Особенности механизма действия протонофоров с высоким сродством к мембране
На правах рукописи
Еремеев Сергей Андреевич Особенности механизма действия протонофоров с высоким сродством к мембране 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2012
Работа выполнена в лаборатории структуры и функций биологических мембран НИИ ФХБ им. А.Н.
Белозерского и на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Ягужинский Лев Сергеевич
Официальные оппоненты: Зинченко Валерий Петрович доктор биологических наук, профессор, институт биофизики клетки РАН, г. Пущино, зав. лабораторией Кобляков Валерий Александрович доктор биологических наук, профессор, Российский онкологический научный центр им.
Н.Н. Блохина, зав. лабораторией
Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской Академии Наук
Защита диссертации состоится 24 декабря 2012 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д. 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы д.1 стр. 12, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, аудитория 389.
С диссертацией можно ознакомиться в научной Библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан «24» ноября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Медведева Марина Валерьена Актуальность работы К настоящему времени достигнут значительный прогресс в понимании механизмов функционирования системы окислительного фосфорилирования митохондрий. Согласно П.
Митчеллу эта система способна функционировать в режиме так называемого делокализованного сопряжения, при котором дыхательные протонные помпы и система синтеза АТФ функционируют как независимые структурно-функциональные единицы. В таких условиях протонные помпы трансформируют энергию окислительных реакций в электрохимический потенциал ионов водорода на митохондриальной мембране, а АТФ синтетаза преобразует энергию потенциала в энергию пирофосфатной связи АТФ. Эта модель в настоящее время является общепринятой. В том же 1961 году Р. Вильямс предложил модель локального сопряжения, согласно которой система окислительного фосфорилирования представляет собой единый мембранный комплекс, где перенос энергии (перенос ионов водорода) и система синтеза АТФ жестко объединены в структуру суперкомплекса. Основная особенность этой модели состоит в том, что переносчик энергии (ион водорода) включен в работу протонных помп и АТФ-синтетазы как структурная единица. Вторая модель, таким образом, предполагает не только функциональное, но и структурное сопряжение работы протонных помп, системы транспорта энергии и АТФ синтетазы.
В течение последних 30 лет в нашей лаборатории ведутся исследования, направленные на поиск условий, при которых реализуется механизм локального сопряжения.
К настоящему времени нами было показано существование двух структурно функциональных состояний системы окислительного фосфорилирования, одно из которых соответствует критериям механизма локального сопряжения (модели суперкомплекса), другое – модели Митчелла. При этом было установлено, что переход между указанными состояниями регулируется системой объемной регуляции, обнаруженной в митохондриях Халестрапом (Halestrap A.P. et al. 1986). Этот результат показал, что модели Митчелла и Вильямса не являются абсолютно взаимоисключающими, но могут реализовываться в митохондриях при различных внешних условиях, в частности под влиянием факторов, вызывающих значительное изменение объема митохондриального матрикса. Модель Вильямса предполагает существование суперкомплекса, в составе которого транспорт энергии окислительных реакций на АТФ-синтетазный комплекс осуществляется мембраносвязанными ионами водорода, обладающими избытком свободной энергии. В наших исследованиях использовался качественно новый путь идентификации фракции мембраносвязанных ионов водорода, выполняющих роль переносчика энергии на АТФ синтетазу. Ранее формирование фракции неравновесно связанных кислот Бренстеда на поверхности мембраны митохондрий в условиях работы протонных помп было обнаружено в нашей лаборатории с помощью катализаторов, которые ускоряют диссоциацию этих кислот, усиливая отрыв неравновесно связанных протонов с поверхности мембран функционирующих митохондрий. Катализаторы снижают активность ионов водорода на поверхности мембраны, увеличивая тем самым отрицательный заряд поверхности. Оба параметра регистрировали либо с помощью ковалентно пришитого к мембранам рН-зонда (Юрков В.И. и др., 2005), либо по изменению -потенциала мембран митопластов (Моисеева В.С. и др., 2011) и митохондрий (Ерошенко Л.В. и др., 2012). В последнем случае эффект образования фракции неравновесно связанных ионов водорода при включении протонных помп удается наблюдать без использования катализатора.
В настоящей работе исследован новый класс поверхностно активных протонофоров, специфически взаимодействующих с фракцией неравновесно связанных с мембраной ионов водорода.
Для исследования было синтезировано производное фенола – 2,4,6-трихлор-3 пентадецилфенол (ТХФ-С15) (Рис. 1), обладающее на 7,5 порядков большим сродством к мембране, чем его структурный аналог 2,4,6-трихлорфенол (ТХФ) и на 6 порядков больше, чем известный классический разобщитель – пентахлорфенол (Мотовилов К.А. и др., 2009).
Изучение этого соединения проводилось параллельно с изучением классических разобщителей ТХФ и ПХФ.
Рис. 1. Структура TХФ-C15 (2,4,6-трихлор-3-пентадецилфенол).
Свойства этого соединения были сопоставлены со свойствами потенциально физиологически активного мембранотропного гидрохинона SkQ3, который обладает высоким сродством к мембране.
