Хромосомная организация некоторых семейств повторяющейся днк у allium cepa l. и allium fistulosum l.
На правах рукописи
БУДЫЛИН Михаил Вячеславович ХРОМОСОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ НЕКОТОРЫХ СЕМЕЙСТВ ПОВТОРЯЮЩЕЙСЯ ДНК У ALLIUM CEPA L. И ALLIUM FISTULOSUM L.
Специальность: 03.02.07 – генетика
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва – 2012
Работа выполнена в научно-образовательном Центре молекулярной биотехнологии ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева»
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Хрусталёва Людмила Ивановна
Официальные оппоненты:
Шилов Илья Александрович доктор биологических наук, профессор, ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук, лаборатория анализа геномов, заведующий лабораторией Болшева Надежда Логиновна кандидат биологических наук, ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, лаборатория молекулярной кариологии и основ клеточной терапии, старший научный сотрудник
Ведущая организация: ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук
Защита состоится « 19 » декабря 2012 г. в 16-30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел./факс: (499) 976-24-92: e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева.
Автореферат разослан «16» ноября 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова
Общая характеристика работы
Актуальность темы. Полвека тому назад стало известно, что количество ДНК в геноме намного больше, чем это нужно для кодирования генетически наследуемой информации, т.е. не вся ДНК в геноме представляет собой гены.
Повторяющиеся ДНК составляет значительную часть эукариотических геномов, количество которой варьирует у разных видов (Flavell et al., 1986). Лук репчатый (Allium cepa L.) имеет огромный геном (1С = 16 415 млн. п.н.), 97% которого составляет повторяющаяся ДНК (Schmidt et al., 2000), для сравнения размер генома Arabidopsis thaliana – 125 млн. п.н., и повторяющаяся ДНК составляет лишь 10% генома (http://www.arabidopsis.org/agi.html). Интенсивные исследования повторяющихся последовательностей ДНК в последние годы показывают, что эти некодирующие ДНК влияют на экспрессию генов и способствует регулированию эпигенетических процессов (Ванюшин et al., 2006, Arbi et al., 2009).
В 1953 году Уотсон и Крик сообщили о своем блестящем открытии – молекулярной структуре молекулы ДНК (Watson et al.,1953), которая расположена и функционирует в хромосоме. Однако до сегодняшнего дня уровень наших знаний о молекулярной организации хромосом остается недостаточным. Разработка технологии флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) ознаменовала переход от классической цитогенетики в эру молекулярной цитогенетики и позволила намного расширить наши знания о молекулярной структуре хромосом.
Лук репчатый является не только важной сельскохозяйственной культурой как продукт питания человека, но представляет интерес для фармацевтической промышленности. Лук батун (Allium fistulosum L.) является источником генов устойчивости ко многим болезням, вредителям, факторам окружающей среды. В связи с проблемой отсутствия в генофонде лука репчатого ряда ценных признаков, лук батун может служить донором ценных признаков в селекции лука репчатого. FISH технологии позволяют визуализировать на хромосоме различные последовательности ДНК, родительские геномы в межвидовых гибридах, и таким образом следить за интрогрессией генетического материала от одного родителя к другому.
Создание молекулярно-цитогенетических маркеров и изучение генома поможет в селекции новых сортов лука. Изучение различных семейств повторяющей ДНК и их организации в структуре хромосом пополнит наши знания о функции и эволюции некодирующей ДНК.
Цель и задачи работы. Цель работы – изучить хромосомную организацию некоторых семейств повторяющейся ДНК у Allium cepa и Allium fistulosum.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Анализ распределения сайтов метилирования на хромосомах А. fistulosum с использованием антител к 5 – метилцитозину.
2. Физическое картирование высококопийных повторов (Cоt–1 фракции A. fistulosum и A. cepa) на хромосомах А. fistulosum и A. cepa с использованием in situ гибридизации.
3. Анализ межвидовых гибридов между А. fistulosum и A. cepa с использованием Cоt–1 фракции и геномной ДНК в качестве пробы для гибридизации in situ.
4. FISH анализ LTR ретротранспозонов Ty-1 copia и Ty-3 gypsy в геноме A. fistulosum и A. cepa.
5. FISH анализ non-LTR ретротранспозона LINEs в геноме A. cepa и A. fistulosum.
6. Физическое картирование ISSR-PCR продуктов на хромосомах А. fistulosum и A. cepa.
7. Клонирование, секвенирование и FISH локализация центромерного повтора A. cepa.
Научная новизна. Выявлен, клонирован и секвенирован прицентромерный повтор рСentAl-agc A. cepa длиной 559 п.н.. До сих пор в подклассе Asparagales, к которому принадлежит A. cepa, не было найдено прицентромерного повтора ни у одного вида. Впервые изучена физическая организация Ty1-copia ретротранспозонов на A. fistulosum и физическая организация Ty3-gypsy и LINEs на А. fistulosum и A. cepa. Впервые выявлены стабильные сайты метилирования в терминальных областях хромосом 6 и 8 A. fistulosum и установлены различия в уровне метилирования у гомологичных хромосом.
Показано наличие терминального видоспецифичного повтора у A. fistulosum.
