрессией SQR [Hagerhall et al., 1992].

В более ранних исследованиях падение удельной скорости дыхания B.

subtilis от сукцината в результате деэнергизации мембраны препятствовало изучению феномена ингибирования SQR на субклеточном уровне. Нам удалось научиться получать из клеток B. subtilis препараты замкнутых мембранных Н+-зависимую частиц, в которых можно было наблюдать сукцинатоксидазную активность [Azarkina & Konstantinov, 2010]. При выделении мембран клетки разрушали Френч-прессом, а в среды добавляли избыток ионов Mg2+ и, в ряде экспериментов, 1 мМ ДЦКД – это повышало сопряженность частиц благодаря предотвращению протонной утечки через фактор F0 в поврежденных молекулах мембранной АТФазы [Smirnova et al., 1990]. Тесты показали, что используемый нами мембранный препарат состоит в основном из вывернутых замкнутых частиц с низкой ионной проницаемостью.

Об этом свидетельствовала высокая удельная скорость окисления непроникающих субстратов и способность образовывать и рН в процессе дыхания. Судя по уровню восстановленности цитохромов непроникающими субстратами, доля замкнутых частиц с клеточной ориентацией мембраны составляла 10-25%. Оказалось, что в условиях, максимально повышающих сопряженность, сукцинатоксидазная активность частиц возрастает до значений, соизмеримых со скоростью дыхания интактных клеток (около 60 молекул О2 на молекулу терминальной оксидазы за 1 сек). Отсюда можно заключить, что доля незамкнутых фрагментов в препарате невелика.

Рис. 6. Влияние сопряженности сукцинат сукцинат мембранного препарата B. subtilis на сукцинатоксидазную активность.

Мембраны выделены при помощи Френч пресса. Среда опыта содержит: 1 – 0,5 mM ХКФ ЭДТА и 1 мM MgSO4;

2 – 0,5 мM ЭДТА, валиномицин мM MgSO4 и 1 мM ДЦКД;

добавки: 6 мМ 1 сукцинат, 7,5 мкМ ХКФ, 5 мкМ валиномицин. 3 – 0,5 мM ЭДТА, 5 мM 5 мин MgSO4 и 1 мM ДЦКД;

сукцинат добавлен до сукцинат 26 мМ.

250 мкМ О На Рис. 6 показано активирующее действие сопрягающих агентов на сукцинатоксидазную активность мембран, а также ингибирование разобщителями дыхания сопряженных мембран от сукцината. Кроме того, в начале 5 мин опыта 3 хорошо заметно ускорение дыхания, связанное с активацией SQR по мере набора H+. Последний эффект проявляется только при концентрациях сукцината свыше 10 мМ, что указывает на рост КМ в условиях энергизации.

Таблица 1.

Каталитические параметры SQR в сопряженных мембранных частицах B. subtilis.

A Б В сукцинатДХФИФ cукцинатФМСДХФИФ сукцинатMQ7О KM, мМ Vmax, с-1 KM, мМ Vmax, с-1 KM, мМ Vmax, с- 0,3 12 1,2 131 2,2 KM/Vmax = 0,025 KM/Vmax = 0,009 KM/Vmax = 0, Приведенные в Таблице 1 данные подтверждают, что дыхание сопряженных частиц характеризуется намного более высокими значениями КМ по сукцинату и Vmax, чем дегидрогеназная и ДХФИФ-редуктазная активности того же препарата, не сопровождающиеся образованием H+. Можно заметить, что рост КМ, связанный с активацией сукцинатоксидазного процесса в энергизованной мембране, непропорционально велик – эта особенность находит объяснение в рамках кинетической модели, учитывающей положительную обратную связь между уровнем H+ и скоростью окисления сукцината [Azarkina & Atsarkin, 2010].

