Молекулярно-генетическое изучение рака молочной железы
На правах рукописи
ФАРАХТДИНОВА АЛЬБИНА РАУФОВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 03.02.07 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2012
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Хуснутдинова Эльза Камилевна
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Викторова Татьяна Викторовна Официальные доктор медицинских наук, профессор, оппоненты:
Башкирский государственный медицинский университет, зав. кафедрой биологии Карпухин Александр Васильевич доктор биологических наук, профессор ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, зав. лабораторией ГБОУ ВПО «Российский национальный
Ведущая организация:
исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита диссертации состоится 29 мая 2012 г. в «_» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН (г.Уфа, просп. Октября, 71), с авторефератом – на сайте ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru/dissov.html, e-mail: [email protected], [email protected]
Автореферат разослан « _» апреля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета С.М. Бикбулатова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В мире ежегодно выявляется около 1 млн. новых случаев рака молочной железы (РМЖ) и более чем 400 000 смертельных случаев от данной патологии (Kamangar et al, 2006). В России ежегодно регистрируется более 46 тыс. случаев РМЖ. Риск возникновения заболевания в течение жизни оценивается в среднем у женщин - 11%, у мужчин- 0.1%. В структуре онкологической патологии женского населения России рак молочной железы занимает первое место (Чиссов, 2011).
(20.1%) Злокачественные новообразования молочных желез имеют наибольший вес в структуре смертности женщин (17.4%). В Республике Башкортостан показатели заболеваемости и смертности от рака молочной железы в году составили 55.77+1.15 и 16.1+0.6 на 100 тыс. населения соответственно (Чиссов, 2011). За период с 1999 по 2009 гг. наблюдается тенденция к неуклонному росту показателя смертности от РМЖ, прирост которого за лет составил 10.4%.
Хорошо известно, что генетические факторы играют ведущую роль в патогенезе спорадических и семейных форм рака молочной железы, который является сложным, многофакторным заболеванием (Nathanson et al., 2001).
Каждая женщина с раком молочной железы имеет генетическую детерминанту, однако, лишь небольшое число случаев заболевания можно объяснить нарушениями в уже известных на сегодняшний день генах, ассоциированных с раком молочной железы.
Мутации в генах BRCA1 и BRCA2 объясняют не более 25% случаев наследственных форм заболевания. BRCA1/2 являются компонентами общего сигнального пути, контролирующего целостность генома, апоптоз и дифференцировку клеток. Данный сигнальный путь определяет нормальный ответ клетки на воздействие ионизирующего излучения и включает множество участников, среди которых продукты таких генов как ATM, RAD50, MRE11, CHEK2, NBN и др. Нарушения в работе этих генов являются ключевым звеном в этиологии злокачественных новообразований.
В результате проведенных полногеномных анализов ассоциаций (GWAS) выявлены новые локусы, ассоциированные с раком молочной железы (Pharoah et al., 2004;
Kammerer et al., 2004;
Cox et al., 2007;
Easton et al., 2007;
Hunter et al., 2007;
Stacey et al., 2008;
Stacey et al., 2008;
Garcia Glosas et al., 2008;
Ahmed et al., 2009;
Thomas et al., 2009;
Zheng et al., 2009;
Antoniou et al., 2010;
Milne et al., 2010;
Turnbul et al., 2010;
Fletcher et al., 2011;
Ghoussaini et al., 2012). Некоторые из аллелей этих полиморфных вариантов изменяют риск развития рака молочной железы у носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. Оценки рисков для отдельных аллелей могут быть не высокими, совместный эффект их взаимодействия увеличивает прогностический потенциал маркеров для предсказания вероятности развития заболевания.
Спектр мутаций, генетическая вариабельность полиморфных маркеров могут сильно варьировать между отдельными странами и этническими группами. Этим обусловлена необходимость проведения наших исследований в различных популяциях России.
Цель работы: провести анализ спектра и частоты мутаций в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN и АТМ у больных раком молочной железы из Республики Башкортостан и изучить ассоциации полиморфных локусов генов-кандидатов с развитием заболевания.
Задачи исследования:
1. Изучить частоту высокопенетрантных мутаций 5382insC, р.С61G, 4153delA в гене BRCA1 и мутации 6174delT в гене BRCA2 у больных раком молочной железы.
2. Изучить частоту мутаций IVS2+1GA, CHEK2dele9,10 (5kb), 1100delC, I157T в гене CHEK2, c.657del5 и р.R215W в гене NBN и p.E1978X в гене ATM у больных раком молочной железы и в группе контроля.
3. Провести анализ клинических особенностей рака молочной железы у носителей мутаций в генах BRCA1, BRCA2, NBN, ATM и CHEK2.
4. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных локусов rs2981582 гена FGFR2, rs13387042 в области 2q35, rs889312 гена MAP3K1, rs3803662 в регионе 16q12, rs10941679 в области 5р12, rs4973768 гена SLC4A7, rs6504950 гена STXBP4, rs1982073 гена TGFb1, rs3817198 гена LSP1, rs1045485 гена CASP8, rs1607237 гена PIK3CA и rs13281615 в регионе 8q24 у больных раком молочной железы и в контрольной группе.
5. Дать оценку ассоциации исследованных полиморфных локусов и их сочетаний с риском развития рака молочной железы.
Научная новизна. Впервые проведено молекулярно-генетическое изучение рака молочной железы в Республике Башкортостан на репрезентативных выборках больных (n=977) и контрольной группы (n=1069). Показано неравномерное распределение спектра и частот мутаций в генах BRCA1, CHEK2, NBN и АТМ у больных раком молочной железы разного этнического происхождения. Впервые установлено, что маркерами повышенного риска развития рака молочной железы у женщин из Республики Башкортостан являются аллель *T и генотипы *T*T и *С*T локуса rs2981582 в гене FGFR2, аллель *А и генотип *А*А локуса rs в области 2q35, генотип *А*С локуса rs889312 в гене MAP3K1 и аллель *Т и генотип *С*Т полиморфного локуса rs3803662 в регионе 16q12.
Научно-практическая значимость. Результаты работы расширяют знания о генетических основах предрасположенности к заболеванию раком молочной железы. Полученные результаты могут быть использованы при медико-генетическом консультировании семей, отягощенных раком молочной железы или раком яичников, а также при проведении ДНК диагностики онкологических заболеваний. Материалы диссертации могут быть включены в курс лекций биологических факультетов университетов, медицинских ВУЗов, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Основные положения диссертации были Апробация работы.
представлены на V Всероссийском Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009);
международном совещании членов консорциума по изучению рака молочной железы (Амстердам, 2009), II научно-практической конференции “Актуальные проблемы медицинской генетики на Крайнем Севере” (Якутск, 2009);
Всероссийской научной конференции «Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний» (Стерлитамак, 2010);
Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы и перспективы изучения естественных и антропогенных экосистем Урала и прилегающих регионов» (Стерлитамак, 2011);
Всероссийской школе-конференции молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии "Биомика - наука XXI века" (Уфа, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из которых 5 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, главы результатов исследований и их обсуждения, выводов и перечня цитируемой литературы, состоящего из 400 источников (55 отечественных и 345 зарубежных). Рукопись содержит рисунков и 52 таблицы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалом для нашего исследования послужили образцы ДНК больных раком молочной железы (n=977), находившихся на стационарном лечении в Клиническом онкологическом диспансере г. Уфы и Клинической больнице № 1 г. Стерлитамак Республики Башкортостан за период 2000- гг. Диагноз был верифицирован согласно гистологической классификации Международного противоракового союза. Возраст больных раком молочной железы в исследуемой выборке колеблется от 24 до 85 лет, средний возраст составляет 52,2±10,8 года. Данные о каждой пациентке заносились в специально разработанную нами формализованную карту, на основании которой создана компьютерная база данных. В контрольную выборку были отобраны женщины (n=1069) без онкологической патологии в анамнезе на момент забора крови. Группа контроля соответствует по возрасту и этническому составу выборке больных раком молочной железы. Все участники исследования дали информированное согласие на проведение молекулярно-генетических исследований.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно хлороформной экстракции (Mathew, 1984). Анализ мутаций в генах BRCA1, CHEK2, NBN и АТМ осуществляли методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР), аллель-специфичной ПЦР и ПДРФ-анализом с последующим электрофорезом в 7% полиакриламидном или 1-3% агарозном геле. Все позитивные случаи были подтверждены секвенированием на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100 согласно протоколу фирмы производителя. Генотипирование полиморфных вариантов rs3803662, rs1982073, rs2981582, rs3817198, rs10941679, rs6504950, rs4973768, rs889312, rs1045485, rs13281615, rs1607237 и rs13387042, а также локуса R215W в гене NBN проводили методом аллельной дискриминации ПЦР в реальном времени с конкурирующими зондами TaqMan (7500 Fast System Software, Applied Математическую обработку результатов проводили с Biosystems).
использованием пакетов программ: MS Office Excel 2003 (Microsoft), STATISTICA v.6.0. (StatSoft), BIOSTAT (Гланц С, 1999). При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовали критерий 2 (р) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Иэйтса на непрерывность. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR) (Schlesselman et al., 1982).
