Вирус гепатита а: генетические особенности изолятов, выявленных в сибирском регионе, и штаммов, адаптированных к культурам клеток
На правах рукописи
БОНДАРЕНКО ТАТЬЯНА ЮРЬЕВНА ВИРУС ГЕПАТИТА А: ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗОЛЯТОВ, ВЫЯВЛЕННЫХ В СИБИРСКОМ РЕГИОНЕ, И ШТАММОВ, АДАПТИРОВАННЫХ К КУЛЬТУРАМ КЛЕТОК 03.01.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Кольцово – 2011
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора).
Научный консультант:
кандидат биологических наук Терновой Владимир Александрович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Щелкунов Сергей Николаевич доктор биологических наук Татьков Сергей Иванович
Ведущая организация:
ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (г. Москва)
Защита состоится «11» марта 2011 г. в 9.00 ч. на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора по адресу:
630559, р. п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел. (383) 336–74–28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Автореферат разослан 2011 г.
Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Г.П. Трошкова Актуальность исследования Гепатит А (ГА) как заболевание широко распространен во всем мире: по данным ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется в среднем 1,4 млн. случаев заболевания вирусным ГА. По данным ФГУЗ «Федерального центра гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора, в последние 10 лет заболеваемость ГА в России регистрируется в пределах от 5 до 15 случаев на 100 тыс. населения.
Вместе с тем ГА может протекать в скрытой, бессимптомной форме и поэтому реальная заболеваемость ГА, возможно, значительно превышает число задокументированных случаев. Основной механизм заражения ГА фекально оральный, реализуемый пищевым, водным и контактно-бытовым путями.
Возбудителем заболевания является вирус ГА (ВГА), представитель рода Hepatovirus, семейства Picornaviridae, порядка Picornavirales. Плюс-РНК геном ВГА имеет длину в 7500 нуклеотидов (н.). К 5-концу РНК ВГА ковалентно присоединен белок VPg, а 3-конец полиаденилирован. Имеются 5- и 3 нетранслируемые области (НТО). Единственная открытая рамка считывания кодирует полипротеин длиной около 2228 аминокислотных остатков (а.о.), который расщепляется клеточными и вирусспецифической протеазами 3Cpro на структурные (VP1, VP2, VP3 и VP4) и неструктурные (2А, 2В, 2С, 3A, 3B, 3Cpro и 3Dpol) белки.
Выявление РНК ВГА при помощи обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) в крови и фекалиях людей очень важно на ранних сроках развития болезни, до появления клинических симптомов и в сложных случаях при смешанных инфекциях. На данный момент общепринятым для генотипирования и исследования вариабельности ВГА является филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента генома в 168 н., включающего район соединения генов белков VP1/2A и содержащего прилегающие к нему части генов VP1 и 2А ВГА.
Все изоляты ВГА в настоящее время подразделяют на шесть генотипов.
Генотипы I–III ВГА вызывают ГА у людей, IV–VI генотипы циркулируют в популяциях обезьян. Преобладающим у людей является генотип IА.
К сожалению, ранее определение генотипов ВГА, циркулирующих на территории России, проводилось только среди больных в европейской части и Якутии. Анализ генотипов ВГА, циркулирующих на территории Сибири, до сих пор не проводился. Учитывая численность населения, проживающего в Сибири, очевидна актуальность анализа изолятов ВГА в Сибирском регионе.
Эффективной мерой для предупреждения ГА является вакцинация населения. В Российской Федерации (РФ) вакцинация от ГА применяется с конца 90-х годов в рамках календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям. В США прививка от ГА включена в национальный календарь как обязательная для всех детей в возрасте 12–23 месяцев. В РФ в последнее время поднимается вопрос о массовой вакцинации детей от ГА, что требует получения вакцинных препаратов в достаточно больших количествах.
Используемые в настоящее время штаммы ВГА для получения вакцин от ГА («Avaxim», Франция;
«Havrix», Бельгия;
«Vaqta», США) обладают низкой скоростью роста (21–28 дней) на культуре клеток MRC-5 (диплоидные клетки легкого человека). Вакцина от ГА, производимая в России, «Геп-А-ин-Вак» основана на штамме ВГА HAS-15, нарабатываемом на культуре клеток (клетки почки зеленой мартышки). Как и зарубежные аналоги, данный метод наработки вируса характеризуется как низкой скоростью роста, так и невысокой продуктивностью. В связи с этим актуальными становятся поиск и изучение штаммов ВГА, имеющих высокую скорость роста в культуре клеток, как экономически более выгодных при производстве вакцин.
В ГНЦ ВБ «Вектор» в начале 90-х годов в результате адаптации изолята ВГА, выделенного от больного гепатитом А (г. Новосибирск, 1988 г.), к культуре клеток FRhK-4 (клетки почки эмбриона макаки-резус) был получен штамм МБ-7, который обладает высокой скоростью роста (Майданюк, 1993).
Были опубликованы данные о нуклеотидной последовательности лишь небольшого участка гена белка VP1 штамма МБ-7. Впоследствии данный штамм после проведения последовательных пассажей был адаптирован к культуре клеток 4647 (штамм МБ-7/4647), аттестованной на территории России для использования при производстве вакцинных препаратов. В дальнейшем штамм МБ-7/4647 был использован для адаптации к культуре клеток HEK (клетки почки эмбриона человека), применяемой для наработки иммунобиологических препаратов. Полученный штамм МБ-7/293, как и штамм МБ-7/4647, обладает высокой скоростью роста, что делает перспективным использование этих штаммов при разработке экономически выгодных профилактических и диагностических препаратов. К сожалению, культуральные и молекулярно-генетические свойства данных штаммов до сих пор недостаточно исследованы.
Таким образом, отсутствие информации о генетических особенностях изолятов ВГА в Сибирском регионе и необходимость детальной молекулярно генетической характеризации быстрорастущих штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ 7/293, адаптированных к культурам клеток 4647 и HEK293 соответственно, безусловно, определяют актуальность данной работы.
Целью настоящего исследования являлось изучение генетических особенностей изолятов ВГА, циркулирующих в Сибирском регионе, и штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293, адаптированных к культурам клеток 4647 и HEK293 соответственно.
