Скрининг аллелей bola-drb3 в популяциях крупного рогатого скота различных пород
На правах рукописи
БЫКОВА Александра Сергеевна СКРИНИНГ АЛЛЕЛЕЙ BOLA-DRB3 В ПОПУЛЯЦИЯХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА РАЗЛИЧНЫХ ПОРОД 03.02.07 – Генетика 06.02.07 – Разведение, селекция, генетика сельскохозяйственных животных
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Дубровицы – 2011
Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.
доктор биологических наук, Научные руководители:
профессор, член-корреспондент РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна кандидат биологических наук, Гладырь Елена Александровна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич доктор биологических наук, профессор Калашникова Любовь Александровна
Ведущая организация: ФГОУ ВПО Российский государственный аграрный университет – МСХА им. К.А. Тимирязева.
Защита состоится «» декабря 2011 г. в 10 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно исследовательский институт животноводс тва Российской академии сельскохозяйственных наук.
Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, тел./факс (4967) 65-11-01. www.vij.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.
Автореферат разослан «» ноября 2011 г.
Ученый секретарь Совета Д 006.013.03 И. В. Гусев 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Основными целями селекционной работы в молочном скотоводстве являются повышение уровня удоя и выхода молочного жира и белка (Красота В.Ф. и др., 2005;
Никифорова Л.Н., 2009). Однако повышенная молочная продуктивность сопряжена со снижением устойчивости к различным заболеваниям, что негативно сказывается на процессе производства, существенно увеличивая стоимость выходной продукции (Тараторкин В.М., Петров Е.Б., 2009).
Развитие молекулярной генетики и совершенствование методов анализа генома животных привело к внедрению в практику животноводства маркерной селекции, основанной на анализе генетических маркеров – участков ДНК, связанных с проявлением определенных признаков (Сулимова Г.Е., 2004, Калашникова Л.А., 2000, Букаров Н.Г., 2004).
Использование ДНК-маркеров, обуславливающих устойчивость или наоборот чувствительность к заболеваниям, является одним из приемов селекции животных, нацеленной на получение особей, обладающих повышенной резистентнос тью к заболеваниям (Эрнст Л.К., Зиновьева Н. А., 2008). Использование такой стратегии является особо актуальным для инфекционных заболеваний, борьба с которыми только с использованием ветеринарных мероприятий не всегда эффективна.
Одним из широко распространенных на территории России заболеваний является лейкоз крупного рогатого скота (Петров Н. И., 2001).
По данным Россельхознадзора в 2010 году было выявлено около 10% животных, инфицированных вирусом лейкоза (ВЛКРС), у которых наблюдались неопластические изменения и изменения лейкоформулы (www.fsvps.ru). В качестве потенциальных Д НК-маркеров устойчивости к лейкозу рассматриваются гены главного комплекса гистосовместимости локуса BoLA, в час тности, ген DRB3 (Эрнст Л.К. и др.1998, Ковалюк Н. В., 2008). Вместе с тем, внедрение данного маркера в практику сдерживается, с одной стороны, отсутствием системы генотипирования животных на наличие «желательных» аллелей в режиме скрининга животных, с другой стороны, наличием лишь ограниченной информации о наличии и характере связи «желательных» аллелей с признаками молочной продуктивности коров.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлся скрининг гена BoLA-DRB3 на наличие аллелей, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, у крупного рогатого скота различных пород.
Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. Провести секвенирование и создать банк ДНК референтных образцов с различными генотипами по BoLA-DRB3.
2. Разработать систему выявления «желательных» аллелей *11, *23, *28=*7А BoLA-DRB3, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, пригодную для массового скрининга скота;
3. Изучить частоты встречаемости «желательных» генотипов и аллелей BoLA-DRB3 у различных пород крупного рогатого скота.
4. Изучить степень инфицированнос ти коров вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в зависимости от наличия в их генотипе «желательных» аллелей BoLA-DRB3.
5. Изучить влияние генотипа по BoLA-DRB3 и с татуса по ВЛКРС на показатели молочной продуктивнос ти коров.
Новизна работы. Впервые разработана тест-система, позволяющая в режиме массового скрининга выявлять животных-носителей «желательных» аллелей BoLA-DRB3 (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу. Изучено распределение «желательных» аллелей BoLA-DRB3 в основных породах крупного рогатого скота, разводимых в России, а также у гибридов крупного рогатого скота и зебу. Проведен анализ влияния наличия в генотипе «желательных» аллелей BoLA-DRB3 на статус по ВЛКРС и уровень молочной продуктивнос ти коров. Получен патент на изобретение «Способ диагнос тики устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза», RU 2428485 С1 от 10.09.2011. Приоритет от 09.03.2010 г.
Практическая значимость. С использованием разработанной тест системы проведен массовый скрининг 1216 голов крупного рогатого скота пород, разводимых на территории Российской Федерации, на наличие «желательных» аллелей BoLA-DRB3 (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу. Установлено, что гомозиготные носители «желательных» аллелей BoLA-DRB3 являются свободными от ВЛКРС.
Показано достоверное превосходство коров черно-пестрой голштинизированной породы – носителей ВЛКРС над не носителями по уровню удоя, содержанию и выходу белка, а также по выходу молочного жира. Выявлено дос товерное превосходство коров – не носителей ВЛКРС, имеющих гетерозиготный генотип по BoLA-DRB3, по содержанию жира в молоке у коров черно-пестрой голштинизированной породы, а так же по уровню удоя и выходу молочного жира у коров красной горбатовской породы.
