Эндонуклеазы wen1 и wen2 и адениновая днк метилтрансфераза wad из проростков пшеницы

На правах рукописи

ФЕДОРЕЕВА ЛАРИСА ИВАНОВНА ЭНДОНУКЛЕАЗЫ WEN1 И WEN2 И АДЕНИНОВАЯ ДНК МЕТИЛТРАНСФЕРАЗА WAD ИЗ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ Специальность: 03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2013 2

Работа выполнена в НИИФХБ имени А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова и ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН Ванюшин Б.Ф.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Бурьянов Я.И.

доктор биологических наук, профессор Кузнецов В.В.

доктор биологических наук, профессор Колесников А.А.

Ведущая организация: РГАУ МСХА им. К.А.Тимирязева

Защита состоится «_» _2013 года на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Автореферат разослан «_» 2013 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, к.б.н. М.А. Гусаковская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Нуклеазы – один из самых многочисленных и разнообразных классов ферментов, расщепляющих фосфодиэфирную связь в нуклеиновых кислотах. Они участвуют во многих генетических процессах, включая репликацию, репарацию, рекомбинацию, а также осуществляют гидролиз чужеродного генетического материала, который может быть использован клеткой для синтеза новых нуклеиновых кислот. К сожалению, растительные эндонуклеазы все еще относительно мало изучены. Поэтому поиск, выделение, изучение структуры, каталитических свойств и функциональных особенностей этих растительных ферментов являются актуальными и имеют большое научное и практическое значение. Для решения многих проблем физиологии и молекулярной биологии растений и биотехнологии нужны нуклеазы с заданными и разнообразными специфическими свойствами. В последние годы нуклеазы нашли применение в медицине - как лекарственные препараты - и сельскохозяйственной биотехнологии.

Способность растительных эндонуклеаз распознавать разные по статусу метилирования ДНК оставалась неизвестной. Изучение этой возможной особенности нуклеаз растений представлялось очень важным и интересным, потому что растительные ДНК в клетке сильно метилированы.

В ДНК растений наряду с 5-метилцитозином ранее был выявлен N6-метил аденин, однако его происхождение было неясным и вообще было неизвестно – существуют ли у растений ферменты адениновые ДНК-метилтрансферазы.

Модификация ДНК по адениновым основаниям в бактериях является существенным элементом системы рестрикции-модификации и вовлечена в процессы регуляции репликации и транскрипции.

Цель работы: Целью работы является выделение и характеристика эндонуклеаз и адениновой ДНК-метилтрансферазы из везикулярной фракции проростков пшеницы, являющихся маркерами апоптоза в растениях, определение субстратной и сайтовой специфичности ферментов, каталитического механизма действия эндонуклеаз, возможной модуляции активности эндонуклеаз S-аденозил-L-метионином (SAM), гистонами из пшеницы, короткими пептидами и определение функциональной роли ферментов.

Научная новизна и практическая ценность работы: Выделенная из везикул проростков пшеницы адениновая ДНК-метилтрансфераза является первой эукариотической адениновой ДНК-метилтрансферазой. Ферменты WEN1 и WEN2, выделенные из того же объекта, являются новыми бифункциональными эндонуклеазами, которые чувствительны к статусу метилирования ДНК, и их активность модулируется SAM. Действие эндонуклеаз WEN1 и WEN2 модулируется гистоном Н1 и коровыми гистонами, а также короткими пептидами. WEN1 и WEN2 обладают сайтовой и структурной специфичностями и слабой экзонуклеазной активностью. Благодаря сайтовой специфичности действия эндонуклеазы и адениновая ДНК-метилтрансфераза могут найти применение в генной инженерии и биотехнологии.

Структура диссертации: Диссертация состоит из пяти частей 1) введение, 2) обзор литературы, 3) материалы и методы исследования, 4) результаты и их обсуждение и 5) заключение. Работа дополнена выводами и списком литературы (1017 ссылок). Работа иллюстрирована 128 фотографиями, схемами, рисунками, спектрами и хроматограммами. Кроме того результаты работы представлены в 30 таблицах.

Объект исследования: Проростки злаков оказались уникальной и очень удобной моделью для изучения физиолого-биохимических механизмов роста и развития растений: рост и развитие проростков могут быть легко синхронизированы. Кроме того, колеоптиль злаков существует относительно короткое время и относительно быстро погибает по мере формирования и роста проростка. Поэтому колеоптиль служит хорошей естественной природной моделью органоптоза и апоптоза у растений. Апоптоз у пшеницы сопровождается возникновением в клетках особых структур цитоплазматичеких везикул, в которых происходит интенсивная репликация митохондриальной ДНК. Другим характерным маркером апоптоза является межнуклеосомная фрагментация ядерной ДНК. Именно из таких везикул проростков пшеницы сорта Мироновская 808 нами и были выделены эндонуклеазы WEN1, WEN2 и адениновая ДНК-метилтрансфераза.

Нуклеазная активность в колеоптилях при развитии проростков пшеницы. Влияние этрела и ионола (ВНТ). Апоптоз представляет собой генетически детерминированную гибель клеток и является обязательной интегральной частью процесса развития растений. В самом процессе апоптоза можно выделить три стадии: индукционную, зависящую от природы смерть-индуцирующего сигнала, эффекторную, в течение которой активируется механизм самоуничтожения клетки, и деградационную, в процессе которой клетки претерпевают необратимые биохимические и морфологические изменения. Нуклеазы являются одними из главных участников процесса апоптоза. Из графиков изменения нуклеазной активности (НА) в процессе развития проростков видна четко выраженная цикличность изменения НА (рис.1). Можно выделить три пика изменений НА, которые коррелируют с известными стадиями роста и развития колеоптиля, включая апоптоз.

Можно полагать, что обнаруженное увеличение НА к 5-у дню развития проростка определяется синтезом или активацией эндонуклеаз, расщепляющих ДНК на крупные фрагменты. Резкое увеличение НА, наблюдаемое после 6-го дня развития проростка, связано, скорее всего, с действием набора нуклеаз, ответственных за межнуклеосомную и более глубокую деградацию яДНК. Продуцент фитогормона этилена - этрел Рис. 1. Нуклеазная активность в колеоптилях пшеницы. Красная кривая контроль;

зеленая- колеоптили, выросшие в присутствии этрела;

синяя колеоптили, выросшие в присутствии ВНТ.

приводит к резкому увеличению НА и более раннему апоптозу (примерно на 48 час) (рис.2).

Рис. 2. Электрофореграммы ДНК из колеоптилей этиолированных проростков пшеницы, выращенных без и в присутствии ВНТ (2,3 х 10-4М) и этрела (10-2М).

Антиоксидант ВНТ замедляет рост НА в колеоптилях, что приводит к появлению первых признаков фрагментации ядерной ДНК только после 8-го дня развития проростка. Таким образом, фитогормон этилен и антиоксидант ионол контролируют уровень суммарной нуклеазной активности и тем самым могут быть вовлечены в регуляцию апоптоза у проростков пшеницы.

Выделение и очистка эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Везикулы из колеоптилей 8-ми дневных этиолированных проростков пшеницы отделяли от ядер и митохондрий дробным центрифугированием гомогенатов клеток.

Нуклеазная активность была экстрагирована из полученных цитоплазматических везикул и очищена последовательно с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, гельфильтрации на Superdex-200 и Superdex-75 и хроматографии на Toyорearl HW-50. В результате выделены две белковые фракции, обладающие нуклеазной активностью. Один из ферментов, названный WEN2, имел кажущуюся мол.

массу около 43 кДа, другой, названный WEN1, имел кажущуюся мол.массу около 27 кДа. В нативном ПААГ-электрофорезе (без SDS) была обнаружена полоса на уровне 54 кДа, что позволило предположить, что этот фермент имеет димерную структуру и состоит из двух гомогенных субъединиц (рис.

3).

Рис. 3. Электрофореграммы в SDS-ПААГ WEN1 и WEN2 и нуклеазной активности WEN1 и WEN2 в геле с вплавленной в гель нативной и денатурированной тимусной ДНК.

Характеристика эндонуклеаз WEN1 и WEN2.

1. Субстратная специфичность эндонуклеаз WEN1 и WEN2.

Нуклеазы WEN1 и WEN2 расщепляют ДНК как из растительного материала, так и из животного. Образование высокомолекулярных фрагментов ДНК, свидетельствующее о расщеплении ДНК внутри цепи, позволяет отнести нуклеазы WEN1 и WEN2 к эндонуклеазам. Эндонуклеаза WEN2 расщепляет Рис. 4. Электрофореграмма ДНК и продуктов ее гидролиза в 1,2 % агарозе.

1 – контроль (ДНК), 2 – 1+ WEN2, 3 –2 в присутствии 3 мМ Mg2+, 4 –2 в присутствии 1 мМ SAM, 5 –1+ WEN1, 6 – 5 в присутствии 3 мМ Mg2+, 7 –5 в присутствии 1 мМ SAM.

двутяжевую (ds) ДНК, а эндонуклеаза WEN1 дву- и однотяжевую (ss) ДНК.