На сопряженных мембранных частицах в присутствии сукцината полностью воспроизводится картина ингибирования дыхания разобщителями, характерная для целых клеток. Важное отличие состоит в том, что в случае клеток электроны поступали в дыхательную цепь главным образом от НАДН через единственную у B. subtilis НАДН-дегидрогеназу (фермент типа II, не обладающий Н+-транслоцирующей активностью [Bergsma et al., 1982]). На окисляющих НАДН мембранных частицах эффекта энергозависимости наблюдать, к сожалению, не удается. По-видимому, это связано с нарушением свойств фермента при выделении мембран. Об этом свидетельствует ряд наблюдений. Так, НАДН-оксидазная активность мембран в наших условиях была по крайней мере на порядок ниже скорости эндогенного клеточного дыхания, проявляла устойчивость к цианиду, уменьшалась по ходу реакции и не сопровождалась образованием Н+. Вероятное объяснение состоит в том, что в мембранном препарате электроны от НАДН попадают, в обход дыхательной цепи, непосредственно на О2. Образование О2 при реакции НАДН с кислородом в присутствии мембранных частиц удалось зарегистрировать в опытах с тетразолием нитросиним. По-видимому, структура НАДН-дегидрогеназы B. subtilis отличается лабильностью и под действием факторов, влияющих на расположение фермента в мембране, его активный центр утрачивает способность реагировать с естественным акцептором MQ7 и становится доступен для прямого контакта с О2.

Вместе с тем, энергозависимый характер работы дыхательной цепи B.

subtilis удалось подтвердить на мембранных частицах, окисляющих глицерин 3-фосфат, хотя все эффекты в этом случае были выражены менее ярко, чем при окислении сукцината. Дыхание частиц от глицерин-3-фосфата воспроизводимо (на 20-30%) ускорялось в присутствии 1 мМ ДЦКД. Деэнергизация мембраны при добавлении протонофора в сочетании с валиномицином вызывала примерно двукратное подавление оксидазной активности.

4. Два режима функционирования SQR из B. subtilis В Главе 4 на примере SQR из B. subtilis рассматривается вопрос об участии H+ в механизме работы SQR и QFR В-типа.

В двугемовых SQR энергетический барьер при переносе электронов с сукцината (Em = +24 мВ) на MQ7 (Em = -74 мВ) мог бы преодолеваться за счет расходования H+ [Schirawski et al., 1998]. Устройство мембранной части SQR/QFR типа В, подтвержденное данными трехмерной структуры фермента из W. succinogenes [Lancaster et al., 1999], согласуется с такой возможностью.

Как видно из Схемы 1, восстановление MQ должно сопровождаться переносом электронов по полю и захватом протонов из периплазмы, т.е. потреблением H+, а обратная реакция – переносом электронов против поля и выбросом протонов в периплазму, т.е. образованием H+.

+ Схема 1. SQR из B. subtilis.

периплазма Штриховые стрелки: перенос электронов.

bL MQ7H Сплошные стрелки: двухэлектронное -95 мВ окисление сукцината и восстановление MQ7.

MQ Экспериментально доказано, что bH +65 мВ QFR из W. succinogenes осуществляет - FeS- MQH2:фумарат-редуктазную реакцию цитоплазма FeS- FeS- электронейтрально [Kroger et al., 2002].

Это связано с тем, что в ферменте есть 2e протон-проводящий «глутаматный» путь, по которому протоны ФАД(H2 ) переносятся обратно в цитоплазму, компенсируя трансмембранное фумарат сукцинат разделение зарядов в ходе катализа [Lancaster et al., 2005;

Madej et al., 2006]. Поскольку в SQR из бацилл ключевой остаток «глутаматного» пути отсутствует [Zaunmuller et al., 2006], считается, что эти ферменты должны работать электрогенно, т.е. с затратой и образованием H+ при катализе в прямом и обратном направлении, соответственно [Madej et al., 2006].

Тот факт, что сукцинат:MQ-редуктазная активность SQR из B. subtilis требует энергизации мембраны, можно объяснить двояко: либо H+ выполняет роль одного из «субстратов» MQ-редуктазной реакции, либо энергизация мембраны поддерживает SQR в активной конформации. В наши задачи входило проверить обе эти возможности.

Первая серия экспериментов была проведена на штамме LUH-17 с единственной терминальной оксидазой bd-типа, которая образует H+ с эффективностью 1 Н+/е- [Lauraeus et al., 1993]. Клетки LUH-17 росли на сукцинате крайне слабо и вскоре лизировались вследствие недостаточного уровня H+ [Jolliffe et al., 1981]. Введение в LUH-17 содержащей гены SQR плазмиды pBSD1200 заметно улучшило рост культуры на сукцинате и предотвратило лизис. Защитный эффект плазмиды проявлялся только в средах, содержащих сукцинат, хотя в минимальной среде с сукцинатом клетки LUH 17/pBSD1200 не были способны делиться. Влияние, оказываемое работающей SQR на рост мутанта с пониженным уровнем H+, мы объясняем ускорением реакций цикла Кребса.