В соответствии с этой целью были сформулированы следующие основные задачи исследования:
1. Провести анализ серопозитивных и серонегативных в ИФА на IgM к ВГА образцов сывороток от пациентов, поступивших в 2001–2002 годах в больницы Новосибирска, Барнаула и Иркутска, на присутствие РНК ВГА с помощью ОТ-ПЦР и в случае положительного результата определить нуклеотидные последовательности фрагментов генов белков VP1, 2A и 2В ВГА.
2. Провести филогенетическое сравнение полученных нуклеотидных последовательностей выявленных изолятов ВГА с нуклеотидными последовательностями известных штаммов ВГА.
3. Определить полные нуклеотидные последовательности геномов быстрорастущих штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293 ВГА, адаптированных к культурам клеток 4647 и HEK293, и провести сравнительный анализ роли выявленных мутаций на особенности штаммов МБ-7/4647 и МБ-7/293.
Научная новизна и практическая значимость работы Впервые на протяжении полного эпидемического сезона (2001– 2002 годах) было проведено изучение клинических изолятов ВГА от больных с острыми гепатитами в трёх крупных городах Сибири: Барнауле, Новосибирске и Иркутске. Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов ВГА (VP1, 2А и 2В) выявленных изолятов.
Определены полные нуклеотидные последовательности геномов штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293, адаптированных к культурам клеток и HEK293 соответственно. В результате сравнительного анализа выявлены мутации, которые могут быть ассоциированы с ростовыми свойствами штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293.
Таким образом, результаты данных исследований вносят существенный вклад в изучение генетического разнообразия ВГА на территории Сибирского региона РФ и могут быть использованы для совершенствования диагностических и профилактических препаратов.
Положения, выносимые на защиту Заболевания ГА в 2001–2002 годах в городах Барнауле, Новосибирске и Иркутске (в 101 выявленном случае) обусловлены двумя вариантами ВГА субгенотипа IА.
Ускоренную репликацию у штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293 в культурах клеток 4647 и HEK293 определяют геномные отличия от сравниваемых штаммов в виде дупликации района в 13 н. в 5-НТО (149-161 н.) и точечных замен в гене VP3 (1692 н.) и в сайте протеолиза 2В/2С.
Геномные отличия штамма ВГА МБ-7/293 от штамма ВГА МБ-7/4647 в 5-НТО (13, 21 н.) и в сайте протеолиза 2А/2В приводят к уменьшению времени наработки вируса с 7–12 дней до 4–7 дней.
Апробация работы и публикации Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях: «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека» (Украина, Судак, 2004), «Генодиагностика инфекционных болезней» (Сосновка, 2005), «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты и проблемы безопасности крови» (Томск, 2007), «Молекулярная диагностика 2010» (Москва, 2010). По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК, получен патент РФ.
Вклад автора Данные секвенирования получены лично автором и в соавторстве с к.б.н.
Терновым В.А. и к.б.н. Чаусовым Е.В. Сравнительный анализ проведен лично автором. Культивирование и оценка эффективности культивирования штаммов ВГА проводились совместно с к.б.н. Святченко В.А. и с.н.с. Киселевым Н.Н.
Структура и объём диссертации Диссертация состоит из «Введения» и разделов «Обзор литературы», «Материалы и методы» и «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков и 8 таблиц. Библиография включает 230 источник, в том числе 206, опубликованных в иностранных журналах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали сыворотки крови и фекалии, собранные в 2001– 2002 годах от пациентов, поступивших в инфекционные больницы Новосибирска, Барнаула, Иркутска. Все поступившие сыворотки были проверены в ИФА на наличие специфических антител класса IgM к ВГА с помощью тест-систем ВГА«Вектогеп А-IgM» («Вектор-Бест», Россия).
Исследование проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан». Забор крови проводили после получения письменного согласия информированного пациента с использованием стерильных одноразовых систем «Вакутайнер».
Культуры клеток 4647 и HEK293 и штамм МБ-7/4647 получали из банка клеточных культур ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Выделение вирусной РНК из клинических образцов и препарата ВГА из культур клеток проводился с помощью TRIzol® (GibcoBRL) согласно инструкции производителя. В ОТ-ПЦР использовали олигонуклеотидные праймеры, рассчитанные с помощью программы OLIGO, на основе предложенных ранее. ПЦР-фрагменты анализировали гель-электрофорезом в 2 % агарозном геле и очищали при помощи наборов S.N.A.P.TM Gel Purification Kit для агарозных гелей (Invitrogen). Определение нуклеотидной последовательности проводили на приборе Beckman CEQ2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Inc.) с помощью наборов Beckman sequencing Kit согласно инструкции производителя.
Филогенетический анализ осуществляли с помощью программы MEGA в сравнении с нуклеотидными последовательностями ВГА из базы данных GeneBank генотипов: IА – HAS-15 (здесь и далее – номер последовательности в базе данных GenBank X15464), CR326 (M10033,1), GBMwt (X75215), GBM/HFS (X75216), M2 (AY974170), H2 (EF406357) DL3 (AF512536), AH2 (AB020565), FH2(AB020568), FG (X83302), Moscow-1999-122 (AY226591), Serpukhov-2001 101(AY226610), Podolsk-2001-83 (AY226609), IT-ILG-00 (AJ505623), BaliA06- (AB298164.1);
IВ генотипа – HM175wt (M14707), HM175/7 (M16632), HM175/43C (M59809), HM175/24A (M59810), MBB (M20273), Germany 2007/2008 (EU416258);
IIA генотипа – CF53Bern (AY644676);
IIIA генотипа – Nor21 (AJ299464);
V генотипа – AGM27 (D00924).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительный генетический анализ изолятов ВГА, выявленных в Сибирском регионе в 2001 – 2002 годах Необходимо отметить, что три крупных города Сибири – Новосибирск, Барнаул и Иркутск – являются большими транспортными узлами, что позволяет говорить об исследовании основных штаммов ВГА, циркулирующих на территории Сибири.
В первой части исследования использовался фрагмент генома ВГА длиной 309 н. (2852-3161 н., координаты по геному штамма HAS-15 (X15464)), который включает в себя общепринятый при исследованиях вариабельности ВГА участок генома в 168 н. (2924-3092 н.), и содержал фрагмент гена белка VP1, ген белка 2А и часть гена белка 2В.