Впервые создана модель хромосомной организации некодирующий ДНК на A. cepa и А. fistulosum.
Практическая значимость. Получены видоспецифичные молекулярно – цитогенетические маркеры, а именно, прицентромерный повтор у A. cepa, терминальный повтор у А. fistulosum, ампликоны К10[AC]8YG, расположенные в проксимальной области короткого плеча хромосомы 2 у А. fistulosum, ампликоны К12 [AC]8G, расположенные на хромосоме 4 в дистальном районе короткого плеча и на хромосоме 5 в проксимальном районе короткого плеча A. cepa, которые будут использоваться в селекции для мониторинга интрогрессии генетического материала в межвидовых гибридах луковых.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на II Международной научно-практической конференции "Cовременные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур.
Традиции и перспективы" (Москва, 2010), XII Международной научно практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт Петербург, 2011), XI молодежной научной конференции секции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011), 6-ом Международном симпозиуме по съедобным Alliaceae (Фукуока, Япония, 2012), на Международной научной конференции молодых учёных и специалистов (Москва, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и включают 32 рисунка, 5 таблиц.
Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Выводы», «Заключение», «Список литературы», «Список иллюстративного материала» Список литературы включает 255 источников, из них иностранных.
Объекты и методы исследования Объекты исследования. В работе был использован следующий растительный материал: pастения лука батуна A. fistulosum сорт Русский зимний, A. сepa сорт Халцедон, выращенные в горшках в теплице. Межвидовые гибриды между A. cepa и A. fistulosum, полученные во ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур: форма № 76 F5 A. cepa A. fistulosum, № 82 F A.cepa A. fistulosum, № 87 F5 A. cepa A. fistulosum, № 106 ВС1 [(F5 A. cepa A. fistulosum) A. cepa сорт Штутгартер Ризен], № 78 ВС2 [(F5 A. cepa A. fistulosum) A. cepa сорт (Одинцовец) A. cepa сорт (Йыгева) и A. wakegi, предоставленный профессором М. Шигио (M. Shigyo), Ямагучи университет, Япония.
Выделение ДНК. Геномную ДНК выделяли из молодых листьев A. fistulosum сорта Русский зимний и A. cepa сорта Халцедон CTAB методом согласно Rogers & Bendich (1988) с некоторыми модификациями. Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием коммерческого набора реактивов «The GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit» (Fermentas, USA), согласно прилагаемому протоколу.
ПЦР-анализ. Амплификацию ретротранспозонов проводили с вырожденными праймерами для Ty1-copia PR 1 и PR 2 на обратную транскриптазу ( Flavell et al 1997), для Ty3 gypsy GyRT3 и GyRT4 на обратную транскриптазу (Friesen et al 2001), для LINEs BEL1MF и BEL2MR на обратную транскриптазу (Kubis et al 2003). В ходе работы был использован набор ISSR праймеров.
Клонирование продуктов амплификации. Клонирование ПЦР продуктов производили с помощью векторной системы pGEM® - T Easy Vector System (Promega, U.S.A.), в соответствии с инструкцией фирмы производителя, в E. coli. Трансформацию бактерий проводили методом электропорации.
Приготовление препаратов митотических хромосом. Приготовление цитологических препаратов метафазных хромосом A. cepa и A. fistulosum проводили согласно Pijnacker et al. (1984) и Бочков и др. (1989) с некоторыми модификациями, а именно использование в качестве цитостатика закиси азота под давлением 10 атмосфер, использование 45% уксусной кислоты для сохранения структуры хромосом и отсутствие промывки в фиксаторе этанол:
уксусная к-та (3:1).
Приготовление ДНК-пробы. Мечение плазмидной ДНК и Cоt- фракции проводили методом Nick-трансляции с использованием DIG-Nick Translation Mix (Roche, Germany) и Biotin-Nick Translation Mix (Roche, Germany) согласно прилагаемой инструкции. Мечение продуктов амплификации проводили методом ПЦР мечения с использованием PCR DIG Labeling Mix (Roche, Germany).
Визуализация сайтов метилирования. Визуализация сайтов метилирования проводилась при помощи иммунодетекции антителами к 5-метилцитозину, полученными в мышах с последующей детекцией с антимышиными антителами с флуорохромом FITC, хроматин окрашивали DAPI.
Флуоресцентная in situ гибридизация. В FISH эксперименте предгибридизационную обработку слайдов и гибридизацию in situ проводили по Kuipers et al. (1997) с некоторыми модификациями. GISH проводили согласно ранее описанному протоколу Khrustaleva & Kik (2001).
Микроскопия и анализ изображения. Препараты хромосом были просмотрены с помощью микроскопа Zeiss AxioImager M1, снабженного фильтрами для детекции FITC, Texas Red и DAPI, ультрафиолетовой лампой HBO мощностью 100 Вт., а также соединенной с компьютером цифровой камеры AxioCam. Морфометрия и кариотипирование метафазных пластинок были проведены с помощью программ AxioVision v.4.6, Isis v.5.ru и MicroMeasure v.6.
Результаты исследований и их обсуждение 1.Анализ распределения сайтов метилирования на хромосомах А. fistulosum с использованием антител к 5-метилцитозину.
