Учебное учреждение белорусский государственный медицинский универси тет удк 616.981.5+576.8-095.23 лебедкова наталия валерьевна биологическая характеристика изолятов сlostridium difficile и разработка
1 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ВЕДУЩЕЕ ВЫСШЕЕ УЧЕБНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИ ТЕТ» УДК 616.981.5+576.8-095.23 Лебедкова Наталия Валерьевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ СLOSTRIDIUM DIFFICILE И РАЗРАБОТКА СИСТЕМ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СТРОГИХ АНАЭРОБОВ 03.00.07 - микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Минск 2003 2 Работа выполнена в Государственном учреждении «Научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Министерст ва здравоохранения Республики Беларусь Научный руководитель: член-корреспондент Национальной акаде мии наук Беларуси, доктор медицинских наук, профессор Л. П. Титов, Госу дарственное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиоло гии и микробиологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь, директор Официальные оппоненты:доктор медицинских наук, профессор А. А. Адарченко, Белорусский государственный медицинский университет, главный научный сотрудник ла боратории внутрибольничных инфекций Центральной научно исследовательской лаборатории доктор медицинских наук, профессор И. И. Генералов, Витебский го сударственный медицинский университет ордена Дружбы народов, заве дующий кафедрой клинической микробиологии Оппонирующая организация:
Гродненский государственный медицинский университет Защита состоится «7» октября 2003 г. в 15 ч. на заседании совета по защите диссертаций Д 03.18.05 при Белорусском государственном медицин ском университете по адресу: 220116, г. Минск, пр. Дзержинского, 83, тел.
272-55-98.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Белорусского госу дарственного медицинского университета.
Автореферат разослан «_» сентября 2003 г.
Ученый секретарь совета по защите диссертаций, доктор медицинских наук, профессор Г. Н. Чистенко ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации Несмотря на то, что Clostridium difficile был выделен в 1935 г. как пред ставитель нормальной микрофлоры кишечника новорожденных, а псевдо мембранозный колит (ПМК) описан еще в 1893 г., этиологическая роль дан ного микроорганизма в возникновении дисфункций желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) была установлена только в 70-е годы. Применение антибиоти ков является провоцирующим фактором развития указанных инфекционных процессов, что отразилось в их названиях: «антибиотико-ассоциированные диареи», «колиты» и «ПМК» [Bartlett J. G. e. a., 1994].
C. difficile имеет убиквитарное распространение, являясь постоянным обитателем кишечника различных видов как домашних, так и диких живот ных, а в ряде случаев обнаруживается в испражнениях взрослых здоровых людей с высоким уровнем носительства у детей первого года жизни - 30-90% [Малов В. А. и др. 1999]. Учитывая биологическую особенность возбудителя, а именно, способность к переходу в споровую форму, длительно сохраняю щуюся на объектах внешней среды [Ward P. B. e. a., 1997], C. difficile пред ставляет особую проблему для медицинских учреждений, обусловливая воз никновение внутрибольничных инфекций в отделениях различного профиля [Hutin Y. e. a., 1997;
Miller J. M. e. a., 1998;
Nath S. K. e. a., 1994;
Silva J., 1994;
Wilson K. H. e. a., 1993].
Данное направление исследований является новым для Республики Бе ларусь. Научный интерес и практическую значимость представляет изучение закономерностей циркуляции C. difficile в популяции человека и молекуляр но-биологических свойств полученных изолятов, а также разработка методов и средств диагностики.
Связь работы с крупными научными программами, темами Работа выполнялась в рамках государственных научно-технических программ:
1. «Создать национальную коллекцию вирусов и бактерий, патогенных для человека» (№ госрегистрации 1996468, 1994-1996 гг.).
2. «Разработать газогенерирующую систему для анаэробного культивирова ния микроорганизмов и изучить биологическую характеристику анаэроб ных бактерий (C. difficile), выделенных из клинического материала» (№ госрегистрации 19971365, 3 кв. 1996-1997 гг.).
3. «Разработать газогенераторные системы для культивирования анаэробных микроорганизмов» (№ госрегистрации 19983418, 1998-2000 гг.).
4. «Разработать питательные среды для культивирования строгих анаэробов и капнофилов, среду для определения чувствительности к антибактериаль ным препаратам» (№ госрегистрации 20012330, 2001-2002 гг.).
Цель и задачи исследования Цель исследования - разработать методологию проведения микробио логической диагностики и мониторинга анаэробных инфекций, обусловлен ных C. difficile в Республике Беларусь.
В соответствии с поставленной целью в задачи исследования входило:
1. Исследовать частоту выделения C. difficile от лиц, обследующихся на дис бактериоз кишечника и пациентов с характерной для C. difficile ассоциированных инфекций симптоматикой, обусловленной предшест вующей антимикробной терапией.
2. Изучить частоту выделения данного микроорганизма с объектов внешней среды в отделениях различного профиля клинических больниц г. Минска.
3. Определить морфологические и культуральные свойства полученных изо лятов, оценить их токсигенность на гено- и фенотипическом уровнях, про вести генотипирование C. difficile.
4. Оптимизировать методические подходы к получению иммунных биологи ческих жидкостей к главному фактору патогенности C. difficile – токсино комплексу, как основы для создания отечественных диагностических тест систем.