Анализ межгенных взаимодействий проводили с помощью программ MDR (Ritchie et al., 2001) и GMDR (Lou et al., 2007;
Chen et al., 2011).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ мутаций в генах BRCA1, CHEK2, ATM, NBN у больных раком молочной железы BRCA1 - ген, ассоциированный с раком молочной железы, 1.
Скрининг мутаций 5382insC, 4153delA, р.C61G в гене BRCA1 в выборке из 977 больных раком молочной железы, проживающих в Республике Башкортостан, выявил 38 носительниц одного из изменений, что составляет 3.9%. Лидирующее положение по частоте встречаемости занимает инсерция 5382insC (3.3%). Инсерция 5382insC в гене BRCA1 в единичных случаях выявлена среди башкир, а также представителей финно-угорской группы мари, мордвы. Считается, что данная мутация произошла в Восточной Европе (Neuhausen et al., 2000;
Hamel et al., 2010). Она редко встречается в странах Скандинавии (0.12%), Германии (1%), Греции (1.2%) (Sorlie et al., 1998;
Backe et al., 1999;
Malander et al., 2004;
Soegaard et al., 2008;
Armao et al., 2009). Ее частота возрастает в направлении Восточной Европы: так, в Белоруссии и Литве частота 5382insC в гене BRCA1 составляет 2.5% (Bogdanova et al., 2010;
Elsakov et al., 2010), в Польше и Латвии – 2.1% и 2.7% соответственно (Gorski et al., 2004;
Plakhins et al., 2011).
Мутации 4153delA (1.07%) и р.C61G (2.15%) в гене BRCA1 являются редкими в нашей выборке больных, они выявлены с более низкой частотой, чем в Эстонии, Польше или Белоруссии (6-10%) (Ciernikova et al., 2006;
Ratajska et al., 2008;
Bogdanova et al., 2010). Для BRCA1-ассоциированного РМЖ характерны некоторые особенности, такие как ранний возраст манифестации заболевания, большой процент случаев заболевания раком молочной железы или раком яичников у родственниц женщин с мутациями в гене BRCA1, билатеральное поражение молочных желез, высокая степень злокачественности опухолевых клеток.
BRCA2 - ген, ассоциированный с раком молочной железы, 2.
Мутация 6174delT в гене BRCA2 в нашей выборке больных раком молочной железы не обнаружена.
CHEK2 - ген киназы сверочных точек 2. Скрининг мутаций 1100delC, IVS2+1G, CHEK2dele9,10(5kb) в гене CHEK2 у больных раком молочной железы из Республики Башкортостан выявил 20 (2.1%) носительниц одного из трех изменений (рис. 1). Делеция CHEK2dele9,10(5kb) обнаружена с частотой 1.2%, OR = 1.9;
P = 0.004.
1, % 1, 0, больные 0, контроль 0,4 0, 0, 0, 0,2 0,1 0, 1100delC IVS2+1GA dele9,10(5kb) Рис. 1. Частота мутаций 1100delC, IVS2+1GA, CHEK2dele9,10(5kb) в гене CHEK2 в выборке больных раком молочной железы и контрольной группе.
Из трех мутаций, проанализированных в гене СНЕК2, в 79% случаев мутации определены у женщин русской, в 11% - украинской, в 5% белорусской и татарской этнической принадлежности. Одна пациентка украинского происхождения является носительницей двух мутаций 1100delC и IVS2+1GA в гене CHEK2. У двух носительниц мутаций в гене СНЕК отмечаются случаи заболевания раком молочной железы у родственниц. У двух женщин выявлено билатеральное поражение молочных желез. Более раннее развитие рака молочной железы характерно для женщин с мутацией 1100delC в гене СНЕК2 (45 лет).
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфного варианта I157T (c.470TC) в гене CHEK2 между больными раком молочной железы и группой контроля достоверных различий не обнаружил (P0.05).
Частота аллеля *T достигает 97% как у больных раком молочной железы, так и у здоровых доноров (рис. 2). Генотип *T*T выявлен с частотой 95% в обеих выборках. Гетерозиготный генотип идентифицирован с частотой ~5% у больных и в контроле. Гомозиготы по аллелю *С определены только в контрольной группе (0.1%).
частота % контроль больные TT CT CC T C генотипы аллели Рис 2. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса I157T (c.470TC) в гене CHEK2.
ATM - ген атаксии телеангиэктазии. В нашей выборке больных РМЖ мутация с.5932GT в гене ATM выявлена с низкой частотой 0.2% (2/977), в контрольной выборке мутация (n=1069) не обнаружена. Возраст манифестации заболевания у пациенток с данной мутацией - 34 и 58 лет. Обе женщины русской этнической принадлежности. В семейном анамнезе одной из носительниц отмечается случай заболевания раком молочной железы (первая степень родства).