Детекция сайтов метилирования с антителами к 5-мС выявила яркие флуоресцирующие сигналы на митотических метафазных хромосомах A. fistulosum (Рис. 1).
а б Рис. 1. Митотическая метафаза A. fistulosum после детекции сайтов метилирования с антителами к 5-мС. Зеленая флуоресценция – места посадки антител, голубая флуоресценция контрокрашивание хромосом DAPI:
а) микрофотосъемка с использованием только FITC-фильтра;
б) микрофотосъемка с использованием DAPI– и FITC– фильтров с последующим совмещением образов в программе AxioVision, версия 4.6.
Биометрический анализ положения сайтов метилирования был проведен на хромосомах 6 и 8, так как эти хромосомы легко идентифицируются в хромосомном наборе без проведения кариотипирования, что позволило сделать количественный анализ хромосомной локализации сайтов метилирования на нескольких десятках хромосом и провести статистическую обработку результатов измерений.
Анализ хромосомы 6 показал, что стабильно были метилированы дистальные регионы на обоих плечах (рис.2). На длинном плече длина сайта метилирования составила в среднем 18,0 % ± 3,2, а на коротком плече, размер сайта составил в среднем 9,6% ± 1,9 хромосомы. У некоторых анализируемых хромосом 6 на длинном плече были выявлены сайты метилирования в прицентромерной области – в среднем 14,5% ± 6,6 длины хромосомы и на этих же хромосомах были метилированы интеркалярные участки – 12,3% ± 5, длины хромосомы. На коротком плече интеркалярных сайтов метилирования не было выявлено. Следует отметить наличие различий в распределении сайтов метилирования в гомологичных хромосомах. В ряде случаев соответствующие сайты в гомологичных хромосомах могли быть метилированы в одном гомологе и неметилированы в другом. Спутник не имел четко выраженных сайтов метилирования.
хромосома 6 хромосома Рис. 2. Расположение сайтов метилирования на хромосоме 6 и 8 Allium fistulosum: а, с) зеленая флуоресценция – места посадки антител к 5 –мС;
b, d) идиограммы: районы стабильно метилированные;
- районы редко метилированные, - неметилированные районы.
На хромосоме 8 были стабильно метилированы дистальные участки короткого и длинного плеча. На коротком плече размер метилированного сайта в среднем составил 18,9% ± 4,1 от длины всей хромосомы. Выявлено два случая, когда короткое плечо было почти по всей длине метилировано. В двух вариантах были метилированы прицентромерные участки, длина сайта метилирования составила 11,7% ± 8,05. Был отмечен единичный вариант интеркалярного метилирования короткого плеча, размер сайта составил 14,1 %.
Длинное плечо было стабильно метилировано в дистальном регионе, длина сайта метилирования составила 19,8% ± 4,7 хромосомы, в трех случаях метилированы прицентромерные области, длина участка составила 19,2% ± 7,1.
Как и на хромосоме 6, были выявлены различия в метилировании соответствующих сайтов у гомологов.
Сравнение распределения сайтов метилирования с полученными ранее результатами in situ гибридизации ПЦР продуктов с праймерами на субтеломерный гетерохроматиновый повтор у A. fistulosum (Фесенко et al., 2001), выявил ко-локализацию стабильных сайтов метилирования и тандемного сателлитного повтора 382 п.н.
2. Хромосомная организация высокоповторяющейся ДНК (Сot1 фракция) Проведённая работа показала характер распределения высоко копийных повторов ДНК на хромосомах A. cepa и A. fistulosum. Cot-1 фракция, состоящая из высоко копийных повторов была выделена из геномной ДНК A. cepa и A. fistulosum. FISH c Сot-1 фракцией A. cepa на митотических хромосомах A. cepa и A. fistulosum показала чёткие сигналы в терминальный областях и единичные сигналы по всей длине хромосом у обоих видов. Яркие сигналы в терминальных областях, скорее всего, соответствуют изученному ранее субтеломерному повтору длиной 375 п.н., который присутствует у A. cepa и A. fistulosum (Pich et al., 1998) FISH c Сot-1 фракцией A. fistulosum на митотических хромосомах A. fistulosum и A. cepa показала интересный результат. При гибридизации Сot- фракции A. fistulosum на хромосомы A. fistulosum интенсивный сигнал локализовался на терминальном участке и давал редкие единичные сигналы по всем хромосомам так же, как и в предыдущем опыте c Сot-1 фракцией A. cepa (Рис 3). Но при гибридизации Сot-1 фракции A. fistulosum на хромосомах A. cepa сигнал в терминальной области хромосом отсутствовал. Объяснение данного феномена техническими причинами, связанными с постановкой FISH, отклоняется, так как гибридизация пробы на хромосомах A. cepa прошла успешно, о чем свидетельствуют единичные сигналы, локализованные на всех хромосомах. Интенсивный сигнал на концах хромосом A. fistulosum может указывать на наличие у A. fistulosum видоспецифичного высококопийного субтеломерного повтора. По-видимому, при выделении Сot-1 фракции, которое основано на быстрой реассоциации высокоповторяющихся последовательностей ДНК, у A. fistulosum основную часть фракции составил именно видоспецифичный повтор.