Кроме того, WEN1 обладает слабой рибонуклеазной активностью. В присутствии ионов магния эндонуклеазы расщепляют ДНК до низкомолекулярных дезоксирибоолигонуклеотидов (ДРОН) и мононуклеотидов. С помощью высокоэффективной хроматографии на колонке С-18 в градиенте концентрации ацетонитрила (0-100%) продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами в присутствии 3 мМ MgCl2 были обнаружены мононуклеотиды. Значит, эндонуклеазы WEN1 и WEN2 могут также проявлять экзонуклеазную активность.

Таким образом, эндонуклеазы WEN1 и WEN2 являются бифункциональными ферментами, обладающими высокой эндонуклеазной и слабой экзонуклеазной активностью.

Эндонуклеаза предпочитает в качестве субстрата WEN - неметилированную ДНК (dam, dcm ) фага. Наоборот, эндонуклеаза WEN преимущественно гидролизовала метилированную по сайтам Gm6ATC и Cm5CWGG (dam+, dcm+) ДНК фага (рис. 4).

Ферменты WEN1 и WEN2 - первые описанные эндонуклеазы эукариот, которые распознают субстратные ДНК по статусу метилирования.

Этот феномен известен для высокоспецифичных бактериальных и протозойных (Chlamidomonas) рестрикционных эндонуклеаз, принадлежащих к системе рестрикции-модификации (R-M).

2. Зависимость нуклеазных активностей от ионов металлов, рН, температуры и SAM.

Ионы Zn2+ полностью ингибировали активность эндонуклеаз WEN1 и WEN во всех случаях даже при низких концентрациях. Таким образом, эндонуклеазы WEN1 и WEN2 из проростков пшеницы явно не относятся к Zn2+- зависимым эндонуклеазам.

Ионы Mg2+ увеличивают активность эндонуклеаз WEN1 и WEN2. В присутствии ионов Mg2+ увеличивается выход низкомолекулярных продуктов гидролиза ДНК. Состав продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами зависит от концентрации ионов Mg2+. В присутствии ионов Mg2+ обе эндонуклеазы расщепляют как метилированную, так и неметилированную ДНК фага практически в равной степени (рис. 4).

Ионы Ca2+ значительно активируют эндонуклеазу WEN1 практически в равной степени, как ионы Mg2+. Но в отличие от WEN1, ионы Ca2+ заметно ингибировали активность эндонуклеазы WEN2, даже в концентрации 1 мМ.

Ионы Mn2+, напротив, активируют эндонуклеазу WEN2 и ингибируют, хотя и незначительно, эндонуклеазу WEN1. Таким образом, катионы влияют на активность эндонуклеаз WEN1 и WEN2 и эти ферменты можно отнести к Ca2+, Mg2+-зависимым эндонуклеазам.

ЭДТА в реакционной среде приводит к полному ингибированию активности как эндонуклеазы WEN1, так и эндонуклеазы WEN2. Увеличение ионной силы путем добавления NaCl или KCl в концентрации от 10 до мМ также приводит к ингибированию ферментативной активности эндонуклеаз. Даже добавление ионов дивалентных металлов в среду с высокой ионной силой не приводит к увеличению активности эндонуклеаз.

Эндонуклеаза WEN1 имеет два рН-оптимума в узких диапазонах рН приблизительно от 6,5 до 7.2 и около 9,7-10,2. Наличие двух рН-оптимумов может свидетельствовать о существовании двух форм фермента – (мономерной и димерной). Нельзя исключать и влияние ионизированных остатков тирозина на активность WEN1. Ионы магния в реакционной среде увеличивают рН-устойчивость фермента. Переход от терминальных значений рН к нейтральным приводит к восстановлению активности WEN1, что указывает на высокую стабильность этого фермента. В отличие от WEN1, эндонуклеаза WEN2 имеет только один рН-оптимум (в нейтральной области 6,8-7,7), диапазон которого увеличивается при добавлении к реакционному раствору ионов Mg2+. В отличие от WEN1, переход от терминальных значений рН к нейтральным не восстанавливает активность фермента, что указывает на нестабильность WEN2 по отношению к рН.

Оптимальной температурой гидролиза ДНК обеими эндонуклеазами, при которой образуются более низкомолекулярные продукты, является 370С.

При комнатной температуре ни эндонуклеаза WEN1, ни эндонуклеаза WEN практически не гидролизуют ДНК независимо от статуса метилирования и даже присутствие ионов Mg2+ не приводит к существенному увеличению активности ферментов. Гидролиз ДНК эндонуклеазой WEN2 при 650С приводит к заметному увеличению выхода более высокомолекулярных ДРОН по сравнению с набором ДРОН при 370С. Даже увеличение времени гидролиза не приводит к уменьшению размеров ДРОН. В отличие от эндонуклеазы WEN2, продукты гидролиза ДНК, особенно метилированной, ферментом WEN1 при 650С заметно не отличаются от продуктов гидролиза ДНК при 370С. Таким образом, WEN1 более стабильна при повышении температуры, чем WEN2.

SAM, а также его производные - SAH (S-аденозил- L -гомоцистеин) и SiBА (S-изобутиладенозин), которые не содержат активной метильной группы, модулируют активность растительных эндонуклеаз WEN1 и WEN2.

Так, SAM значительно активирует WEN2 при гидролизе ДНК фага (dam-, dcm-) и (dam+, dcm+) (рис. 4). В присутствии SAM гидролиз эндонуклеазой WEN2 ДНК независимо от статуса ее метилирования осуществляется практически целиком до олигомеров размером 120-140 пн. SAM также модулирует активность эндонуклеазы WEN1 независимо от статуса метилирования ДНК, но в отличие от WEN2, присутствие SAM в реакционной среде приводит к ингибированию активности WEN1. Таким образом, статус метилирования ДНК и аллостерическое влияние SAMа донора метильных групп для метилирования, в том числе и ДНК - являются эффективными регуляторами активности WEN1 и WEN2 in vitro, а возможно, и in vivo.

SAH стимулирует WEN1, что проявляется в образовании ДРОН длиной в 120-140 пн. SAH в низких концентрациях также стимулирует гидролиз фаговой ДНК ферментом WEN2, но в меньшей степени, чем WEN1, особенно при гидролизе метилированной ДНК. Интересно отметить, что другой структурный аналог SAM – SiBА - также активирует обе эндонуклеазы, хотя и в разной степени. Тем не менее, стимуляция гидролиза вполне заметна, и эти агенты при определенных условиях, как и SAM, могут выступать в качестве модуляторов активности эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Можно предположить, что в эндонуклеазах WEN1 и WEN2 существуют специфические участки – регуляторные домены, отвечающие за связывание с SAM, подобно эндонуклеазам рестрикции (и метилтрансферазам).

Локализация и изменение активностей эндонуклеаз WEN1 и WEN2 в субклеточных структурах колеоптилей в процессе развития проростков пшеницы.

Нуклеазная активность WEN1 обнаружена во всех изученных нами субклеточных структурах (свободные митохондрии, митохондрии в везикулах, ядра) колеоптиля. Нуклеазная активность другой эндонуклеазы – WEN2 выявлена только в ядерной и везикулярных фракциях. Динамика изменения нуклеазной активности в разных структурах в процессе развития проростков позволяет судить о времени индукции и/или активации индивидуальных нуклеаз (рис. 5).

Рис. 5. Динамика нуклеазной активности полипептидов с мол. массой кДа, 54 кДа и 27 кДа в субклеточных структурах колеоптилей проростков.

Синяя – ядерная фракция, красная – везикулярная фракция, зеленая – фракция свободных митохондрий.

На основе данных по динамике нуклеазной активности ферментов в разных структурах предложена схема локализации эндонуклеаз WEN1 и WEN2 в процессе развития проростков (рис. 6). Эндонуклеаза WEN1 в молодых проростках локализуется в свободных митохондриях, но в процессе развития фермент высвобождается из митохондрий и накапливается в ядерной и везикулярной фракциях. Эндонуклеаза WEN1, вероятно, может появляться в везикулярной фракции также внутри целых митохондрий.

Рис. 6. Предполагаемая субклеточная локализация эндонуклеаз WEN1 и WEN2.

Эндонуклеаза WEN2 в молодых проростках локализуется только в ядерной фракции. В старых апоптозных колеоптилях активность WEN1 и WEN2 в ядерной фракции падает и увеличивается во фракции везикул.

Функциональная роль эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Возможное участие в апоптозе.

Мы считаем, что эндонуклеазы WEN1 и WEN2 принимают участие в апоптозе, осуществляя межнуклеосомную фрагментацию и последующую деградацию ядерной ДНК. Об этом, в частности, свидетельствуют их локализация в ядре клеток стареющих апоптозных колеоптилей, резкое увеличение их активности при апоптозе и индукция их активности гормоном старения – этиленом. Мы установили, что в изолированных ядрах эндонуклеаза WEN2 расщепляла ДНК на крупные фрагменты. В этих Рис. 7. Активность эндонуклеаз WEN1 и WEN2 на изолированных ядрах из 3 х дневных проростков пшеницы. 1 – изолированные ядра, 2 – 1+ ДНКазаI, 3 – 1+WEN1 + WEN2, 4 - 1+ WEN2, 5 – 1+WEN1. Маркеры в тыс.пн.