Основные положения, выносимые на защиту:
Система определения в режиме скрининга «желательных» аллелей BoLA-DRB3 (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу.
Распределение «желательных» аллелей и генотипов у крупного рогатого скота 10 пород и зебувидного скота.
Отсутствие носителей провирусной формы ВЛКРС среди животных, гомозиготных по «желательным» аллелем BoLA-DRB3.
Связи генотипов BoLA-DRB3 с показателями молочной продуктивности коров.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены:
на 7-й международной научной конференции «Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных», БиоТехЖ-2008, 2008 г., п. Дубровицы;
на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» посвященной памяти Р.Г.
Гареева, 25-27 февраля 2009 г., Казань;
на V Московском международном конгрессе «Биотехнология:
состояние и перспективы развития», 16-20 марта 2009 г., Москва;
на конференции «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных», посвященной 100-летию со дня рождения основателя института, заслуженного деятеля науки профессора М.М. Лебедева, 3-5 июня 2009 г., Санкт-Петербург-Пушкин;
на конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России», 28-30 октября 2009 г., Сергиев Посад;
конференции Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ ВИЖ 16 ноября 2011 года.
Структура и объем работы. Диссертация написана на 110 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит таблицы и 10 рисунков. Список литературы включает 148 источников, в том числе 82 источника на иностранном языке.
Всего по теме Публикации результатов исследований.
диссертационной работы опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ («Зоотехния», 2009, №9;
«Проблемы биологии продуктивных животных», 2011, № 1). Получен патент на изобретение.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проводили в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук в период с 2007 по 2011 гг. по схеме, приведенной на рисунке 1.
Выборка была представлена 1216 головами 10 пород крупного рогатого скота, разводимых на территории Российской Федерации: черно-пестрая голштинизированная (n=417), симментальская (n=94), айрширская (n=53), ярославская (n=203), красная горбатовская (n=167), бестужевская (n=28), костромская (n=121), бурая швицкая (n=21), сычевская (n=29), холмогорская (n=83) и 19 гибридами зебу и крупного рогатого скота.
Материалом для молекулярно-генетических исследований являлись образцы ткани (ушные выщипы), крови или спермы. Выделение ДНК проводили по общепринятым методикам (Зиновьева Н. А. и др., 1998) и с использованием колонок Nexttec GmbH (Германия), набора реагентов DIAtomTM DNA Prep100 (Россия).
Коллекцию референтных образцов с известными генотипами в позициях 70-71 BoLA-DRB3 получали с использованием метода пиросеквенирования. Наличие «желательных» аллелей BoLA-DRB3 (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, определяли с использованием системы, разработанной в ходе выполнения диссертации.
Создание коллекции референтных образцов с известными генотипами в позициях 70-71 BoLA-DRB Теоретическое и экспериментальное моделирование системы анализа полиморфизма BoLA-DRB3, пригодной для массового скрининга Генотипирование крупного рогатого скота по BoLA-DRB3 с использованием разработанной системы Кр асно-пестрая (n=5) Бур ая швицкая (n=21) Кр асная горбатовская Холмогорская (n=83) Костромская (n=121) голштинизированная Яр ославская (n=203) Бестужевская (n=28) Айр ширская (n=53) Сычевская (n=29) Зебувидный скот Симментальская Черно-пестрая (n=417) (n=167) (n=94) (n=19) Определение частот встречаемости «желательных» аллелей и генотипов BoLA-DRB Изучение популяционно-генетического разнообразия по гену BoLA-DRB ПЦР-диагностика наличия вируса лейкоза в крови Анализ показателей молочной продуктивности (удой, кг;
жир, %;
жир, кг;
белок,%;
белок, кг) за 1 лактацию Изучение влияния статуса по ВЛКРС и генотипа по BoLA-DRB3 на показатели молочной продуктивности коров Рис. 1. Схема проведенных исследований Определение наличия провирусной формы ВЛКРС в крови животных проводили с использованием методики Гладырь Е.А. и др. (2006).
На основании данных анализа генотипа животных проводили оценку популяционно-генетических параметров исследованных пород. Были определены частоты встречаемости желательных аллелей и генотипов, наблюдаемый (Ho) и ожидаемый (He) уровни гетерозиготности, рассчитаны индекс фиксации F и число эффективных аллелей (Ne), построены матрица генетических дистанций по методу Nei (Nei M., 1983) и дендрограмма генетических расстояний между исследованными породами.
Статис тическую обработку данных лабораторных исследований и зоотехнического учета проводили методами дисперсионного и корреляционного анализа с использованием критериев Фишера и Стьюдента по методикам, описанным Животовским Л.А. (1991) и Крамаренко С.С.
(2004), с помощью программ Статис тика 6.0 и Excel.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Разработка системы скрининга аллелей BoLA-DRB3, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу Анализ нуклеотидных последовательнос тей и информации, содержащейся в электронной базе данных NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, показал, что все аллели BoLA-DRB (*11, *23, *28 =*7А), ассоциированные с генетической устойчивостью к вирусу лейкоза, в отличие от других аллелей (нейтральных и чувствительных) содержат два нуклеотидных триплета gga и gag, соответс твующих аминокислотам Glu и Arg в позициях 70 и 71 (аллели ER).