A. fistulosum A. cepa Рис. 3. FISH с Сot-1фракцией A. fistulosum на митотических хромосомах A. cepa и A. fistulosum. Синяя флуоресценция – контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-11dUTP меченная Сot-1фракции A. fistulosum, детектированная антителами с FITC.
Для более убедительного доказательства того, что в выделенной нами Сot-1фракции A. fistulosum содержится видоспецифичный повтор, была проведена гибридизация Сot-1фракции A. fistulosum с искусственными гибридами между A. fistulosum и A. cepa: 87 F5 (A. cepa. x A. fistulosum), 78 BC F5 ( [ (F5 (A.cepa. x A.fistulosum) x A.cepa] x A.cepa), 76 F5 (A. cepa. x A. fistulosum), и A. wakegi – естественным гибридом между A. fistulosum и A.cepa.
FISH на всех анализируемых межвидовых гибридах выявила интенсивные яркие сигналы в терминальных областях отдельных хромосом (Рис. 4).
Рис. 4. FISH с Сot-1фракции A. fistulosum на митотических хромосомах межвидового гибрида 87 F5 (A. cepa. x A. fistulosum) (а), 78 BC2 F5 ([(F5 (A.cepa. x A.fistulosum) x A.cepa] x A.cepa) (б), 76 F5 (A. cepa. x A. fistulosum) (в), и A. wakegi - естественного гибрида между A. fistulosum и A. cepa (г). Синяя флуоресценция (а,б,г) и серая (в) – контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-11dUTP детектированные антителами с FITC (а, б, в), красная флуоресценция – Biotin-16-dUTP детектированная антителами с Texas Red (г).
Последовательная in situ гибридизация с геномной ДНК (GISH) на A. wakegi на тех же самых препаратах, на которых была проведена FISH с Сot- фракцией A. fistulosum, показала, что сигнал гибридизации Сot-1фракции A. fistulosum был на хромосомах A. fistulosum (Рис. 5).
Рис. 5. Последовательная FISH и GISH на тех же препаратах хромосом A. wakegi. А - FISH с Cot-1 A. fistulosum, меченной Biotin – 16- dUTP и детектированной антителами с TexasRed (красная флуоресценция);
В - GISH с геномной ДНК A. fistulosum, меченной Dig-11dUTP и детектированной антителами с FITC (зеленая флуоресценция) и немеченой геномной ДНК A. cepa. Синяя флуоресценция - контрокрашивание DAPI.
Результаты GISH анализа с искусственными гибридами между A. fistulosum и A. cepa: 87 F5 (A. cepa. x A. fistulosum), 78 BC2 F5 ([(F5 (A.cepa. x A.fistulosum) x A.cepa] x A.cepa), 76 F5 (A. cepa. x A. fistulosum) подтвердили, что сигнал гибридизации Cot-1 фракции A. fistulosum был только в терминальный областях плеч хромосом, принадлежащих A. fistulosum (рис. 6).
Итак, FISH c Сot-1 фракцией A. cepa на митотических хромосомах A. cepa и A. fistulosum показала чёткие сигналы в терминальный областях и единичные сигналы по всей длине хромосом у обоих видов, что свидетельствует о присутствии в геномах этих двух видов общих высокоповторяющихся последовательностей ДНК. В Cot-1 фракции A. fistulosum был выявлен видоспецифичный повтор, который локализован в терминальных регионах хромосом A. fistulosum. Наличие видоспецифичного повтора в геноме A. fistulosum и его хромосомная локализации были убедительно доказаны с помощью последовательной FISH+GISH.
Рис. 6. GISH c Biotin-16-dUTP меченной геномной ДНК A. fistulosum на митотических метафазных хромосомах межвидового гибрида B C2 F5 ([(F (A.cepa. x A.fistulosum) x A.cepa] x A.cepa) селекционная форма 78. 14 хромосом с красной флуоресценцией принадлежат A. fistulosum, 14 хромосом с голубой флуоресценцией принадлежат A. cepa и 4 рекомбинантные хромосомы между A. cepa. и A. fistulosum (указаны стрелками). А и В - рекомбинантные хромосомы 7 (GISH);
A’ и В’ - рекомбинантные хромосомы 7 с Cot-1 фракцией A. fistulosum.
Рис. 7. Идиограмма кариотипа гибрида B C2 F5 ( [ (F5 (A.cepa. x A.fistulosum) x A.cepa] x A.cepa) селекционная форма 78.
3. Сравнительный анализ хромосомной организации ретротранспозонов у A. cepa и A. fistulosum 3.1 FISH анализ Ty1-copia LTR ретротранспозона В результате FISH на митотических метафазных хромосомах A. fistulosum было установлено, что Ty1-copia ретротранспозон распределён по всей длине хромосом за исключением терминальных областей хромосом (Рис. 8).
Проведенная нами FISH c Cot-1 фракцией A. fistulosum выявила наличие видоспецифичного повтора локализованного в терминальных областях хромосом. Кроме этого ранее было показано, что у A. fistulosum в этой области хромосом имеется еще и общий с A. cepa субтеломерный повтор (Pich et al., 1998, Фесенко et al., 2001). Таким образом, возможно, отсутствие сигнала в терминальной области хромосом связано с захватом этих областей высокоповторяющимися повторами.