5. Разработать различные по принципам функционирования газогенерирую щие системы для создания анаэробной атмосферы, предназначенные для использования как в анаэростатах, так и в газонепроницаемых полиэтиле новых пакетах.
Объект и предмет исследования 1. Пациенты, подвергшиеся обследованию с целью выделения C. difficile.
2. Объекты внешней среды в отделениях различного профиля клинических больниц г. Минска.
3. Изоляты C. difficile.
4. Лабораторные животные.
Гипотеза Циркуляция C. difficile имеет место на территории Республики Бела русь. У пациентов с нарушениями в составе кишечного микробиоценоза, ча ще всего вследствие антимикробной терапии, токсигенные изоляты указан ного микроорганизма могут быть причиной формирования инфекционного процесса. Популяция C. difficile, циркулирующая в различных биотопах, по мимо присущих данному виду типичных биологических свойств, характери зуется вариабельностью генетической структуры.
Методология и методы исследования 1. Микроскопический метод.
2. Бактериологический метод.
3. Молекулярно-биологический метод:
полимеразная цепная реакция (ПЦР), генотипирование с использованием арбитрального праймера.
4. Серологический метод: реакции нейтрализации в культуре клеток, на жи вотных;
иммуноферментный анализ (ИФА).
5. Метод определения токсинопродукции в культуре клеток.
6. Биологический метод (получение иммунных биологических жидкостей).
7. Физико-химические методы.
8. Методы вариационной статистики с использованием компьютерных про грамм «Statistica 5.5», «Origin 5.0.».
Научная новизна и значимость полученных результатов Впервые установлена циркуляция C. difficile на территории Республики Беларусь с выделением этого патогена c объектов внешней среды клиниче ских больниц г. Минска и от пациентов.
Выявлены отделения с наибольшей частотой обнаружения на объектах внешней среды C. difficile, госпитализация в которые может быть расценена как фактор риска развития инфекций, ассоциированных с данным микроор ганизмом. Это отделения интенсивной терапии и реанимации (ОИТР).
Установлены объекты больничной среды, контаминированные C. diffi cile, которые являются потенциальными факторами передачи данного пато гена: подкладные судна, пол, стены, тумбочки, умывальники, другие сани тарно-технические устройства, уборочный инвентарь.
Впервые изучена токсигенность изолятов C. difficile, выделенных в республике как на геномном (локус патогенности), так и на фенотипическом уровнях, с количественным определением токсинопродукции в культуре кле ток. Установлено, что практически все изоляты содержат tox гены А и В, экс прессия которых проявляется средними уровнями токсинопродукции в куль туре клеток – от 103 до 104 ЦТЕ в 1 мл.
Впервые получены данные о генетической гетерогенности изолятов C. difficile, выделенных в республике. Выявлено семь геногрупп с доминиро ванием в структуре двух генотипов - I и IV.
Практическая значимость полученных результатов Получены как прямые, так и косвенные доказательства наличия C. dif ficile-ассоциированных заболеваний в Республике Беларусь, что свидетельст вует о целесообразности проведения микробиологического мониторинга ука занных инфекций на изучаемой территории.
Оптимизирована схема выделения и идентификации C. difficile из кли нического материала и на ее основе получены изоляты данного микроорга низма. Основываясь на клинических данных и результатах бактериологиче ских исследований, были поставлены диагнозы: «ПМК, обусловленный C. difficile», «антибиотико-ассоциированный колит, обусловленный C. diffi cile», и назначена этиотропная терапия.
Оптимизированы методические подходы получения иммунных биоло гических жидкостей к главному фактору патогенности C. difficile - токсино комплексу, что послужит основой создания отечественных иммунобиологи ческих диагностикумов для выявления данной инфекции.
Разработана и зарегистрирована 27.03.02 г. № 12-02/25 в Белорусском Государственном институте стандартизации и сертификации каталитическая газогенерирующая система для создания анаэробной атмосферы «Анаэропак Н2+СО2», предназначенная для использования в анаэростатах с целью куль тивирования строгих анаэробов.
Разработан опытный образец бескатализаторной газогенерирующей системы для создания анаэробной атмосферы, предназначенный для исполь зования в газонепроницаемых полиэтиленовых пакетах, что будет способст вовать более широкому внедрению способов диагностики анаэробных ин фекций в республике.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. C. difficile циркулируют в отделениях различного профиля клинических больниц г. Минска. Наиболее часто указанный микроорганизм обнаружи вается в отделениях интенсивной терапии и реанимации. C. difficile выде ляется от больных людей, является этиологическим агентом инфекционно го процесса, характеризующегося общими закономерностями развития и течения, присущими этому патогену.
2. C. difficile, циркулирующие на территории Республики Беларусь, характе ризуются типичными для данного микроорганизма морфологическими, культуральными свойствами и относятся к токсигенным вариантам этого вида. Экспрессия токсигенного генотипа (локус патогенности) in vitro про является средними уровнями токсинопродукции с развитием типичных для указанного микроорганизма морфо-дегенеративных и цитотоксических изменений в культуре клеток. Полученные из внешней среды и от больных людей изоляты C. difficile характеризуются генетической гетерогенностью с доминированием двух генотипов - I и IV.