В этой связи, теоретическое моделирование тест-системы было направлено на идентификацию животных-носителей аллелей ER BoLA-DRB3.
На первом этапе выполнения работы нами была создана коллекция ДНК с известными генотипами в позициях 70 и 71 BoLA-DRB3.
Смоделированная нами система скрининга животных по BoLA-DRB предусматривала проведение аллелеспецифической ПЦР с целью идентификации образцов, содержащих аллели ER, с последующим пиросеквенированием таких образцов с целью определения зиготности (гомозиготный или гетерозиготный генотип по ER). Экспериментальная апробация системы на референтных образцах показала 100% совпадение результатов анализа.
3.2. Определение частот встречаемости «желательных» аллелей и генотипов BoLA-DRB Результаты генотипирования скота с использованием разработанной системы приведены в таблице 1 и на рисунке 2.
Как следует из данных таблицы 1, наибольшее число «желательных» гомозиготных генотипов выявлено в симментальской (12,77%) и костромской породах (9,09%). Относительно высокие частоты встречаемости «желательных» генотипов выявлены в холмогорской (8,43%) и айрширской (7,55%) породах. Оценка достоверности наблюдаемых различий показала, что симментальская порода по частоте встречаемости гомозигот достоверно (p0,05) превосходит все остальные породы, кроме холмогорской и костромской. Бурая швицкая и сычевская породы уступают по частоте встречаемости гомозиготных генотипов другим исследованным породам (p0,05). Гетерозиготные генотипы достоверно чаще по сравнению с остальными популяциями встречались у зебувидного скота (p0,05), достоверно реже – в бестужевской и красной горбатовской породах (p0,05).
Табл. 1. Распределение частот встречаемости генотипов BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота различных пород Группа животных Частоты генотипов, M±m ER/ER, % ER/ -, % -/- *, % Черно-пес трая голштинизированная порода 4,08±0,97 16,07±1,80 79,86±1, Симментальская порода 12,77±3,05 28,72±4,84 58,51±5, Айрширская порода 7,55±3,63 16,98±5,16 75,47±5, Ярославская порода 5,42±1,59 16,75±2,62 77,83±2, Красная горбатовская 3,59±1,44 2,99±1,32 93,41±1, Бестужевская порода 3,57±3,51 7,14±4,87 89,29±5, Костромская порода 9,09±2,61 21,49±3,73 69,42±4, Бурая швицкая порода 0 14,29±7,64 85,71±7, Сычевская порода 0 13,79±6,40 86,21±6, Холмогорская порода 8,43±3,44 26,51±4,67 65,06±5, Зебувидный скот 5,26±5,12 36,84±11,07 57,89±11, В среднем 5,67±0,66 16,68±1,06 77,65±1, Примечание: * - нейтральные или чувствительные аллели Примечание: ось Х – породы скота;
под осью Х показаны значения частот встречаемости «желательных» аллелей ER, %;
слева от оси Y – частоты аллелей, %;
справа от оси Y – ошибка частот аллелей, %.
Рис. 2. Распределение частот встречаемости аллелей BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота различных пород Частоты встречаемости желательных аллелей ER варьировали от 5,09% в красной горбатовской породе до 27,13% в симментальской породе.
Относительно высокие значения частот встречаемости «желательных» аллелей отмечены так же у холмогорской, костромской и айрширской пород (21,69, 19,83 и 16,04%, соответственно).
Популяционно-генетические параметры исследованных пород скота, рассчитанные на основании их генотипов по BoLA-DRB3 по Peakall R. и Smouse P.E. (2006) обобщены в таблице 2.
Табл. 2. Показатели генетического разнообразия крупного рогатого скота различных пород по гену BoLA-DRB Группа животных N Ne Ho He F Черно-пес трая голштинизированная 417 1,27 0,16 0,21 0,25*** Холмогорская 83 1,51 0,27 0,34 0,22* Айрширская 53 1,37 0,17 0,27 0,37** Ярославская 203 1,31 0,17 0,24 0,30*** Красная горбатовская 167 1,11 0,03 0,10 0,69*** Бестужевская 28 1,15 0,07 0,13 0,46* Костромская 121 1,47 0,21 0,32 0,32*** -0,08ns Бурая швицкая 21 1,15 0,14 0, -0,07ns Сычевская 29 1,15 0,14 0, Симментальская 94 1,67 0,30 0,40 0,26* -0,02ns Зебувидный скот 19 1,57 0,37 0, Примечание: Ho – наблюдаемая гетерозиготность;
He – ожидаемая гетерозиготность;
F – индекс фиксации, Ne – число эффективных аллелей;
ns– не достоверно/not significant, * p0,05, ** p0,01, *** p0, Наибольшее число эффективных аллелей (1,67) было обнаружено у симментальской породы, что говорит о большем генетическом разнообразии в данной породе по сравнению с другими. Положительные значения индекса фиксации F указывают на недостаток гетерозигот. Исключение составили бурая швицкая, сычевская породы и зебувидный скот, где было отмечено отрицательное значение этого показателя, что свидетельствует об избытке гетерозигот. Анализ генного равновесия по Харди-Вайнбергу показал, что отклонения наблюдаемых час тот аллелей от ожидаемых в бурой швицкой, сычевской породах и у зебувидного скота носят случайный характер, в то время как в остальных популяциях эти различия обусловлены определенными факторами, в частнос ти, ведением селекционной работы с использованием ограниченного числа производителей, разведения по линиям, что в целом ведет к нарастанию инбридинга.