NBN - ген нибрина. В выборке больных раком молочной железы мутация c.657del5 в гене NBN обнаружена с частотой 0.41% (4/977), в контрольной группе – 0.37%. (4/1069). Достоверных различий между значениями частот генотипов между выборками больных и контроля не выявлено (Р=1.00). Средний возраст пациенток с делецией c.657del5 в гене NBN составляет 50 лет. У носительниц данной мутации случаев заболевания раком молочной железы в семье не отмечается. У одной пациентки у родственницы первой степени родства выявлен рак яичников. По этнической принадлежности пациентки с мутацией распределились c.657del следующим образом: 2 пациентки - русские, одна - мордва и одна - украинка.
В ряде работ было показано, что мутация c.657del5 гена NBN ассоциирована с раком молочной железы у женщин Восточной Европы (Buslov et al., 2005;
Gorski et al., 2005;
Bogdanova et al., 2008). Также отмечено, что частота делеции с.657del5 повышается в группе больных раком молочной железы с наследственной формой заболевания и при билатеральном поражении молочных желез (Steffen J. et al., 2006).
Другая мутация в гене NBN (р.R215W) обнаружена у больных раком молочной железы с частотой 0.5% (5/977), в контрольной группе ее частота составила 0.2% (2/1060), P=0.8. Средний возраст манифестации заболевания у женщин с мутацией р.R215W - 47.5 лет. Семейных случаев заболевания в анамнезе пациенток не отмечается. Носители данной мутации относятся к трем этническим группам: двое русских, одна украинка и одна татарка.
*** Таким образом, мутация 5382insC в гене BRCA1 наиболее часто встречается среди изученных мутаций (3.3%), ассоциированных с высоким риском развития РМЖ, у женщин Республики Башкортостан. Второе место по частоте распространения (1.2%) занимает мутация CHEK2dele9,10(5kb) в гене СНЕК2. На долю мутаций р.C61G в гене BRCA1, 1100delC, IVS2+1GA в гене СНЕК2 и 657del5 в гене NBN приходится по 0.4%. Мутации p.E1978X в гене АТМ и 4153delA в гене BRCA1 выявлены с самой низкой частотой – 0.2% (табл. 1, стр. 17). Мутация 6174delT в гене BRCA2 не характерна для нашего региона. В целом, лишь 7% случаев заболевания раком молочной железы в Республике Башкортостан мы можем объяснить наличием одной из изученных мутаций (рис. 3).
0,5% 0,4% 3,3% 0,2% 0,4% 0,4% 1,2% 0,4% 0,2% Рис. 3. Спектр и доля изученных мутаций в генах BRCA1, CHEK2, ATM, NBN в общей выборке больных из Республики Башкортостан.
Наши результаты демонстрируют неравномерное распределение частот изученных мутаций в различных этнических группах (рис. 4). Все вышеперечисленные мутации встречаются у русских, почти весь спектр мутаций представлен у женщин украинской этнической принадлежности. У башкир выявлена в одном случае инсерция 5382insC в гене BRCA1. В группе больных РМЖ татарского происхождения встречаются мутации 5382insC, C61G в гене BRCA1, CHEK2dele9,10(5kb) в гене СНЕК2 и р.R215W в гене NBN.
Одной из клинико-генетических характеристик наследственной формы РМЖ является наличие билатерального поражения молочных желез. В нашей группе больных выявлено 29 женщин с двусторонним РМЖ, что составляет 3% от общей выборки больных. Из них у 4 пациенток обнаружена мутация 5382insC в гене BRCA1, мутации 1100delC и IVS2+1GA в гене СНЕК определены в одном случае. Три женщины с двусторонним поражением молочных желез, указывают на случаи заболевания РМЖ у ближайших родственниц. Наши результаты подтверждают тот факт, что у носителей мутаций в генах BRCA1 и CHEK2 высокая вероятность развития билатерального РМЖ.
% 4,5 5382insC BRCA 4 4153delA BRCA 3, C61G BRCA dele9,10(5kb) CHEK 2, 1100delC CHEK IVS2+1GA CHEK 1, p.E1978X ATM 0,5 c.657del5 NBN 0 p.R215W NBN ры ры цы е ки ки та ин сс та ш ра ру ба ук Рис. 4. Спектр и частота изученных мутаций в генах BRCA1, CHEK2, ATM и NBN в разных этнических группах больных раком молочной железы.