Из приведенной структуры ТХФ-С15 видно, что эта молекула может двумя принципиально разными способами воздействовать на ионную проницаемость мембран. Во первых – присутствие фенольной группировки, определяющей протонофорные свойства этого соединения. Во-вторых – высокая поверхностная активность вещества, которая определяется сочетанием в структуре молекулы полярной гидроксильной группы и длинного углеводородного гидрофобного фрагмента. Первый этап изучения этого соединения как вещества, стимулирующего дыхание митохондрий, был проведен в лаборатории на высоких концентрациях (10-320 мкМ), при которых может проявляться свойство ТХФ-С15 как детергента. В настоящей работе систематически исследована концентрационная зависимость действия ТХФ-С15. Основное внимание уделено изучению действия низких и очень низких концентраций ТХФ-С15 (1 мкМ – 1 нМ), при которых вероятность проявления детергентных свойств данного соединения сведена к минимуму. Протонофорные свойства ТХФ-С15 были продемонстрированы в экспериментах на модели БЛМ.
Цель работы Получить строгое экспериментальное обоснование действия ТХФ-С15 – как протонофора, специфически взаимодействующего с фракцией неравновесно связанных с мембраной протонов, которая образуется на поверхности внутренней митохондриальной мембраны в условиях работы дыхательных протонных помп. Установить особенности его активности по сравнению с классическими разобщителями.
Задачи работы:
1. Различить протонофорный и детергентный эффекты ТХФ-С15 в условиях воздействия этого соединения на дыхание митохондрии. Для этого показать способность ТХФ-С стимулировать дыхание митохондрий в диапазоне низких и сверхнизких концентраций (1 мкМ – 1 нМ).
2. Продемонстрировать протонофорные свойства ТХФ-С15 на БЛМ.
3. На митохондриях подтвердить специфическое сродство ТХФ-С15 к поверхностно связанным протонам, обладающим избытком свободной энергии.
4. Продемонстрировать различие механизма стимуляции дыхания митохондрий ТХФ С15 и классическим разобщителем пентахлорфенолом.
5. Сопоставить действие ТХФ-С15 и SkQ3 на митохондрии.
Научная новизна работы На примере поверхностно активного фенола ТХФ-С15 описан новый класс протонофоров, сродство которых к мембранам митохондрий на несколько порядков выше, чем сродство классических разобщителей. Было доказано, что эти соединения обладают способностью в микромолярном и наномолярном диапазоне концентраций избирательно взаимодействовать с фракцией неравновесно связанных ионов водорода, возникающей на поверхности при включении работы протонных помп. В независимых опытах на модельной системе (БЛМ) доказаны протонофорные свойства этого соединения. Полученные данные рассмотрены в работе как независимое доказательство эффекта неравновесного связывания ионов водорода на мембранах митохондрий в условиях работы протонных помп (опыты проводились при тесной стыковке внешней и внутренней мембран митохондрий в условиях низкоамплитудного набухания митохондрий в гипотонических условиях).
Практическое значение работы Обнаружение нового типа протонофоров открывает принципиально новые подходы для разработки лекарственных препаратов и создания средств, направленно регулирующих механизмы трансформации и запасания энергии в митохондриях.
Апробация работы Результаты работы были доложены на международном форуме по нанотехнологиям "Rusnanotech-08" (Москва, Россия, 2008);
на XX Симпозиуме "Современная химическая физика" (Туапсе, Россия, 2008);
на Всероссийском школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, Россия, 2008);
на 34-м Конгрессе FEBS (Прага, Чешская Республика, 2009);
на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009);
на 15-ой европейской конференции биоэнергетиков “EBEC” (Варшава, Польша, 2010);
на 53 ей научной конференции МФТИ (Долгопрудный, 2010);
на 36-м Конгрессе FEBS (Турин, Италия, 2011);
на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), на международной конференции «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), на международной конференции «Ломоносов-2012» (Москва, 2012), на 4 съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), на 16-ой европейской конференции биоэнергетиков “EBEC” (Фрайбург, Германия, 2012).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации Диссертация написана на 124 страницах, содержит 82 рисунка и 6 таблиц и состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Выводы», и «Список литературы». Список литературы включает в себя источников.
Объекты и методы исследования Объектом исследования в данной работе является фракция протонов неравновесно связанных с поверхностью мембран. В данной работе исследовался представитель нового класса протонофоров (ТХФ-С15), избирательно взаимодействующий с рассматриваемой фракцией протонов. Для исследования взаимодействия ТХФ-С15 с фракцией протонов, неравновесно связанных с мембраной, мы использовали катализатор, ускоряющий отрыв рассматриваемой фракции от поверхности мембран (HEPES), обнаруженный в предыдущих работах нашей лаборатории.
Митохондрии печени крысы выделялись на основе частично модифицированной методики, изложенной в (Johnson D. et al., 1967). Для выделения использовались самки взрослых белых беспородных крыс (150-200 г) и среды тоничностью 300 мОсм (изотония).
Скорость дыхания митохондрий измеряли в условиях термостатирования полярографическим методом с помощью кислородного электрода Кларка (рабочее напряжение U = 450-500 мВ) на полярографе Record4 (Пущино, Россия). Концентрация белка митохондрий в опытах составляла 0,8-1,0 мг/мл. Определение концентрации белка проводилось биуретовым методом. Время записи одной полярографической пробы варьировалось от 5 до 30 минут в зависимости от требований эксперимента. Все эксперименты проводились в гипотонических средах (120 мОсм).
Активацию сукцинатдегидрогеназы проводили по модифицированной методике (Kotlyar A.B., Vinogradov A.D., 1984). Густую суспензию свежевыделенных митохондрий (60– 100 мг белка/мл) инкубировали при комнатной температуре с сукцинатом в концентрации мМ в течение 15 мин в закрытой пробирке, после чего пробирку помещали в лед и хранили в холодильнике при +4°С. Этот метод применен на митохондриях впервые, до этого он использовался только на СМЧ.