условиях эндонуклеаза WEN1 гидролизовала ДНК хроматина на более короткие фрагменты. При одновременном воздействии эндонуклеаз WEN1 и WEN2 на ядра проростков пшеницы выявляется четкая картина деградации яДНК с образованием фрагментов, кратных по длине примерно 140 пн.

(рис.7).

Таким образом, найденные нами эндонуклеазы из проростков пшеницы фрагментируют ДНК в хроматине по межнуклеосомным участкам, образуя так называемую «лестницу» из фрагментов ДНК, и, следовательно, они могут быть активными участниками процесса апоптоза.

Сайтовая специфичность действия эндонуклеаз WEN1 и WEN2.

Сайтовая специфичность действия растительных эндонуклеаз практически не изучена. Имеются лишь указания на то, что у растений эти ферменты, в отличие от известных бактериальных эндонуклеаз рестрикции, выраженной сайтовой специфичностью действия не обладают. При анализе продуктов гидролиза ДНК фага эндонуклеазами WEN1 и WEN2 с помощью электрофореза в агарозном геле четких дискретных полос (фрагментов ДНК) не выявлено (рис. 4). Это может, в частности, объясняться наличием большого количества относительно коротких сайтов в ДНК, которые распознаются и расщепляются эндонуклеазами WEN1 и WEN2.

Для изучения сайтовой специфичности ферментов были синтезированы ДРОН с разной последовательностью, а также нуклеотиды с флуоресцентным зондом FAM- 5,6-карбоксифлуоресцеином. Анализ продуктов гидролиза синтетических ДРОН эндонуклеазой WEN1 выявил, что сайтом, по которому происходит расщепление фосфодиэфирной связи, является CNG (рис. 8). При гидролизе ферментом WEN1 разных ДРОН, Рис. 5. Электрофореграммы в 20% -ном полиакриламидном геле олигонуклеотидов c одним CNG сайтом и продуктов их гидролиза эндонуклеазой WEN1: 1 - CGC GCG CGC GCG GCG CGC GCG CGC, 2 – продукты гидролиза 1, 3 - CGC GCG CGC GCA GCG CGC GCG CGC, 4 – продукты гидролиза 3, 5 - CGC GCG CGC GCT GCG CGC GCG CGC, 6 – продукты гидролиза 5, 7 - CGC GCG CGC GCC GCG CGC GCG CGC, 8 – продукты гидролиза 7. а – двутяжевые, б – однотяжевые олигонуклеотиды содержащих только один CNG сайт (CGC GCG CGC GCG GCG CGC GCG CGC, CGC GCG CGC GCA GCG CGC GCG CGC, CGC GCG CGC GCT GCG CGC GCG CGC и CGC GCG CGC GCC GCG CGC GCG CGC), возникают два сходные по длине фрагмента, которые на геле представлены одной полосой (второй не виден). В контроле эти исходные ДРОН представлены двумя компонентами, один из которых является двутяжевым (а), а другой однотяжевым (б). Под действием фермента двутяжевые структуры в ДРОН с CGG, CTG и CCG, но не с CAG сайтами исчезают полностью. Эндонуклеаза WEN1 гидролизует метилированные и полуметилированные двутяжевые структуры, содержащие 5-метилцитозин (m5CAG и m5CТG) в большей степени, чем неметилированные. Фермент способен гидролизовать и однотяжевые ДРОН, но в этом случае он предпочитает неметилированные субстраты.

Это первый случай обнаружения и выделения эндонуклеазы высших эукариот, обладающей выраженной сайтовой специфичностью действия.

Фермент гидролизует ДРОН по CNG сайтам, расщепляя фосфодиэфирную связь между остатками C и N (N – G, A, T, C) в любом близлежащем нуклеотидном окружении, за исключением сочетания CCCG. Не исключено, что действие этого фермента может быть связано или даже скоординировано с действием ДНК-метилтрансферазы CMT3, которая метилирует цитозиновый остаток в CNG последовательности ДНК. Метилирование именно этой последовательности играет важную роль в организации хроматина и специфической регуляции экспрессии ряда генов у растений и животных в норме и при различных стрессовых ситуациях. Поскольку действие эндонуклеазы WEN1 может подавляться SAM, логично предположить, что под влиянием SAM в условиях благоприятных собственно для метилирования ДНК активность WEN1 должна быть понижена, чтобы, по-крайней мере, обеспечивалась целостность ДНК структур, метилируемых или прометилированных ДНК-метилтрансферазой CMT3.

Рис. 9. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза эндонуклеазой WEN2: 1 –GCG GCG GAT CGC CGC CGC CGC CGC (FAM), 2 -1+ WEN2, 3 – CGC CGC CGC C(m5)GA TGG CGC CGC(FAM), 4 - 3+WEN2, 5 - ССС ССС GAT CCC CCC CCC (FAM), 6 - 5+WEN2, 7 - GCG GCG TGA TCA GCG GCG GCG(FAM), 8 – 7+WEN Набор разных по длине продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазой WEN2 подобен набору продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазой WEN1.

Гидролиз синтетических ДРОН эндонуклеазой WEN2 выявил различие в специфичности между двумя ферментами (рис. 9). Эндонуклеаза WEN предпочитает гидролизовать CG-обогащенные последовательности, которые расположены по соседству со связывающим сайтом. Этот сайт, скорее всего, имеет последовательность GAT. Если природа нуклеотида, ближайшего к 3’ концу сайта GAT, не влияет на состав продуктов гидролиза ДРОН ферментом, то с 5’- конца оказывала существенное влияние. Расположение остатков гуанина и, особенно, цитозина перед сайтом проводит к полному гидролизу ДРОН, вплоть до появления мононуклеотидов. Остатки аденина или тимина (рис. 9, дорожки 7 и 8) перед сайтом GAT приводят к образованию только двух продуктов (второй не виден, так как флуорозонд расположен на 3’-конце). Расщепление ДРОН только в одном месте непосредственно перед сайтом связывания представляется перспективным для использования фермента в биотехнологии.

Способность ферментов дискриминировать метилированные и неметилированные ДНК, а также разные по статусу метилирования двутяжевые ДРОН, распознавать в субстрате определенные специфичные сайты (CG и СNG) и модулироваться SAM в какой-то мере роднит эукариотические эндонуклеазы WEN1 и WEN2 с прокариотическими эндонуклеазами рестрикции. Учитывая возможное бактериальное происхождение митохондрий у эукариот, резонно предположить, что в процессе эволюции эукариотической клетки именно бактерии как предшественники митохондрий, могли привнести в нее эндонуклеазы рестрикции, а кодирующие их гены попали в ядро. Как бы то ни было, обнаружение в проростках пшеницы описанной нами уникальной эндонуклеазы WEN1 (а также WEN2) указывает на то, что у высших растений могут существовать системы рестрикции-модификации генома (R M) или, по крайней мере, некоторые их элементы. На наш взгляд, такие эпигенетические системы могут принимать участие в явлениях избирательной делеции генетического материала и так называемой нестабильности генома у растений, в том числе и при апомиксисе.

Взаимодействие эндонуклеаз WEN1 и WEN2 с ДНК.

Взаимодействие эндонуклеаз с ДНК изучено с помощью флуоресцентных методов. Спектры флуоресценции эндонуклеаз, полученные при возбуждении светом длиной волны =280 нм, имеют два максимума (при =315 нм и около =340 нм), что является нехарактерным для глобулярных белков, причем интенсивность флуоресценции при =315 нм выше, чем интенсивность флуоресценции, обусловленной триптофановыми остатками.

Наличие двух максимумов флуоресценции может быть связано с тем, что тирозиновые и триптофановые остатки в белках находятся на значительном удалении между собой и возможно связано с существованием доменной структуры в ферментах.

При титровании эндонуклеазами WEN1 и WEN2 ДНК разного статуса метилирования наблюдается тушение флуоресценции, обусловленной как тирозиновыми, так и триптофановыми остатками (рис.10). Образование комплексов ДНК-белок сопровождается также смещением максимумов спектров флуоресценции, обусловленной триптофановыми остатками, в длинноволновую область более, чем на 10 нм. Батохромный сдвиг максимума указывает на увеличение полярноcти окружения триптофановых Рис. 10. Титрование эндонуклеаз WEN1 (А) и WEN2 (Б) метилированной ДНК. Спектры флуоресценции получены при возбуждении светом с длиной волны = 280 нм.

остатков эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Такое изменение микроокружения ароматических аминокислотных остатков обусловлено образованием ионных связей между ДНК и ферментами, которые приводят к конформационным перестройкам в структуре белков.

При титровании раствором ДНК эндонуклеаз WEN1 и WEN наблюдается появление флуоресценции в дальней области (рис. 10).

Изменение интенсивности эмиссии в длинноволновой области спектра флуоресценции не имело прямой зависимости от концентрации ДНК.

Предполагается, что появление флуоресценции в этой области спектра связано с образованием промежуточных комплексов фермент-ДНК. По видимому, пространственные структуры промежуточных комплексов WEN1 ДНК и WEN2-ДНК различны. Об этом могут свидетельствовать положения максимумов спектров флуоресценции в дальней области спектра. Этот факт может быть обусловлен тем, что каталитические центры у WEN1 и WEN отличаются по набору аминокислотных остатков и, следовательно, каталитические механизмы действия этих ферментов могут быть различными.