На присутствие РНК ВГА методом ОТ-ПЦР был исследован 131 образец (45 образцов сывороток и 86 фекалий) от пациентов с серопозитивными в ИФА на IgM к ВГА сыворотками, поступившими в 2001–2002 годах в больницы Новосибирска, Барнаула и Иркутска с диагнозом «острый гепатит», и образец серонегативных в ИФА сывороток от пациентов с диагнозом «вирусный гепатит невыясненной этиологии».
Из 45 серопозитивных в ИФА на IgM к ВГА образцов сывороток крови РНК ВГА была обнаружена в 25 случаях. Процент выявления РНК ВГА составил 55,6 %. Из 86 образцов фекалий от пациентов с серопозитивными в ИФА на IgM к ВГА сыворотками, в 64 образцах была обнаружена РНК ВГА, что составило 74,4 %. Выявляемость РНК ВГА была выше в образцах фекалий, что согласуется с литературными данными о кратковременной виремии и более длительной экскреции вируса с фекалиями. Таким образом, РНК ВГА была обнаружена в 89 случаях из 131.
РНК ВГА среди 101 серонегативного в ИФА на IgM к ВГА образца сывороток была выявлена в 12 образцах (11,8 % случаев), что подтверждает необходимость использования метода ОТ-ПЦР для более достоверного выявления геномной РНК ВГА у больных при диагностике заболеваний печени.
При этом в трех случаях было выявлено смешанное инфицирование вирусами гепатитов С и А.
Таким образом, были определены нуклеотидные последовательности фрагментов, полученных в ОТ-ПЦР, для 101 изолята ВГА (89 серопозитивных и 12 серонегативных в ИФА на IgM к ВГА) с исследуемой территории.
Сравнение определенных частичных нуклеотидных последовательностей геномов 101 изолята ВГА (62 изолята из Иркутска, 23 из Новосибирска, 16 из Барнаула) с таковыми известных штаммов показало, что все последовательности группируются с последовательностями IА-субгенотипа (рис. 1). Изоляты внутри субгенотипа IА образовывали 2 группы. Первая группа объединила 92 изолята (из всех трёх городов), филогенетически близких к штаммам ВГА HAS-15 (США), CR-326 (Коста-Рика);
M2 (Куба), IT-ILG- (Италия), BaliA06-72 (Индонезия). Вторая группа объединила 9 изолятов из Новосибирска (ТТG413 и ТТG415), Барнаула (КNG305) и Иркутска (CHAP 310, 319, 323;
LVV 77, 88, 92), филогенетически близких к российским штаммам и штаммам из Японии (AH2, FH2). При этом 20 изолятов 1-й группы оказались идентичными между собой и не отличались от штамма ВГА HAS-15.
Между изолятами ВГА первой группы из разных городов не оказалось существенных отличий. Видимо, в данное время на территории трёх крупных городов Сибири циркулировали генетически близкие варианты ВГА IА субгенотипа. Во вторую группу также вошли изоляты из всех трёх городов.
Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное [Б] HIA [И] LVV на основе частичных (VP1, 2А 2В) [И] LVV [И] CHAP нуклеотидных последовательностей геномов 66 [Н] TTG [Н] UYAS ВГА, выявленных в изолятах, циркулирующих [И] CHAP326b [Н] TTG на территории Сибири.
70 [Н] TTG 61 [Н] UYAS Примечание – [И] CHAP [И] DYUA Здесь и далее длина линии отражает [Н] TTG [И] DYUA генетическую дистанцию. Значения индекса [И] CHAP230b [И] DYUA58b поддержки в узлах ветвей указаны после [Н] MOI [И] DYUA репликаций.
[И] CHAP137b [И] DYUA50b [Н] – Новосибирск, [Б] – Барнаул, [И] – [И] CHAP185b [И] LVV140b Иркутск. Прототипные изоляты выделены 47 [И] CHAP 71[И] LVV жирным шрифтом [Н] KIV 71 [И] LVV [Н] BTG [И] LVV HAS [Н] MOI [И] CHAP 49 [Н] TTG [И] LVV167b [И] CHAP [Н] TTG [И] CHAP 1 группа [И] CHAP 52 [И] LVV [И] DYUA 59 [И] DYUA [И] CHAP [Н] MOI [И] CHAP [И] CHAP [Н] UYAS [Н] UYAS [Н] BTG 65 [Н] TTG [Н] KIV [И] CHAP158b [Н] BTG [Н] KNG [И] CHAP M [Н] KDI [И] LVV47b [Н] KNG [Б] HIA 74 [И] DYUA [И] DYUA [Н] KNG [И] CHAP [Н] KNG [Н] MOI [И] CHAP 59 [И] LVV [И] CHAP [Н] MOI [Н] TTG [Н] KNG IT-ILG- [И] CHAP [И] CHAP [Н] TTG [И] LVV79b 78 CR BaliA06- AH FH 67 82 Moscow 60 Serpuhov2001- [Н] KNG Podolsk-2001- [Н] TTG 97 [Н] TTG [И] CHAP 2 группа 69 [И] CHAP 93 [И] LVV 61 [И] LVV [И] CHAP 70 [И] LVV GBMwt 98 FG MBB Germany2007/ 97 HM175wt NOR CF53Bern 76 AGM 0. Наличие двух групп свидетельствует об одновременной циркуляции двух вариантов ВГА IА-субтипа. Все выявленные изоляты отличаются от зарубежных европейских изолятов GBM (Германия) и FG (Италия), образующих отдельную ветвь внутри IА-субгенотипа.
Фрагменты геномов 66 изолятов содержали значимые нуклеотидные отличия, приводящие к аминокислотным отличиям в белках VP1, 2A и 2В.
Среди них были выявлены ранее не описанные варианты ВГА, имевшие Город Штамм Белок, положение а.о.
VP1 2A 2B 735а.о. 761а.о. /830а.о.
Прот. HAS15 LSVTEQSEFY FPRAPLNSNA MLSTESMMSR IAAGDLESSV DDPRSEEDRR FESHIECRKP YKELRLEVGK QRLKYAQEEL SNEVLPPPRK MKGLFSQAKI SLF Прот. GBMwt.............................................................................................V.........
Прот. CR326....Q..................................................................................................
Прот. M2........................................................................I..............................
Прот. FG.............................................................................................V.........
Прот. AH2.............................................................................................V.........
Прот. FH2....................................................................................S..................