Проницаемость плоских бислойных мембран (БЛМ) измеряли в тефлоновой ячейке, разделенной на два отсека (объемом по 3 мл) перегородкой с отверстием (диаметр мм), на котором формировали БЛМ. Мембрана формировалась из 0, дифитаноилфосфатидилхолина, выделенного из E. coli, или азолектина из вытяжки соевых бобов (фосфатидилхолина 45,7%, фосфатидилэтаноламина 22,1%, фосфатидилинозитола 18,4%, фасфатидная кислота 6,9%, другие липиды 6,9%), растворенных в декане (20 мг/мл).
Оба отсека содержали исследуемое вещество в равных концентрациях. Ток регистрировался с помощью усилителя Keithley 428 (Keithley Instruments). Преобразование аналогового сигнала в цифровой производилось с помощью АЦР LabPC 1200 (National Instruments, США), цифровые данные подавались на ЭВМ, где визуализировались и обрабатывались с помощью программы WinWCP (Strathclyde Electrophysiology Software), разработанной J.
Dempster (University of Strathclyde, UK). В установке использовались Ag–AgCl электроды помещенные непосредственно в измерительную ячейку.
Личный вклад автора Автор лично принимал участие в выполнении исследований по всем разделам диссертации: Его заслугой является разработка и отладка методики предварительного встраивания гидрофобного реагента ТХФ-С15 в мембраны митохондрий и БЛМ. Разработка методических подходов при изучении действия малых и сверхмалых концентраций веществ на дыхание митохондрий. Автор впервые применил на митохондриях метод активации СДГ, что позволило надежно регистрировать увеличение скорости дыхания митохондрий при медленном встраивании протонофора в мембрану.
Результаты и их обсуждение Как отмечалось во введении, соединение ТХФ-С15 может воздействовать на протонную проницаемость митохондриальной мембраны двумя способами – как детергент, путем «разрыхления» липидного бислоя, ослабления белково-липидных взаимодействий, а также как протонофор – переносчик ионов водорода. Согласно нашему предположению, поверхностно активное соединение, обладающее огромным сродством к мембранам, должно преимущественно взаимодействовать с фракцией протонов, неравновесно связанных с внешней поверхностью внутренней митохондриальной мембраны. Образование этой фракции, наблюдающееся при работе протонных помп митохондрий, было описано нами в предыдущих работах. Мы ожидали, что ТХФ-С15, в силу высокого сродства к межфазной границе, будет преимущественно взаимодействовать с R-протонами, которые в этом случае следует рассматривать как специфический субстрат протонного переносчика ТХФ-С15.
Требовалось доказать, что это соединение действительно является протонофором;
что оно действует в низких концентрациях (не более 1 мкМ), которые не разрушают мембрану;
прямо показать на модели БЛМ его протонофорные свойства.
Первые исследования, начатые в нашей лаборатории, были проведены с высокими расчетными концентрациями ТХФ-С15. В этих экспериментах мы наблюдали быстрое возрастание скорости дыхания митохондрий после внесения 10-50 мкМ ТХФ-С15. В таких концентрациях соединение ТХФ-С15 может выступать как в роли протонофора, так и в роли детергента.
Изучение протонофорных свойств низких концентраций ТХФ -С 15 на митохондриях.
Чтобы в явном виде выделить протонофорный эффект ТХФ-С15, представлялось необходимым исследовать на митохондриях гораздо более низкие концентрации этого соединения, которые заведомо не могут проявлять детергентные свойства. Мы планировали также продемонстрировать протонофорные свойства ТХФ-С15 на модельной системе БЛМ. В настоящей работе мы исследовали диапазон концентраций от 1 мкМ до 1 нМ, при таких концентрациях эффект ТХФ-С как детергента должен отсутствовать.
При изучении действия низких концентраций ТХФ-С15 на митохондрии были выявлены важные особенности этого соединения по сравнению с классическими разобщителями. Это соединение проявляет Рис. 2. Эффект стимуляции дыхания способность стимулировать дыхание митохондрий 1 мкМ ТХФ-С15. Среда митохондрий в очень широком диапазоне инкубации содержит 1 мкМ ротенона, мкМ циклоспорина, HEPES 3 мМ. концентраций (от 10 нМ до 60 мкМ). Мы предположили, что в спиртовом растворе ТХФ-С15, при концентрации этого соединения мМ и выше, образуются относительно устойчивые неактивные мицеллы, однако только мономер обладает протонофорными свойствами. После добавления такой смеси к водной суспензии митохондрий большая часть вещества сохраняется в виде мицелл, которые почти не переходят в форму мономера и не проявляют при этом протонофорной активности. В тоже время при использовании более разбавленных стоковых спиртовых раствором ( мкМ и ниже), ТХФ-С15 вызывает стимуляцию дыхания митохондрий в очень низких 10-6 – 10-9 М (см. рис 3). В таких условиях проявляется вторая особенность ТХФ-С15 – медленное встраивание этого соединения в митохондриальную мембрану.