Для каждого варианта фермент-ДНК были построены зависимости Q от R (рис. 11). Из этих зависимостей следует, что ферменты связываются с ДНК независимо от статуса метилирования в соотношении 1:1. Из графиков зависимости r/L от r, построенных согласно уравнению Скэтчарда, были Рис. 11. Зависимость тушения флуоресценции (Q) от молярного соотношения (R) WEN1 и метилированной ДНК. Q= 100 х ( Fо – F/ Fо ), Fо – начальная интенсивность флуоресценции, F- интенсивность при добавлении ДНК, R- отношение концентрации фермента к концентрации добавленной ДНК.

рассчитаны константы диссоциации комплексов ферментов с ДНК (табл.1), которые зависят от статуса метилирования ДНК и от природы флуоресцирующего основания (табл.1). Также из полученных данных можно сказать, что остатки тирозина могут участвовать в связывании с ДНК и определять чувствительность эндонуклеаз к статусу метилирования ДНК.

Таблица Взаимодействие эндонуклеаз WEN1 и WEN2 с ДНК лямбда фага (dam, dcm-) и (dam+, dcm+). Константы диссоциации, 10 9 М- = 315 нм = 315 нм = 340 нм = 340 нм WEN - Mg2+ + Mg2+ - Mg2+ + Mg2+ неметилированная ДНК 4,4 2,8 2,3 3, метилированная ДНК 2,3 3,6 4,8 6, = 315 нм = 315 нм = 340 нм = 340 нм WEN - Mg2+ + Mg2+ - Mg2+ + Mg2+ неметилированная ДНК 2,2 3,6 4,8 5, метилированная ДНК 4,6 2,2 2,8 4, При титровании эндонуклеаз ионами магния наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции. У WEN1 выявлен один конформационный переход при концентрации 5 мМ MgCl2, а у WEN2 - два конформационных перехода, соответственно при 3 мМ и 7 мМ MgCl2 (рис. 12). По-видимому, эндонуклеаза WEN1 связывается с одним ионом металла и ее катализ зависит от одного иона металла, а эндонуклеаза WEN2 связывается с двумя ионами металла и ее катализ зависит от двух ионов металла.

Рис. 12. Зависимость интенсивности флуоресценции при = 340 нм эндонуклеаз WEN1 (A) и WEN2 (Б) от концентрации ионов магния в среде.

Было выявлено, что константы диссоциации комплексов фермент-ДНК изменяются в присутствии ионов магния (табл.1). Следовательно, ионы магния могут влиять на связывание ферментов с ДНК. Изменения этого связывания сопровождаются модулированием действия ферментов, что приводит к потере распознавания ферментами статуса метилирования ДНК, как это было показано на основании электрофоретического анализа продуктов гидролиза ДНК (рис.4).

Процессивный характер реакции гидролиза ДНК эндонуклеазами WEN и WEN2.

При анализе продуктов гидролиза ДНК пшеничными эндонуклеазами в течение различных промежутков времени методом электрофореза в агарозе выявлены разные по молекулярной массе фрагменты ДНК (рис. 13). Такой Рис. 13 Электрофоретический анализ продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами WEN1и WEN2 в присутствии ионов Mg2+ в зависимости от времени гидролиза: 1 – 5 мин, 2 – 10 мин, 3 – 15 мин, 4 – 20 мин, 5 – 30 мин, – 45 мин, 7 – 60 мин выявленный нами более или менее дискретный последовательно возникающий набор продуктов гидролиза ДНК может объясняться выраженным процессивным действием эндонуклеаз из пшеницы. Была выявлена корреляция между конформационными изменениями в ферментах и появлением новых продуктов гидролиза ДНК.

Была предложена следующая вероятная схема гидролиза ДНК эндонуклеазой WEN не зависит от Mg2+ зависит от Mg2+ зависит от Mg2+ E + P EP E + P1 EP1 E + P2 EP2 E + P сайт-специфичное образование образование расщепление ДНК олигонуклеотидов очень коротких олиго (120-140 пн) и мононуклеотидов и эндонуклеазой WEN не зависит от Mg2+ не зависит от Mg2+ зависит от Mg2+ E + P EP E + P1 EP2 E + P2 EP3 E + P расплетание сайт-специфичное образование цепей ДНК расщепление ДНК олигонуклеотидов (120-140 пн) зависит от Mg2+ EP4 E + P4.

образование очень коротких олиго и мононуклеотидов где Е – эндонуклеаза, Р – исходный лиганд (ДНК), ЕР – промежуточный комплекс эндонуклеаза-ДНК, Р1, Р2, Р3, Р4 – продукты соответствующих этапов гидролиза ДНК.

На первом этапе гидролиза, характерном только для эндонуклеазы WEN1, происходит возможно расплетание цепей ДНК. Доказательством существования этого этапа может быть тушение флуоресценции комплекса бромистый этидий-ДНК только эндонуклеазой WEN1 и расщепление сплавленных двух олигонуклеотидов – AAA AAA AAA CGA AAA AAA AAA + TTT TTT TTT GCT TTT TTT TTT, у которых сайт CNG образуется только при их сплавлении, причем однотяжевые исходные олигонуклеотиды WEN1 не расщеплял. Второй этап - это сайт-специфичный этап гидролиза, осуществляющийся по металл-независимому механизму, третий этап, названный структурно-специфичным этапом гидролиза и зависящий от присутствия ионов магния, происходит с образованием олигонуклеотидов длиной в 120-140 пн. Последний этап связан с образованием низкомолекулярных олигонуклеотидов. Гидролиз ДНК эндонуклеазой WEN протекает в три этапа.

Итак, пшеничные эндонуклеазы WEN1 и WEN2 существенно различаются по сродству к субстратным ДНК с разным статусом метилирования, скоростям гидролиза и времени образования сходных по длине фрагментов ДНК. Выраженная сайтовая специфичность действия ферментов с узнаванием определенных нуклеотидных последовательностей (CNG и CG) проявляется на ранних этапах гидролиза ДНК. После добавления ионов металла в реакционную среду такая сайтовая избирательность действия ферментов утрачивается и ферменты меняют специфичность и проявляют структурную специфичность (расщепляют ДНК из разных источников до фрагментов 120-140 нп). В конечном итоге ферменты способны расщеплять возникшие фрагменты ДНК практически до мононуклеотидов, действуя как экзонуклеазы. Мы не знаем, как работают эти ферменты собственно в клетке и ядре, однако такая наблюдаемая любопытная последовательная деградация ДНК под их действием, по видимому, имеет определенный биологический смысл. Может быть, после начального избирательного гидролиза ДНК по определенным доступным сайт-специфичным последовательностям ДНК в хроматине возникшие фрагменты ДНК служат некими сигналами для реорганизации структуры и изменения свойств самих ферментов, сообщая им способность уже полностью деградировать ДНК. Вероятно, такая перестройка в структуре и работе эндонуклеаз действительно происходит, поскольку мы на самом деле наблюдаем два типа эндонуклеазной активности у этих ферментов – не зависимую и зависимую от ионов металлов. Изученные растительные эндонуклеазы, по-видимому, и в клетке могут не только фрагментировать ядерную ДНК на крупные куски, но и последовательно гидролизовать возникшие фрагменты ДНК до очень коротких олиго- и мононуклеотидов, участвуя в утилизации ядерного материала клетки при апоптозе.

Процессивный характер гидролиза может быть проявлен не только в участии эндонуклеаз в процессе апоптоза, но и в других процессах, например, в процессах репликации и репарации.

Химическая модификация эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Каталитический механизм.

Для понимания каталитического механизма действия пшеничных эндонуклеаз WEN1 и WEN2 и определения аминокислотных остатков, входящих в каталитический домен, проводили химическую модификацию аминокислотных остатков наиболее часто образующих каталитические центры нуклеаз – гистидина, дикарбоновых кислот и лизинов/аргининов.

Модификацию аминокислотных остатков проводили как в отсутствие, так и в присутствии ДНК разного статуса метилирования, а также изучали влияние ионов магния на модифицированные в разных условиях ферменты. Благодаря такому комплексному подходу к модификации можно определить аминокислотные остатки, входящие не только в каталитический домен, но и в ДНК-связывающие домены.

Модификацию гистидиновых остатков эндонуклеаз WEN1 и WEN проводили диэтилпирокарбонатом (ДЭПК). В отсутствие ДНК наблюдается полная потеря энзиматической активности у эндонуклеаз. ДНК защищает эндонуклеазу WEN2 от ингибирующего действия ДЭПК (рис. 14). Защитное действие ДНК от потери активности эндонуклеазы WEN2 доказывает, что гистидин участвует в связывании с ДНК. В случае эндонуклеазы WEN присутствие ДНК при модификации гистидинов ДЭПК не защищает фермент от потери активности. Из дифференциальных спектров поглощения было Рис. 14. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2 в 1,2% агарозном геле при модификации гистидиновых остатков. 1- контроль (неметилированная ДНК), со 2 по дорожки – эндонуклеаза WEN1, с 8 по 13 дорожки эндонуклеаза WEN2. 2 ДНК+фермент, 3-ДНК+фермент+Mg2+,4-ДЭПК-фермент+ДНК, 5- ДЭПК + ДНК+фермент+Mg2+, 6- модифицированный ДЭПК фермент в присутствии ДНК, 7- модифицированный ДЭПК фермент в присутствии ДНК+Mg2+ определено число модифицированных остатков гистидина, оно для обеих эндонуклеаз равно 2. Однако при модификации ДЭПК гистидиновых остатков в присутствии ДНК независимо от статуса метилирования у WEN модифицируются два остатка, а у WEN2 только один. Можно предположить, что только один остаток гистидина в эндонуклеазе WEN2 входит в активный центр. Присутствие ДНК при модификации фермента ДЭПК не защищает этот остаток гистидина от модификации, но при этом активность фермента падает. Второй остаток гистидина у эндонуклеазы WEN2 может входить в связывающий центр.