3. Токсинокомплекс C. difficile в экспериментах in vivo и in vitro оказывает выраженный летальный и цитотоксический биологические эффекты. При использовании его в качестве антигена получены иммунные биологиче ские жидкости, обладающие специфической антитоксической активно стью. Альтернативу поликлональным кроличьим антитоксическим сыво роткам могут составить мышиные иммунные асцитические жидкости.
4. Газогенерирующие системы, обеспечивающие создание условий для куль тивирования анаэробных микроорганизмов с применением химических со единений, являются альтернативой вакуумзаместительному методу. Разра ботанные системы соответствуют своему назначению и по химическим и эксплуатационным характеристикам приближаются к лучшим зарубежным аналогам.
Личный вклад соискателя Проведение экспериментальных исследований по выделению C. difficile с объектов внешней среды клинических больниц г. Минска и от пациентов с изучением их морфологических, культуральных, молекулярно биологических и цитотоксических свойств, статистическая обработка, теоре тическое обобщение результатов и оформление диссертационной работы вы полнены лично автором на базе лаборатории клинической и эксперименталь ной микробиологии НИИ эпидемиологии и микробиологии.
Апробация результатов диссертации Основные результаты исследований доложены и обсуждены на:
1. Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехноло гия», г. Минск, 6-8 апреля 1998 г.
2. 1-ой Итоговой научно-практической конференции «Современные пробле мы инфекционной патологии человека» (эпидемиология, клиника, микро биология, вирусология и иммунология), г. Минск, 8-9 апреля 1998 г.
3. Международной научно-практической конференции «Проблемы патоло гии, санитарии и бесплодия в животноводстве», п. Ратомка Минского рай она, 17-18 декабря 1998 г.
4. Республиканском научно-практическом семинаре «Актуальные вопросы диагностики, клиники, лечения и профилактики ВБИ» п. Лесное, Минская область, 25 февраля 1999 г.
5. Заседании Минского городского научного медицинского общества микро биологов, эпидемиологов и паразитологов, г. Минск, 4 ноября 1999 г.
6. Научно-практической конференции «Инфекция и иммунитет», г. Минск, 9-10 декабря 1999 г.
7. Научно-практическом семинаре «Современные методы лабораторной ди агностики вирусных и бактериальных инфекций», г. Минск, 18-21 апреля 2000 г.
8. VIII Международном симпозиуме «Актуальные вопросы детской онколо гии и гематологии», Минск, 27-29 апреля 2000 г.
9. Международном научно-практическом семинаре «Актуальные проблемы инфекционной патологии», г. Минск, 22 мая 2000 г.
10. 2-ой Итоговой научно-практической конференции НИИЭМ «Современ ные проблемы инфекционной патологии человека» (вирусология, микро биология, иммунология, эпидемиология и клиника), г. Минск, 18 января 2001 г.
11. Семинарe «Лабораторная диагностика гнойно-воспалительных заболева ний, обусловленных анаэробными микроорганизмами», Минск, 28 июня 2001 г.
12. 1-ом FEMS конгрессе европейских микробиологов, Словения, Любляна, 29 июня – 3 июля 2003 г.
Опубликованность результатов Основные положения диссертации опубликованы в 11 научных рабо тах, в том числе в рецензируемых изданиях – 3 статьи и 1 тезисы, в сборни ках материалов съездов и конференций – 4 статьи и 3 тезисов, в том числе в иностранных изданиях – 1 статья и 1 тезисы. Суммарно основные результаты диссертации опубликованы на 52 страницах.
Структура диссертации Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, иллю стрирована 26 таблицами и 36 рисунками, состоит из введения, общей харак теристики работы, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собст венных исследований, заключения, выводов, списка использованных источ ников, включающего 33 отечественных и 180 иностранных источников и приложения.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Материалом для исследования являлись пробы испражнений, получен ные от госпитализированных пациентов с дисфункциями ЖКТ в виде диареи, послабления стула, возникшими на фоне приема антибиотиков или при нали чии в анамнезе у этой категории больных антимикробной терапии (n=77);
подозрительные на C. difficile колонии черного цвета с явлениями газообра зования, образующиеся на среде Вильсона-Блера после посева проб стула от лиц, обследовавшихся на дисбактериоз кишечника (n=504).
Предметом исследований были также объекты внешней среды (n=1700) палат и мест общего пользования отделений терапевтического и хирургиче ского профиля клинических больниц г. Минска.
Материалом для последующих исследований служили 65 изолятов C. difficile, полученных с объектов больничной среды и от пациентов.
Выделение C. difficile из первичного материала проводили общеприня тым бактериологическим методом с использованием как селективных, так и селективно-дифференциально-диагностических сред [Калиниченко Н. Ф. и др., 1989]. Селективными компонентами являлись D-cycloserine и cefoxitin в количестве 250 мг/л и 8 мг/л соответственно. У выделенных микроорганиз мов изучали морфологические и культуральные свойства, что являлось осно ванием для их первичной идентификации. Указанный методический подход и сейчас относится к «золотому стандарту» лабораторной диагностики C. dif ficile-ассоциированных инфекций [Fedorko D. P. e. a., 1997].