Расчеты значения F коэффициента Фишера при заданном числе степеней свободы и уровне значимости, а также силы влияния фактора показали, что межпопуляционная изменчивость, обусловленная влиянием фактора породы, достоверно превосходит изменчивость по гену BoLA-DRB внутри популяций. При этом сила влияния данного фактора составляла всего 4,2% (p0,001). Это говорит о том, что факт принадлежнос ти животного к определенной породе не гарантирует у него наличия в генотипе устойчивых к лейкозу аллелей, хотя и несколько повышает вероятнос ть их обнаружения.
Существенную роль (95,6%) играют другие неучтенные факторы.
Расчеты генетических дистанций по методу Nei M. (1983) показали, что наиболее существенные различия по локусу BoLA-DRB3 выявлены между симментальской и красной горбатовской, бурой швицкой, сычевской и бестужевской породами (от 0,026 до 0,049).
Как показано на рисунке 3, молочные породы (айрширская, ярославская, черно-пестрая голштинизированная, холмогорская, костромская) образовывали на дендрограмме отдельный кластер, который, в свою очередь, был разделен еще на два кластера. Зебувидный скот был отнесен к этому кластеру, поскольку при его выведении использовались животные черно-пестрой породы. Другой крупный кластер был образован породами комбинированного направления продуктивности – бестужевской, сычевской, бурой швицкой и красной горбатовской, относительно недалеко отстоящей от молочных пород. Симментальская порода, отличавшаяся наибольшей частотой желательных аллелей, образовала отдельный кластер.
Таким образом, анализ показал, что симментальская порода с наибольшей частотой встречаемос ти желательных аллелей может быть использована в качестве перспективной породы при создании стада генетически устойчивого к лейкозу.
Рис. 3. Дендрограмма генетических дистанций 3.3. Анализ распределения носителей ВЛКРС в зависимости от генотипа по BoLA-DRB Исследование влияния присутствия в генотипе «желательных» аллелей BoLA-DRB3 на заболеваемостью лейкозом проводилось на животных черно пестрой голштинизированной, красной горбатовской пород и зебувидного скота (табл. 3).
Табл. 3. Распределение носителей провируса ВЛКРС в зависимости от наличия «желательных» аллелей BoLA-DRB Группа животных Генотип по ВЛКРС «+»* ВЛКРС «-»* BoLA-DRB3 гол. % гол. % Черно-пес трая ER/ER 0 0,00 16 100, голштинизирован ER/- 13 78,33 47 21, ная порода -/- 72 76,16 230 23, Красная ER/ER 0 0,00 6 100, горбатовская ER/- 2 60,00 3 40, порода -/- 23 85,26 133 14, Зебувидный скот ER/ER 0 0,00 1 100, ER/- 0 0,00 7 100, -/- 0 0,00 11 100, Всего ER/ER 0 0,00 23 100, ER/- 15 79,17 57 20, -/- 95 79,74 374 20, Примечание: ВЛКРС «+» – носители ВЛКРС, ВЛКРС «-» – не носители ВЛКРС.
Как следует из данных таблицы 3, наибольшее количес тво вирусоносителей в черно-пестрой голштинизированной породе наблюдалось среди животных, не имевших в своем генотипе «желательных» аллелей BoLA-DRB3. Зебувидный скот вне зависимости от генотипа по BoLA-DRB был свободен от провируса лейкоза. Ни у одного из животных, имеющих в своем генотипе «желательные» аллели в гомозиготном состоянии, провирус лейкоза обнаружен не был. У коров черно-пестрой голштинизированной породы заметных различий в степени инфицированнос ти ВЛ КРС между гетерозиготными носителями «желательных» аллелей BoLA-DRB3 и не носителями выявлено не было (21,67 и 21,84%, соответс твенно), в то время как в красной горбатовской породе эти показатели составили, соответс твенно, 40,00 и 14,74%. С использованием дисперсионного анализа установлено, что наличие в генотипе животных «желательных» аллелей по BoLA-DRB3 с вероятностью ошибки 5,5% способствует снижению их инфицированнос ти ВЛКРС.
3.4. Анализ уровня молочной продуктивности коров в зависимости от статуса по ВЛКРС и генотипа по BoLA-DRB 3.4.1. Влияние статуса по ВЛКРС на уровень молочной продуктивности Результаты анализа молочной продуктивности в группах коров с различным с татусом по ВЛ КРС (носители ВЛКРС и свободные от ВЛКРС) приведены в таблице 4.