Прот. BaliA06-07.............................................................................................V.........
Прот. IT-ILG-00.......................................................................................................
Прот. Moscow1999.......................................................................................................
Прот. Serpuhov20.......................................................................................................
Прот. Podolsk-20.......................................................................................................
Прот. CF53Bern.........................T..............................S..............................................
Прот. NOR21.................T...M.S.T..D...L................K......K................................. I..V.........
Прот. AGM27.....................MVS...LD...S............A..K.......QG.......M..........M......I...... V............
Прот. HM175wt................................................K......................................................
Прот. Germany200................................................K......................................................
Прот. MBB................................................K......................................... K............
Ирк. LVV189 V......................................................................................................
Н-ск. BTG124 V...........................................................................E........................P.
Ирк. CHAP318.F.....................................................................................................
Н-ск. TTG441.F.......................................................................................E...........P.
Н-ск. UYAS280.F.......................................................................................E.R...........
Ирк. LVV76.........................................................T...........................................P.
Ирк. CHAP137b.F.............................V......................................................................L Ирк. CHAP185b.F....................................................................................................L Ирк. CHAP326b.F...........T...........................................................R.............................
Ирк. CHAP348.F.....................................................................................................
Ирк. CHAP423.F......................G..............................................................................
Ирк. DYUA50b.F....................................................................................................L Ирк. CHAP230b......................................................................................................L Ирк. DYUA58b..................................NW..................................................................L Ирк. CHAP383................................................TG...P................................................L Ирк. CHAP387........................................................R..........................................N..L Барн. MOI286......................................................................................................L Ирк. LVV140b.F..........................G.......................................................H.................L Ирк. LVV171.F..........K.........................................................................................L Ирк. LVV191.F..........K........W.................................................................................
Барн. HIA247............K........W.................................................................................
Ирк. LVV79b............K..........................................................................................
Ирк. LVV92............K..........................................................................................
Ирк. CHAP319........................................................................................K..............
Ирк. CHAP419........................................................................................K..............
Ирк. CHAP336.F........ S....................................... S............S............H...........K..............
Н-ск. UYAS44......................C........................... S............S........................K..N.........P.
Н-ск. UYAS282..LS.............................................. S............W..G.....................K.....S........
Н-ск. BTG141..F............................................... S............S........................K..............
Ирк. DYUA123..F...............................................................................K....................
Барн. MOI292.......................................................................................................
Ирк. DYUA132...............................................N...........................................N..S........
Ирк. DYUA90......................................................................................................L Ирк. LVV142......................................................................................................L Н-ск. TTG382.P..K.................................................................................................L Н-ск. UYAS244.P..K..................................................................................................
Ирк. CHAP322.......................................................................................................
Ирк. CHAP323.......................................................................................................
Ирк. CHAP368............I................T.............Q...........................................................
Рис. 2. Cравнение аминокислотных последовательностей белков VP1, 2А, 2В (103 а.о.) ВГА, выявленных на территории Сибири, и прототипных штаммов.
Примечания – Координаты даны по HAS-15. Идентичные аминокислоты показаны точками. Сходные аминокислотные отличия обведены рамкой. Прот. – прототипный штамм;
Н-ск. – Новосибирск;
Ирк. – Иркутск;
Барн. – Барнаул уникальные аминокислотные отличия в белках VP1, 2А и 2В по сравнению с известными штаммами ВГА, что показано на рис. 2.
Идентичные отличия (заключены в прямоугольники на рис. 2) в исследуемых белках встречались чаще в одном из городов (Иркутск:
Ser(736) Phe;
Arg(748) Lys, Phe(837) Leu;
Новосибирск Leu(836) Pro), однако такие же замещения редко, но встречались и в других городах.
Таким образом, были исследованы и охарактеризованы изоляты ВГА, выявленные в 2001–2002 годах в Сибирском регионе.
Сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей штамма МБ-7/4647 с аналогичными характеристиками известных штаммов ВГА Исходный штамм ВГА МБ-7 был получен из изолята, выделенного в году от больного ГА в Новосибирске, адаптирован к росту в культуре клеток FRhK-4. Исследуемый в данной части работы штамм МБ-7/4647 был получен после адаптации штамма МБ-7 к росту в культуре клеток 4647.
На первом этапе была определена полная нуклеотидная последовательность геномной РНК штамма ВГА МБ-7/4647 (EU251188). РНК штамма МБ-7/4647 состоит из 7487 н. (без учета полиА-тракта) и кодирует полипротеин длиной 2225 а.о. (ABX44727). 5-НТО (749 н.) предшествует единственной открытой рамке считывания (6675 н.), за которой следует 3-НТО (63 н.). 5-НТО генома штамма МБ-7/4647 содержит два пиримидиновых тракта. Первый (99–138 н.) состоит на 95 % из пиримидиновых оснований.
Второй тракт (727–736 н.) расположен непосредственно перед инициирующим кодоном.
Нуклеотидный состав генома штамма МБ-7/4647 (A – 29.3 %, C – 16 %, G – 21,8 % и U – 32.9 %), подобно другим ранее описанным штаммам ВГА, характеризуется очень низким содержанием G+C (38 %). 5-НТО генома штамма МБ-7/4647 имеет G+C-содержание, равное 47 %.
Для сравнительного анализа нуклеотидной последовательности штамма МБ-7/4647 использовали вакцинный штамм HAS-15, M2 (Куба), штамм GBM (основа вакцины «Avaxim»), штамм СR-326 (основа вакцины «Vaqta»), штаммы, выделенные на территории Китая, – H2 (основа живой аттенуированной вакцины, лицензированной в КНР) и DL3;
FG (Италия), два японских штамма AH2 и FH2;
два штамма IB субгенотипа – HM175/7 (основа вакцины «Havrix») и MBB, а также представители трёх других генотипов – CF53Bern (IIA), Nor21 (IIIA), AGM27 (V).
При сравнении нуклеотидных последовательностей кодирующей части геномов разных штаммов ВГА был проведен анализ филогенетического Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнения кодирующей части геномов штаммов ВГА.