Для выявления генов экзотоксинов А и В C. difficile применяли поли меразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием набора праймеров YT- и YT-29 и YT-17 и YТ-18 соответственно [Gumerlock P. H. e. a., 1993;
Silva J.
e. a., 1994;
Tang Y.J. e. a., 1994]. Вышеуказанным методом был изучен локус патогенности, включающий помимо основных генов - tcdА и tcdВ три вспо могательных гена - tcdC, tcdD, tcdE. Генотипирование изолятов C. difficile проводили с использованием арбитрального праймера в полимеразной цеп ной реакции [Titov L. e. a., 2000]. Молекулярно-генетическое типирование и изучение локуса патогенности части изолятов выполнено совместно с про фессором Д. Сильвой в лаборатории бактериологии кафедры инфекционных болезней Калифорнийского университета в рамках международного сотруд ничества.
Для выявления экспрессии токсигенного генотипа изолятов осуществ ляли исследование в культуре клеток с количественным определением уров ней токсинопродукции. В качестве питательной среды для культивирования микроорганизмов с целью накопления токсинокомплекса использовали сер дечно-мозговой бульон («Diagnostics Pasteur», Франция). Эксперимент про водили на перевиваемой клеточной линии BGM (почка африканской зеленой мартышки), полученной из банка культур клеток Института цитологии Рос сийской Академии Наук. Степень цитопатического действия (ЦПД) оценива ли по проценту погибших клеток в монослое по четырехплюсовой системе [Третьяков В. А. и др., 1987]. За 1 цитотоксическую единицу (ЦТЕ) принима ли максимальное разведение образцов надосадочных жидкостей, при кото ром наблюдалась гибель 50% и более клеточного пласта.
При проведении иммунизации в качестве продуцента токсинокомплек са во всех экспериментах использовали высокотоксигенный референс-штамм C. difficile VPI 10463. Первая схема предполагала очистку токсинокомплекса от низкомолекулярных, балластных белков. Вначале его осаждали сульфатом аммония до 40% насыщения, а затем проводили гель-фильтрацию с примене нием сефадекса G-200. Концентрацию белка определяли по методу Лоури.
Анатоксин получали по щадящей методике, согласно которой использовали формальдегид в конечной концентрации 0,4%, но материал предварительно обрабатывали 1% раствором лизина для его стабилизации [Королева В. М., 1992]. В обеих схемах анатоксин смешивали с адъювантом (эмульсиген про изводства США) в соотношении 1:2 соответственно. Антиген в концентрации 500 мкг белка на 1 инъекцию вводили внутримышечно кроликам породы Шиншилла массой 3 кг. Полный цикл иммунизации состоял из 11 инъек ций с интервалом 7 дней. Во второй схеме иммунизацию проводили натив ным токсинокомплексом в нарастающих дозах введения антигенного мате риала, начиная с 5 мл (37 мг белка) и заканчивая 20 мл (147 мг белка). Схема иммунизации состояла из пяти инъекций с интервалом 7 дней.
Иммунные асцитические жидкости получали на безлинейных белых мышах весом 20-25 г. Анатоксин готовили по схеме изложенной выше. При проведении внутримышечных и подкожных инъекций использовали указан ный адъювант, который смешивали с материалом в соотношении 1:2 соот ветственно. Апробированы три схемы иммунизации, основным отличием ко торых был способ введения антигена. Все схемы состояли из 7 инъекций с интервалом 7 дней, а между первым и вторым введением материала был сде лан 10 дневный перерыв. В первой схеме животных иммунизировали внут рибрюшинно анатоксином с постепенным увеличением дозы (от 0,5 мл до мл). Во второй схеме дополнительно подкожно вводили анатоксин вместе с адъювантом в объеме 1 мл на протяжении всего цикла иммунизации. В третьей схеме инъекции проводили внутримышечно анатоксином вместе с адъювантом в объеме 1 мл. Специфическую активность иммунных биологи ческих жидкостей оценивали тремя методами (нейтрализацией ЦПД в куль туре клеток и летальной активности на лабораторных животных, а также им муноферментным анализом). За 1 антицитотоксическую единицу (АЦТЕ) принимали конечное разведение исследуемых биологических жидкостей, ко торое обеспечивало как минимум 50% защиту от цитопатического действия антигена взятого в дозе 100 ЦТЕ50. За 1 антитоксическую единицу (АЕ) при нимали максимальное разведение исследуемых биологических жидкостей, которое нейтрализовало действие антигена в дозе 100 Dlm. Эксперименты по иммунизации выполнены совместно с сотрудниками РНИУП «Института экспериментальной ветеринарии им. С. Н. Вышелесского Национальной ака демии наук Беларуси».
Одной из задач исследования являлась разработка различных по прин ципам функционирования газогенерирующих систем для создания анаэроб ной атмосферы, адекватной для культивирования указанной группы микро организмов. Состав газовой среды анализировали газохроматографическим методом на газовом хроматографе «Хром-5», оборудованном детектором по теплопроводности. Сравнительный анализ эксплуатационных характеристик, разработанных опытных и контрольных систем с использованием референт ных штаммов строгих анаэробов (C. difficile VPI 10463, ATCC 9689, «Bor riello»;
B. ovatus ATCC 8483), проводили бактериологическим методом. Дан ный раздел выполнен совместно с сотрудниками лаборатории химии конден сированных сред НИИ физико-химических проблем Белгосуниверситета.
Статистическая обработка данных проведена с использованием ком пьютерных программ «Statistica 5.5», «Origin 5.0.».