Табл. 4. Показатели продуктивности коров с различным статусом по ВЛКРС Показатель Порода Черно-пес трая Красная голштинизированная горбатовская ВЛКРС «+» ВЛКРС «-» ВЛКРС «+» ВЛКРС «-» N, голов 78 189 23 Удой, кг 6553±113* 5965±72 3362±199 3165± Жир, % 3,98±0,04* 3,84±0,03 4,16±0,04 4,19±0, Выход жира, кг 249,4±5,6** 230,1±3,6 140,1±8,43 132,1±3, Белок, % 3,09±0,02 3,08±0,01 - Выход белка, кг 193,2±3,6* 184,0±2,3 - Примечание: * p0,05, ** p0,01, *** p0, Как следует из данных таблицы 4, коровы – носители ВЛКРС обеих исследованных пород отличались большей молочной продуктивнос тью по сравнению с не носителями. В черно-пестрой голштинизированной породе носители ВЛКРС превосходили здоровых животных по удою на 588 кг, содержанию жира – на 0,14% абс. и выходу белка на – на 9,2 кг (р0,05), а также по выходу молочного жира на 19,3 кг (p0,01). В красной горбатовской породе была установлена аналогичная тенденция по уровню удоя и выходу молочного жира, однако различия между группами были не достоверны.
3.4.2. Влияние генотипа по гену BoLA-DRB3 на уровень молочной продуктивности коров Результаты анализа молочной продуктивности коров в зависимости от генотипа по BoLA-DRB3 обобщены в таблице 5.
Табл. 5. Молочная продуктивность коров в зависимости от генотипа по BoLA-DRB Генотип по BoLA-DRB Черно-пес трая Красная горбатовская Показатель голштинизированная порода порода ER/ER ER/- -/-* ER/ER ER/- -/-* n, гол. 7 44 216 5 5 5892±491 6172±154 6030±68 2863±136 3546±538 3199±74* Удой, кг 3,98±0,06 3,98±0,05* 3,86±0,03 4,27±0,08 3,98±0,08** 4,19±0, Жир, % Выход жира, кг 235,1±21,7 247,3±8,2 233,4±3,4 121,9±4,5 141,5±22,3 133,6±3,0* 3,08±0,06 3,08±0,03 3,09±0,01 - - Белок, % Выход белка, кг 180,7±13,0 190,1±4,9 186,2±2,2 - - Примечание:
-/-* - чувствительные и нейтральные аллели, * - р0,05;
** - р0,01;
*** - р.0, Максимальный удой отмечен в группах коров, несущих гетерозиготный генотип по BoLA-DRB3, минимальный – у коров, гомозиготных по аллелям ER.
Таким образом, гетерозиготные генотипы по BoLA-DRB3 являются наиболее предпочтительными, исходя из уровня молочной продуктивности.
3.4.3. Комплексное влияние генотипа по гену BoLA-DRB3 и статуса по ВЛКРС на уровень молочной продуктивности коров Результаты анализа уровня молочной продуктивности в группах коров с различными генотипами по BoLA-DRB3 в зависимости от статуса по ВЛКРС приведены в таблице 6.
Табл. 6. Уровень молочной продуктивности коров - носителей и не носителей ВЛКРС с разными генотипами по гену BoLA-DRB Показа- Статус по Генотип по BoLA-DRB тель ВЛКРС* Черно-пестрая Красная голштинизированная горбатовская ER/ER ER/- -/-** ER/ER ER/- -/-* N, гол. + 0 10 68 0 2 - 7 34 148 5 3 Удой, кг + 0 6290±355 6248±120 0 3600±1700 3339± - 5892±491 6138±172 5930±80 2863±136 3511±12 3170± Жир, % + 0 4,02±0,08 3,98±0,05 0 3,97±0,08 4,18±0, - 3,98±0,06 3,97±0,06 3,80±0,03 4,27±0,08 3,98±0,14 4,19±0, Выход + 0 252,6±15,0 249,0±6,1 0 144,0±70,1 139,7±7, жира, кг - 235,1±21,7 245,7±9,7 226,2±3,9 121,9±4,5 139,8±4,5 132,4±3, Белок, % + 0 3,11±0,04 3,09±0,02 - - - 3,08±0,06 3,07±0,03 3,09±0,01 - - Выход + 0 532,0±11,4 541,3±4,5 - - белка, кг - 543,9±10,1 538,7±7,4 542,1±3,3 - - Примечание: * - «+» - носители ВЛКРС, «-» - не носители ВЛКРС, ** нейтральные и чувствительные аллели Анализ уровня молочной продуктивности в группах коров, гетерозиготных по «желательным» аллелям BoLA-DRB3 и не имеющих «желательных» аллелей показал, что носители ВЛКРС превосходили коров – не носителей по всем показателям молочной продуктивнос ти вне зависимости от породной принадлежности.
3.5. Оценка влияния линейной принадлежности коров на распределение аллелей BoLA-DRB3 и статус по ВЛКРС Исследования влияния линейной принадлежнос ти и происхождения коров на формирование «желательного» генотипа по BoLA-DRB3, молочную продуктивность и заболеваемость лейкозом, были выполнены на коровах черно-пестрой голштинизированной породы, содержащихся в ФГУП э/х «Кленово-Чегодаево». Выборка коров была представлена генеалогическими линиями Вис Бэк Айдиала (ВБА), Монтвик Чифтейна (МЧ), Рефлекшн Соверинга (РС), Силинг Трайджун Рокита (СТР) и Файн Телекс Грейлинд (ФТГ). Кровность по голштинской черно-пес трой породе в среднем была на уровне 70-80%. Средние показатели молочной продуктивнос ти по первой лактации составили 6043±68 кг по удою, 3,88±0,03% - по содержанию жира в молоке и 3,09±0,01% - по содержанию белка в молоке.