В Таблице 2 приводятся характеристики мембранных частиц из LUH 17/pBSD1200. Наиболее примечательной их особенностью является полная неспособность окислять сукцинат. В процессе выращивания клетки мутанта используют сукцинат в качестве дыхательного субстрата, а выделенные мембраны содержат значительное количество SQR и проявляют высокую сукцинат-дегидрогеназную активность. Тем не менее, сукцинатоксидазная активность мембран LUH-17/pBSD1200 практически отсутствует даже в максимально сопрягающих условиях, когда на препарате «дикого типа» удается достичь скорости окисления сукцината, сравнимой с клеточным дыханием.

Очевидно, генерация H+ со стехиометрией 1 Н+/е- не обеспечивает необходимого для работы SQR уровня H+. Следует предположить, что катализ SQR сопровождается затратой H+ со стехиометрией 1 Н+/е-.

Таблица 2.

Типичные характеристики мембранных препаратов с повышенной экспрессией SQR.

SQR сукцинат- сукцинатО2 НАДНО2 НАДНфумарат Штамм дегидрогеназа нмоль нмоль О2 нмоль О2 нмоль НАДН нмоль ДХФИФ /мг белка /(минмг белка) /(минмг белка) /(минмг белка) /(минмг белка) 3G /pBSD1200 1,9 5604 1500 120 LUH- /pBSD1200 1,5 4065 150 Во второй серии экспериментов изучалась MQH2:фумарат-редуктазная активность мембранных частиц, которую измеряли в анаэробных условиях, восстанавливая мембранный MQ7 от НАДН. Как выяснилось, в отсутствие О активность НАДН-дегидрогеназы B. subtilis достаточно стабильна.

НАДН Рис. 7. Фумарат-редуктазная НАДН фумарат активность мембран B. subtilis.

ХКФ, валиномицин Анаэробные условия. Добавки: 0, малонат мМ НАДН, 46 мМ фумарата калия, 2, 10 мкМ ХКХ, 5 мкМ валиномицин, A-339нм 91 мМ малонат.

Типичная кинетика 1, процесса приведена на Рис. 7.

Примечательно, что, в отличие 0, от катализа в направлении 0 20 80 100 время, мин окисления сукцината, фумарат редуктазная активность SQR не чувствительна к разобщителям. При наличии НАДН и фумарата реакция идет с постоянной скоростью в течение 2 часов и более. Таким образом, предположение о чисто регуляторной роли Н+ не подтверждается: если бы Н+ стабилизировала активную конформацию SQR, энергизация мембраны была бы необходима для протекания как прямой, так и обратной реакции.

Возможность образования Н+ в ходе НАДН:фумарат-редуктазной реакции была проверена в опытах с акридиновым оранжевым. Добавляя к мембранному образцу в аэробных условиях низкие концентрации сукцината, мы определили минимальную скорость электронного транспорта, достаточную для наблюдения ответа. С учетом того, что терминальные оксидазы работают с эффективностью 2 H+/e, а стехиометрия образования Н+ при окислении H+/e-, MQH2 может составлять лишь 1 достоверный ответ должен обеспечиваться НАДН:фумарат-редуктазной активностью, равной 120 нмолей НАДН/(минмг белка).

Регистрация рН на частицах с высокой НАДН:фумарат-редуктазной активностью показана на Рис. 8А. Внесение обладающего собственной флуоресценцией НАДН вызывает сдвиг уровня сигнала, не связанный с изменением рН внутри частиц. Добавка фумарата дает кратковременный отброс, после чего флуоресценция принимает прежнее значение, не меняющееся под действием Na+/H+-обменника моненсина. Таким образом, генерации рН не наблюдается, хотя реакция идет с постоянной скоростью в течение всего эксперимента.

А НАДН Б сукцинат Рис. 8. Сравнение флуоресценция, 10% шкалы способности мембран B.

флуоресценция, 20% шкалы subtilis образовывать рН 2 при фумарат-редуктазной и сукцинат - оксидазной фумарат реакциях.