Примечание – Генотипы и субгенотипы отмечены над ветвями. ВГА генотипов: IА HAS-15 (X15464), GBM/HFS (X75216), M2 (AY974170), H2 (EF406357) DL3 (AF512536), AH2 (AB020565), FH2 (AB020568), FG (X83302),);
IВ HM175/7 (M16632) MBB (M20273);
IIA-CF53Bern (AY644676);
IIIA Nor21 (AJ299464);
V-AGM27 (D00924) родства штамма МБ-7/4647 с 14 штаммами. Результаты показали (рис. 3), что 11 штаммов ВГА, относящихся к I-му генотипу, формировали 4 субкластера.
Штамм МБ-7/4647 входил в первый субкластер вместе с вакцинным штаммом HAS-15. В три первых субкластера входили штаммы, относящиеся к субгенотипу IA;
в четвёртый – штаммы субгенотипа IB. Внешнюю группу сравнения формировали штаммы CF53Bern (генотип IIA), Nor21 (генотип IIIA) и AGM27 (генотип V).
Из анализа филогенетического родства видно, что ближайшим к штамму МБ-7/4647 является штамм HAS-15, используемый для приготовления вакцины «Геп-А-ин-Вак» в РФ. Ввиду этого автором проводилось сравнение в первую очередь с ним. Примечательно, что сравнение нуклеотидных последовательностей штамма МБ-7/4647 в области генов VP1-2B (2852– 3161 н.), использованной в первой части работы, показало их идентичность как с HAS-15, так и с 20 изолятами 1-й группы IА-субтипа ВГА, выявленных нами на территории Сибири.
В целом, при сравнении геномов штаммов МБ-7/4647 и HAS-15, выявлено 48 нуклеотидных отличий, тогда как между последовательностями геномных РНК штаммов HM175/7 и GBM/HFS (генотипы IB и IА соответственно), на основе которых выпускаются вакцины «Havrix» и «Avaxim», выявляется более 300 нуклеотидных отличий, а между штаммами HAS-15 и GBM/HFS, относящихся к одному субгенотипу (IА), более 150.
В табл. 1 представлены данные, показывающие степень нуклеотидной идентичности штамма МБ-7/4647 со сравниваемыми штаммами (как по полному геному, так и по его отдельным районам). Штамм МБ-7/4647 был близок к вакцинному штамму HAS-15 и штамму M2 с процентом идентичности 99,4 % и 99,1 % соответственно.
В дальнейшем был проведен анализ отличий в нуклеотидной и аминокислотной последовательностях отдельных районов генома штаммов МБ 7/4647 и HAS-15.
Таблица 1.
Идентичность (в %) нуклеотидных последовательностей геномов различных штаммов ВГА с геномом штамма МБ- Название Has GBM/ CR HM175/ H2 DL3 M2 AH2 FH2 FG MBB CF53BernNor21AGM штамма 15 HFS 326 AY AY M10033, AB AB AF EF AJ M M X X X D Номер в GenBank Полный 99,4 96,3 96,1 95,3 95,2 99,1 95,5 95,3 94,0 91,2 91,0 85,7 82,3 82, геном 5-НТО 98,2 96,5 98,3 96,5 95,1 - 94,7 96,2 94,9 92,9 93,2 90,0 82,2 92, VP4 100 98,2 97,4 97,1 95,4 100 98,1 95,3 98,1 91,0 88,6 90,3 94,0 82, VP2 100 96,3 94,6 95,3 95,2 100 94,6 94,2 95,5 91,3 91,2 84,1 81,9 81, VP3 99,9 97,5 97,1 95,4 94,6 99,4 95,2 95,1 96,2 90,6 91,0 86,0 83,7 82, VP1 97,8 96,3 94,2 96,2 96,2 99,2 95,1 95,1 94,5 89,9 90,4 87,1 80,8 78, 2А 100 96,1 97,4 96,8 94,7 99,4 94,3 93,5 96,0 90,2 93,7 83,8 79,1 80, 2B 100 95,2 - 95,1 95,1 99,2 95,4 94,7 94,1 91,3 90,6 85,1 80,0 78, 2C 99,4 95,4 - 96,3 94,2 99,1 94,6 94,4 94,3 88,5 88,4 85,0 81,1 74, 3A 98,6 91,1 - 92,2 92,7 96,1 91,3 90,1 91,6 90,7 87,3 83,2 75,3 80, 3B 100 95,3 - 92,5 95,1 98,2 94,5 91,3 95,7 88,5 88,7 88,2 82,7 81, 3C 100 96,4 - 96,1 95,4 99,3 96,5 96,2 95,0 91,3 91,0 84,1 83,0 80, 3D 99,7 96,5 - 96,2 95,2 99,2 96,4 96,1 94,2 92,8 92,5 84,8 82,2 86, 3-НТО 100 97,3 - 98,4 98,3 100 100 100 100 98,3 92,3 94,0 92,0 81, В 5-НТО (149–161 н.) генома штамма МБ-7/4647 по сравнению с HAS- присутствует вставка из 13 н. (5-GTAAATATTGATT-3), являющаяся повтором. Такой же повтор присутствует у адаптированных к культуре клеток FRhK быстрорастущих штаммов HM175/43C (M59809), HM175/24A (M59810).
У остальных сравниваемых штаммов данная вставка отсутствовала.
3-НТО штамма МБ-7/4647, как и у ряда других штаммов, была идентична таковой у HAS-15, что полностью согласуется с известными данными о высокой степени консервативности данного участка генома.
В кодирующей части генома штамма МБ-7/4647 по сравнению с HAS- выявлено 34 нуклеотидных отличия. 16 точечных отличий было в генах: VP1 – 2, VP3 – 1, 2С – 6, 3А – 3, 3D – 4, один фрагмент из 18 н. (5 СAACCATGAGGGATTTAA-3), присутствующий в составе гена VP1 штамма МБ-7/4647 и отсутствующий в соответствующей области генома HAS-15.
В табл. 2 представлены данные по сравнению аминокислотных последовательностей штамма МБ-7/4647 с отобранными для сравнения штаммами ВГА. Процент идентичности полипротеинов штамма МБ-7/4647 и штаммов HAS-15 и М2 превышает 99 %, а у остальных штаммов IA субгенотипа составляет 98 %.
Таблица 2.
Количество отличий и степень гомологии протеинов штамма МБ-7/ и других штаммов ВГА Штамм Количество а.о.