Оказалось, что при низких концентрациях скорость встраивания ТХФ-С15 в мембрану мала, вследствие чего после добавления ТХФ-С15 скорость дыхания митохондрий медленно нарастает во времени (15-20 минут) (рис. 2), в отличие от классических разобщителей, у которых максимальная скорость достигается очень быстро (20-40 сек после добавления соединения в среду инкубации, содержащую суспензию митохондрий). В связи с этим нами была модифицирована методика Рисунок 3. Ускорение дыхания низкими специальной предобработки концентрациями ТХФ-С15. Время измерения 15- митохондрий (по методике: Kotlyar минут, концентрация белка 1мг/мл. Среда A.B., Vinogradov A.D., 1984), которая содержала HEPES 3 мМ, сукцинат 5 мМ, ротенон включает в себя предварительную мкМ, тоничность 120 мОсм.
активацию сукцинатдегидрогеназы.
Благодаря этому скорость дыхания в контрольных опытах никогда не нарастает во времени и остается постоянной на протяжении эксперимента. В указанных условиях нам удалось достоверно регистрировать медленное нарастание эффекта стимуляции дыхания в присутствии очень низких концентраций ТХФ-С15. Для подтверждения данных рисунка 2, на следующем этапе были проведены серийные эксперименты по титрованию дыхания митохондрий низкими концентрациями ТХФ-С15 (рис. 3), показавшие существование концентрационной зависимости эффекта стимуляции дыхания (в диапазоне очень низких концентраций ТХФ-С15). Из данных рисунка 3 видно, что эффект стимуляции дыхания зависит от концентрации этого вещества. Проведенный статистический анализ (с применением критерия Стьюдента) показал, что средние значения ускорения дыхания митохондрий различными концентрациями ТХФ-С15 достоверно различаются (для следующих диапазонов концентраций 1 мкМ/100 нМ р1 = 0,0089;
100нМ/10 нМ р2 = 0,0229;
100 нМ/(10 нМ+1 нМ) р3 = 0,0084). То обстоятельство, что наномолярные концентрации ТХФ-С15 вызывают достоверную стимуляцию дыхания митохондрий, делает вероятность «детергентного механизма» предельно низкой.
Существенное различие в степени стимуляции дыхания митохондрий классическими разобщителями и ТХФ-С15 может быть объяснено несколькими факторами. Это локализация ТХФ-С15 в мембране и достаточно затрудненная рециркуляция этого протонофора через мембрану. Кроме того, классические разобщители имеют значительно больший пул «субстрата», нежели ТХФ-С15, «субстратом» которого являются протоны, неравновесно связанные с мембраной. Также важно указать, что ТХФ-С15 достоверно не снижает АДФ/О, следовательно, конкуренцию за протон между АТФ-синтетазой и ТХФ-С15 выигрывает первая.
Установление протонофорных свойств ТХФ -С 15 на модели БЛМ На следующем этапе работы были поставлены эксперименты, в которых было показано, что при определенных условиях ТХФ-С15 на бислойной липидной мембране обладает протонофорной активностью. Для этого на БЛМ были сняты вольт-амперные характеристики для вышеуказанного соединения при равных значениях рН в обоих отсеках ячейки (см. кривые с черными точками на рисунке 4). Затем, путем добавления щелочи в один из отсеков ячейки (на той же мембране) был создан рН = 1 (см. кривые со светлыми точками на рисунке 4) и снова снята вольт-амперная характеристика. Согласно закону Нернста, мы должны были увидеть для нулевого тока сдвиг напряжения 59 мВ, при создании на мембране рН = 1:
Рис.4. Зависимость силы тока от напряжения. рН = (светлые точки), рН = (черные точки). Мембрана сформирована из азолектина, среда содержит ТХФ-С15 мкМ, 3мМ HEPES и 81мМ KCl.
Заранее оттитрованное количество КОН добавлялось с одной стороны мембраны Как можно видеть из рисунка 4, на вольт-амперной кривой, в случае ТХФ-С15 был зарегистрирован сдвиг напряжения равный 47 мВ.
Для контроля на мембране сформированной из азолектина, был поставлен такой же эксперимент с классическим протонофором трихлорфенолом (рис. 5). При рН = 1 (на мембране) сдвиг потенциала для нулевого тока составил 55 мВ.
Относительно небольшие различия экспериментальных значений потенциала от теории Рис. 5. Зависимость силы тока от напряжения. рН = обусловлены, очевидно, 0 (черные точки), рН = 1 (светлые точки). Липид мембраны - азолектин, среда содержит ТХФ 10 мкМ, эндогенными утечками HEPES 20мМ и KCl 70 мМ. мембраны по другим ионам.
Как видно из полученных данных (рис. 4), ТХФ-С15 в опытах на БЛМ, качественно проявляет себя также как протонофор.
Участие транслокатора нуклеотидов в переносе через мембрану митохондрий ТХФ-С 15 в низких и высоких концентрациях Было показано, что в транспорте ТХФ-С15 через митохондриальную мембрану принимает участие транслокатор нуклеотидов. Результаты экспериментов, приведенные на рисунке 6, показывают, что ингибитор транслокатора нуклеотидов (карбоксиатрактилазид) достоверно снижает эффект стимуляции дыхания митохондрий, индуцированный ТХФ-С15.
Эти опыты показали, что от половины до двух третей аниона ТХФ-С15 транспортируется через мембрану митохондрий в условиях эксперимента путем связывания с транслокатором.
Рис. 6. Участие транслокатора нуклеотидов в траснмембранном переносе ТХФ-С15 через мембрану митохондрий. Ингибитор транслокатора нуклеотидов снижает степень ускорения дыхания митохондрий под действием высоких (левый рисунок) и низких (1 мкМ) концентраций (правый рисунок) ТХФ-С15.