а б Рис. ретротранспозонов 8. Ty1-copia A. fistulosum:
(а) – электрофореграмма ПЦР продукта с праймером на обратную транскриптазу Ty1-copiа и геномной ДНК A. fistulosum;
(б) - FISH с ПЦР продуктом на митотических хромосомах A. fistulosum (синяя флуоресценция – контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-11dUTP меченный ПЦР продукт, детектированный антителами с FITC).
Интенсивные FISH сигналы тесно располагались вдоль хромосом A. fistulosum. Такая же картина FISH локализации Ty1-copiа была показана на A. cepa (Brandes et al., 1997), в геноме которого содержится 100 000-200 копий Ty1-copia ретротранспозонов (Pearce et al., 1996 ).
3.2. FISH анализ Ty3-gypsy LTR ретротранспозона FISH ПЦР продукта с праймером на обратную транскриптазу Ty3-gypsy и геномной ДНК A. cepa показал дисперсное распределение сигнала по всем хромосомам A. cepa, кроме терминальной области (Рис 9). FISH ПЦР продукта с праймером на обратную транскриптазу Ty3-gypsy и геномной ДНК A. fistulosum на хромосомах A. fistulosum показал схожую с A. cepa картину распределения сигнала, но у A. fistulosum сигнал отсутствовал так же в районе ядрышкового организатора и спутника на гомологичных хромосомах 6 (Рис. 9).
A. cepa A. fistulosum Рис. 9. FISH с Ty3-gypsy (синяя флуоресценция – контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-11dUTP меченный ПЦР продукт, детектированный антителами с FITC). Красными стрелками указан ядрышковый организатор и следующий за ним спутник гомологичных хромосом 6 A. fistulosum.
Отсутствие ретротранспозонов в районе ядрышкового организатора было показано на ячмене (Heslop-Harrison et al., 1997) и сахарной свекле (Schmidt et al., 1995,1996). Возможно, что тандемная организация рибосомальных генов и специфика их конформации препятствуют вставки ретротранспозонов (Heslop Harrison et al., 1997). Однако противоположные результаты были получены на Cestrum strigilatum, где также в качестве пробы в FISH был использован ПЦР продукт с праймером на обратную транскриптазу Ty3-gypsy, сильный сигнал гибридизации пробы был выявлен в районе локализации ядрышкового организатора (Jferson et al., 2007). Такие различия в распределении ретротранспозонов в районе ядрышкового организатора скорее всего связаны с отсутствием у разных видов определенных семейств ретротранспозонов, которые локализуется в ядрышковом оганизаторе. Так, например, в полностью секвенированном геноме Arabidopsis thaliana было найдено 9 семейств Ty3 gypsy (Marn & Llrens, 2000).
3.3 FISH анализ LINEs non-LTR ретротранспозонов FISH c ПЦР продуктом, полученным при амплификации геномной ДНК с вырожденными праймерами на обратную транскриптазу LINEs и геномной ДНК A. cepa и A. fistulosum, выявил сигналы гибридизации на всех хромосомах, кроме терминальной области на обоих видах (Рис 10).
A. cepa A. fistulosum Рис. 10. FISH с LINEs (синяя флуоресценция – контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция меченный ПЦР продукт, - Dig-11dUTP детектированный антителами с FITC).
Итак, в результате сравнительного анализа распределения Ty1-copia, Ty3-gypsy и LINEs ретротранспозонов не было выявлено существенных различий между A. cepa и A. fistulosum в их хромосомной локализации.
Изученные нами семейства ретротранспозонов распределены дисперсно по всей длине хромосом, кроме субтеломерных окончаний, где находится высоко повторяющийся субтеломерный повтор. Наблюдались различия в интенсивности сигнала между семействами ретротранспозонов: самый интенсивный сигнал даёт Ty1-copia ретротранспозон, затем идёт Ty3-gypsy и с наименьшей интенсивностью сигнала были LINEs (Рис. 11) на обоих видах, что отражает размер фракции трех изученных семейств ретротранспозонов в геномах A. cepa и A. fistulosum.
Рис. 11. Сравнительный анализ распределения ретротранспозонов Ty3 – gypsy, Ty1 – copia и LINEs. Пробы ДНК ретротранспозонов меченные Dig-11dUTP, детектированные антителами с FITC, на митотических хромосомах A. cepa и A. fistulosum. Микрофотосъемка сделана на FITC фильтре.
4. Хромосомная организации межмикросателлитых повторов у A. cepa и A. fistulosum Первичный скрининг геномной ДНК A. cepa и A. fistulosum на наличие микросателлитных повторов был проведен с набором ISSR праймеров, включающей 20 праймеров. Продукты ПЦР с наибольшим количеством бэндов (ампликоны К24, К26, К12, К28, К27, К18, К10, К13 у A. cepa и К10, К19, К12, К32 у A. fistulosum) были отобраны для FISH эксперимента.
FISH на митотических метафазах A. fistulosum FISH c ампликонами К10[AC]8YG выявила единичные сигналы на всех хромосомах. Наиболее выраженный сигнал был обнаружен на хромосоме 2 в коротком плече в проксимальной его части (Рис. 12). Этот сигнал стабильно наблюдался на всех анализируемых метафазах.