Модификация карбоксильных групп проводилась 1 – этил-3-( диметиламинопропил)карбодиимидом (КДИ). Из дифференциальных спектров поглощения при =305 нм модифицированных эндонуклеаз против Рис. 15. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2 в 1,2% агарозном геле после модификации остатков дикарбоновых аминокислот. 1- контроль (неметилированная ДНК), со 2 по 7 дорожки – эндонуклеаза WEN1, с 8 по 13 дорожки эндонуклеаза WEN2. 2 - ДНК+фермент, 3- ДНК+фермент+Mg2+,4 - КДИ фермент+ДНК, 5 - КДИ + ДНК +фермент+Mg2+, 6 – модифицированный КДИ фермент в присутствии ДНК, 7- модифицированный КДИ фермент в присутствии ДНК + Mg2+ нативных было рассчитано число остатков модифицированных дикарбоновых кислот. Модификация КДИ дикарбоновых аминокислот в присутствии ДНК зависит от статуса метилирования ДНК.

Модификация аспарагиновых и глутаминовых аминокислотных остатков приводит к полной потере активности эндонуклеазы WEN1 при гидролизе неметилированной ДНК, однако при добавлении к реакционной среде ионов Mg2+ ферментативная активность частично восстанавливается (рис. 15). Модификация дикарбоновых аминокислотных остатков Рис. 16. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2 в 1,2% агарозном геле после модификации лизиновых/аргининовых остатков. 1-контроль (неметилированная ДНК), со 2 по 7 дорожки – эндонуклеаза WEN1, с 8 по 13 дорожки эндонуклеаза WEN2. 2-ДНК+фермент,3-ДНК + фермент +Mg2+,4-ТНБСК-фермент+ДНК, 5- ТНБСК + ДНК + фермент +Mg2+, 6-модифицированный ТНБСК фермент в присутствии ДНК, 7- модифицированный ТНБСК фермент в присутствии ДНК+Mg2+ эндонуклеазы WEN2 также приводит к потере активности при гидролизе неметилированной ДНК и практически не влияет на активность при гидролизе метилированной ДНК.

Модификация лизиновых и/или аргининовых аминокислотных остатков тринитробензол сульфокислотой (ТНБСК) приводит к потере ферментативной активности эндонуклеазы WEN1 в реакции гидролиза ДНК, независимо от статуса метилирования ДНК (рис. 16). Проведение модификации WEN1 в присутствии ДНК защищает эндонуклеазу от ингибирующего действия ТНБСК. При модификации лизиновых/аргининовых остатков эндонуклеазы WEN2 активность фермента не только не уменьшается, а сильно увеличивается. Нейтрализация положительного заряда приводит к изменению специфичности действия фермента и он действует как экзонуклеаза.

Итак, в каталитический центр эндонуклеазы WEN1 входят два остатка гистидина и, скорее всего, два остатка дикарбоновых аминокислот, а также остатки лизина. Кратко каталитический центр WEN1 можно представить в таком виде как HD/EK(D/EK)H. В каталитический центр эндонуклеазы WEN2 входят один остаток гистидина и, скорее всего, два остатка аспарагиновой или глутаминовой аминокислот. Мы можем кратко представить каталитический центр WEN2 как HD/ED/E. Остатки дикарбоновых кислот, входящие в связывающие домены, возможно, определяют чувствительность эндонуклеаз WEN1 и WEN2 к статусу метилирования ДНК. Нами показано, что остатки тирозинов также входят в состав ДНК-связывающих доменов, особенно они важны для WEN1. Для эндонуклеазы WEN2 особую роль в ДНК-связывающем домене играют остатки лизина.

Как уже упоминалось, изученные нами эндонуклеазы обладают сайт специфичной и структурной эндонуклеазной и экзонуклеазной активностями.

Мы предположили, что гидролиз ДНК эндонуклеазами из проростков пшеницы по металл-независимому и металл-зависимому путям осуществляется в одном каталитическом центре. Однако, для проявления раздельно разных активностей ферменты имеют, по крайней мере, два ДНК связывающих домена и один регуляторный домен. На рис. 17 представлена схема возможного взаимодействия ДНК-связывающих, регуляторного и каталитического доменов эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Расположение, последовательность доменов в ферментах на схеме представлена произвольно.

Рис. 17. Схема возможного взаимодействия каталитического, ДНК связывающих и регуляторного доменов при гидролизе ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2 по металл-независимому механизму.

Добавление ионов магния к ферментам сопровождается конформационными перестройками, скорее всего, изменяется ионное окружение вблизи каталитического домена. Эти структурные изменения в белках, вероятно, сопровождаются участием в катализе второго ДНК связывающего домена, в результате ферменты теряют чувствительность к статусу метилирования ДНК и проявляют иную эндонуклеазную активность (структурную). Именно благодаря наличию двух разных ДНК- связывающих доменов в ферментах возможно проявление двух разных по специфичности эндонуклеазных активностей у ферментов.

Модуляция активности эндонуклеаз WEN1 и WEN2 гистонами из проростков пшеницы.

Эндонуклеазы действуют в клетке на ядерную ДНК в составе хроматина.

Гистоны – небольшие основные белки, которые вовлечены в организацию хроматиновой структуры и регуляцию активности генов. Гистон Н локализован в линкерной зоне между нуклеосомами. Гистон Н1 имеет множественные изоформы. Нами установлено, что гистон Н1 модулирует действие эндонуклеаз WEN1 и WEN2 из проростков пшеницы, причем разные подфракции гистона Н1 могут как активировать, так и ингибировать ферменты, и эта модуляция зависит от типа гистона и от статуса метилирования ДНК. Как видно на рис. 18 и 19, добавление гистонов в реакционную смесь приводит к разному соотношению продуктов гидролиза ДНК, это позволяет предполагать, что разные гистоны влияют на разные Рис. 18 Влияние гистонов на нуклеазную активность WEN1 в реакции гидролиза неметилированной (А) и метилированной (Б) ДНК. Разделение продуктов гидролиза в 1.2% агарозе. Ниже приведены значения нуклеазной активности в виде гистограмм. Синяя –высокомолекулярные фрагменты ДНК (более 1000 пн), красная –фрагменты ДНК около 500 пн, зеленая – фрагменты ДНК около 100 пн.

Рис. 19 Влияние гистонов на нуклеазную активность WEN2 в реакции гидролиза неметилированной (А) и метилированной (Б) ДНК. Разделение продуктов гидролиза в 1.2% агарозе. Ниже приведены значения нуклеазной активности в виде гистограмм. Синяя –высокомолекулярные фрагменты ДНК (более 1000 пн), красная –фрагменты ДНК около 500 пн, зеленая – фрагменты ДНК около 100 пн.

этапы гидролиза ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2. Такое различие в модуляции действия ферментативной активности разными гистонами возможно обусловлено образованием разных специфических структур с ДНК, которые являются более или менее предпочтительными структурами для атаки эндонуклеаз. Как свидетельствуют данные спектров флуоресценции, взаимодействие между эндонуклеазами и FITC-меченными гистонами зависит как от эндонуклеаз, так и от природы коровых гистонов и подфракций гистона Н1, т.е. можно говорить о специфичности взаимодействия между этими белками. Так, эндонуклеаза WEN1 сильно тушит флуоресценцию FITC-гистона H1/6, кор-гистонов и слабо тушит флуоресценцию гистона H1/1. В отличие от эндонуклеазы WEN1, эндонуклеаза WEN2 слабо тушит флуоресценцию гистона H1/6 и сильно тушит флуоресценцию гистона H1/1.

А Б Рис. 20. Зависимость тушение флуоресценции ( F/ F0 ) FITC- гистона Н1/ от молярного отношения гистон:эндонуклеаза WEN1(А) и WEN2(Б).

В качестве примера на рис. 20 приведены кривые титрования FITC гистона Н1/1 эндонуклеазами WEN1 и WEN2 в виде зависимости тушения флуоресценции (Q=F/F0) от молярного соотношения гистон-фермент. Из подобных зависимостей была определена стехиометрия связывания белков.

Н1/1 связывается с WEN1 в молярном соотношении 1:1, а с WEN2 он связывается в соотношении 1:2. Исходя из данных рис. 20,Б, можно предположить, что связывание двух молекул эндонуклеазы WEN2 c гистоном Н1/1 происходит по разным участкам белка с разными константами связывания. Интересно отметить, что каждый коровый гистон связывается только с одной молекулой WEN1 или WEN2.