Частота встречаемости особей, гомозиготных по «желательным» аллелям BoLA-DRB3R, составляла 4,17%, гетерозиготных - 16,39% и животных, не несущих «желательных» аллелей – 79,44%.
3.5.1. Полиморфизм гена ВoLA-DRB3 у коров черно-пестрой голштинизированной породы различных генеалогических линий Частоты встречаемости генотипов и аллелей BoLA-DRB3 у коров разных линий предс тавлены в таблице 7.
Табл. 7. Распределение генотипов и аллелей BoLA-DRB3 у коров черно пестрой породы в зависимости от линейной принадлежности Генеалогическая Число Частота генотипов, % Частота аллелей, % линия голов ER/ER ER/ - -/-* ER -/-* ВБА 112 2,68 14,29 83,04 9,82±1,98 90,18±1, МЧ 76 2,63 14,47 82,89 9,87±2,42 90,13±2, РС 86 4,65 22,09 73,26 15,70±2,77 84,30±2, СТР 13 0,00 7,69 92,31 3,85±3,77 96,15±3, ФТГ 5 20,00 40,00 40,00 40,00±15,49 60,00±15, Другие линии 68 7,35 14,71 77,94 14,71±3,04 85,29±3, Примечание: *«-» – нейтральные и чувствительные аллели Максимальная час тота аллеля ER наблюдалась в линии ФТГ (40,00±15,49%), однако значительная ошибка показателя не позволяет считать его достоверным. Таким образом, наибольшая частота встречаемости «желательных» аллелей наблюдалась в линии РС (15,70%), причем как в гомозиготном (4,65%), так и в гетерозиготном (22,09%) состояниях, минимальная - в линии СТР (3,85%). Проведенные расчеты показали достоверные различия в частотах встречаемости гомозиготных генотипов у коров линий СТР и РС (p0,05). Значимых различий в частотах встречаемости «желательных» аллелей между линиями выявлено не было.
3.5.2. Связь линейной принадлежности коров со статусом по ВЛКРС Результаты инфицированности коров различных генеалогических линий ВЛКРС представлены в таблице 8.
Табл. 8. Распределение коров - носителей ВЛКРС в зависимости от линейной принадлежности Генеалогическая Статус по ВЛКРС линия носители не носители Всего n % n % животных ВБА 31 27,68 81 72,32 МЧ 16 21,05 60 78,94 РС 28 32,56 58 67,44 СТР 4 30,77 9 69,23 ФТГ 2 40,00 3 60,00 Другие линии 4 12,90 27 87,10 Итого 85 236 Как следует из данных таблицы 8, среди коров, принадлежащих к линии РС, было выявлено значительное количество носителей провируса лейкоза, хотя в этой же линии, как показано выше, наиболее велика доля желательных аллелей. Максимальная доля вирусоносителей обнаружена в линии ФТГ. Результаты оценки влияния фактора линейной принадлежности на распределение вирусоносителей показали отсутствие значимых различий в вероятности инфицированнос ти ВЛ КРС коров, принадлежащих различным генеалогическим линиям.
3.5.3. Распределение генотипов и аллелей ВoLA-DRB3 у дочерей различных быков-производителей Результаты анализа частот встречаемости генотипов и аллелей BoLA DRB3 в потомстве отдельных быков-производителей даны в таблице 9.
Табл. 9. Частоты встречаемости генотипов и аллелей BoLA-DRB3 у коров черно-пестрой голштинизированной породы в зависимости от происхождения Частота аллелей, % Частота генотипов, % Бык Линия производитель ER -/-* ER/ ER ER/- -/-* Вис Бэк Бук 22,22±9.79 77,78±9.79 0,00 44,44 55, Айдиал Вираж 7,14±4.87 92,86±4.87 0,00 14,29 85, Самсунг 5,92±1.91 94,08±1.91 1,32 9,21 89, Фрейланд 10,00±9.49 90,00±9.49 0,00 20,00 80, М онтвик Абрикос 0,0 100,0 0,00 0,00 100, Чифтейн Анилин 6,25±6.05 93,75±6.05 0,00 12,50 87, Гвидон 10,71±2.92 89,29±2.92 3,57 14,29 82, Свет 20,00±12.65 80,00±12.65 0,00 40,00 60, Рефлекшн Вереск 21,43±10.97 78,57±10.97 0,00 42,86 57, Соверинг Раундап 4,35±3.01 95,65±3.01 0,00 8,70 91, Тирбах 59,38±8.68 12,50 56,25 31, 40,63±8. Эгли 1,56±1.55 98,44±1.55 0,00 3,13 96, Силинг Трай- Эльвио джун Рокит 3,85±3.77 96,15±3.77 0,00 7,69 92, Файн Телекс Андрос Грейлинд 60,00±15.49 20,00 40,00 40, 40,00±15. Другие быки 41,18±3.04 58,82±3.04 23,53 35,29 41, Другие линии 14,71±8.44 85,29±8.44 7,35 14,71 77, Примечание: *«-» – нейтральные и чувствительные аллели.