НАДН : фумарат (А) моненсин редуктазная реакция. 1 – 1 регистрация рН. Добавки:

0,4 мМ НАДН, 65 мМ НАДН фумарат фумарат, 6,7 мкМ моненсин.

2– кинетика окисления сукцинат НАДН фумаратом.

Сукцинатоксидазная (Б) 75 мкМ НАДН реакция. 1 – 40 мкМ 100мкМ О сукцинат, 2 – 60 мкМ сукцинат;

регистрация рН.

3 3 – 60 мкМ сукцинат;

кинетика потребления кислорода.

10 мин 10 мин Положительный контроль представлен на панели Б, где сукцинатоксидазная активность, соответствующая условиям эксперимента А, сопровождается снижением рН внутри частиц, регистрируемым до тех пор, пока система не истощается по сукцинату.

ВЫВОДЫ 1. Дыхание целых клеток B. subtilis ускоряется под действием Н+ и практически полностью подавляется при деэнергизации мембраны.

Энергозависимая стимуляция переноса электронов по дыхательной цепи направлена на стадию восстановления мембранного MQ различными дегидрогеназами.

2. Эффект ингибирования разобщителями эндогенного клеточного дыхания характерен для MQ-содержащих организмов: бацилл и, возможно, других грам-положительных аэробов. Электрон-транспортная активность UQ содержащих дыхательных цепей грам-отрицательных бактерий при деэнергизации мембраны не тормозится.

3. Получение из клеток B. subtilis мембранной фракции сопровождается резким падением удельной сукцинатоксидазной активности, причиной которого является низкая сопряженность препарата. Энергизация замкнутых мембранных частиц полностью восстанавливает работу дыхательной цепи B.

subtilis от сукцината.

4. Окисление сукцината сопряженными мембранными частицами из B.

subtilis сопровождается потреблением Н+ «прямого знака». Энергизация мембраны за счет активности хинолоксидазы bd-типа недостаточна для заметного протекания сукцинатоксидазной реакции.

5. Восстановление фумарата сопряженными мембранными частицами из B. subtilis не сопровождается образованием Н+. Денергизации мембраны не влияет на скорость MQH2:фумарат-редуктазной реакции.

6. Таким образом, SQR из B. subtilis способна функционировать в двух режимах: катализ в прямом направлении сопровождается электрогенезом «обратного знака», катализ в обратном направлении не связан с преобразованиями Н+. Данная особенность может являться характерным свойством двугемовых SQR и QFR.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Azarkina N.V. Induction of Na+-motive terminal oxidase in facultatively alkalophilic bacterium Bacillus halodurans grown under alkaline conditions. (1995) Biochemistry (Moscow) 60, 2, 211-216.

2. Azarkina N., Borisov V.B. and Konstantinov A.A. Spontaneous spectral changes of the reduced cytochrome bd. (1997) FEBS Lett. 416, 171-174.

3. Azarkina N., Siletsky S., Borisov V., von Wachenfeldt C., Hederstedt L.

and Konstantinov, A.A. A cytochrome bb’-type quinol oxidase in Bacillus subtilis strain 168. (1999) J. Biol. Chem. 274, 32810-32817.

4. Azarkina N. and Konstantinov A.A. Stimulation of menaquinone-dependent electron transfer in the respiratory chain of Bacillus subtilis by membrane energization. (2002) 12th European Bioenergetics Conference. In: Biochim. Biophys.

Acta, EBEC Short Reports 12, 148.

5. Azarkina N. and Konstantinov A.A. Stimulation of menaquinone-dependent electron transfer in the respiratory chain of Bacillus subtilis by membrane energization. (2002) J. Bacteriol. 184, 19, 5339-5347.

6. Azarkina N.V. and Konstantinov A.A. Energization of Bacillus subtilis membrane vesicles increases catalytic activity of succinate:menaquinone oxidoreductase. (2010) Biochemistry (Moscow) 75, 1, 50-62.

7. Azarkina N.V. and Atsarkin V.A. Energy-dependent respiration of Bacillus subtilis coupled membranes. A kinetic model. (2010) Doklady Rus. Acad. Sci. 435, (принято к публикации).

8. Azarkina N. and Konstantinov A.A. Electrogenicity of succinate:menaquinone oxidoreductase from Bacillus subtilis depends on the direction of electron transfer.

(2010) 16th European Bioenergetics Conference. In: Biochim. Biophys. Acta 1797, 112.