Рис. 12. FISH продуктов амплификации ISSR с праймером К10 [AC]8YG на митотических хромосомах A. fistulosum. Синяя флуоресценция – контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-11dUTP меченные ISSR ампликоны, детектированные антителами с FITC.
FISH c ПЦР продуктами на праймерах К19, К12, К32 не выявила четких сигналов гибридизации ни на одной из хромосом, что, вероятно, связано с недостаточным количеством копий межмикросателлитных повторов в одном локусе на хромосоме, т.е. протяженность ДНК мишени на хромосоме была ниже порога чувствительности FISH.
FISH на митотических метафазах A. cepa FISH с ампликонами К12 [AC]8G выявил единичные сайты с двойными сигналами гибридизации на хромосомах 4 и 5. На хромосоме 4 сигнал был в дистальном районе короткого плеча, а на хромосоме 5 в проксимальном районе короткого плеча.
Рис. 13. FISH продуктов амплификации ISSR K12 [AC]8G на митотических хромосомах A. cepa. Синяя флуоресценция – контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-11dUTP меченные ISSR ампликоны, детектированные антителами с FITC.
FISH с ампликонами К24 [GА]8A выявила множественные сайты гибридизации, которые были распределены дисперсно по всем хромосомам, с ампликонами К26 [AG]8T были слабые сигналы на всех хромосомах. ПЦР продукты с праймерами К10, К13, К18, и К28 не дали FISH сигналов.
Интересные результаты были получены с ампликонами К27 (AG)7C. FISH сигнал был локализован в прицентромерной области на всех хромосомах A. cepa (Рис. 14 a). Также отмечена четкая локализация сигнала на интерфазных ядрах на одном из полюсов, что может указывать на Rabl конфигурацию с цетромерами и теломерами, расположенными на противоположных полюсах (Рис. 14 б).
Рис. 14. FISH продуктов амплификации ISSR K 27 (AG)7C на митотических хромосомах A. cepa.. Синяя флуоресценция – контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-11dUTP меченные ISSR ампликоны, детектированные антителами с FITC.
Известно, что центромерный повтор является видоспецифичным, как это было установлено для Arabidopsis arenosa и Arabidopsis thaliana (Kamm et al., 1995;
Martinez-Zapater et al., 1996) и Beta (Gindullis et al., 2001), и даже может быть хромосом специфичным, как у Zea mays (Nagaki et al., 2003;
Page et al., 2001). Для того чтобы проверить является ли продукт амплификации с праймером К 27 и геномной ДНК A. cepa видоспецифичным была проведена FISH на метафазных хромосомах близкородственного вида A. fistulosum и естественного гибрида между A. cepa и A. fistulosum - A. wakegi (Рис. 15).
Рис. 15. FISH продуктов амплификации ISSR K 27 (AG)7C на митотических хромосомах A. wakegi (слева) и A.fistulosum (справа). Синяя флуоресценция – контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция Dig-11dUTP меченные ISSR ампликоны, детектированные антителами с FITC.
FISH на A. wakegi выявил четкий сигнал в области центромеры только у хромосом из 16. Кариотипический анализ установил, что сигнал гибридизации присутствовал только на хромосомах A. cepa. При проведении FISH на A. fistulosum никаких сигналов гибридизации не было обнаружено.
Было проведено клонирование ПЦР продукта, полученного с ISSR праймером К27 [AG]8C в векторе pGEMT- easy (Promega). В результате скрининга выросших колоний E. coli с праймерами М13 нами было отобрано 48 клонов, со вставками различной длины (Рис. 16).
Рис. 16. Электрофореграмма размера вставки в клонирующем векторе:
ПЦР с фланкирующим вставку праймером М13.
Размер вставок варьировал от 709 до 243 п.н. Из отобранных 48 клонов, клонов (A5.1, A5.2, G7.4, H1.8, F25.8, F31.1, F5.32, F6.43 (дорожки 1, 2, 4, 8, 25, 31, 32, 43) были секвенированы.
Полученые сиквенсы 8 клонов были использованы для поиска схожих сиквенсов в базах данных NCBI (EST, GSS, SRA, Nucleotides, WGS) с помощью BLAST. Из 8 проанализированных сиквенсов 4 сиквенса имели высокую схожесть с сиквенсами A.cepa в GSS (A5.1, F5.32, F6.43) и EST (A5.2) базах данных NCBI. Сиквенс клона А5.2 имел высокий уровень схожести с кДНК A.cepa. Сиквенс клона H1.8 имел схожесть с геном A. cepa, кодирующим цитохромоксидазу. BLAST трех клонов (G7.4, F25.8, F31.1) не обнаружил сиквенсов со значительным уровнем схожести в базе данных. На сервере GIRI с помощью программы Censor у шести сиквенсов (A5.1, A5.2, H1.8, F31.1, F5.32, F6.43) найдена схожесть их отдельных участков с известными мобильными элементами (ДНК транспозоны, ретротранспозоны). Для выявления внутренних повторов у 8 сиквенсов, нами был проведено построение дот матрицы, которая не выявила внутренних повторов. Анализ сиквенсов в программе UGene на наличие внутренних микросателлитных повторов показал присутствие в сиквенсах микросателлитных последовательностей, соответствующих сайтам посадки праймеров и короткие тринуклеотидные повторы.