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Биологическая характеристика изолятов C. difficile, полученных с объектов больничной среды и от пациентов При обследовании 1700 объектов в отделениях различного профиля клинических больниц г. Минска C. difficile выделены из 42 объектов (2,5±0,4%). Преимущественная изоляция этого микроорганизма отмечалась в отделениях интенсивной терапии и реанимации, где показатель частоты его обнаружения на объектах больничной среды составил 5,7±0,9% (n=700). По одному изоляту было получено из отделений гематологии и общей хирургии, а частота выделения составила 0,3±0,3% (n=350) и 0,2±0,2% (n=650) для от делений терапевтического (исключая ОИТР) и хирургического профиля со ответственно.
При анализе частоты изоляции C. difficile с отдельных объектов внеш ней среды стационаров г. Минска было установлено, что с наибольшей час тотой (22,1±4,7%) данные микроорганизмы выделялись с подкладных суден, прошедших санитарную обработку. Из других объектов, таких как стены, уборочный инвентарь, тумбочки, умывальники, другие санитарно технические устройства, пол, C. difficile изолировались в небольшом процен те случаев (1,7-3,1%). Один изолят этого патогена был получен из смыва с телефона, находившегося на посту медицинской сестры.
От лиц, подвергшихся обследованию на дисбактериоз кишечника, было получено 8 изолятов C. difficile. Низкая частота выделения 1,6±0,6% этого патогена в данном случае может быть обусловлена спецификой контингента пациентов (n=504).
При бактериологическом обследовании пациентов, имеющих клиниче скую симптоматику типичную для C. difficile-ассоциированных инфекций и ее связь с предшествующей антимикробной терапией (n=77), частота выде ления этого патогена составила 19,5±4,5%. Четырем больным на основании клинических наблюдений и результатов бактериологического исследования был поставлен диагноз ПМК. У всех лиц, колонизированных данным патоге ном, наблюдалась диарея различной степени выраженности, а у двоих паци ентов стул был до 15-20 раз в сутки. Связь вышеуказанных симптомов с ан тибактериальной терапией прослеживалась практически у всех больных.
Препараты, возможно причастные к возникновению вышеуказанных дис функций кишечника, были различны. Чаще других антибиотиков использо вали линкомицин и левомицетин, причем у 8 пациентов это была комбини рованная терапия. Больным, колонизированным C. difficile, с учетом резуль татов бактериологических исследований, назначался метронидазол, а при тя желом клиническом течении проводилось комбинированное лечение ванко мицином и метронидазолом в общепринятых дозах.
Молекулярно-биологическая характеристика изолятов C. difficile Все изоляты, предварительно идентифицированные по результатам изучения морфологических и культуральных свойств как C. difficile, прохо дили тестирование методом ПЦР с целью обнаружения у них фрагментов ге нов экзотоксинов А и В. Исследовано 65 изолятов, 23 из которых были полу чены при обследовании пациентов. Все микроорганизмы, выделенные с объ ектов внешней среды (n=42), несли в своем геноме фрагменты обоих tox ге нов А и В C. difficile, что представлено на рис. 1. У изолятов были выявлены две специфические полосы на расстоянии, соответствующем пробегу фраг ментов ДНК, равных 630 н.п. и 399 н.п., что характерно для tox генов А и В соответственно.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 615 н.п.
630 н.п.
369 н.п.
399 н.п.
Условные обозначения:
Дорожки 1 и 11: маркер – «лестница» 123 н.п.
Дорожка 2: контроль системы (проба с деионизированной водой).
Дорожки 3-8: изоляты, полученные с объектов внешней среды.
Дорожки 3, 5, 7: амплифицированные фрагменты ДНК области гена В.
Дорожки 4, 6, 8: амплифицированные фрагменты ДНК области гена А.
Дорожки 9, 10: положительный контроль - референтный штамм С. difficile VPI 10463;
где дорожка 9: фрагмент ДНК области гена В, а дорожка 10:
фрагмент ДНК области гена А.
Рис. 1 Электрофоретический анализ в 2% агарозном геле продуктов ПЦР фрагментов tox генов А и В C. difficile В геноме большинства C. difficile, выделенных от пациентов (за исклю чением одного), также как и у изолятов с объектов внешней среды, обнару живали фрагменты обоих tox генов А и В. Изучение локуса патогенности микроорганизмов показало наличие у всех исследованных бактерий трех до полнительных генов - tcdC, tcdD, tcdE, которые вместе с основными генами tcdА и tcdВ участвуют в его формировании.
Генотипирование 47 изолятов C. difficile, полученных с объектов внеш ней среды клинических больниц г. Минска и от пациентов, выявило наличие семи генотипов. Несмотря на их кажущееся разнообразие, большинство мик роорганизмов было отнесено к двум из них, а именно, к I и IV, на долю кото рых суммарно приходилось 78,7%. Доминирующим был I генотип, зани мающий в структуре 53,2±7,3%. Выявлены определенные генотипы бакте рий, выделяющиеся только от пациентов (III) или только с объектов боль ничной среды (IV, V, VI, VII).