Наибольшая частота «желательных» аллелей (40,63%) обнаружена у дочерей Тирбаха, которые значимо (р0,05) превосходили дочерей других быков за исключением Андроса. В целом, наибольшие частоты встречаемости «желательных» аллелей BoLA-DRB3 выявлены у дочерей линий РС (Тирбах, Вереск) и ФТГ (Андрос). Исследование статуса дочерей отдельных быков-производителей по ВЛКРС не выявило достоверных различий, то ес ть дочери этих быков имеют примерно равную степень вероятности заболеть лейкозом, если не принимать во внимание другие факторы (например, генотип), оказывающие значимое влияние.
3.6. Анализ взаимосвязей между исследованными факторами и показателями молочной продуктивности коров Результаты анализа корреляционных связей между показателями продуктивности, генотипом и инфицированностью ВЛКРС на выборке коров черно-пестрой голштинизированной (n=267) и красной горбатовской пород (n=133) приведены в таблице 10.
Табл. 10. Коэффициенты корреляции между исследованными факторами и показателями молочной продуктивности коров Исследованные факторы Черно-пес трая голштинизированная порода Носительство BoLA-DRB Генотип по Молочный Удой, кг Жир, % ВЛКРС жир, кг Красная гор Генотип по BoLA-DRB3 1.00 -0.03 0.12*** 0.08** -0.12*** батовская Удой, кг -0.04 1.00 0.24*** 0.89*** 0.13* порода Жир, % -0.02 -0.25** 1.00 0.64*** 0.17** Молочный жир, кг -0.04 0.98*** -0.07 1.00 0.18** Носительство ВЛКРС -0.03 0.09 -0.06 0.09 1. Примечание: значения над диагональю: голштинизированная черно пестрая порода;
значения под диагональю: красная горбатовская порода;
*р0.05;
**p0,01;
***p0, Как следует из данных таблицы 10, у коров черно-пестрой голштинизированной породы между наличием в генотипе «желательных» аллелей по BoLA-DRB3 отмечена слабая положительная корреляция с содержанием жира (+0,12, p0,001), количеством молочного жира (+0,08, p0,01) и слабая отрицательная корреляция – со статусом по ВЛКРС (-0,12, p0,001), в то время как у коров красной горбатовской породы достоверные корреляции между этими показателями не выявлялись.
Инфицированность коров черно-пестрой голштинизированной породы ВЛКРС характеризовалось положительной корреляцией с уровнем удоя (+0,13, p0,05), процентным содержанием и количеством молочного жира (+0,17 и +0,18, соответс твенно, p0,01). У коров красной горбатовской породы достоверные корреляции между этими показателями не выявлялись.
4. ВЫВОДЫ 1. Разработана система генотипирования аллелей BoLA-DRB3 в режиме быстрого скрининга. Система основана на проведении аллелеспецифической ПЦР с целью идентификации образцов ДНК животных-носителей «желательных» аллелей (*11, *23, *28 =*7А), ассоциированных с генетической устойчивостью к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), с последующим пиросеквенированием таких образцов с целью определения гомо- или гетерозиготнос ти.
2. Проведенная апробация разработанной системы на 1216 головах крупного рогатого скота 10 пород (черно-пестрая голштинизированная (n=417), симментальская (n=94), айрширская (n=53), ярославская (n=203), красная горбатовская (n=167), бестужевская (n=28), костромская (n=121), бурая швицкая (n=21), сычевская (n=29), холмогорская (n=83)) и 19 головах зебувидного скота показала, что частоты встречаемости «желательных» аллелей BoLA-DRB3 варьировали от 5,09±1,20% в красной горбатовской породе до 27,13±3,24% в симментальской породе и в среднем составили 14,01±0,70%.
3. Установлено, что исследованные породы достоверно различаются по частотам встречаемости «желательных» генотипов BoLA-DRB3.
Наибольшая частота встречаемости гомозиготных генотипов 0, (12,77±3,05% ) отмечалась в симментальской породе. В бурой швицкой и сычевской породах гомозиготные генотипы обнаружены не были.
Гетерозиготные генотипы достоверно чаще встречались у зебувидного скота (36,84±11,07%0,05) и реже – в бестужевской и красной горбатовской породах (7,14±4,87%0,05 и 2,99±1,32%0,05, соответственно).
4. Оценка генетического разнообразия по локусу BoLA-DRB показала значительный недостаток гетерозигот в красной горбатовской породе (F=0,69). Выявлено, что отклонение от равновесия Харди-Вайнберга по частотам наблюдаемых и ожидаемых аллелей в бурой швицкой, сычевской породах и у зебувидного скота носит случайный характер, в то время как в остальных породах эти различия обусловлены фактором породной принадлежнос ти.
5. Исследование коров черно-пестрой голштинизированной и красной горбатовской пород показало отсутствие носителей ВЛКРС среди животных, гомозиготных по «желательным» аллелям BoLA-DRB3. Распределение носителей ВЛКРС среди животных, несущих «желательные» аллели по BoLA-DRB3 в гетерозиготном состоянии, и не имеющих «желательных» аллелей составило, соответственно, 21,67 и 23,84% в черно-пестрой породе и 40,00 и 14,74 – в красной горбатовской породе.
6. Выполнен анализ влияния генотипа по BoLA-DRB3, породной и линейной принадлежнос ти, статуса по ВЛКРС на признаки молочной продуктивности.