Для идентификации клона с предполагаемым прицентромерным повтором была проведена FISH с каждым из 8 клонов на хромосомах A.cepa. FISH показала, что только клон A5.1 давал сигналы в прицентромерной области (Рис.
17) на всех 8 хромосомах A. cepa. Проведённый биоинформатический анализ выявил очень короткий фрагмент (42 п.н.) сиквенса A5.1 со схожестью к ДНК транспозона и непротяжённые микросателлитные повторы, что не позволяет идентифицировать природу найденного нами прицентромерного повтора, т.е.
отнести к определенному типу повторов, на основании известных в базе данных последовательностей ДНК. Поэтому, мы можем предположить, что выделенный клон A5.1 является единицей повтора или его частью.
Рис. 17. FISH c клоном А5.1. на A. cepa. Электрофореграмма ПЦР клона с праймером М13 (слева). Синяя флуоресценция – контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-11dUTP меченные ISSR ампликоны, детектированные антителами с FITC.
FISH сигнал с клоном А5.1 был достаточно сильным, поэтому мы можем предполагать, что протяженность детектируемого повтора на хромосоме, по меньшей мере, составляет более 10 тыс. п. н. – порога чувствительности обычного FISH. Длина вставки клона А5.1 составляет 559 п.н., а значит, открытый нами прицентромерный повтор, который мы назвали рСentAl-agc, повторяется не менее сотни раз. У Triticum aestivum центромерный тандемный повтор TailI составляет 570-bp (Kishii et al., 2001), у Zea maize Cent4 – 740 п.н (Ananiev et al., 1998), у Zingeria biebersteiniana Zbcen1 755-bp (Saunders et al., 2001). Возможно, такой достаточно большой размер тандемного повтора является характерным для класса Commelinanae однодольных растений, к которому согласно современной классификации, основанной на секвенировании хлоропластной, митохондриальной и ядерной ДНК, относится подкласс Poales (зерновые, травы;
Chase et al., 2000;
Fay et al., 2000). Подкласс Asparagales, представителями которого являются луковые, считается очень близким к Commelinanae и размер открытого нами 559 п.н. повтора рСentAl-agc хорошо с этим согласуется.
Заключение Клонирование, секвенирование и локализация с помощью in situ гибридизации семейств повторяющихся последовательностей ДНК, которые составляют значительную часть генома луковых, позволило лучше понять организацию их геномов, структуру хромосом и сделать следующие обобщения: изученные семейства ретротранспозонов Ty1-copia, Ty3-gypsy и LINEs распределены дисперсно по всем хромосомам у A. cepa и A. fistulosum, причем отмечена закономерность в интенсивности сигнала и числе сайтов гибридизации характерная для обоих видов - больше всего сигналов давало семейство Ty1-copia, затем Ty3-gypsy и наименьшее LINEs, что отражает размер фракции трех изученных семейств ретротранспозонов в геномах обоих видов. Следует отметить особенность локализации Ty3-gypsy на хромосомах A. fistulosum - сигнал отсутствовал в районе ядрышкового организатора и спутника на гомологичных хромосомах 6.
Анализ локализации сайтов метилирования ДНК на хромосомах A. fistulosum с помощью антител к 5-метилцитозину выявил, что всегда были метилированы терминальные области хромосом и были отмечены различия в уровне метилирования гомологичных хромосом. Стабильные сайты метилирования совпадали с местами локализации Cot-1 фракции и субтеломерного повтора, выделенного и изученного ранее (Фесенко и др., 2001). В терминальных областях, занятых субтеломерным повтором, отсутствовали сигналы гибридизации Ty1-copia. Следует отметить, что у луковых не выявлен типичный для многих растений (TTTAGGG)n теломерный повтор, который защищает хромосому от укорачивания при каждом раунде репликации (Sykorova et al. 2003). До сих пор мы не знаем как луковые стабилизируют свои хромосомы.
Выделенная нами Cot-1 фракция A. fistulosum и её физическая локализация на хромосомах A. cepa, A. fistulosum и гибридов между A. cepa и на A. fistulosum, позволяет сделать вывод, что нам удалось выявить видоспецифичный для A. fistulosum субтеломерный повтор.
С помощью in situ гибридизации амликонов, полученных с ISSR праймером (AG)7C и последующим их клонированием и секвенированием был найден A. cepa прицентромерный повтор, который мы назвали рСentAl-agc.
Результаты in situ гибридизации изученных семейств повторяющейся ДНК интегрированы в моделях хромосом для A. cepa и A. fistulosum (Рис. 18).
Рис. 18. Модель распределения некоторых семейств некодирующей ДНК на хромосомах A. cepa (а) и A. fistulosum (б).Данные по локализации Ty1-copia на хромосомах A. cepa взяты из работы Brandes et al. (1996).
ВЫВОДЫ 1. Выявлены стабильные сайты метилирования в терминальных областях хромосом 6 и 8 A. fistulosum;
установлены различия в уровне метилирования у гомологичных хромосом.