Название GBM/HFS CF53Bern HM175/ HAS- AGM CR Nor белка MBB AH FH DL M FG H 16 25 9 29 37 19 25 30 53 48 50 87 138 Полипротеин 99,3 98,9 98,9 98,7 98,3 99,1 98,9 98,6 97,6 97,8 97,7 96,1 93,8 92, 1 1 1 1 VP4 100 100 100 100 95,7 100 100 100 100 95,7 95,7 95,7 95,7 4 2 3 2 3 VP2 100 100 98,2 100 100 100 100 100 99,1 98,6 99,1 100 98,6 97, 1 1 1 2 2 1 1 1 3 2 2 6 3 VP3 99,6 99,6 99,6 99,2 99,2 99,6 99,6 99,6 98,8 99,2 99,2 97,6 98,8 96, 8 1 4 1 1 1 1 1 7 3 3 2 11 VP1 97 99,6 98,5 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 97,3 98,9 98,9 99,2 95,8 1 1 1 1 1 2 2 1 6 2A 100 98,6 100 100 100 98,6 98,6 98,6 98,6 97,2 97,2 98,6 91,5 84, 5 - 7 7 4 5 8 10 5 5 10 19 2B 100 98 97,2 97,2 98,4 98 96,8 96 98 98 96 92,4 91, 4 6 - 7 10 6 7 9 14 16 19 22 25 2C 98,8 98,2 97,9 97 98,2 97,9 97,3 95,8 95,2 94,3 93,4 92,5 89, 1 6 - 5 5 4 6 5 7 6 7 8 16 3A 98,6 91,9 93,2 93,2 94,6 91,9 93,2 90,3 91,9 90,5 89,2 78,4 82, - 1 3B 100 100 100 100 100 100 100 100 95,7 100 100 100 95, 1 - 1 3 1 1 2 1 1 3 7 3C 100 99,5 99,5 98,6 100 99,5 99,5 99,1 99,5 99,5 98,6 96,8 2 4 - 6 8 2 3 4 7 8 8 34 47 3D 99,6 99,2 98,8 98,4 99,6 99,4 99,2 98,6 98,4 98,4 93 90,4 90, Примечание – В столбцах в верхней части ячейки указано число замен в соответствующем протеине, в нижней части ячейки – процент гомологии аминокислот. «- » отсутствие данных. Все данные приведены в сравнении с аминокислотами штамма МБ-7/4647.
В белке VP1, начиная с 26-й аминокислоты от N-конца, выявлены дополнительные 6 а.о. в сравнении со штаммом HAS-15 – Thr-Thr-Met-Arg-Asp Leu. Надо отметить, что эта последовательность из 6 а.о. присутствует так же у остальных сравниваемых штаммов, в том числе и у штаммов HM175/7, CR326 и GBM/HFS, на основе которых производятся вакцины от гепатита А. В работах Ю.А. Овчинникова с соавт. (1985) и B. Robertson с соавт. (1989) высказываются предположения, что делеция фрагмента белка VP1 (6 а.о.) штамма HAS- произошла в процессе адаптации вируса к клеточной культуре FRhK-4.
Делеция в белке VP1, как у штамма HAS-15, обнаружена и у штаммов FG и GBM/FRhK.
Еще два точечных аминокислотных отличия от HAS- идентифицированы в составе белка VP1 Ala(534) Val и Lys(660) Glu. Второе отличие интересно тем, что у остальных сравниваемых штаммов также присутствует Glu 660, а Lys определяется только у штаммов HAS-15 и М2.
При сравнении расчётной вторичной структуры с помощью программы PSIPRED v. 2.6 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred /psiform.html) белков VP1 у штаммов HAS-15 и МБ-7/4647 предсказаны структурные различия в N концевой области (рис. 4). В рамке на рис. 4 указана часть белка VP1, HAS-15 МБ-7/ Рис. 4. Предсказанная вторичная структура белков VP1 штаммов HAS-15 и МБ-7/4647.
Примечание – Conf – достоверность предсказания вторичной структуры. Pred – предсказанная вторичная структура. АА – аминокислотная последовательность. Цилиндр – -спираль, стрелка – -складка.
Рамкой обозначена часть белка VP1, отсутствующая в протеине штамма HAS- отсутствующая в протеине штамма HAS-15. У штамма HAS-15 обнаружена небольшая -спираль (14–15 а.о.), которой нет у штамма МБ-7/4647.
Следующая за -спиралью -складка (36–37 а.о.) у штамма HAS-15 оказалась короче, чем -складка (26–28 а.о.) у штамма МБ-7/4647. Если у штамма МБ 7/4647 -складка начиналась там, где у HAS-15 была делеция и до следующей -складки было 22 а.о., то у HAS-15 до следующей -складки было 7 а.о. Это было общим отличием штаммов HAS-15, FG, GBM/FRhK с делецией в данном районе белка VP1.
Известно, что N-концевые части белков VP1, VP2, VP3 ВГА участвуют в формировании капсида. Возможно, что вышеупомянутые различия влияют на эффективность процесса сборки вирионов в клетках определенных хозяев.
Изменения в структуре основного поверхностного белка может свидетельствовать об изменении взаимодействия вируса с рецепторами хозяйских клеток.
Следует отметить, что отличие, выявленное в белке VP3 Asp(316) His в результате замены G(1692) C, присутствует только у исследуемых штаммов МБ-7/4647 и МБ-7/293. Та же позиция в белке VP3 Asp(316) Ala отлична у адаптированных к культуре клеток FRhK быстрорастущих штаммов HM175/43C и HM175/24A от всех сравниваемых штаммов, что, по-видимому, говорит о критичности отличий в данном районе для скорости их роста в культуре клеток.
Остальные аминокислотные отличия были отмечены в неструктурных белках: 2С – 4, 3A – 1 и 3D – 2.
В сайте протеолиза 2В/2С выявлено отличие Phe(1092) Ile у штамма МБ-7/4647 от штамма HAS-15. Аминокислота Phe встречается в данном районе у остальных сравниваемых штаммов, а Ile только у штамма NOR-21 генотипа IIIA. Протеин 2С обладает хеликазной активностью и модификации в этом белке напрямую влияют на синтез РНК. Следовательно, выявленные изменения в сайте протеолиза 2В/2С влияют на увеличение скорости репликации штамма МБ-7/4647.
В гене, кодирующем неструктурный белок 2С, отличия были локализованы в позициях 4014 [1089 (Phe Ile)], 4838, 4913 [1388 (Met Leu)], 4949 [1400 (Ser Asn)] и 4997 [1416 (Phe Ser)] (в квадратных скобках указаны значимые отличия, приводившие к замене а.о.). Ранее Эмерсоном при исследовании генетических особенностей вариантов штамма HM-175, быстрорастущих на культуре клеток FRhK штаммов HM175/43C (M59809) и HM175/24A (M59810), были выявлены отличия в генах 2B (3889 (Ala Val)) и 2C (4087 (Lis Met), 4222 (Phe Ser)) критичные, по их мнению, для скорости роста в культуре клеток. Однако таких отличий в гене 2B штамма МБ-7/ нами обнаружено не было, а в гене 2С были отличия в других районах. Таким образом, можно говорить о влиянии отличий в гене 2С штамма МБ-7/4647 на адаптацию к культуре клеток 4647, но их влияние на скорость роста требует дальнейших исследований.
В белке 3А у штамма МБ-7/4647, участвующем в обеспечении мембранной локализации репликативного комплекса, идентифицировано отличие от HAS-15 в N-концевой области (10-й а.о.) Ala(1433) Pro. Обе аминокислоты, Ala и Pro, являются неполярными алифатическими аминокислотами.
Расчётный внутримембранный участок белка 3А штаммов МБ-7/4647 и HAS-15 локализуется в районе 38–57 а.о. (TMHMM Server v. 2. (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/).
В белке 3Dpol (РНК-полимераза) были обнаружены два отличия:
уникальное Gly(2006) Ala и Cys(2034) Tyr, встречающееся в этой же позиции протеина у штаммов GBMwt, GBM/FRhK, CF53Bern, AGM27. Данные отличия локализовались в функциональном субдомене РНК-полимеразы и могли влиять на эффективность репликации.
Таким образом, было подтверждено, что штамм МБ-7/4647 относится к генотипу IА и ближайшим к нему из известных штаммов является вакцинный штамм HAS-15. Сравнительный анализ выявил мутации, которые могут быть ассоциированы с ростовыми свойствами штамма МБ-7/4647.
Сравнительный анализ нуклеотидных и аминокилотных последовательностей штамма МБ-7/293, адаптированного к росту в культуре клеток HEK293, и штамма МБ-7/4647, адаптированного к росту в культуре клеток 4647, с аналогичными характеристиками известных штаммов ВГА С целью выявления и анализа молекулярных изменений, накапливающихся в геноме ВГА в процессе адаптации вируса к репликации in vitro, и определения их влияния на репликативные свойства вируса была проведена адаптация штамма МБ-7/4647 ВГА к культуре клеток НЕК293 и получен штамм МБ-7/293.
При этом был проведен сравнительный анализ скорости роста штаммов МБ-7/293 и МБ-7/4647. Кинетика накопления антигена и инфекционного вируса в клетках НЕК293 и 4647, инфицированных штаммами ВГА МБ-7/293 и МБ 7/4647, показана на рис. 5.
В инфицированных штаммом МБ-7/293 клетках НЕК293 появление вирусспецифического антигена и инфекционного вируса достигает значительного уровня уже к 4-м суткам после заражения, максимальные значения отмечаются на 6–7 сутки. Штамм МБ-7/4647 на культуре НЕК реплицируется очень слабо. На культуре клеток 4647 достоверных отличий в репликативной активности штаммов МБ-7/293 и МБ-7/4647 не отмечено. Ранее подобная способность к репликации была отмечена у штамма GBM при адаптации к культурам клеток FRhK и HFS. Штамм GBM/FRhK мог расти в дальнейшем только на FRhK, в противоположность этому вариант GBM/HFS мог продуцироваться и на FRhK и HFS.
А. Инфекционный титр, log ИД 0 2 4 6 8 10 12 Срок культивирования, сутки МБ-7/293, КК НЕК293 МБ-7/4647, КК НЕК МБ-7/293, КК 4647 МБ-7/4647, КК Б Титр антигена в ИФА 0 2 4 6 8 10 12 Срок культивирования, сутки МБ-7/293, КК НЕК293 МБ-7/4647, КК НЕК МБ-7/293, КК 4647 МБ-7/4647, КК Рис. 5. Кинетика накопления инфекционного ВГА (А) и антигена (Б) в клетках НЕК293 и 4647 инфицированных штаммом МБ-7/293 и штаммом МБ-7/4647.
Примечание – КК–культура клеток Кинетика накопления вирусспецифического антигена и инфекционного вируса в клетках НЕК293, инфицированных штаммом МБ-7/293, существенно опережает таковую в клетках 4647, инфицированных штаммом МБ-7/4647 или штаммом МБ-7/293. Эффективность системы наработки ВГА при использовании штамма МБ-7/293 и клеток НЕК293 (максимальные значения титра вирусспецифического антигена – 1/512 и инфекционного титра вируса ИД50/мл – 1/2·107) значительно превосходит штамм МБ-7/4647 в клетках (1/64 и 1/106 соответственно).
Таким образом, штамм МБ-7/293 при культивировании на культуре клеток НЕК293 значительно превосходит штамм МБ-7/4647 при культивировании на клетках 4647 как по продуктивности (количеству инфекционного вируса и вирусспецифического антигена), так и по скорости накопления антигена и вируса.
Была определена полная нуклеотидная последовательность геномной РНК штамма ВГА МБ-7/293 (HQ437707) и проведено сравнение нуклеотидных последовательностей геномных РНК штаммов МБ-7/293 и МБ-7/4647 (табл. 3).
Обнаруженные замены локализовались в 5-НТО и генах белков VP3, VP2, VP1, 2В, 2C, 3A 3C, 3D. Всего было выявлено 23 нуклеотидные замены в сравнении с геномом МБ-7/4647, из них 10 замен привели к изменениям в аминокислотной последовательности в белках VP3, VP1, 2В, 2C и 3A.
В геноме штамма ВГА МБ-7/293 в 5-НТО позиции 13, 21 и 702 н.
отличались от штамма ВГА МБ-7/4647. Первые две замены приводили к увеличению петли в расчётной вторичной структуре РНК, что, вероятно, влияло на репликацию, так как в районе 1–98 н. находятся значимые для репликации домены I и II.