WEN2 имеет более высокую константу диссоциации его комплекса с гистоном Н1/1 и практически одинаковые константы с коровыми гистонами (табл. 2). В случае эндонуклеазы WEN1 наблюдается обратная зависимость:

этот фермент имеет более высокие константы диссоциации его комплексов с коровыми гистонами и гистоном Н1/6, тогда как с Н1/1 константа диссоциации почти на порядок ниже. Таким образом, были обнаружены существенные различия во взаимодействиях эндонуклеаз как с разными подфракциями гистона Н1/1, так и с разными коровыми гистонами.

Различия в связывании гистонов с ферментами обусловлены особенностями структуры гистонов. В аминокислотной последовательности Н1 из пшеницы обнаружен пептид kaakakk в N-концевой области, который присущ всем подфракциям гистона Н1. Однако его расположение и его микроокружение различно во всех подфракциях, что, по-видимому, и обусловливает связывание подфракций гистона Н1 с эндонуклеазами WEN и WEN2 с разной аффинностью.

Таблица Взаимодействие FITC-меченых гистонов пшеницы и их ДНК комплексов с эндонуклеазами WEN1 и WEN2.

Константы диссоциации, М- лиганд His H1/1 His H1/6 His H2 His H3 His H 1,0x106 6,7 x107 1,6x107 2,4 x107 1,5x WEN 1,0x108 5,7x105 2,3x106 3,6 x106 1,3x WEN 5,3x106 1,5 x107 0,7x107 8,9x106 8,8 x WEN1+неметДНК 0,9x108 1,3x106 0,6 x107 5,3 x106 1,7x WEN2+неметДНК 2,4x106 8,9x106 2,0 x107 4,3x106 2,2x WEN1+ метДНК 1,1x108 1,4 x107 4,3x106 3,0 x106 1,2x WEN2+ метДНК Зависимость тушения флуоресценции при титровании комплексов гистон-ДНК ферментами (Q=F/F0) от молярного соотношения комплекс фермент выявила, что во всех случаях это соотношение равно 1:1, т.е. оно не зависит ни от природы гистона, ни от фермента, ни от статуса метилирования ДНК (табл. 2).

Связывание ферментов с комплексом гистон-ДНК может протекать следующим образом: 1) ферменты связываются со свободными участками ДНК. В этом варианте гистон не влияет на состав продуктов гидролиза ДНК (рис.18,19). Такая ситуация возможно имеет место при взаимодействии WEN1 с комплексом ДНК-гистон Н1. 2) ферменты связываются с комплексом через N-концевой участок гистона. В этом случае, вероятнее всего, гистон будет существенно влиять на набор продуктов гидролиза ДНК ферментами, ингибируя или активируя действие эндонуклеаз. При этом модуляция действия ферментов будет зависеть от структуры комплекса гистон-ДНК и, следовательно, от природы гистона и от статуса метилирования ДНК.

Величины констант диссоциации комплексов фермент-гистон-ДНК существенно зависят от статуса метилирования ДНК (табл. 2). In vivo метилирование ДНК – один из механизмов регуляции экспрессии генов. Оно влияет на ДНК-белковые взаимодействия и индуцирует конформационные превращения в хроматине. Так как пшеничные эндонуклеазы чувствительны к статусу метилирования ДНК, они, скорее всего, чувствительны к этим конформационным изменениям субстратов. Поскольку метилированная ДНК предпочтительно связывается с гистоном Н1, образующиеся комплексы, по видимому, обогащены метилированной ДНК, тогда как свободная от гистона Н1 ДНК, по-видимому, содержит незначительное количество метилированных участков. Не исключено, что под влиянием гистона Н1 в результате белок-белковых взаимодействий может изменяться сайтовая специфичность действия эндонуклеаз. Ингибирование фракциями Н1/1 и Н1/6 гидролиза метилированной ДНК эндонуклеазой WEN1 указывает на то, что возможными местами атаки ДНК для WEN1 могут быть сайты с метилированными адениновыми остатками, так как известно, что Н предпочитает связываться с АТ-богатыми последовательностями, которые после связывания Н1, по-видимому, становятся стерически недоступными для WEN1.

Поскольку гистон Н1 расположен в межнуклеосомных линкерах, можно предположить, что первоначальной атаке эндонуклеазы WEN2 на ДНК хроматина подвергаются именно линкерные области хроматина.

Действительно, WEN2 расщепляет ДНК в изолированных ядрах на крупные фрагменты по межнуклеосомным участкам, образуя выявляемую при электрофорезе так называемую «лестницу» фрагментов ДНК. В отличие от WEN2, действие эндонуклеазы WEN1 стимулируется коровыми гистонами, особенно Н2в.

Разные подфракции гистона Н1, по-видимому, участвуют в регуляции ступенчатой деградации ДНК эндонуклеазой WEN2 при апоптозе. Известно, что на первых стадиях апоптоза гидролиз ДНК может быть остановлен.

Однако когда апоптоз основательно задействован и началась уже межнуклеосомная фрагментация ДНК, процесс уже нельзя остановить и деградация ДНК продолжается. При этом значительную роль могут играть, коровые гистоны, которые активируют действие эндонуклеазы WEN1.

Модуляция активности эндонуклеаз WEN1 и WEN2 короткими биологически активными пептидами Пептиды образуют обширную и многообразную сигнальную регуляторную систему, контролирующую физиологию, рост и развитие растений и животных. Мы нашли, что пептиды, синтезированные в Санкт Петербургском институте биорегуляции и геронтологии - эпиталон® (Ala Glu-Asp-Gly), пинеалон® (Glu-Asp-Arg), бронхоген® (Ala-Asp-Glu-Leu), тестаген® (Lys-Glu-Asp-Gly), кардиоген® (Ala-Glu-Asp-Arg), панкраген® (Lys-Glu-Asp-Trp) модулируют действие эндонуклеаз WEN1 и WEN2 по разному (рис. 21). Модуляция активности ферментов пептидами может быть Рис. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза 21.

метилированной и неметилированной фаговой ДНК эндонуклеазами WEN и WEN2. 1 – метилированная ДНК, 2 -1+ фермент WEN2, 3 – 2+ Mg2+, 4 2+гистон Н1, 5 – 2+ эпиталон, 6 -4+ эпиталон, 7 – 2+гистон Н1, 8 – 4+ бронхоген, 9 – 2+ пинеалон, 10 – 4+ пинеалон, 11 – 1+фермент WEN1, 12 – 11+ Mg2+, 13 – 11+ гистон Н1, 14 – 11+ эпиталон, 15 – 13 + эпиталон, 16 – 11+бронхоген, 17 – 13 + бронхоген, 18 – 11+ пинеалон, 19 -13+ пинеалон.

обусловлена тем, что пептиды связываются с определенными сайтами на ДНК, в результате чего ферменты либо конкурируют с пептидами за эти сайты и в результате наблюдается ингибирование действия ферментов, либо связанные пептиды облегчают гидролиз ДНК ферментами. Кроме того, действие пептидов может быть опосредовано гистонами. Это очень важный факт, поскольку в клетке пептиды изначально должны найти в хроматине те места, которые доступны для связывания, а эта доступность может определяться гистонами.

Мы установили, что FITC-меченные пептиды способны проникать внутрь клетки. Они были обнаружены нами внутри ядер и ядрышек, и, тем самым, одним из местом связывания пептидов может быть ДНК.

Все исследованные пептиды модулируют гидролиз однотяжевых и двутяжевых олигонуклеотидов, содержащих CNG и CG-сайты, ферментами WEN1 и WEN2 (рис. 22). Эта модуляция зависит от структуры пептида и может свидетельствовать о специфическом связывании пептидов с олигонуклеотидами.

Рис. 22 Электрофоретический анализ (в 20%-ном полиакриламидном геле) продуктов гидролиза флуоресцентно меченных однотяжевого 5'-FAM CGC CGC CAG GCG CCG CCG CG-3' (А) и двутяжевого 5'-FAM CGC CGC CAG GCG CCG CCG CG-3'/3'-GCG GCG GTC CGC GGC GGC GC-FAM (Б) дезоксирибоолигонуклеотидов эндонуклеазой WEN1. А: 1 – олигонуклеотид, 2 – 1 + фермент + Mg2+;

3 – 2 + эпиталон;

4 – 2 + бронхоген;

5 – +кардиоген;

6 –2 + панкраген;

7 – 2 + пинеалон;

8 – 2 + тестаген. Б: а – двутяжевый, б – смесь однотяжевых.

Итак, нами впервые показано, что короткие пептиды модулируют действие эндонуклеаз. По-видимому, эта модуляция в основном происходит благодаря сайт-специфическому связыванию пептид–ДНК. Выявленное нами специфическое связывание пептидов с одноцепочечными ДРОН имеет особое значение. В ДНК всегда есть или появляются однотяжевые участки, особенно при репликации, рекомбинации и репарации. Взаимодействие коротких пептидов именно с такими участками может контролировать и эти генетические процессы.