Одним из критериев прохождения молекулярно-генетической диагностики на наличие генетических нарушений у родственников больного является развитие онкологического заболевания у пробанда в молодом возрасте. Из полученных нами результатов следует, что для женщин с изученными мутациями, характерно более раннее развитие заболевания по сравнению со средним возрастом манифестации рака молочной железы у женщин без мутаций (рис. 5). Ранняя манифестация заболевания особенно характерна для пациентов с мутациями в гене BRCA1, у которых средний возраст составляет 44±8,8 года (таб. 1).
Известно, что наследственные опухолевые синдромы составляют незначительную пропорцию от общего числа новообразований (1%), хотя при раке молочной железы их удельный вклад достигает более высоких показателей (5-20%) (Имянитов, 2010).
50 5382insC BRCA 4153delA BRCA C61G BRCA IVS2+1GA CHEK dele9,10(5kb) CHEK 1100delC CHEK p.E1978X ATM 20 c.657del5 NBN p.R215W NBN 10 без мутаций NBN BRCA1 ATM CHEK Рис. 5. Средний возраст больных РМЖ с мутациями в генах BRCA1, CHEK2, ATM и NBN.
В нашей выборке больных выделена группа из 103 женщин, указавших на наличие случаев заболевания раком молочной железы или раком яичников у родственников. Спектр и доля выявленных мутаций у пациенток с отягощенным семейным анамнезом и у женщин со спорадическими случаями заболевания представлены на рис.6.
У 15 женщин (14.6%) с наследственной формой РМЖ выявлена инсерция 5382insC в гене BRCA1, у двух (1.9%) пациенток обнаружена замена р.C61G в гене мутации BRCA1, BRCA1*4153delA, СНЕК2*IVS2+1GA, CHEK2dele9,10(5kb), NBN*657del5 и p.E1978X в гене АТМ определены только однажды (1%).
Мутация 5382insC в гене BRCA у больных с отягощенным семейным анамнезом встречается в семь раз чаще, чем в оставшейся выборке женщин с РМЖ. Следует отметить высокую частоту встречаемости протяженной делеции в гене СНЕК2 у больных со спорадической формой заболевания.
Интересно, что мутация 1100delС в гене СНЕК2 не обнаружена в группе с наследственной формой РМЖ, тогда как сообщается о более высокой частоте встречаемости данной мутации в отягощенных семьях (Meijers-Heijboer еt al., 2002).
1.0% 1.0% 0.34% 0..57% 14.6% 0.11% 1.0% 1.0% 1.9% 0.46% 1.9% 1.26% 1.0% 0.11% 0.34% 0.23% 5382insC BRCA 4153delA BRCA C61G BRCA dele9,10 (5kb) CHEK 1100delC CHEK 21% 5% IVS2+1GA CHEK p.1978X ATM без мутаций без мутаций с.657del5 NBN p.R215W NBN 79% 95% А Б Рис. 6. Спектр и доля мутаций генов BRCA1, CHEK2, ATM и NBN у больных А) с генетически отягощенным анамнезом, n=103 Б) со спорадическими случаями заболевания, n=874.
Подводя итог выше изложенному, необходимо сказать, что диагностика генетической предрасположенности к развитию злокачественных новообразований позволяет правильно организовать медицинское наблюдение и предотвратить неблагоприятный исход заболевания. Результаты данного раздела позволяют разработать дальнейшую стратегию молекулярно-генетических исследований с целью поиска новых ДНК-маркеров, ассоциированных с раком молочной железы. В регионе, где проживает этнически гетерогенное население, необходимо учитывать особенности генетической структуры популяций. Например, в тест-системах на ДНК диагностику ряд коммерческих лабораторий России предлагает скрининг на мутацию 6174delT в гене BRCA2, наши данные позволяют говорить о необоснованности такого подхода в Республике Башкортостан.
Таблица 1.