Оценка токсигенности C. difficile в культуре клеток Для выявления экспрессии токсигенного генотипа микроорганизмов проводили исследование в культуре клеток с количественным определением уровней токсинопродукции. В эксперименте использовали перевиваемую клеточную линию BGM, рис. 2. Результаты исследования в культуре клеток находились в соответствии с ранее проведенным тестированием токсигенно сти бактерий на генетическом уровне. Все tox-позитивные C. difficile прояви ли цитотоксическую активность в культуре клеток с уровнями токсинопро дукции от 103 до 104 ЦТЕ в 1 мл. У высокотоксигенного референс-штамма C. difficile VPI 10463 указанный показатель составил 106 ЦТЕ50 в 1 мл. Харак тер дегенеративных изменений в культуре клеток был типичен для данного патогена. Отмечали нарушение межклеточных связей, утрату характерной морфологии клеток, они округлялись и выглядели в виде «бусин», диффузно разбросанных в поле зрения, рис. 3.
Рис. 2 Культура клеток BGM Рис. 3 Культура клеток BGM, под (контроль, после 48 ч роста). x 100 вергшаяся воздействию токсино комплекса C. difficile Получение диагностических антитоксических иммунобиологических препаратов Наряду с классическим бактериологическим исследованием для лабо раторной верификации диагноза C. difficile-ассоциированного заболевания широко применяются серологические методы, основанные на способности токсинов или микробных клеток вступать в реакцию с иммунными специфи ческими сыворотками. Принимая во внимание то, что главным фактором па тогенности данного микроорганизма признаны вырабатываемые им токсины, мы сфокусировали свои исследования на получении антитоксических сыво роток. При гель-фильтрации на сефадексе G-200 токсинокомплекс C. difficile элюировал в первом пике, объединенная фракция верхушки которого харак теризовалась высокой как летальной (12,5 Dlm/100 мкг белка), так и цитоток сической (9756,1 ЦТЕ50/100 мкг белка) активностью, и именно она была ис пользована в качестве антигенного материала. Короткая схема иммунизации, состоящая из 5 инъекций, позволила получить сыворотку с довольно высо ким титром антител в ИФА (1:25600), но вместе с тем она характеризовалась невысокой специфической активностью в реакции нейтрализации in vivo (3, АЕ/мл). Полученная сыворотка специфически взаимодействовала с 25 изоля тами C. difficile из рабочей коллекции и не давала перекрестных реакций с видами микроорганизмов, персистирующих в желудочно-кишечном тракте людей и животных (Bacillus macer, Bacillus subtilis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium perfringens типы A, C, E, Clostridium septicum, Escherichia coli, Fusobacterium necrophorum, Haemophilus pleuropneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae).
Применение иммунизации с введением антигена в нарастающих дозах позволило получить антитоксическую сыворотку с высокой специфической активностью нейтрализующих антител в летальном (160 АЕ/мл), цитотокси ческом (5120 АЦТЕ/мл) тестах и в ИФА (1:12800 титр).
Альтернативу сывороткам могут составить мышиные иммунные асци тические жидкости. Это удобный во многих отношениях подход, который нашел широкое применение при идентификации арбовирусов. Ограничивает использование мышиных сывороток малое количество крови, которое удает ся получить от этих животных, однако, при индукции асцита устраняется это препятствие [Гайдамович С. Я. и др., 1969;
Самойлова Т. И. и др. 1974]. В данной биологической модели определяющим моментом в выработке анти тел является схема иммунизации, в которой оптимальным образом сочетают ся как способ введения антигенного материала, так и кратность инъекций.
Результаты нашего эксперимента указывают на преимущества моновакцина ции с внутримышечным введением антигенного материала и короткой ( инъекций) схемы иммунизации, при которой удалось получить асцитические жидкости, обладающие специфической активностью (51,2 АЕ/мл, 320 АЦ ТЕ/мл, 1:51200 титр в ИФА) при небольшом расходе антигенного материала.
Разработка газогенерирующих систем для культивирования анаэробов Наиболее чувствительными к составу газовой среды являются бакте рии из группы строгих анаэробов. После 20-40 мин экспозиции на воздухе их количество снижается на 30-70%. Для культивирования строгих анаэробных микроорганизмов необходимо быстрое создание атмосферы с уровнем со держания кислорода менее 0,5 об.% [Imhof A., 1996].
При разработке указанных систем были применены два подхода, а именно: каталитический и бескатализаторный. Каталитические газогенери рующие системы предназначены для использования в анаэростатах, так как принцип их функционирования предполагает создание избыточного давления по водороду, окисление которого сопровождается локальным нагревом в об ласти размещения катализатора. Бескатализаторные газогенерирующие сис темы относятся к разработкам нового поколения, которые могут применяться как в анаэростатах, так и в герметично закрывающихся газонепроницаемых полиэтиленовых пакетах, в которых происходит химическая реакция и куль тивирование посевов.
Каталитическая газогенерирующая система для создания анаэробной атмосферы - «Анаэропак Н2+СО2» Принцип функционирования систем, предназначенных для культиви рования анаэробных микроорганизмов, сводится к поглощению кислорода и обогащению атмосферы углекислым газом, который, в зависимости от вида бактерий, является или незаменимым, или стимулирующим их рост компо нентом. При создании анаэробной атмосферы использован двухступенчатый подход. В результате взаимодействия борогидрида натрия и борной кислоты происходит выделение водорода, который в последствии в присутствии пал ладиевого катализатора окисляется кислородом воздуха, что сопровождается образованием воды. Одновременно с генерированием водорода выделяется углекислый газ в результате обменного взаимодействия гидрокарбоната на трия и лимонной кислоты. Система для создания анаэробной атмосферы «Анаэропак H2+CO2» представляет собой комплект, состоящий из газогене рирующего пакета, катализатора низкотемпературного окисления водорода и индикаторной тест-полоски. На рис. 4 представлена кинетика процессов свя зывания кислорода и выделения углекислого газа, происходящих при ис Концентрация газа, об.% 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Время, мин пользовании каталитической газогенерирующей системы.