Из табл. 3 видно, что аминокислотные отличия штаммов МБ-7/4647 и МБ-7/293 находятся в структурных белках VP3 (1 замещение), VP (1 замещение), и неструктурных белках 2В (5 замещений) и 2С (3 замещения).
В гене 2В интересна замена А(3263) Т, связанная с замещением Lys(839) Asn. Оказалось, что замещение Lys(839) Asn в сайте протеолиза 2А/2B штамма МБ-7/293 присутствует и у быстрорастущих в культуре клеток FRhK штаммов HM175/43C и HM175/24A. Ввиду этого, данный район в белке 2В (839 а.о.) в сайте протеолиза 2А/2B, также является определяющим в формировании быстрорастущих штаммов ВГА при адаптации их к культурам клеток.
При анализе расчётного гидрофобного профиля было выявлено, что положения замещений аминокислот, произошедшие в белках 2В и 2С штамма МБ-7/293 на N-концевых участках, в гидрофильной части белка 2В (84-й а.о.) и С-концевом участке белка 2В, находятся на поверхности белковых структур и значимы для функционирования белков и во взаимодействии с другими белками.
Таблица 3.
Отличия в нуклеотидных последовательностях геномов и в аминокислотных последовательностях штаммов МБ-7/293 и МБ-7/4647 (позиции н. по геному и а.о. по полипротеину штамма МБ-7/4647) Нуклеотид в Нуклеотид в Позиция н. в Район генома МБ-7/ геноме МБ-7/ [замещение а.о.] 13 C T 21 G A 5-НТО 702 T G VP2 998 T C VP3 1520 A T[E(257) D] 2282 T C VP 2505 T A [L(586) M] 3263 A T [K(839) N] 3277 A G [Y(844) C] 3287 G C [E(847) D] 2B 3327 G A [D(861) N] 3425 C T 3504 T A [Y(919) N] 4014 A T [N(1089) Y] 4063 G A [S(1105) N] 2C 4140 G A [V(1131) I] 4712 T C 3A 5051 T C 5559 C T 3C 5744 C T 6194 A C 3D 6596 C T 6902 T C Таким образом, перечисленные отличия в 5-НТО (13, 21 и 702 н.), а также в генах VP3, 2В и 2C возникали при адаптации вируса к клеткам HEK293. Замены в 5-НТО (13, 21 н.) и в гене 2В (3263 н.) приводили к более быстрой репликации штамма МБ-7/293.
В работе впервые охарактеризованы полные нуклеотидные последовательности геномов быстрорастущих штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ 7/293 на культурах клеток 4647 и HEK293 соответственно, перспективных для производства диагностических и вакцинных препаратов.
Выводы 1. В результате проведения ОТ-ПЦР серопозитивных и серонегативных в ИФА на IgM к ВГА образцов сывороток от пациентов, поступивших в 2001 – 2002 годах в больницы Новосибирска, Барнаула и Иркутска, в 101 случае была обнаружена РНК ВГА и определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов VP1, 2A, 2В.
2. Сравнительный анализ частичных (VP1-2А-2В) нуклеотидных последовательностей выявленных изолятов ВГА показал принадлежность их всех к IА-субгенотипу. Выявленные изоляты образовали внутри IА субгенотипа 2 группы, что свидетельствует об одновременной циркуляции двух вариантов ВГА IА-субтипа.
3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293 с геномами известных штаммов ВГА выявил отличия, которые играют ключевую роль в увеличении скорости репликации, а именно: дупликацию района в 13 н. в 5-НТО (149-161 н.), отличия в гене VP3 (1692 н.) и в сайте протеолиза 2В/2С.
4. Показано, что замены в 5-НТО (13, 21 и 702 н.), а также в генах VP3, 2В и 2C возникали при адаптации вируса к клеткам HEK293. Замены в 5-НТО (13, 21 н.) и в сайте протеолиза 2А/2В приводили к более быстрой репликации штамма МБ-7/293.
Список статей, опубликованных по теме диссертации 1. Терновой В.А., Чаусов Е.В., Бондаренко Т.Ю., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов С.В. Генетическое разнообразие вируса гепатита А в Сибири // Вопросы вирусологии. – 2006. – Т. 51. – № 1. – С.
23-27.
2. Бондаренко Т.Ю., Терновой В.А., Святченко В.А., Киселев Н.Н., Чаусов Е.В., Мунтянова М.А., Немцов Ю.В., Яшин В.В., Крюк Н.И., Куслий А.Г., Никулин Л.Г., Нетесов С.В. Полная геномная последовательность быстро реплицирующегося штамма вируса гепатита А МБ-7 и ее характеристика в сравнении с нуклеотидными последовательностями других штаммов вируса гепатита А // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2010. – № 1. – С.33-39.
Патент 1. Святченко В.А. Киселев Н.Н., Терновой В.А., Бондаренко Т.Ю., Куслий А.Г., Никулин Л.Г., Мироненко В.В., Молокеев А.В., Ясудис Г.В., Гусева И.А., Нетесов С.В. Штамм вируса гепатита А (ГепА-293), адаптированный к культуре клеток HEK293 для приготовления вакцинных и диагностических препаратов. Патент РФ №2306336, БИ №10 от 10.04.07.
Доклады и тезисы на конференциях 1. Чаусов Е.В., Терновой В.А., Бондаренко Т.Ю., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов С.В. Генетическое разнообразие вируса гепатита А в Сибири // «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека», Украина, Судак, 2004, С.154-156.
2. Бондаренко Т.Ю., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Яшин В.В., Мунтянова М.А., Нетесов С.В. Полная нуклеотидная последовательность генома цитопатического штамма вируса гепатита А МБ-7 // «Генодиагностика инфекционных болезней», Сосновка, Новосибирская обл., 2005, С.33-34.
3. Бондаренко Т.Ю., Терновой В.А., Святченко В.А., Киселев Н.Н., Нетесов С.В. Исследование молекулярной структуры штаммов ГепА-293 и МБ 7 вируса гепатита А // «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты и проблемы безопасности крови», Томск, 2007, С.140-141.
4. Бондаренко Т.Ю., Терновой В.А., Святченко В.А., Киселев Н.Н., Нетесов С.В. Сравнительный анализ молекулярных механизмов адаптации штамма МБ-7 вируса гепатита А к культурам клеток 4647 И HEK293 // «Молекулярная диагностика-2010», Москва, 2010, С.202-203.