Частота распространения мутаций в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN и АТМ у больных раком молочной железы из Республики Башкортостан Число Число носителей носителей Средний мутации у Изменение мутации в Принятые возраст Этническая больных с Ген на уровне общей манифестации принадлежность обозначения семейными выборке ДНК заболевания случаями больных, РМЖ или N= РЯ, N= русские, татары, башкиры, 5382insC c.5266dupC 32 (0.33) 15 (14.6%) 44.8+9. мордва, мари, украинцы BRCA р.C61G с.181TG русские, татары 4 (0.4) 2 (1.9%) 46+6. русские, 31 и 4153delA c.4034delA 2 (0.2) 1 (1%) украинцы 6174delT c.5946delT - - - BRCA русские, 1100delC c.1100delC 4 (0.4) 0 45.5+10. украинцы русские, c.444+1G IVS2+1GA 4 (0.4) 1 (1%) 47+12. украинцы CHEK2 A русские, украинцы, dele9,10(5kb) 12 (1.2) 1(1%) 49+11. татары, белорусы с.5932GT 34 и 58 русские p.E1978X 2 (0.2) 1(1%) ATM русские, украинцы, 657del5 c.657del5 4 (0.4) 1(1%) 50+5. мордва NBN русские, р.R215W с.643СТ украинцы, 5 (0.5) 0 47+7. татары Анализ ассоциации полиморфных локусов с раком молочной железы Результаты проведенных полногеномных исследований позволили идентифицировать новые полиморфные локусы, ассоциированные с раком молочной железы в европейских и азиатских популяциях (Easton et al, 2007;
Hunter et al, 2007;
Stacey et al, 2007;
Stacey et al, 2008;
Garcia-Glosas et al, 2008;
Ahmed et al, 2009;
Thomas et al, 2009;
Zheng et al, 2009;
Antoniou et al, 2010;
Milne et al, 2010;
Turnbull et al, 2010;
Fletcher et al, 2011;
Ghoussaini et al, 2012). Несмотря на то, что оценки риска для отдельных аллелей могут быть не высокими, совместный эффект их взаимодействия увеличивает прогностический потенциал данных для предсказания вероятности развития заболевания.
В нашей работе проведен анализ ассоциации полиморфных локусов с раком молочной железы, которые были отобраны на основе результатов исследований полногеномного анализа ассоциаций однонуклеотидных полиморфных вариантов с развитием заболевания: rs2981582 гена FGFR2, rs13387042 в области 2q35, rs889312 гена MAP3K1, rs3803662 в регионе 16q12, rs10941679 в области 5р12, rs4973768 гена SLC4A7, rs6504950 гена STXBP4, rs1982073 гена TGFb1, rs3817198 гена LSP1, rs1607237 гена PIK3CA, rs1045485 гена CASP8 и rs13281615 в регионе 8q24.
Обнаружена ассоциация четырех полиморфных локусов: rs (СТ) в гене рецептора факторов роста фибробластов (FGFR2), rs (GA) в области 2q35, rs3803662 (CT) в регионе 16q12, rs889312 (AC) в гене митоген активированной протеин киназы киназы киназы 1 (MAP3K1) с раком молочной железы (рис. 7).
OR=1, FGFR2 rs2981582 *T FGFR2 rs2981582 *T*T OR=1, OR=1, FGFR2 rs2981582 *C*T OR=1, 2q35 - rs13387042 *A OR=1, 2q35 - rs13387042 *A*A контроль MAP3K1 rs889312 *С больные OR=1, OR=1, MAP3K1 rs889312 *A*C OR=1, 16q12 -rs3803662 *T OR=1, 16q12 -rs3803662 * С*Т 0 10 20 30 40 50 частота % Рис. 7. Генетические маркеры повышенного риска развития рака молочной железы у женщин из Республики Башкортостан Установлено, что у женщин русской этнической принадлежности и в общей выборке в целом аллель rs2981582*T и генотип *T*T в гене FGFR2, повышают риск заболевания РМЖ (OR=1.4 [1.14-1.71], P=0.0019 и OR=1. [1.18-1.53], P=0.005;
OR=2.23 [1.4-3.56], P=0.0012 и OR=1.85 [1.38-2.48], P=0.0005, соответственно), что согласуется с результатами зарубежных и отечественных исследований (Easton et al., 2007;
Liang et al., 2008;
Milne et al., 2010;
Boyarskikh et al., 2010). Общая тенденция повышения частоты аллеля *Т и генотипа *T*T у больных РМЖ татарской и башкирской этнической группы сохраняется, но не достигает статистической значимости (Р0.05).
Выявлена ассоциация полиморфного локуса 2q35-rs13387042 с РМЖ.
Аллель rs13387042*А и генотип *А*А являются маркерами повышенного риска развития рака молочной железы (OR=1.22 [1.08-1.33], P=0.002 и OR=1.48 [1.15-1.92], P=0.003).
Для общей выборки больных и для женщин татарской и башкирской этнической группы показана ассоциация полиморфного варианта rs889312 в гене MAP3K1 с РМЖ. У носителей аллеля *С и генотипа *А*С повышен риск развития заболевания: выборка в целом (OR=1.18 [1.04-1.35], P=0.013 и OR=1.34 [1.11-1.63], P=0.003);
татары (OR=1.32 [1.04-1.69], P=0.025 и OR=1.57 [1.1-2.26], P=0.014);
башкиры (OR=2.64 [1.8-3.9], P=0.0005 и OR=2.45 [1.27-4.75], P=0.007). Согласно данных зарубежных исследователей полиморфный локус rs889312 ассоциирован с риском РМЖ у европейских женщин (Easton et al, 2007;
Garcia-Glosas et al, 2008;
Long et al, 2010).