Обнаружение существования неактивной формы ТХФ-С 15 в экспериментах на митохондриях Для обнаружения существования «неактивной формы» ТХФ-С15 нами были поставлены две серии экспериментов по стимуляции дыхания митохондрий одинаковыми количествами ТХФ-С15, когда расчетная концентрация вещества в суспензии митохондрий составляла 1 мкМ. В первой серии в среду инкубации митохондрий вещество вносилось из стокового раствора концентрации 1 мМ, во второй серии стоковый раствор имел концентрацию 100 мкМ. Из рисунка 7 можно увидеть, что максимальная скорость дыхания митохондрий (измерения проведены через 20 минут после добавки соединения) под влиянием разбавленного раствора увеличивается в 4 раза сильнее по сравнению с концентрированным раствором. Эти опыты подтвердили наше предположение об образовании относительно устойчивых неактивных мицелл в спиртовых растворах ТХФ-С ТХФ-С 15 как протонофор, избирательно взаимодейству ющий с фракцией ионов водорода, неравновесно связанных с мембраной.
В настоящем разделе работы было установлено, что катализатор (HEPES), который ускоряет реакцию отрыва неравновесно связанных протонов от поверхности мембраны, приводит к существенному снижению эффекта стимуляции дыхания митохондрий под действием ТХФ-С15. Эти результаты приведены Рис. 7. Влияние эффекта мицеллообразования на на рисунке 8, из которого следует, усиление скорости дыхания митохондрий под что повышение концентрации действием 1 мкМ ТХФ-С15 внесенного в среду катализатора (HEPES) с 3 до 20 мМ в инкубации из разных стоковых растворов: а – 1 мМ, б – 100 мкМ. Среда инкубации: 3 мМ HEPES, 1 мкМ среде инкубации митохондрий ротенона, 2 мкМ циклоспорина А. снижает эффект стимуляции дыхания митохондрий почти до нулевых значений. В то же время необходимо отметить, что классические разобщители (ПХФ, ТТФБ, могут значительно увеличивать FCCP) максимальную скорость разобщенного дыхания (Юрков В.И. и др., 2005). Пример усиления стимуляции дыхания митохондрий под действием классического разобщителя ПХФ при повышении концентрации HEPES в среде инкубации приведен на рисунке 10.
Установление специфичности взаимодействия ТХФ -С 15 с фракцией ионов водорода, неравновесно связанных с мембраной (R-протонов), которая образуется в условиях работы дыхательных протонных помп В настоящем разделе проведена экспериментальная проверка модели специфического взаимодействия ТХФ-С15 с фракцией R-протонов.
Нам представлялось логичным рассматривать фракцию мембраносвязанных протонов как «специфический субстрат» ТХФ-С15, который, согласно нашему предположению, избирательно взаимодействует с данной фракцией. Следовало ожидать, что удаление субстрата приведет к снятию или значительному уменьшению эффекта стимуляции дыханиях под действием ТХФ-С15.
Снижение объема фракции достигалось путем внесения в суспензию митохондрий высоких концентраций катализатора (HEPES), увеличивающего скорость реакции отрыва мембраносвязанных протонов от поверхности мембраны. На рисунках 8 и 9 приведены примеры экспериментов, результаты которых подтверждают правильность предложенной модели о снижении стимуляции дыхания митохондрий под действием ТХФ-С15 (на всем исследуемом интервале концентраций) при внесении в среду инкубации высокой концентрации Опыты с низкими HEPES.
концентрациями ТХФ-С15 были выполнены в присутствии 1мкМ, нМ, 10 нМ и 1 нМ, во всех случаях прирост скорости дыхания в 2-4 раза снижался при внесении в среду инкубации катализатора (HEPES).
Всего было выполнено Рис. 8. Примеры снижения ускорения дыхания независимых эксперимента на митохондрий под действием 1 мкМ ТХФ-С15 при образцах взятых из разных животных внесении в среду катализатора (HEPES 20 мМ).
с использованием разных Среда инкубации содержит 1 мкМ ротенона, мкМ циклоспорина А. концентраций катализатора (HEPES), примеры приведены на рисунках 8 и 9. В контрольном опыте с классическим разобщителем катализатор повышает максимальную скорость разобщенного дыхания митохондрий (рис.
10) (Юрков В.И. и др., 2005) (рисунок 10).
Классические разобщители эффективно взаимодействуют со свободными протонами в объеме водной фазы.
Максимальная скорость разобщенного дыхания лимитирована реакцией отрыва протонов от поверхности мембраны.
Катализатор ускоряет эту (HEPES) реакцию, увеличивая тем самым максимальную скорость разобщенного дыхания митохондрий. Следует подчеркнуть то обстоятельство, что в роли буфера (но не HEPES катализатора) должен оказывать одинаковое влияние на разобщающую активность ПХФ и ТХФ-С15. Тогда как из Рис. 9. Высокие концентрации катализатора HEPES снижают эффект ускорения дыхания сравнения данных (рис. 8, 9 и 10) следует, митохондрий индуцированный ТХФ-С15 на всем что знак эффекта HEPES на стимуляцию интервале концентраций соединения.
дыхания митохондрий под действием ПХФ и ТХФ-С15 прямо противоположен (объяснение этого различия связано с разными лимитирующими стадиями протонного транспорта для этих протонофоров (см. рис. 11)).
Наблюдаемый эффект снижения стимуляции дыхания под действием ТХФ С15, которое возникает при внесении в систему катализатора (HEPES 20 мМ) (рис. 8), говорит о том, что данный протонофор избирательно Рис. 10. Эффект катализатора HEPES на взаимодействует непосредственно с ускорение дыхания по действие пентахлорфенола, обратный по сравнению с мембраносвязанными протонами, эффектом на ТХФ-С15 (см. рис. 7).
согласно схеме (рис. 11 б), которые фактически являются «субстратом» этого протонофора и перестает стимулировать дыхание в отсутствие этого субстрата. Классические разобщители преимущественно взаимодействуют с протонами в объеме водной фазы. Следует принять во внимание то обстоятельство, что HEPES является не только катализатором, но также обладает свойствами буфера и может снижать трансмембранный рН градиент на мембране функционирующих митохондрий.
Однако, согласно теории, при работе протонных помп такое снижение химического потенциала иона водорода (учитывая малую емкость внутренней мембраны митохондрий) быстро компенсируется ростом, при этом H не снижается. В то же время скорость дыхания, несмотря на снижение рН, должна оставаться постоянной в силу постоянства H. Поэтому возникновение эффекта стимуляции дыхания под действием HEPES в разобщенных митохондриях является однозначным доказательством каталитических свойств этого соединения в условиях нашего эксперимента.
Рис. 11. А - схема транспорта протона через мембрану с участием классического разобщителя ТХФ;
[XH+]- неравновесное состояние кислоты Бренстеда на поверхности мембраны. Медленная стадия цикла - реакция отрыва протона от поверхности мембраны (1), катализатор повышает максимальную скорость дыхания. Б схема транспорта протона через мембрану с участием ТХФ-С15. Медленная стадия цикла реакция (2) перенос протона с кислоты Бренстеда [XH+] на анион ТХФ-С15 (Т на схеме);
катализатор снижает ускорение дыхания.
Таким образом, как видно из рисунка 11 (схемы А и Б), нам удалось получить экспериментальное обоснование повышенного сродства бифильного поверхностно активного протонофора ТХФ-С15 с мембраносвязанными протонами, обладающими избытком свободной энергии.
Переносчик фосфата в митохондриях – эндогенный регулятор объема фракции мембраносвязанных протонов Считается, что транспорт фосфата связан с реакциями фосфат/ОН обмена или с реакцией симпорта фосфата и протона обмен (см. рис. 12).
Рис. 12. Схема работы фосфатного переносчика. Фосфатный переносчик может функционировать в нескольких режимах: 1 – фосфат-анионный обмен (частный случай фосфат-OH обмен), 2 – симпорт фосфата и протона, фосфат-фосфатный обмен (не показан). Слева: снятие эффекта стимуляции дыхания митохондрий высокими концентрациями ТХФ-С15 при включении фосфатного переносчика. NEM (20 мкМ) существенно блокирует эффект фосфата.
В связи с этим можно было ожидать, что в присутствии фосфата протекание реакции, представленной на рисунке 12, приведет к снижению фракции мембраносвязанных протонов. Это действительно удалось наблюдать в эксперименте на низких и высоких концентрациях ТХФ-С15 (см. рис. 13 и 12 соответственно).
На рисунках 12 и 13 можно видеть, что добавление фосфата, так же как и внесение в среду инкубации HEPES (20 мМ), приводит к резкому Рис. 13. Снятие эффекта стимуляции дыхания снижению степени стимуляции митохондрий индуцированного ТХФ-С15 при дыхания митохондрий под действием включении фосфатного переносчика (а – 100 нМ низких (рис. 13) и высоких (рис. 12) ТХФ-С15, б – 60 мкМ ТХФ-С15). NEM (20 мкМ) – снижает эффект фосфата. концентраций ТХФ-С15.
Эффект фосфата, как и следовало ожидать, значительно блокируется добавлением ингибитора фосфатного переносчика (рис. В присутствии N-этилмалеимида 13).
классических разобщителей NEM в этих концентрациях не блокирует стимуляцию дыхания.
Этот результат представляется нам особо интересным, поскольку в этом случае можно сделать вывод, что эндогенная система транспорта фосфата в митохондриях может участвовать в регуляции объема фракции неравновесно связанных ионов водорода.
Сравнение действия ТХФ-С15 и SkQ3 на дыхание митохондрий.
Проведенные эксперименты показали, что в концентрациях 1 мкМ и 100 нМ SkQ (восстановленная форма SkQ3) стимулируют дыхание митохондрий (рис. 14). Степень этой стимуляции достаточно велика. Также важно подчеркнуть, что, как и в случае с ТХФ-С15, эффект стимуляции дыхания возрастает во времени (рис. 14). Из приведенных данных можно видеть, что внесение в среду инкубации катализатора HEPES, также как и в случае ТХФ-С приводит к существенному ослаблению действия SkQ3 как стимулятора дыхания митохондрий.
Рис. 14. SkQ3 в концентрациях1 мкм (левый рисунок) и 100 нМ (правый рисунок) стимулирует дыхание митохондрий. Повышение концентрации катализатора HEPES ( мМ) в среде инкубации резко снижает эффект стимуляции дыхания под действием SkQ3.
Также как катализатор (HEPES 20 мМ) в концентрации 20 мМ, фосфат снижает эффект стимуляции дыхания митохондрий под действием SkQ3. Как можно видеть на рисунке 15, внесение в среду инкубации неорганического фосфата, также как и в случае с ТХФ-С15 приводит к достоверному снижению эффекта ускорения дыхания. Использование NEM, в свою очередь, частично обращает эффект фосфата.
Обсуждая приведенные данные, следует указать, что, в отличие от электронейтрального ТХФ-С15, в случае катиона SkQ3 ускорение дыхания митохондрий может частично быть обусловлено связыванием жирных кислот, присутствующих в мембране, с положительно заряженной фосфониевой группировкой (Severin F.F. et al., 2010).
О проблеме транспорта ионов водорода через мембрану положительно заряженными переносчиками ряда SkQ.
Обнаружение эффекта стимуляции дыхания митохондрий соединениями ряда SkQ рассматривается нами как следствие образования гидрохинонов ряда Одним из вариантов SkQ.
объяснения наблюдаемого Рис. 15. Включение фосфатного переносчика феномена является предположение снимает эффект ускорения дыхания митохондрий об образовании циклической формы под действием SkQ3. a – стимуляция дыхания митохондрий при внесении 1 мкМ SkQ3;
b – снятие мономера SkQ3H или его димера.
эффекта стимуляции дыхания внесением в среду Такая схема представляется нам мМ неорганического фосфата;
c – снятие эффекта весьма вероятной. Однако, значения фосфата добавлением ингибитора фосфатного переносчика – NEM (20 мкМ). Состав сред: 3 мМ рК бензогидрохинонов существенно HEPES, 1 мкМ ротенона, 2 мкМ циклоспорина А, превышают значение рК известных мМ сукцината.
классических разобщителей окислительного фосфорилирования. Такое расхождение требует специального обсуждения, которое было дано в одной из наших статей (Еремеев С.А. и др. 2009). Следует подчеркнуть, что образование электронейтральной формы гидрохинонов ряда SkQ может происходить без специфических конформационных изменений молекул этих веществ, связанных с образованием циклических форм гидрохинонов. Такая ситуация возникает в том случае, если происходит одноэлектронное окисление гидрохинонов (или восстановление хинонов) с образованием семихинонов (или одноэлектронное восстановление хинонов), которые являются более сильными кислотами, чем соответствующие хиноны. Для примера укажем, что семихинон CoQ имеет рК равное 6,0 (Blaikie F.H. et al., 2006). При этом цвиттерионы включающие остаток семихинона и трифенилфосфониевую группировку имеют суммарный нулевой заряд, как в замкнутой, так и в линейной форме.
Согласно альтернативной гипотезе (Severin F.F. et al., 2010), нейтральная форма соединений ряда SkQ и их аналогов может возникать в результате комплексообразования положительно заряженных гидрохинонов и хинонов с жирными кислотами, карбоксильные группы которых обеспечивают протонофорные свойства таких комплексов. В заключение следует отметить, что вышеуказанные варианты механизма протонного транспорта с участием соединения ряда SkQ в целом не являются альтернативными, поэтому в митохондриях наблюдаемый транспорт протонов может протекать с участием обоих механизмов. В то же время соединение ряда SkQ - SkQ3, также как и производное ТХФ – ТХФ-С15, обладает специфическим свойством – эффективно взаимодействовать с фракцией R-протонов, возникающей при работе дыхательных протонных помп на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны. Особенность механизма протонного транспорта описывается схемой на рисунке 10.
Общее заключение Работа направлена на изучение механизма транспорта энергии окислительных реакций в условиях образования мембранного фосфорилирующего суперкомплекса. В работе детально исследованы протонофорные свойства поверхностно-активного соединения 2,4,6 трихлор-3-пентадецилфенол (ТХФ-С15). Получены экспериментальные данные, показывающие, что на БЛМ это соединение обладает полноценной протонофорной активностью. В условиях работы дыхательных протонных помп ТХФ-С15 стимулирует дыхание митохондрий, но, в отличие от классических разобщителей, преимущественно взаимодействует с фракцией ионов водорода, связанных с поверхностью мембран и обладающих избытком свободной энергии. Показано, что на 60-75% циклический трансмембранный транспорт ТХФ-С15 в митохондриях осуществляется при участии транслокатора адениновых нуклеотидов. Обнаружение нового типа протонофоров, избирательно взаимодействующих с протонами, неравновесно связанными с поверхностью мембран, обсуждено в работе как новое, независимое подтверждение модели «локального» транспорта энергии окислительных реакций на АТФ-синтетазу. Проведено сопоставление протонофорной активности ТХФ-С15 и потенциально физиологически активного соединения ряда SkQ – SkQ3. Показано качественно сходство протонофорной активности этих соединений на митохондриях.
В работе показано, что система транспорта фосфата в митохондриях включена в регуляцию объема фракции мембраносвязанных ионов водорода, обладающих избытком свободной энергии.
Выводы 1. На модели плоской бислойной мембраны (БЛМ) показано, что поверхностно активное соединение (ТХФ-С15) обладает свойствами 2,4,6-трихлор-3-пентадецилфенол протонофора.
2. На митохондриях показано, что ТХФ-С15 стимулирует дыхание митохондрий в состоянии два по Чансу.
3. Найдены условия, при которых на митохондриях наблюдается резкое качественное различие между протонофорной активностью классических разобщителей и поверхностно активным ТХФ-С15.
4. Показано, что, в отличие от классических разобщителей, ТХФ-С15 преимущественно взаимодействует с мембраносвязанной неравновесной фракцией ионов водорода, которая образуется в условиях низкоамплитудного набухания митохондрий на поверхности митохондриальной мембраны при включении дыхательных протонных помп:
Таким образом, получено независимое подтверждение образования фракции мембраносвязанных протонов, обладающих избытком свободной энергии, возникающей при работе протонных помп митохондрий.