Рис. 4 Кинетические кривые поглощения кислорода (1) и выделения углеки слого газа (2) каталитической газогенерирующей системы для создания ана эробной атмосферы - «Анаэропак H2+CO2» Сравнительный анализ, разработанной каталитической газогенери рующей системы и аналогичных фирменных Gas Pak (BBL) систем в рабочих условиях с использованием контрольных штаммов строгих анаэробов, позво лил констатировать отсутствие достоверных различий между показателями количества выросших колоний при использовании как опытных, так и кон трольных систем.
Бескатализаторная газогенерирующая система для создания анаэробной атмосферы Действие современных бескатализаторных газогенерирующих систем для культивирования строгих анаэробных микроорганизмов основано на окислении аскорбиновой кислоты или аскорбата натрия. Образующаяся при этом щавелевая кислота взаимодействует с гидрокарбонатом (карбонатом) натрия с выделением углекислого газа. На рис. 5 представлена кинетика про цессов связывания кислорода и выделения углекислого газа, происходящих при использовании бескатализаторной газогенерирующей системы.
При оценке количества выросших бактерий в опытных и контрольных системах («Анаэропак H2+CO2») достоверности различий сравниваемых по казателей не было установлено (Р0,05).
Концентрация газа, об.% 0 100 200 300 400 500 Время, мин Рис. 5 Кинетические кривые поглощения кислорода (1) и выделения углеки слого газа (2) бескатализаторной газогенерирующей системы для создания анаэробной атмосферы ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Доказано наличие инфекций, обусловленных C. difficile, на территории Республики Беларусь с характерными для них закономерностями. При бакте риологическом обследовании лиц, имеющих клиническую симптоматику ти пичную для C. difficile-ассоциированных инфекций и ее связь с предшест вующей антибактериальной терапией, частота выделения этого патогена со ставила 19,5±4,5% [2, 3].
2. Контаминация спорами C. difficile объектов внешней среды клинических больниц г. Минска указывает на наличие в стационарах пациентов с заболе ваниями, ассоциированными с данным микроорганизмом. Высокий риск раз вития вышеуказанных инфекций вероятен для отделений интенсивной тера пии и реанимации, во внешней среде которых наиболее часто обнаруживали C. difficile (5,7±0,9%). Потенциальными факторами передачи этого патогена в стационарах могут являться следующие объекты: подкладные судна (22,1±4,7%), пол (3,1±1,4%), стены (1,7±0,8%), тумбочки (2,0±1,1%), умы вальники (2,2±1,0%), другие санитарно-технические устройства (3,1±1,8%), уборочный инвентарь (1,7±0,8%) и др. [4, 5, 10, 11].
3. Абсолютное большинство изолятов, полученных от больных и с объектов внешней среды, относятся к токсигенным представителям вида C. difficile, что подтверждено как на молекулярно-биологическом уровне, так и феноти пическими проявлениями генотипа в цитотоксическом тесте в культуре кле ток. В локусе патогенности изолятов, кроме основных генов - tcdА и tcdВ, обнаружены три дополнительных гена - tcdC, tcdD, tcdE, участвующие в его формировании. Супернатанты C. difficile характеризовались цитотоксической активностью в отношении культуры клеток с типичным для данного микро организма ЦПД, в виде эффекта округления клеток. По уровню токсинопро дукции изоляты были однородны, и указанный показатель находился в пре делах от 103 до 104 ЦТЕ в 1 мл, что в сравнительном аспекте с референтным высокотоксигенным штаммом C. difficile VPI 10463 (106 ЦТЕ50 в 1 мл) может быть оценено как средний уровень токсинопродукции [5, 6, 8, 11].
4. Популяция C. difficile, циркулирующая на территории республики, харак теризуется гетерогенностью генетической структуры. Среди изученных изо лятов выявлено семь геногрупп микроорганизмов с доминированием I и IV генотипов, на долю которых суммарно приходилось 78,7%. Отсутствовала четкая связь определенного генотипа с профилем отделения, клиникой или формой патологического процесса. Вместе с тем, выявлены определенные генотипы бактерий, выделяющиеся только от пациентов (III) или только с объектов больничной среды (IV, V, VI, VII) [8, 11].
5. Продуцируемый C. difficile токсинокомплекс характеризуется высокой ле тальной, цитотоксической и иммуногенной активностью. При использовании его в качестве антигена получены кроличьи иммунные антисыворотки и мы шиные иммунные асцитические жидкости, обладающие специфической в от ношении токсинокомплекса активностью. Данные иммунобиологические препараты могут явиться основой для создания отечественных диагностиче ских тест-систем [1].