В результате нашего исследования показана ассоциация полиморфного локуса rs3803662 в области 16q12 (TOX3) с раком молочной железы как в общей выборке больных, так и у женщин татарской этнической принадлежности. Редкий аллель *Т и генотип *С*Т полиморфного локуса rs3803662 являются маркерами повышенного риска развития рака молочной железы: выборка в целом (OR=1.18 [1.04-1.35], P=0.013 и OR=1.36 [1.00 1.84], P=0.005);
женщины татарской этнической принадлежности (OR=1. [1.06-1.74], P=0.015 и OR=1.9 [1.06-3.42], P=0.031).
Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к раку молочной железы.
В представленной работе для моделирования межгенных взаимодействий были использованы программы MDR и GMDR [Ritchie et al., 2001;
Lou et al., 2007], в которых с помощью многократного перекрестного пересчета первичных данных были выбраны оптимальные модели межгенных взаимодействий.
Была определена двухлокусная модель ген-генного взаимодействия, предрасполагающая к развитию рака молочной железы: rs2981582 в гене FGFR2 - rs1607237 в гене PIK3CA. Тестируемая сбалансированная точность (Bal.Acc.) данной модели составила 0.76, чувствительность (Se) – 0.67, специфичность (Sр) – 0.85, повторяемость результата - 10/10, OR = 11. [8.5822 – 15.9929], P 0.0001.
Рис. 8. Комбинации генотипов полиморфных локусов rs2981582 в гене FGFR2, rs889312 в гене MAP3K1, rs1607237 в гене PIK3CA, ассоциированные с повышенным или пониженным риском заболевания раком молочной железы.
Примечание: темно-серым цветом выделены ячейки с сочетанием генотипов повышенного риска, светло-серого – пониженного риска.
Также определена трехлокусная модель ген-генного взаимодействия, предрасполагающая к развитию рака молочной железы: [rs2981582 в гене FGFR2 - rs889312 в гене MAP3K1 - rs1607237 в гене PIK3CA] (рис.8).
Тестируемая сбалансированная точность (Bal.Acc.) данной модели составила 0.77, чувствительность (Se) – 0.69, специфичность (Sр) – 0.84, повторяемость результата - 7/10, OR = 11.7338 [8.6287-15.9563], P 0.0001.
Таким образом, проведенный анализ ген-генных взаимодействий изученных локусов дал возможность установить такие сочетания полиморфных вариантов, которые способствуют формированию генетической предрасположенности к раку молочной железы.
ВЫВОДЫ 1. Частота мутаций 5382insC, р.C61G и 4153delA в гене BRCA1 в семьях, отягощенных раком молочной железы или раком молочной железы/раком яичников, составила 17.5%, в выборке больных со спорадической формой рака молочной железы – 2.24%. Наиболее высокая частота мутации 5382insC в гене BRCA1 обнаружена у больных славянского происхождения. Мутация 6174delT в гене BRCA2 не встречается у больных раком молочной железы из Республики Башкортостан.
2. Установлено, что частота мутации СНЕК2dele9,10(5kb) составляет 1.2% в общей выборке больных РМЖ, на долю мутаций 1100delC и IVS2+1GA в гене СНЕК2 приходится по 0.4%. Ассоциации полиморфного локуса I157T в гене СНЕК2 с раком молочной железы не выявлено.
3. Мутации c.657del5 и р.R215W в гене NBN и p.E1978X в гене ATM вносят незначительный вклад в развитие рака молочной железы в Республике Башкортостан (частота 0.4%, 0.5%, 0.2%, соответственно).
4. Установлено, что для больных с мутациями 5382insC, р.C61G и 4153delA в гене BRCA1 характерны: ранний возраст манифестации заболевания, билатеральное поражение молочных желез и семейная история заболевания раком молочной железы.
5. Обнаружена ассоциация полиморфных вариантов rs2981582 в гене рецептора факторов роста фибробластов FGFR2, rs13387042 в области 2q35, rs889312 в гене митоген активированной протеин киназы киназы киназы MAP3K1, локуса rs3803662 в области 16q12 c раком молочной железы.
Маркерами повышенного риска развития рака молочной железы являются аллель *T и генотипы *T*T и *С*T локуса rs2981582 в гене FGFR2, аллель *А и генотип *А*А локуса rs13387042 в области 2q35, генотип *А*С локуса rs889312 в гене MAP3K1 и аллель *Т и генотип *С*Т полиморфного локуса rs3803662 в регионе 16q12.
6. Выявлены две оптимальные модели межгенного взаимодействия локусов:
двухлокусная - rs2981582 в гене рецептора факторов роста фибробластов FGFR2 и rs1607237 в гене фосфатидил инозитол 3 киназы PIK3CA;
трехлокусная - rs2981582 в гене рецептора факторов роста фибробластов FGFR2, rs889312 в гене митоген активированной протеин киназы киназы киназы 1 MAP3K1и rs1607237 в гене фосфатидил инозитол 3 киназы PIK3CA, определяющие формирование генетической предрасположенности к заболеванию раком молочной железы.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Бермишева М.А., Богданова Н.В., Зиннатуллина Г.Ф., Кононова В.А., Фарахтдинова А.Р., Ганцев Ш.Х., Доерк Т., Хуснутдинова Э.К. Анализ мутаций с.657del5 и р.R215W гена NBN у больных раком молочной железы в Республике Башкортостан и Ханты-Мансийском автономном округе. // Медицинская генетика. 2009. № 8. Стр. 36-40.
2. Фарахтдинова А.Р., Федорова С.А., Николаева Т.И., Иванов П.М., Бермишева М.А., Доерк Т., Хуснутдинова Э.К. Анализ мутаций в генах BRCA1, CHEK2, NBS1 у больных раком молочной железы из Республики Саха (Якутия) // Якутский медицинский журнал. 2009. № 2. Стр. 91-93.
3. Зинатуллина Г.Ф., Бермишева М.А., Кононова В.А., Фарахтдинова А.Р., Хуснутдинова Э.К. Прогнозирование возникновения риска молочной железы на основе генетических исследований // Креативная хирургия. Онкология.
2009. № 2. Cтр. 61-62.
4. Хуснутдинова Э.К., Ганцев Ш.Х., Бермишева М.А., Фарахтдинова А.Р., Зинатуллина Г.Ф., Прокофьева Д.С. Молекулярно-генетическое изучение рака молочной железы в Республике Башкортостан // Креативная хирургия.
Онкология. 2010. № 4. Cтр. 56-58.
5. Milne RL, Goode EL, Garcia-Closas M, Couch FJ, Severi G, Hein R, …(Collaborators 125) Khusnutdinova E, Bermisheva M, Prokofieva D, Farahtdinova A, Olson JE, Wang X, Humphreys MK, Wang Q, Chenevix-Trench G;
kConFab Investigators;
AOCS Group, Easton DF. Confirmation of 5p12 as a susceptibility locus for progesterone-receptor-positive, lower grade breast cancer // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2011. V. 20: P. 2222-31.
6. Фарахтдинова А.Р., Бермишева М.А., Зиннатуллина Г.Ф., Ганцев Ш.Х., Кочанова В.А., Федорова С.А., Хуснутдинова Э.К. Анализ мутаций в генах BRCA1/2, ATM, NBN, CHEK2 у больных раком молочной железы различного этнического происхождения Материалы Съезда // V Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 2009. Cтр. 515.
7. Прокофьева Д.С., Бермишева М.А., Фролова В.Ю., Зиннатуллина Г.Ф., Фарахтдинова А.Р., Богданова Н.В., Doerk-Bousset T., Ганцев Ш., Хуснутдинова Э.К. Вклад мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и PALB2 в развитие рака яичников у жителей Республики Башкортостан // Материалы II Всероссийской школы-конференции молодых ученых УНЦ РАН и Волго Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии.
Биомика/Biomics. 2011. Том 1. № 2. Cтр. 101-103.
8. Фарахтдинова А.Р. Полногеномные исследования многофакторных заболеваний // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Проблемы и перспективы изучения естественных и антропогенных экосистем Урала и прилегающих регионов». 2011. Cтр. 104-106.
Список сокращений и условных обозначений РМЖ – рак молочной железы РЯ – рак яичников – Odds Ratio (соотношение шансов) OR 95%CI – Confidence interval (доверительный интервал) GWAS – полногеномный анализ ассоциаций BRCA1 – ген, ассоциированный с РМЖ, BRCA2 – ген, ассоциированный с РМЖ, CHEK2 – киназа сверочных точек – ген атаксии телеангиэктазии ATM – ген нибрина NBN Подписано в печать 26.04.12. Формат 60? 841/16.
Бумага офсетная. Печать оперативная. Тираж 100 экз. Заказ № 173 /12.
Гарнитура «Times New Roman».
Отпечатано в полиграфическом участке Стерлитамакской государственной педагогической академии им. Зайнаб Биишевой г. Стерлитамак, пр. Ленина 49, т/ф: 3473-20-28-