а) Установлено достоверное превосходство коров черно-пестрой голштинизированной породы - носителей ВЛКРС над не носителями по уровню удоя (на 588 кг0,05 ), содержанию жира (на 0,14%0,05 ) и выходу белка (на 9,2 кг0,05 ), а также по выходу молочного жира (на 19,3 кг0,01 ).
б) Установлены достоверные различия по показателям молочной продуктивности коров - не носителей ВЛКРС с различными генотипами по BoLA-DRB3. Коровы черно-пестрой голштинизированной породы, гомозиготные и гетерозиготные по «желательным» аллелям BoLA-DRB3, превосходили коров – не носителей по содержанию жира в молоке на 0,17%0,01 и 0,16%0,05, соответс твенно. Коровы красной горбатовской породы, гетерозиготные по «желательным» аллелям, превосходили гомозиготных носителей «желательных» аллелей по уровню удоя (на 647 кг0,01 ) и выходу молочного жира (на 17,9 кг0,05 ), а также коров, не имевших в генотипе «желательных» аллелей – по удою (на 340 кг0,001). Среди носителей ВЛ КРС не найдено достоверной разницы между генотипами по BoLA-DRB3 и показателями молочной продуктивнос ти.
7. Установлено достоверное влияние генеалогической линии коров черно-пестрой голштинизированной породы э/х «Кленово-Чегодаево» на некоторые показатели молочной продуктивнос ти: линия Рефлекшн Соверинга превосходит линии Вис Бэк Айдиала (по удою на 353,7кг0,05, по содержанию жира в молоке на 0,13%0,05, по выходу молочного жира и белка на 22,4кг0,05 и 12,1кг0,05 соответственно) и Монтвик Чифтейна (по удою на 640,8кг0,001, по выходу молочного жира и белка на 32кг0,001 и 18,9кг0, соответс твенно).
8. Не выявлено достоверного влияния линейной принадлежности и происхождения (отца) коров на частоту встречаемости «желательных» аллелей BoLA-DRB3 и статус по ВЛКРС.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Лабораториям молекулярно-генетической экспертизы для генотипирования крупного рогатого скота рекомендуем использование разработанной нами тест-системы скрининга аллелей BoLA-DRB3, ассоциированных с генетической устойчивостью к вирусу лейкоза.
Сельскохозяйственным предприятиям при проведении подборов родительских пар с целью повышения в стаде частоты встречаемости «желательных» аллелей, ассоциированных с генетической устойчивостью к вирусу лейкоза, и поддержания уровня гетерозиготнос ти рекомендуем производить учет генотипа по BoLA-DRB3.
Список опубликованных работ по теме диссертации Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
1. Гладырь, Е. А. Молекулярные методы в диагностике заболеваний и наследственных дефектов сельскохозяйственных животных / Гладырь Е. А., Зиновьева Н. А., Эрнст Л.К., Костюнина О.В., Быкова А.С., Банникова А.Д., Кудина Е.П., Брем Г. // Зоотехния. - № 8. – 2009. – С.26-28.
2. Быкова, А.С. Экспресс-диагностика аллелей BOLA-DRB3, ассоциированных с устойчивостью крупного рогатого скота к лейкозу / Быкова А.С., Зиновьева Н. А., Гладырь Е.А. // «Проблемы биологии продуктивных животных», Т. 1, 2011, - с.12-15.
Патент.
3. Гладырь, Е. А., Способ диагнос тики устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза / Гладырь Е.А., Зиновьева Н. А., Быкова А.С., Эрнст Л.К. // Патент RU 2428485 С1 от 10.09.2011. Приоритет от 09.03.2010.
Статьи в других изданиях.
4. Гладырь, Е. А. Моделирование системы скрининга Bos Taurus по генетической устойчивости к ВЛКРС / Гладырь Е. А., Быкова А.С., Зиновьева Н. А. // Сборник трудов 7-й Международной научной конференции-школы: «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии», «БиоТехЖ-2008», 23-24 октября 2008. С. 33-40.
5. Быкова, А.С. Разработка системы детекции аллельных вариантов гена BoLA DRB3.2, способствующих устойчивости к лейкозу крупного рогатого скота / Быкова А.С., Гладырь Е.А., Зиновьева Н. А.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» посвященной памяти Р.Г. Гареева (25-27 февраля 2009 года) Казань, 2009. –С. 345-349.
6. Гладырь, Е. А. Моделирование системы скринига Bos taurus генетической устойчивости к лейкозу как элемента ДНК-технологии повышения устойчивости к заболеваниям крупного рогатого скота (Проект РФФИ №08-04-13736) / Гладырь Е. А., Зиновьева Н.А., Быкова А.С., Эрнст Л.К. // Материалы конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России», 28-30 октября 2009 г., Сергиев Посад, - С.145-149.
7. Быкова, А.С. Создание системы скрининга аллелей гена BoLA DRB3.2, обуславливающего потенциальную устойчивость крупного рогатого скота к вирусу лейкоза / Быкова А.С., Гладырь Е. А., Зиновьева Н. А. // «ЕС – Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи», 29 сентября - 5 октября 2010 г, БашГАУ, Уфа, - С. 72-74.
Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии Тел. (8-4967) 65-13- (8-4967) 65-15- Сдано в набор 23.11.2011. Подписано в печать 24.11. Заказ № 54. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.
Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии