Естественная и искусственная гибридизация в комплексе saxifraga cernua l. – s. sibirica l. на урале
На правах рукописи
Дымшакова Ольга Сергеевна ЕСТЕСТВЕННАЯ И ИСКУССТВЕННАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ В КОМПЛЕКСЕ SAXIFRAGA CERNUA L. – S. SIBIRICA L.
НА УРАЛЕ 03.00.05 – ботаника
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Екатеринбург – 2010
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте экологии растений и животных Уральского отделения РАН
Научный консультант: доктор биологических наук Семериков Владимир Леонидович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Позолотина Вера Николаевна кандидат биологических наук Князев Михаил Сергеевич
Ведущая организация: ГОУ ВПО Марийский государственный университет
Защита состоится «6» апреля 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 004.005.01 при Институте экологии растений и животных УрО РАН по адресу: 620144, г. Екатеринбург, ул. 8 Марта, Факс: 8 (343) 260-82-56;
E-mail: [email protected] URL: http://ipae.uran.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института экологии растений и животных УрО РАН.
Автореферат разослан «» марта 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Н. В. Золотарева ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы: Гибридизация является одним из важнейших фак торов видообразования у растений [Грант, 1984;
Цвелев, 1972, 2000;
Першина, 2009;
и др.]. К настоящему времени накоплена обширная литература по данно му вопросу [Викторов, 2000;
Lebens-Mack, Milligan, 1998;
Lowe, Abbott, 2000;
Mooring, 2002;
и др.]. Главным образом, в этих работах предлагается описание того или иного гибрида. Исследований, в которых проводилось искусственное моделирование процесса естественной гибридизации, известно меньше [Svejda, 1974;
Vargas, 1996;
Kaplan, Fehrer, 2006;
Trojak-Goluch, Berbe, 2007]. Однако именно такие работы важны для лучшего понимания процесса гибридизации.
На территории горного Урала обитают два родственных вида камнелом ки: Камнеломка поникающая (Saxifraga cernua L.) и камнеломка сибирская (S.
sibirica L.), отличающиеся по уровню плоидности. На Среднем Урале были об наружены растения камнеломки с промежуточным внешним обликом. Предпо лагалось, что они появились в результате межвидовой гибридизации между S.
cernua и S. sibirica [Капралов, 2004]. Таким образом, существование комплекса S. cernua – S. sibirica на Урале предоставляет возможность для искусственного моделирования естественной гибридизации между этими камнеломками и сравнения искусственных гибридов со среднеуральскими растениями.
Цель работы – моделирование процесса гибридного видообразования у видов рода Saxifraga.
Задачи исследования:
1. Провести скрещивание между растениями S. cernua, S. sibirica и их F гибридов в разных комбинациях.
2. Сравнить морфометрические, репродуктивные, кариологические и ге нетические параметры S. cernua, S. sibirica, растений с промежуточным обли ком (далее среднеуральские растения) и искусственных гибридов.
3. Изучить результаты гетероплоидного скрещивания и оценить вероят ность такого скрещивания в естественных условиях.
Защищаемые положения:
1. Образование фертильных гибридов возможно как при прямом скрещи вании S. cernua и S. sibirica, так и при возвратном скрещивании гибридов пер вого поколения и растений родительских видов.
2. Искусственные гибриды прямого и возвратного скрещивания имеют высокую изменчивость морфологических, кариологических и репродуктивных признаков.
3. При гетероплоидном скрещивании (2х и 4х) основная доля гибридного потомства имеет триплоидный уровень, в меньшей степени образуется ди- и тетраплоидное потомство.
4. Наблюдается зависимость между уровнем плоидности и фертильно стью пыльцы: триплоиды имеют низкую фертильность пыльцы, тогда как ди- и тетраплоиды – высокую.
Научная новизна и теоретическая значимость результатов исследо вания: Впервые проведено искусственное моделирование процесса гибридиза ции между S. cernua и S. sibirica в лабораторных условиях, получены F1 и B поколения растений. Исследованы морфометрические, репродуктивные, карио логические и генетические признаки у искусственных гибридов. Показана воз можность такого скрещивания в естественных условиях.
Полученные данные расширяют знания о гибридном видообразовании.
Практическая значимость: Разработана методика скрещивания, прора щивания семян и выращивания гибридных растений камнеломки в лаборатор ных условиях. Полученные результаты важны для разработки стратегии охраны реликтовых видов флоры Урала. Результаты работы включены в теоретический и практический курс «Методы экологических исследований» (УрГПУ, геогра фо-биологический факультет).
Апробация работы: Результаты исследований были представлены на Всероссийских конференциях молодых ученых в ИЭРиЖ УрО РАН в 2003- гг.;
VII Всероссийском популяционном семинаре «Методы популяционной биологии» (Сыктывкар, 2004);
Демидовских чтениях (Екатеринбург, 2006);
IX международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006);
Международной конференции «Устойчивость экосистем и проблема сохране ния разнообразия на Севере» (Кировск, 2006);
XII съезде русского ботаническо го общества «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники XXI века» (Петрозаводск, 2008);
на семинаре лаборатории биоразнообразия и генетики университета Упсалы (Швеция, 2008);
Международной конференции «Моло дежь в науке – 2009» (Минск, 2009).
Личный вклад автора: Автором выполнена работа по сбору полевого материала (выборки из популяций на р. Серга, р. Юрюзань, р. Чусовая), прове дению искусственного скрещивания в течение 4 лет. Анализ полученных ре зультатов проведен автором лично.
Публикации: По материалам исследования опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, се ми глав, выводов, списка литературы, включающего 244 наименования, из ко торых 141 на иностранных языках. Работа изложена на 141 странице, содержит 19 таблиц и 18 рисунков.
Благодарности: Благодарю моего научного руководителя – д-р. биол на ук В. Л. Семерикова;
очень признательна коллегам канд. биол. наук О. Е. Су шенцову и канд. биол. наук А. Г. Быструшкину за помощь в сборе материала и статистической обработке полученных данных;
д-р. биол наук, проф. А. В. Ро дионову и канд. биол. наук Е. О. Пуниной за помощь в постановке методики и подсчете хромосом;
канд. биол. наук, доц. Н. А. Кутлуниной и канд. биол. наук, доц. С. А. Зимницкой за помощь при выполнении работ по репродуктивной биологии и обсуждении результатов работы;
проф. М. Ласко (Martin Lascoux), Ч. Сантессон (Kerstin Santesson), асп. К. Онге (Kate St. Onge) за возможность выполнения ДНК-анализа, проточной цитометрии и всемерную поддержку;
на уч. сотр. А. Руду (Andreas Rudh) за теоретическую помощь в проведении AFLP анализа и интерпретацию полученных данных;
канд. биол. наук С. А. Семери ковой, канд. биол. наук А. Ю. Беляеву, канд. биол. наук М. В. Капралову, канд.
биол. наук М. В. Модорову за обсуждение работы;
И. В. Братцевой за помощь при составлении библиографического списка.
ГЛАВА 1. ГИБРИДИЗАЦИЯ В МИРЕ РАСТЕНИЙ В главе приводится краткий обзор литературы, посвященный истории изучения гибридизации, ее роли в эволюции растений. Рассматриваются усло вия протекания гибридизации и характеристики, используемые при изучении гибридов.
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И РАЙОН ИССЛЕДОВАНИЯ S. sibirica L. – вид, занимающий горные местообитания от островов в Эгейском море, через горы Кавказа и Средней Азии до Гималаев. Растения, как правило, образуют сильноветвящиеся генеративные побеги, несущие много численные цветки (около 10). Обычно размножаются семенами, однако обна ружены растения, образующие столоны и выводковые почки в пазухах стебле вых листьев – бульбочки (псевдовивипария) [Капралов, Дымшакова, 2006]. Ха рактеризуются наличием хромосомного полиморфизма: 2n = 16-28.
S. cernua L. – арктоальпийский вид, имеющий обширный циркумполяр ный ареал. Растения, как правило, образуют неветвящиеся генеративные побеги с одним цветком. Семенное размножение возможно только в годы с благопри ятным вегетационным периодом. Основное размножение – вегетативное (псев довивипария). Характеризуется наличием хромосомного полиморфизма: 2n = 24-72. Считается, что S. cernua имеет три предковых вида: S. sibirica, S. debilis и S. radiata [Checklist of the.., 2007].
Между предковыми видами и S. cernua обнаружены промежуточные формы растений. Так, на Среднем Урале обнаружены растения с промежуточ ным морфологическим обликом. Растения имеют слабо ветвящиеся побеги с несколькими цветками (3-5). Размножаются семенами и бульбочками. Обнару жено хромосомное число 2n = 24. В работе изучаются растения, собранные в популяциях от Южного до Полярного Урала.
ГЛАВА 3. ИСКУССТВЕННОЕ СКРЕЩИВАНИЕ 3.1 Материал и методика искусственного скрещивания. Скрещивание ме жду S. cernua и S. sibirica проводили однократно. Полученные семена хранили при температуре +2..+5С, затем проращивали, проростки высаживали в смесь торфа и почвы (1:1) и выращивали в лаборатории при круглосуточном освеще нии, постоянной температуре (+18С) и обильном поливе. Скрещивание гибри дов первого поколения (F1) с одним из родительских видов, проращивание се мян и выращивание гибридов возвратного скрещивания (В1) проводили по ме тодике, описанной для получения гибридов F1.
3.2 Продуктивность искусственного скрещивания. В период 2005-2008 гг.
было проведено 560 скрещиваний. При прямом скрещивании потомство было получено в 46,4% случаев, при возвратном – в 33,4% (табл. 1). Гейтоногамия (скрещивание в пределах одного растения) для растений F1 составила 9,1%, скрещивание между гибридами и самоопыление гибридов не давало результа тов.
Таблица 1 – Скрещивание между родительскими видами и гибридами Растение- Опыляемое растение Результат скрещивания донор успешные доля удачных скрещивания скрещиваний, % (число попыток) Скрещивания S. cernua и S. sibirica 11 (46) 23, S. sibirica S. cernua 28 (38) 73, S. cernua S. sibirica Общее 39 (84) 46, Возвратное скрещивание F1 82 (216) 38, S. sibirica F1 15 (41) 36, S. cernua F1 37 (76) 48, S. sibirica F1 3 (41) 7, S. cernua Общее 137 (410) 33, Скрещивание гибридов F1 F1 (самоопыление) 0 (27) 0, F1 F1 (гейтоногамия) 2 (20) 9, F1 F1 (растение той же 0 (21) 0, семьи) F1 F1 (растение другой 0 (1) 0, семьи) Общее 2 (69) 2, Так, при гетероплоидном скрещивании S. cernua (4х) и S. sibirica (2x) ме нее чем в половине случаев были получены семена. Наиболее высокая доля за вязывания семян наблюдалась при опылении растений F1 пыльцой S. sibirica (48,7% случаев). Низкая доля завязывания семян наблюдалась при опылении растений F1 пыльцой S. cernua – 7,3%. Примерно одинаковый уровень завязы вания семян (38,0% и 36,6% соответственно) наблюдался при опылении роди тельских растений пыльцой гибридных растений.
ГЛАВА 4. МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ S. CERNUA, S. SIBIRICA, СРЕДНЕУРАЛЬСКИХ РАСТЕНИЙ И ИСКУССТВЕННЫХ ГИБРИДОВ 4.1 Материал и методика исследования морфологических признаков. С каждого исследуемого растения использовали по пять листьев прикорневой ро зетки. Для каждого листа измеряли следующие параметры: длина черешка, длина листа, ширина листа, длина листа от основания (основание – точка при крепления черешка), рассеченность листа (глубина выреза верхней доли листа), перекрываемость (положительные значения при перекрывании нижних долей листа, отрицательные при отсутствии перекрывания, равен нулю при смыкании долей). Измерения проводили с помощью штангенциркуля (точность 0,1 мм).
Всего было исследовано 241 растение: S. cernua (100 особей), S. sibirica (18), среднеуральские растения (26), растения F1 (97). В качестве исходных дан ных брали усредненные промеры пяти листьев одного растения.
4.2 Анализ морфометрической изменчивости листа. Распределения зна чений исследованных морфометрических параметров приведены на рисунке 1.
Наиболее высокие средние значения для всех морфометрических признаков на блюдались для искусственных гибридов (за исключением признака «перекры ваемость»), наиболее низкие – для S. sibirica и S. cernua. Среднеуральские рас тения занимают промежуточное положение относительно родительских видов по признакам «длина черешка», «ширина листа» и «длина листа от основания».
Для анализа значимости различий морфометрических признаков между группами растений был проведен непараметрический тест Манна-Уитни. Обна ружен только один признак – «длина черешка» – по которому все группы рас тений достоверно отличаются друг от друга (p0,05). Также он является един ственным признаком, по которому различаются родительские виды S. cernua и S. sibirica. По другим признакам группы растений перекрываются в той или иной степени.
длина от основания, мм длина черешка, мм 1 2 3 4 1 2 3 вид вид ширина листа, мм рассеченность, мм 1 2 3 4 1 2 3 вид вид перекрываемость, мм длина листа, мм - 1 2 3 4 1 2 3 вид вид Показаны средние значения, 50% интервал, минимальные и максимальные значения;
1 – S. cernua, 2 – среднеуральские растения, 3 – S. sibirica, 4 – искусственные гибриды прямого скрещивания Рисунок 1 – Морфометрические признаки в четырех группах растений Исследуемые группы растений были проанализированы по комплексу морфометрических признаков. Проведен дискриминантный анализ (не показан) и анализ главных компонент. Все группы исследуемых растений перекрывают ся (рис. 2).
4, 3, 2, 1, 0, -2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4, -1, -2, -3, S. cernua S. sibirica Среднеуральские растения Искусственные гибриды Рисунок 2 – Исследуемые группы растений в плоскости главных координат на основе координат факторов Тем не менее, имеются достоверные различия между всеми группами растений по комплексу признаков (дискриминантный анализ, p0,05). S. cernua по комплексу признаков наиболее близка к S. sibirica (квадрат расстояний Ма халанобиса 2,6, р0,01), и одинаково удалена от среднеуральских растений и искусственных гибридов (3,2, р0,01). Растения S. sibirica наиболее близки к среднеуральским растениям (1,8, р0,01), и удалены от искусственных гибри дов (5,2, р0,01). На такое же расстояние удалены друг от друга среднеураль ские растения и искусственные гибриды.
По комплексу морфометрических признаков искусственные гибриды бо лее близки к S. cernua, чей уровень плоидности выше (4x), а, следовательно, выше вероятность передачи большей части генома, как было отмечено в других подобных исследованиях [Brysting, 1998].
По всем изученным морфологическим признакам наблюдается повышен ная изменчивость у искусственных гибридов (рис. 1), что отражается также на плоскости главных компонент (рис. 2). Близость среднеуральских растений к S.
sibirica (2х), вероятно, указывает на интрогрессивную гибридизацию в природе, когда происходили неоднократные скрещивания гибридов на S. sibirica. Или это явление указывает на то, что среднеуральские растения являются прямыми потомками S. sibirica при продвижении ее на север, подвергаясь процессам по липлоидизации и естественного отбору.
Слабые отличия между S. cernua, S. sibirica и среднеуральскими расте ниями, вероятно, объясняются их близкородственностью. Отличие искусствен ных гибридов от других исследуемых групп растений, вероятно, связано с яв лением гетерозиса [Дымшакова, 2007]. Среднеуральские растения более близки к S. cernua и S. sibirica, чем к искусственным гибридам, что может быть связано с длительным воздействием отбора.
ГЛАВА 5. РЕПРОДУКТИВНЫЕ ПРИЗНАКИ S. CERNUA, S. SIBIRICA, СРЕДНЕУРАЛЬСКИХ РАСТЕНИЙ И ИСКУССТВЕННЫХ ГИБРИДОВ 5.1 Материал и методика исследования репродуктивных признаков. В ра боте исследовано 489 растений: S. cernua (10 популяций, 94 особи), S. sibirica ( популяции, 39 особей), среднеуральские растения (4 популяции, 36 особей), ис кусственные гибриды F1 (144 особи) и BB1 (176 особей).
Для всех растений были исследованы репродуктивные признаки, в каче стве которых использовались: 1) количество цветков на генеративный побег, 2) количество бульбочек на генеративный побег, 3) фертильность пыльцы.
Для сравнения групп по исследованным репродуктивным признакам бы ли использованы дискриминантный анализ и непараметрический тест Манна Уитни.
5.2 Анализ изменчивости репродуктивных признаков. Тест Манна-Уитни показал достоверное различие (p0,05) по исследуемым репродуктивным при знакам всех групп растений (рис. 3).
Фертильность пыльцы, % Количество цветков, шт 0 1 2 3 4 5 1 2 3 4 Показаны средние значения, 50% ин Количество бульбочек, шт.
тервал, минимальные и максимальные значения;
1 – S. cernua;
2 – S. sibirica;
– среднеуральские растения;
4 – искус ственные гибриды первого поколения;
5 – искусственные гибриды возвратно го скрещивания 1 2 3 4 Рисунок 3 – Количество цветков, бульбочек на генеративный побег, фертиль ность пыльцы в исследуемых группах растений По признакам «количество цветков и бульбочек» на побег среднеураль ские растения занимают промежуточное положение относительно S. cernua и S.
sibirica, перекрываясь с ними. По признаку «фертильность пыльцы» группа растений S. sibirica, имеющая повышенную фертильность, не отличалась от среднеуральских растений, а искусственные гибриды F1, обладающие наи меньшей фертильностью, достоверно не отличаются от S. cernua, но отличают ся от искусственных гибридов возвратного скрещивания (тест Манна-Уитни p0,05). Низкая фертильность пыльцы искусственных гибридов, вероятно, объ ясняется несбалансированным кариотипом, получившимся в результате гетеро плоидного скрещивания (между 2х и 4х). Сниженная фертильность пыльцы S.
cernua, вероятно, связана с более высоким уровнем плоидности, чем у S. sibirica и среднеуральских растений.
При исследовании групп растений по комплексу репродуктивных призна ков (дискриминантный анализ, не показан) наблюдали промежуточное положе ние среднеуральских растений и искусственных гибридов относительно первой оси (основной вклад – количество цветков (0,66) и бульбочек (– 0,88)). По вто рой оси наблюдалась слабая тенденция к отделению искусственных гибридов от других групп, более того, наблюдалась тенденция к разделению внутри BB (вклад во вторую ось «фертильность пыльцы» (– 0,94)). По большинству изу ченных репродуктивных признаков наблюдается тенденция к увеличению из менчивости у искусственных гибридов по сравнению с остальными группами растений.
Таким образом, значение признаков фертильности пыльцы, «количество цветков» и «количество бульбочек на побег» у среднеуральских растений сви детельствует в пользу их гибридного происхождения.
ГЛАВА 6. КАРИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ S. CERNUA, S. SIBIRICA, СРЕДНЕУРАЛЬСКИХ РАСТЕНИЙ И ИСКУССТВЕННЫХ ГИБРИДОВ 6.1 Методика подсчета хромосомных чисел. Числа хромосом подсчиты вали в делящихся клетках (на стадии метафазы) верхушечной меристематиче ской ткани корня. Для изготовления препаратов использовали обработку ко решков холодом, близкую к способу Делоне, 1931 [см. Навашин, 1936]. Препа раты окрашивали кармином, а затем А-Т специфичным флуорохромом Хехста (Hoechst – 33258).
6.2 Методика проведения проточной цитометрии. Проточная цитометрия использовалась для определения уровня плоидности. Технология основана на измерении интенсивности флуоресцентного свечения ядра клетки, окрашенного ДНК-специфичным красителем. В исследование было включено 102 растения.
6.3 Анализ кариологической изменчивости. Были подсчитаны числа хро мосом у 23 особей (12 растений S. cernua, 5 растений с промежуточными при знаками, 4 искусственных гибрида первого поколения). Хромосомы отличались мелким размером, что было отмечено некоторыми исследователями [A chromo some study.., 1998].
Для исследуемых растений S. cernua были обнаружены хромосомные числа 2n = 24, 36 и 48;
для среднеуральских единственное число 2n = 24;
для искусственных гибридов – 2n = с.20 и с.28;
для S. sibirica число хромосом 2n = 16 было определено М. В. Капраловым [2004] для растений этих популяций.
С помощью проточной цитометрии была определена плоидность расте ний S. cernua (13 особей), S. sibirica (10), среднеуральские растения (4), F1 (45) и BB1 (30). Как в прямом, так и возвратном скрещивании наибольшая доля гиб ридов являлась триплоидами (84,1% и 66,7% соответственно, рис. 4). Диплоид ные и тетраплоидные растения встречались реже.
84, 80 66, 20, 13, 0, B 15, F 2х 3х 4х Рисунок 4 – Доля (в %) гибридных растений с разным уровнем плоидности в поко лениях F1 и В 6.4 Связь репродуктивных признаков и уровня плоидности. Была изучена зависимость уровня плоидности исследуемых растений и их репродуктивных параметров [Дымшакова, 2009]. Всего исследовано 78 растений (S. cernua – 6, S. sibirica – 6 F1 – 39, BB1 – 27), также включены в анализ 29 среднеуральских растений с известными репродуктивными признаками и уровнем плоидности [Капралов, 2004].
Соотношения признаков «количество цветков на генеративный побег» и «количество бульбочек на генеративный побег» не зависело от уровня плоид ности (тест Манна-Уитни).
По признаку «фертильность пыльцы» не наблюдалось достоверных отли чий между диплоидными растениями S. sibirica и диплоидами B1, между трип лоидами поколений F1 и BB1, между тетраплоидами F1, B1 и S. cernua (тест B Манна-Уитни, p0,05). Однако наблюдались достоверные различия между тет раплоидами среднеуральских популяций, F1 и BB1.
Средняя фертильность пыльцы для триплоидных искусственных гибри дов составила 23,0% (табл. 2). Искусственные гибридные растения с уровнем плоидности 2х и 4х имели более высокую фертильность пыльцы, чем растения 3x (среднее значение 65,8% и 57,1% соответственно), хотя среди растений 4х наблюдались стерильные особи (фертильность пыльцы 0%).
Таблица 2 – Сравнение групп растений с разной плоидностью по фертильности пыльцы (тест Манна-Уитни) Среднее Медиана, CV, % Группы растений значение, % U-тест N % Диплоиды 2x 10 77,7 84,0 5,8 U2-3 = 21,0** (S. sibirica, B1) U2-4(1) = 80, Триплоиды 3x(F1, BB1) 50 23,0 16,5 18,7 U 3-4(1) = 218,0* Тетраплоиды 4x 18 62,0 74,9 10,0 U 2-4(2) = 137,5* (S. cernua, F1, B1) U3-4(2) = 225,0** Тетраплоиды 4x (СР.) 28 95,1 97,1 2, U4(1)-4(2) = 94, Примечание – N – количество растений;
CV – коэффициент вариации;
U – коэффициент Манна-Уитни, где 2 – диплоиды, 3 – триплоиды, 4(1) – тетраплоиды, искусственное скрещивание, 4(2) – тетраплоиды, среднеуральские растения;
уровень значимости: * p0,05;
** p0, Обычно триплоидные растения считают стерильными, но в настоящей работе показано, что они способны скрещиваться и давать жизнеспособные се мена [Дымшакова, 2008]. Так, при опылении гибридов пыльцой S. cernua семе на получили в 3 случаях из 8, при опылении пыльцой S. sibirica – в 24 случаях из 46. При опылении S. cernua пыльцой гибридов семена получены в 1 случае из 15, при опылении S. sibirica – в 5 случаях из 9. Как правило, триплоидные гибридные растения существуют благодаря вегетативному размножению [Грант, 1984], что и подтверждается в настоящей работе [Дымшакова, 2006а;
2006б].
ГЛАВА 7. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ S. CERNUA, S. SIBIRICA, СРЕДНЕУРАЛЬСКИХ РАСТЕНИЙ И ИСКУССТВЕННЫХ ГИБРИДОВ 7.1 Материал и методика AFLP-анализа ДНК. Анализ AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) [AFLP: a new.., 1995] для растений из одних и тех же выборок был проведен дважды: 1) в лаборатории биоразнообразия и ге нетики в центре биологической эволюции университета г. Уппсалы (Швеция) и 2) в лаборатории молекулярной экологии растений Института экологии расте ний и животных УрО РАН (г. Екатеринбург). В первом случае использовано три комбинации селективных праймеров, во втором случае – одна.
7.2 Анализ генетической изменчивости. В первом варианте анализа после селективной амплификации было рассмотрено 176 получившихся образцов из 200. На основании стабильности проявления фрагмента и его дискретности бы ло выбрано 83 изменчивых AFLP-фрагмента. Общими для всех групп (S.
cernua, S. sibirica, искусственные гибриды F1, BB1, среднеуральские растения) являются 45 фрагментов (54,2%). Не обнаружено уникальных фрагментов для родительских растений. Выявлены два общих фрагмента (2,4%) для родитель ских растений и искусственных гибридов F1, но отсутствующих у B1 и средне B уральских растений;
13 общих фрагментов (15,7%) для родительских растений, F1 и B1, но отсутствующих у среднеуральских растений.
Во втором варианте было проанализировано 49 получившихся образцов из 96, представлены три группы: S. cernua, S. sibirica и среднеуральские расте ния. Обнаружено 19 (55,8%) общих фрагментов для всех групп. Для S. sibirica выявлено 2 (5,9%) уникальных фрагмента, тогда как для S. cernua уникальных не было;
4 (11,8%) фрагмента для S. cernua и среднеуральских растений;
(5,9%) – для S. sibirica и среднеуральских растений;
1 (2,9%) для S. cernua и S.
sibirica;
5 (14,7%) фрагментов специфичны для среднеуральских растений.
На основе бинарной матрицы присутствия/отсутствия AFLP-фрагментов были вычислены генетические расстояния для выявления степени различия между исследуемыми особями. Для визуализации результата использовали ана лиз главных координат (PCА, рис. 5).
Координатная ось 21,9% Координатная ось 27,1% S.sibirica S.cernua F1 B1 Среднеуральские растения А Координатная ось 20,5% Координатная ось 27,9% S.sibirica S.cernua Среднеуральские растения Б А – первый набор данных AFLP-анализа, Б – второй набор данных Рисунок 5 – S. cernua, S. sibirica, среднеуральские растения и искусственные гибриды в плоскости главных координат на основе бинарных генетических дистанций Как в первом, так и во втором случае по первой оси группы растений чет ко не разделяются, хотя наблюдается тенденция к разграничению S. cernua и S.
sibirica. Не обнаружено разделения между искусственными гибридами и сред неуральскими растениями. По второй оси в обоих случаях не выявляется четко го разграничения между всеми группами, более того, нет и тенденции к их раз делению. В первом анализе искусственные гибриды и среднеуральские расте ния не были близки ни к одному из родительских видов. Во втором случае среднеуральские растения располагались ближе к S. sibirica. Вероятно, данный факт связан с интрогрессивной гибридизацией с этим видом. Все результаты анализа ДНК, полученные в настоящей работе, подтверждают генетическую близость родительских растений S. cernua и S. sibirica, а также группы средне уральских растений. Поскольку AFLP не обнаруживает существенных различий между родительскими видами, то, естественно, что он не позволяет оценить вклад родителей в геном искусственных гибридов.
Таким образом, наши результаты AFLP анализа допускают две основные альтернативные интерпретации в отношении эволюционного взаимоотношения популяций S. cernua и S. sibirica на Урале. Первая интерпретация предусматри вает вторичный контакт на Урале двух самостоятельных видов с формировани ем гибридной зоны (среднеуральских популяций переходного облика). В этом случае отсутствие разрешающей способности AFLP есть следствие эволюцион ной молодости данных видов.
Другое возможное «негибридное» объяснение основывается на полифи летической теории происхождения S. cernua от S. sibirica [Капралов, Дымшако ва, 2006] и предполагает недавний генезис уральских популяций S. cernua от уральских же популяций S. sibirica в результате адаптации к условиям севера.
Так, можно предположить, что среднеуральские растения являются переход ным звеном эволюции от камнеломки сибирской к камнеломке поникающей.
Иначе, можно предположить независимое существование S. cernua и S. sibirica на Урале, при этом среднеуральские растения промежуточного облика рассмат риваются как уклоняющиеся формы первого или второго вида.
ВЫВОДЫ 1. Между растениями S. cernua и S. sibirica, а также между родительскими растениями и искусственными гибридами, имеющими разные уровни плоидно сти, возможно искусственное скрещивание, однако самоопыление искусствен ных гибридов первого поколения и скрещивание между ними затруднено.
2. Единственный диагностический морфометрический признак листа, дифференцирующий родительские и гибридные группы растений – длина че решка. По комплексу всех морфометрических признаков листа имеются суще ственные отличия между всеми группами растений.
3. Искусственные гибриды полностью перекрываются с родительскими и среднеуральскими растениями по репродуктивным признакам «количество цветков на побег» и «количество бульбочек на побег».
4. Искусственные гибриды характеризуются наибольшей изменчивостью по морфологическим и репродуктивным признакам среди изученных групп растений.
5. Искусственные гибриды характеризуются низкими значениями фер тильности пыльцы (ниже 25%), в то время как родительские и среднеуральские растения имеют фертильность пыльцы выше 70%.
6. Для прямого и возвратного скрещивания между S. cernua (4х) и S. si birica (2х) наибольшая доля полученных гибридов имеет триплоидный уровень (77% случаев), тетраплоидный и диплоидный уровень наблюдается реже (14,9% и 8,1% соответственно).
7. Фертильность пыльцы зависит от уровня плоидности: она значительно ниже у триплоидов, в отличие от диплоидных и тетраплоидных растений. Для количества цветков и пропагул на побег зависимость с плоидностью нет.
8. Не выявлено различий между родительскими видами, среднеуральски ми растениями и искусственными гибридами по AFLP-маркерам.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ – в изданиях, рекомендованных ВАК:
1. Капралов М. В. О видах подсекции Mesogine (Saxifraga, Saxifragaceae) флоры полуострова Ямал / М. В. Капралов, О. С. Дымшакова // Бюл. МОИП Отд. Биол. – 2006. – Т. 111, вып. 2. – С. 103-104.
2. Дымшакова О. С. Искусственная гибридизация между Saxifraga cer nua L. и S. sibirica L. / О. С. Дымшакова // Экология. – 2009. – N 6. – С. 465-467.
– в прочих изданиях:
3. Капралов М. В. Изменчивость репродуктивных признаков в широтном градиенте на примере комплекса Saxifraga cernua - sibirica / М. В. Капралов, Дымшакова О. С. // Методы популяционной биологии: материалы докл. VII Всерос. популяц. семинара. – Сыктывкар, 2004. – Ч. 2. – С. 156-157.
4. Дымшакова О. С. Гибридизация как один из факторов увеличения биологического разнообразия: комплекс Saxifraga cernua L. – S. sibirica L. на Урале / О. С Дымшакова // Устойчивость экосистем и проблема сохранения биоразнообразия на севере: материалы междунар. конф. – Кировск, 2006а. – Т.
1. – С. 78-81.
5. Дымшакова О. С. Репродуктивная биология растений с различной плоидностью: комплекс Saxifraga cernua L. – S. sibirica L. на Урале / О. С.
Дымшакова // Материалы IX международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге. – СПб., 2006б. – С. 26-27.
6. Дымшакова О. С. Морфологическая изменчивость в комплексе Saxi fraga cernua L. – S. sibirica L. (Saxifragaceae) на Урале / О. С. Дымшакова // Экология: от Арктики до Антарктики: материалы конф. молодых ученых. – Екатеринбург, 2007. – С. 77-81.
7. Дымшакова О. С. Естественная и искусственная гибридизация в ком плексе Saxifraga cernua L. – S. sibirica L. (Saxifragaceae) на Урале / О. С. Дым шакова // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: материалы всерос. конф. – Петрозаводск, 2008. – Ч. 3. – С. 91-93.
Подписано в печать 15.01.2009 г. Формат 60х84 1/ Усл. печ. л. 1,0. Тираж 120 экз. Заказ № _ Отпечатано в типографии Института экономики УрО РАН 620014, г. Екатеринбург, ул. Московская, 29.
Тел. (343) 371-16-