Поскольку существует тканевая, субклеточная и возрастная разнокачественность метилирования ДНК, мы считаем, что один и тот же биологически активный пептид будет по-разному связываться с ДНК в зависимости от ее метилирования и по-разному воздействовать на геном: в различных тканях (клетках), в ядре и митохондриях, в молодых и старых клетках, в нормальных и раковых клетках. Почти все это подтверждено экспериментально. Обнаруженный нами феномен модуляции действия эндонуклеаз короткими пептидами может быть лишь частью глобального биологического закона: сайт-специфично связывающиеся с ДНК (особенно с регуляторными элементами генома) пептиды должны модулировать функции многих взаимодействующих с ДНК белков (РНК- и ДНК-полимеразы, ДНК метилтрансферазы и многие регуляторные факторы). Мы предлагаем один из наиболее вероятных механизмов активации генов короткими пептидами:

пептиды селективно связываются с промоторными CNG или CG сайтами, что делает эти сайты недоступными для ДНК метилтрансфераз и в результате промотор остается неметилированным, а это – решающий элемент активации генов. Таким образом, специфические (комплементарные) пептид–ДНК взаимодействия могут эпигенетически контролировать генетические функции клетки, и, вероятно, они играли очень важную роль уже на самых ранних этапах зарождения жизни и эволюции.

N6–адениновая ДНК метилтрансфераза из проростков пшеницы.

N6-метиладенин уже давно найден в ДНК высших растений, протозойных, грибов и водорослей, однако его происхождение оставалось неизвестным. До сих пор адениновые ДНК-метилтрансферазы у этих организмов были не выявлены.

Нами из везикулярной фракции колеоптилей 8-дневных проростков пшеницы выделена адениновая ДНК-метилтрансфераза (WAD метилтрансфераза). Фермент гомогенен, его удельная активность 1, kcpm/мкг.

Рис. 23. А - SDS-ПААГ электрофорез белковых фракций с адениновой ДНК метилтрансферазной активностью, выделенных из колеоптилей пшеницы.

1- белковый экстракт из везикул колеоптилей, 2- очищенная обогащенная белковая фракция, 3- фракция 2 после HPLC в градиенте ацетонитрила с 1% трифторуксусной кислотой Б -Электрофореграммы в 0.7%-ном агарозном геле неметилированной и метилированной WAD метилазой ДНК фага и продуктов их гидролиза различными рестрикционными эндонуклеазами: 1 – неметилированная ДНК фага, 2 -1+ BclI, 3 - метилированная WAD метилазой ДНК фага + нерадиоактивный SAM + BclI, 4 - метилированная WAD метилазой ДНК фага, 5- 4 + MboI, 6 – 1 + MboI, 7 – 1 + RsaI, 8 - 4+ RsaI, 9 – 1 + EcoRI, 10 – 4 + EcoRI.

Кажущаяся молекулярная масса фермента по данным SDS-электрофореза кДа (рис. 23, А). Фермент метилирует ДНК в присутствии SAM с образованием остатков N6 –метилдезоксиаденозина, который был выделен тонкослойной хроматографией и имел характерные экстремумы в УФ спектре.

Другим важным доказательством аденинового метилирования ДНК является защита метилирования от действия соответствующих рестрикционных эндонуклеаз. В качестве субстратной ДНК для метилирования WAD-метилазой была использована неметилированная ДНК фага (dam-, dcm-). Метилирование ДНК WAD-метилазой защищает ДНК от гидролиза рестрикционной эндонуклеазой BclI (рис. 23, Б). Эта эндонуклеаза рестрикции расщепляет ДНК по сайту TGATCA.

Таблица Радиоактивность в N6–метиладенозине в различных олигонуклеотидах после метилирования адениновой ДНК-метилтрансферазой в присутствии ( Н-метил) -SAM.

Субстрат Радиоактивность, cpm 11640± (1) GGG TGA TCA GGG 10070± (2) CCC TGA TCA CCC (3) GGG TGA TCA GGG + 7590± CCC TGA TCA CCC (сплав) 11140± (4) GCG TGA TCA CGC 6070± (5) GCG TGA TCA CGC (сплав) 160± (6) GG TGT TCA GG (7) фага ДНК 9980± 160± (8) poly d(AT) 40± (9) poly d(IC) 190± (10) poly d(А) _ В качестве субстратов для метилирования WAD-метилазой были использованы также синтетические ДРОН (табл. 3). Фермент эффективно катализирует включение радиоактивности из [метил-3Н]-SAM в однотяжевые ДРОН 1, 2 и 4 с сайтом-мишенью TGATCA. Эффективность включения метки падает в два раза при использовании в качестве мишени комплементарных ДРОН 1+2 (3) или самокомплементарного ДРОН 4.

Фермент de novo метилирует одно- и двутяжевые структуры ДНК, но предпочитает однотяжевые. Замена первого остатка аденина на тимин в сайте – мишени TGATCA делает ДРОН (6) инертным для метилирования WAD-метилазой.

Таким образом, первый остаток аденина является мишенью для метилирования в сайте TGATCA и делает этот сайт после метилирования WAD-метилазой устойчивым к действию рестрикционной эндонуклеазы BclI (рис. 23,Б). Монотонные ДРОН, такие как poly-d(AT) или poly-d(IC) и полирибонуклеотид poly-A не служат субстратами для WAD-метилазы.

WAD-метилаза является Ca2+, Mg2+ -зависимым ферментом. Около 2- мМ CaCl2 и MgCl2 необходимо для проявления максимальной ДНК метилазной активности. ЭДТА (до 3 мМ) почти не влияет на активность фермента. Увеличение концентрации ЭДТА до 10 мМ приводит к почти полному ингибированию фермента. Фермент активен в относительно широком интервале рН, а в диапазоне рН от 7,5 до 8,0 он проявляет максимальную активность. Оптимальная концентрация SAM для реакции метилирования ДНК WAD-метилазой - 10 мкМ, что является характерной для многих бактериальных адениновых ДНК-метилтрасфераз. Увеличение концентрации SAM в реакционной среде выше 20 мкМ приводит даже к ингибированию фермента.

По-видимому, выделенная из проростков пшеницы WAD-метилаза участвует в репликации митоходриальной ДНК, так как WAD-метилаза была обнаружена в везикулярной фракции, содержащей митохондрии, в которых происходит активная репликация ДНК в апоптозных растительных клетках.

Известно, что энзиматическое dam метилирование контролирует репликацию плазмид в бактериях. Возможно WAD-метилтрансфераза может контролировать репликацию митохондриальной ДНК, которая представляет собой, главным образом, циклические молекулы. Известно, что митохондрии эволюционно происходят от бактерий, поэтому существование контроля плазмидной репликации адениновым ДНК метилированием, подобно бактериальному, кажется вполне реальным и в растительных клетках и, вероятно, оно используется для контроля за митохондриальной репликацией.

Одним из механизмов защиты от чужой ДНК, например, у бактерий, является система рестрикции-модификации. В проростках пшеницы в везикулярной фракции были обнаружены, помимо адениновой ДНК метилтрансферазы, две эндонуклеазы WEN1 и WEN2, чувствительные к статусу метилирования ДНК, и их действие регулируется SAM – донором метильной группы. На основании этих данных можно предположить, что у высших растений существует система «рестрикции-модификации» или, по крайней мере, ее элементы. Эндонуклеазы WEN1 и WEN2 могут принимать участие в репликации, репарации и рекомбинации митохондриальной ДНК.

Выводы:

1. Из везикулярной фракции стареющих колеоптилей пшеницы выделены две новые Са2+, Mg2+ - зависимые нуклеазы, названные WEN1 и WEN2. Эти ферменты – первые эукариотические нуклеазы, которые чувствительны к статусу метилирования ДНК и активность которых модулируется S аденозил–L-метионином (SAM). Это указывает на то, что у растений могут существовать элементы системы рестрикции-модификации (R-M) генома.

2. Нуклеазные активности, соответствующие активностям WEN1 и WEN2, найдены в ядре, их действие увеличивается со старением колеоптилей, а также под воздействием гормона старения – этилена, и оно максимально выражено при апоптозе. WEN1 и WEN2 расщепляют ДНК изолированных ядер проростков пшеницы по межнуклеосомным участкам. Все это означает, что ферменты WEN1 и WEN2 могут участвовать в апоптозе у растений.

3. Фермент WEN1 предпочитает гидролизовать метилированную ДНК фага лямбда, и его активность ингибируется SAM. Наоборот, фермент WEN предпочтительно гидролизует неметилированную ДНК фага лямбда, и SAM активирует гидролиз ДНК. Тем самым, открыт новый механизм разнонаправленной регуляции активности растительных нуклеаз SAMом.

Са2+ активирует WEN1 и ингибирует WEN2. Таким образом, оптимальные условия для функционирования одного фермента являются ингибирующими для работы другого.

4. WEN1 эндонуклеолитически расщепляет как двутяжевую ДНК, так и однотяжевую ДНК. Кроме того, WEN1 обладает слабой рибонуклеазной активностью. WEN2 эндонуклеолитически предпочитает расщеплять двутяжевую ДНК. В присутствии ионов магния ферменты могут расщеплять ДНК экзонуклеолитически. Таким образом, нуклеазы WEN1 и WEN являются бифункциональными ферментами, обладающими высокой эндо- и слабой экзонуклеазной активностями.

5. Эндонуклеаза WEN1 обладает CNG-сайтовой специфичностью действия и расщепляет фосфодиэфирную связь между остатками С и N. Это - первый случай обнаружения и выделения эндонуклеазы из эукариот, обладающей выраженной сайтовой специфичностью действия. Эндонуклеаза WEN предпочитает расщеплять CG-обогащенные участки ДНК.