5. Показано, что транспорт ТХФ-С15 в митохондриях на 60-75% осуществляет переносчик адениновых нуклеотидов.
6. Обнаружено, что система транспорта фосфата в функционирующих митохондриях является эндогенным регулятором объема фракции неравновесно связанных с мембраной протонов.
7. Проведено сопоставление разобщающих свойств ТХФ-С15 и гидрохинона ряда SkQ (SkQ3H2). На митохондриях установлено качественное сходство этих соединений как протонофоров.
По материалам диссертации опубликованы следующие работы:
Еремеев С.А., Каргин В.И., Мотовилов К.А., Ташлицкий В.Н., Марков В.Ю., Коршунова 1.
Г.А., Сумбатян Н.В., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С. Молекулярные механизмы превращения митотропных хинонов ряда SkQ и поиск путей создания избирательно действующих "ловушек" свободных радикалов. Биохимия. Том 74, 10, стр. 1368-1379.
2. Еремеев С.А., Мотовилов К.А., Волков Е.М., Ягужинский Л.С. Новый представитель класса мембранотропных разобщителей – SkQ3. Биологические мембраны. 2011, Том 28, 5, стр. 339-345.
3. Ягужинский Л. С., Мотовилов К. А., Волков Е. М., Еремеев С. А. О взаимодействии поверхностно активного основания с фракцией мембраносвязанных протонов Вильямса.
Биофизика. 2013 (принята в печать).
4. Еремеев С.А., Каргин В.И., Мотовилов К.А., Тышлицкий В.М., Коршунова Г.А., Сумбатян Н.В., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С. Митотропные бензохиноны ряда SkQ как потенциальные регуляторы уровня свободных радикалов в клетке. XX Симпозиум "Современная химическая физика". Туапсе, Россия, 15-26 сентября, 2008.
5. Еремеев С.А., Каргин В.И., Мотовилов К.А., Тышлицкий В.М., Коршунова Г.А., Марков В.Ю., Сумбатян Н.В., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С. Молекулярные механизмы превращения митотропных хинонов ряда SkQ и поиск путей создания избирательно действующих «ловушек» свободных радикалов. Всероссийская школа-семинар для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы», Белгород, Россия, 9-11 декабря 2008, с.53-56.
6. Еремеев С.А., Каргин В.И., Мотовилов К.А., Ташлицкий В.Н., Коршунова Г.А., Сумбатян Н.В., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С. Митотропные хиноны ряда SkQ как потенциальные регуляторы уровня свободных радикалов в клетке. Nanotechnology International Forum "Rusnanotech-08". Moscow, Russia, 3-5 декабря, 2008, с. 583- Еремеев С.А., Костава В.Т., Ягужинский Л.С. Механизм действия противоопухолевых 7.
алкилирующих соединений на митохондрии: эффект открывания неспецифической поры. Международная концеференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, Россия, 2009, стр. 586-590.
8. S. Eremeev, V. Kargin, K. Motovilov, V. Tashlitsky, VMarkov, M. Vyssokikh, G.
Korshunova, N. Sumbatyan, L, Yaguzhinsky. Investigation of chemical properties of group of mitotropic antioxidants of benzoquinone series. 34th FEBS Congress, Prague, Czech Republic, 2009,p. 44.
9. S.A. Eremeev, K.A. Motovilov, L.S. Yaguzhinsky.The new type of uncouplers whitch selectively interact with non-equilibrium membrane bounded protons. 16th European Bioenergetics Conference, Warsaw, Poland, 2010, p. 43.
10. Л.В. Ерошенко, А.С. Мараховская, К.А. Мотовилов, С.А. Еремеев, Л.С. Ягужинский.
Изучение механизма терминальной стадии переноса протона через внутреннюю мембрану митозондрий в условиях синтеза АТФ. 53-янаучная конференция МФТИ.
«Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», Долгопрудный, Россия, 2010, стр. 18- 11. ЕремеевС.А., МотовиловК.А., КоршуноваГ.А., СумбатянН.В., ВолковЕ.М., ЯгужинскийЛ.С. Новый класс разобщителей дыхания и фосфорилирования митохондрий – мембранотропные разобщители. Международная концеференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино, Россия, 2011, стр. 654-658.
12. S.A. Eremeev and L.S. Yaguzhinsky. New class of membranotropic uncouplers of oxidative phosphorylation in mitochondria. 34th FEBS Congress, Prague, Czech Republic, 2011,p. 13. Еремеев С.А.Регуляция активности мембранотропных разобщителей. Тезисы XVIII Международной конференции «Ломоносов-2011», Москва, 2011.
14. Еремеев С.А. Изучение свойств неравновесной фракции ионов водорода возникающей на поверхности внутренней мембраны митохондрий при работе протонных помп. Тезисы XIХ Международной конференции «Ломоносов-2012», Москва, 2012.
15. Eremeev S.A., Motovilov K.A., Yaguzhinsky L.S. The new class of surface-actyve phenols selectively interact with membrane-bound protons fraction with an excess of free energy. 17th European Bioenergetics Conference, Frieburg, Germany, 2012, p. 132.
16. Еремеев С.А., Мотовилов К.А., Ягужинский Л.С. Новый класс поверхностно активных фенолов избирательно взаимодействующих с фракцией мембраносвязанных протонов Вильямса. 4 съезд биофизиков России, Нижний Новгород, 2012, Т.2, стр. 50.