FISH c Сot-1 фракцией A. cepa на митотических хромосомах A. cepa и 2.
A. fistulosum показала чёткие сигналы в терминальных областях и единичные сигналы по всей длине хромосом обоих видов.
Выявлен видоспецифичный субтеломерный повтор в Сot-1 фракции 3.
A. fistulosum. Доказана видоспецифичность повтора с помощью FISH+GISH на хромосомах A. cepa, A. fistulosum и гибридов между A. cepa и на A. fistulosum FISH с продуктом амплификации обратной транскриптазы Ty1-copia 4.
показала, что этот LTR ретротранспозон распределён по всей длине хромосом за исключением терминальных областей у A. fistulosum.
FISH с продуктом амплификации обратной транскриптазы Ty3-gypsy 5.
показала, что этот LTR ретротранспозон распределён по всей длине хромосом за исключением терминальных областей у A. cepa и A. fistulosum;
ретротранспозон отсутствовал так же в районе ядрышкового организатора и спутника на гомологичных хромосомах 6 A. fistulosum.
FISH с продуктом амплификации обратной транскриптазы LINEs 6.
показала, что этот non-LTR ретротранспозон распределён по всей длине хромосом за исключением терминальных областей у A. cepa и A. fistulosum.
7. Выявлена для обоих видов луковых одинаковая закономерность в интенсивности FISH сигнала между семействами ретротранспозонов: самый интенсивный сигнал дают Ty1-copia ретротранспозоны, затем Ty3-gypsy и с наименьшей интенсивностью сигнала был LINEs, что отражает размер фракции трех изученных семейств ретротранспозонов в геномах A. cepa и A. fistulosum.
8. FISH локализация межмикросателлитных повторов выявила единичные сигналы на всех хромосомах A. fistulosum с ампликонами К10[AC]8YG.
Наиболее выраженный сигнал был обнаружен в проксимальной области короткого плеча хромосомы 2.
9. У A. cepa FISH с ампликонами К12 [AC]8G, выявила единичные локусы гибридизации на хромосоме 4 в дистальном районе короткого плеча и на хромосоме 5 в проксимальном районе короткого плеча.
10. Найден прицентромерный повтор у A. cepa путем клонирования и секвенирован ПЦР продуктов, полученных при амплификации праймера К [AG]8C с геномной ДНК A. cepa. С помощью FISH доказывает локализацию клона A5.1, несущего вставку 559 п.н., названную рСentAl-agc, в прицентромерной области.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ Будылин М.В., Сахарова А.М., Андреева Г.Н., Хрусталёва Л.И. Анализ 1.
распределения сайтов метилирования на хромосомах 6 и 8 Allium fistulosum L. c использованием антител к 5-метилцитозину // Известия ТСХА, 2011.- № 4. С. 73-80.
Будылин М.В., Хрусталёва Л.И. Особенности распределения 2.
некодирующей ДНК в геноме A. fistulosum // Сборник статей XII международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности».- Санкт-Петербург, 2011.- Т. I.- С. 203-205.
Будылин М.В., Хрусталёва Л.И. Хромосомная организация 3.
некодирующей ДНК в геноме лука батуна // II Международная научно практическая конференция "Cовременные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы".- Москва, 2010. Т. II.- С. 134.
Будылин М.В., Хрусталёва Л.И. Особенности распределения 4.
некодирующей ДНК в геноме луковых // Сборник тезисов участников XI молодежной научной конференции секции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии».- Москва, 2011.- С. 45.
Будылин М.В., Хрусталёва Л.И. Физическая локализация некодирующей 5.
ДНК // Сборник тезисов участников XI молодежной научной конференции секции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва, 2011.- С. 67.
Будылин М.В., Хрусталёва Л.И. Особенности хромосомной организации 6.
некодирующей ДНК в геноме Allium fistulosum // Международная научная конференция молодых учёных и специалистов.- Москва, 2012.- С. 8.
7. Khrustaleva L., Romanov D., Budylin M., Kirov I., Fesenko I., Kiseleva A.
Chromosomal Organization of Genes and Some Types of Extragenic DNA in Allium (Хромосомная организация генов некоторых типов негенной ДНК у Allium) // Материалы 6-го Международного симпозиума по съедобным Alliaceae, Фукуока, Япония, 21-24 мая 2012.- С. 34.
Автор выражает особую благодарность своему научному руководителю профессору Хрусталёвой Людмиле Ивановне, за неоценимую помощь в написании диссертации и помощи в достижении результата. Так же отдельное спасибо автор выражает к.б.н. Дивашуку Михаилу Георгиевичу за помощь в секвенировании и Кирову Илье Владимировичу за помощь в биоинформатическом анализе. Автор выражает благодарность заведующей лаборатории генетики и цитологии ВНИИССОК к.с-х.н. Кан Людмиле Юрьевне и профессору Masayoshi Shigyo, Ямагучи университет, Япония за предоставленный растительный материал.
Благодарность за материальную и моральную поддержку на протяжении всего периода аспирантуры, автор хотел бы выразить своему отцу Будылину Вячеславу Ивановичу и матери Будылиной Рите Бякёновне.