6. Эндонуклеазы WEN1 и WEN2 обладают выраженным процессивным действием. Сначала ДНК расщепляется ферментами сайт-специфически до крупных фрагментов независимо от присутствия ионов магния. Затем эти фрагменты в присутствии ионов магния гидролизуются до олигонуклеотидов длиной 120-140 пн. На этом этапе гидролиза ДНК изменяется специфичность действия ферментов и утрачивается их чувствительность к статусу метилирования ДНК. При дальнейшем гидролизе эндонуклеазы расщепляют образовавшиеся олигонуклеотиды до низкомолекулярных и мононуклеотидов. Этапы гидролиза ДНК сопровождаются изменениями спектров собственной белковой флуоресценции эндонуклеаз WEN1 и WEN2.

Наблюдаемые конформационные переходы этих белков коррелируют с изменением специфичности действия ферментов.

7. Открыта важная роль ионов магния в регуляции специфичности действия растительных эндонуклеаз. Ферменты гидролизуют ДНК по металл независимому и металл-зависимому механизмам. Эндонуклеаза WEN расщепляет образовавшиеся крупные фрагменты ДНК по механизму, зависимому от одного иона магния, а эндонуклеаза WEN2 - от двух.

8. С помощью химической модификации аминокислотных остатков нуклеаз, установлено, что каталитический центр эндонуклеазы WEN1 имеет мотив – HD/E(D/EК)KH, а у эндонуклеазы WEN2 – H(E/D)(E/D). Остатки дикарбоновых аминокислот и тирозинов входят в ДНК-связывающие мотивы этих ферментов и, по-видимому, определяют чувствительность эндонуклеаз к статусу метилирования ДНК.

9. Гистон Н1 и коровые гистоны модулируют действие эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Эта модуляция действия ферментов зависит от природы гистонов и статуса метилирования ДНК. Эндонуклеаза WEN1 связывается со свободным участком ДНК в комплексе ДНК-гистон Н1, а WEN2 связывается непосредственно с гистоном в составе этого комплекса. WEN1 и WEN связываются с комплексом кор-гистоны-ДНК непосредственно через кор гистоны.

10. Короткие пептиды модулируют действие эндонуклеаз WEN1 и WEN2, и эта модуляция опосредована гистонами. Пептиды специфически связываются с олигонуклеотидами и ДНК, а также с определенными мотивами гистонов и их комплексов с ДНК. Таким образом, короткие пептиды могут регулировать связывание эндонуклеаз с хроматином.

11. Из везикулярной фракции клеток стареющих колеоптилей пшеницы выделена и охарактеризована первая эукариотическая адениновая ДНК метилтрансфераза. Этот Са2+, Mg2+ – зависимый фермент метилирует остаток аденина внутри сайта TGATCA и, по-видимому, может участвовать в регуляции репликации митохондриальной ДНК.

Публикации по теме диссертации:

1. Fedoreyeva L. I., Vanyushin B. F. (2002). N6-Adenine DNA-methyltransferase in wheat seedlings. // FEBS Letters 514, 305-308.

2. Александрушкина Н. И., Середина А. В., Федореева Л. И., Замятнина В.А., Бакеева Л. Е., Смирнова Е. Г., Ягужинский Л. С., Ванюшин Б. Ф. (2001).

Антиоксиданты – регуляторы роста, развития и клеточной дифференцировки растений. // Тезисы докладов 6-ой Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (26-28 июня г.) ISBN 5-94327-038-8, M.: Изд-во МСХА, 78.

3. Федореева Л.И., Александрушкина Н.И., Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А., Ванюшин Б.Ф. (2003). Влияние продуцента этилена этрела и антиоксиданта ионола (ВНТ) на протеолитический аппарат в колеоптилях проростков пшеницы при сопровождающем ранний онтогенез апоптозе. // Биохимия, 68, 570-576.

4. Дунаевский Я.Е., Федореева Л.И., Александрушкина Н.И., Смирнова Т.А., Коломийцева Г.Я., Ванюшин Б.Ф.,. Белозерский М.А. (2003). Влияние антиоксиданта ионола на протеолитический аппарат стареющих колеоптилей, выращиваемых на свету проростков пшеницы // Биоорганическая химия, 29, 505-509.

5. Fedoreyeva L.I., Sobolev D.E., Vanyushin B.F. (2007). Wheat endonuclease WEN1 depent on S-adenosyl-L-methionine and sensitive to DNA methylation status. // Epigenetics 2, 50-53.

6. Соболев Д.Е., Федореева Л.И., Ванюшин Б.Ф. (2007).Чувствительная к статусу метилирования ДНК S-аденозилметионин - зависимая растительная эндонуклеаза. VI съезд общества физиологов растений России.

Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (18-24 июня 2007 г. Сыктывкар, республика Коми, Россия). Материалы докладов, Часть 1, стр. 215-216 Изд-во Коми НЦ УрО РАН.

7. Федореева Л.И., Соболев Д.Е., Ванюшин Б.Ф. (2008). S-аденозил-L метионинзависимая и чувствительная к статусу метилирования ДНК эндонуклеаза WEN2 из колеоптилей пшеницы. // Биохимия 73, 1243-1251.

8. Федореева Л.И., Смирнова Т.А., Коломийцева Г.Я., Ванюшин Б.Ф. (2008).

Влияние подфракций гистона НI пшеницы на активность апоптотических эндонуклеаз стареющего колеоптиля пшеницы. Тезисы докладов. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая 2008 г., Новосибирск), 105.

9. Vanyushin B.F., Fedoreyeva L.I., Sobolev D.E., Ashapkin V.V., Kharchenko P.N. (2008). DNA methylation and endonucleases dependent on S-adenosyl-L methionine and sensitive to DNA methylation status in plants. // Abstracts. 7 th Plant Genomics European Meeting, Session 10. Epigenetics, Small RNAs and Chromatin Structure", Albena, Bulgaria (24-27 September, 2008), number S 10.5.

10. Vanyushin B.F., Fedoreyeva L.I., Ashapkin V.V., Kharchenko P.N. (2009).

Adenine DNA methylation and unique endonucleases in plants. // 8th Plant Genomics European Meeting (07-10 October, 2009;

Lisbon, Portugal), S.4.1, p.

127.

11. Федореева Л.И., Смирнова Т.А., Коломийцева Г.Я., Ванюшин Б.Ф. (2009).

Гистон Н1 модулирует гидролиз ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2 из колеоптилей пшеницы. // Биохимия 74, 181-189.

12. Хавинсон В.Х., Федореева Л.И., Ванюшин Б.Ф. (2011). Сайт специфическое взаимодействие коротких пептидов с ДНК модулирует действие эукариотических эндонуклеаз. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 151, 76-81.

13. Хавинсон В.Х., Федореева Л.И., Ванюшин Б.Ф. (2011). Короткие пептиды модулируют действие эукариотических эндонуклеаз из проростков пшеницы.

// Докл. РАН, 437, 124-127.

14. Федореева Л.И., Ванюшин Б.Ф. (2011). СNG сайт-специфичная метил чувствительная эндонуклеаза WEN1 из проростков пшеницы. // Биохимия 76, 799-806.

15. Федореева Л.И, Киреев И.И., Хавинсон В.Х., Ванюшин Б.Ф. (2011).

Проникновение коротких флуоресцентно-меченых пептидов в ядро в клетках и специфическое взаимодействие пептидов с HeLa дезоксирибоолигонуклеотидами и ДНК in vitro. // Биохимия, 76, 1505-1516.

16. Федореева Л.И., Ванюшин Б.Ф. (2012). Процессивный характер действия пшеничных эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Кинетические параметры.

Биохимия, 77, 603-610 (2012).

17. Moiseyev G.P., Beintema J.J., Fedoreyeva L.I., Yakovlev G I. (1994). High sequence similarity between a ribonuclease from ginseng calluses and fungus elicited proteins from parsley indicates that intracellular pathogenesis-related proteins are ribonucleases. // Planta 193, 470-472.

18. Moiseyev G.P., Fedoreyeva L.I., Zhuravlev Y.N., Yasnetskaya, Jekel P.A., Beintema J.J. (1997). Primary structures of two ribonucleases from ginseng calluses/ new members of PR-10 family of intracellular patgogenesis-related plant proteins. // FEBS Letters 407, 207-210.

Cписок статей, которые будут опубликованы в 2013 г.

1. Федореева Л.И., Ванюшин Б.Ф. (2013). Механизмы каталитического действия и химические модификации эндонуклеаз WEN1 и WEN2 из проростков пшеницы // Биохимия, 78, 52-65.

2. Федореева Л.И., Смирнова Т.А., Коломийцева Г.Я., Хавинсон В.Х., Ванюшин Б.Ф. (2013). Взаимодействие коротких биологически активных пептидов с FITC-меченными гистонами пшеницы и их комплексы с дезоксирибоолигонуклеотидами // Биохимия, 78, 230-242.

3. Федореева Л.И., Смирнова Т.А., Коломийцева Г.Я., Ванюшин Б.Ф. (2013).

Модуляция гистонами действия эндонуклеаз WEN1 и WEN2 из проростков пшеницы // Биохимия,