6. Разработаны отечественные каталитическая («Анаэропак Н2+СО2») и бес катализаторная газогенерирующие системы, предназначенные для создания анаэробной атмосферы в анаэростате и в рабочих герметично закрывающих ся полиэтиленовых пакетах, которые соответствуют предъявляемым для та ких устройств требованиям, сопоставимы с лучшими зарубежными аналога ми и могут использоваться для культивирования и изучения свойств строгих анаэробных микроорганизмов в бактериологических лабораториях [7, 9].
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Андросик Н. Н., Лысенко А. П., Финогенов А. Ю., Титов Л. П., Лебедко ва Н. В. Метод получения диагностической антитоксической сыворотки к токсину А Clostridium difficile // Вести Нац. АН Беларуси: Серия аграр ных наук.- 2002.- № 4.- С. 53-57.
2. Андросик Н. Н., Титов Л. П., Финогенов А. Ю., Лебедкова Н. В. Случаи Clostridium difficile-ассоциированных колитов у собак // Материалы ме ждунар. конф. «Роль антропогенных и природных патогенов в формиро вании инфекционных и неинфекционных болезней человека», Минск, 8 9 окт. 2002 г.- Минск, 2002.- С. 463-464.
3. Лебедкова Н. В., Титов Л. П., Счесленок Е. П., Григорович И. И., Корот кина В. Ф., Рогачева Т. А. Частота выделения и определение токсигенно сти C. difficile у больных с дисфункциями желудочно-кишечного тракта // Актуальные вопросы инфекционных болезней: Сб. тр. 2-ой науч. практ. конф., посвящ. памяти П. Л. Новикова.- Минск, 2001.- С. 54-58.
4. Лебедкова Н. В., Титов Л. П., Счесленок Е. П., Шабанов А. Г., Григоро вич И. И. Выделение C. difficile из объектов внешней среды отделений интенсивной терапии и реанимации клиник г. Минска // Актуальные во просы детской онкологии и гематологии: Материалы VIII междунар.
симпоз.- Минск, 2000.- С. 70-71.
5. Лебедкова Н. В., Титов Л. П., Шабанов А. Г., Григорович И. И., Сильва Д., Танг Я. Молекулярно-биологическая идентификация Clostridium difficile, выделенных из объектов больничной среды // Здра воохранение.-2000.- № 2.- С. 25-27.
6. Счесленок Е. П., Лебедкова Н. В., Григорович И. И., Маринич Л. И., Титов Л. П. Разработка и апробация диагностической тест-системы для идентификации токсигенных штаммов C. difficile с использованием по лимеразной цепной реакции // Достижения медицинской науки в Белару си: Рец. науч.-практ. ежегодник.- Минск, 2000.- Вып. 5.- С. 102-103.
7. Титов Л. П., Лебедкова Н. В., Морозова О. М., Лесникович А. И., Во робьева С.А., Левчук С. М., Доронин В. С., Бордович Е. В., Тихомирова Н. А. Газогенерирующие системы для культивирования анаэробных, микроаэрофильных, капнофильных микроорганизмов // Материалы II науч.-практ. конф. по итогам выполнения ГНТП «Инфекционные болез ни» 1998-2000 гг., Минск, 18 янв. 2001 г.- Минск: ФилСерв плюс, 2001. С. 236-252.
8. Титов Л. П., Лебедкова Н. В., Шабанов А. Г., Григорович И. И., Танг Я., Сильва Д., Кохен С. Генотипическая характеристика госпитального па тогена - Clostridium difficile // Инфекция и иммунитет: Материалы Респ.
науч.-практ. конф., посвящ. 75 летию БелНИИЭМ, Минск, 9-10дек. г.- Минск, 1999.- С. 233-239.
9. Титов Л. П., Лесникович А. И., Воробьева С. А., Лебедкова Н. В., Му шинский В. В., Гарбаренко В. В. Газогенерирующая система для ана эробного культивирования микроорганизмов в анаэростате // Современ ные проблемы инфекционной патологии человека: Ст. и тез. докл. I итог.
науч.-практ. конф., Минск, 8-9 апр. 1998 г.- Минск, 1998.- С. 470-474.
10. Titov L., Gorbunov V., Lebedkova N., Blyha K. Hospital strains antibiotics resistance monitoring system in the Republic of Belarus // 10th European Con gress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: Abstracts book. Stockholm, Sweden, 28-31 May.- Stockholm, 2000.- Vol. 6, Suppl. 1.- P. 132.
11. Titov L., Lebedkova N., Shabanov A., Tang Y. J., Cohen S. H., Silva J. Isola tion and molecular characterization of Clostridium difficile strains from pa tients and the hospital environment in Belarus // J. Clin. Microbiol.- 2000. Vol. 38, № 3.- P. 1200-1202.
Считаю своим долгом выразить искреннюю благодарность научному руководите лю чл.-корр. НАНБ, профессору, д.м.н. Л. П. Титову за руководство, поддержку и помощь при выполнении диссертационной работы;
к.м.н. А. С. Петкевичу;
к.м.н. Г. В. Владыке;
профессору Д. Сильве;
к.б.н. А. Г. Шабанову;
к.б.н. Е. П. Счесленок;
И. И. Григоровичу;
к.м.н. О. Т. Андреевой;
В. Ф. Короткиной;
к.х.н. С. А. Воробьевой;
к.в.н. А. Ю. Финогено ву;
профессору, д.в.н. А. П. Лысенко;
к.б.н. Т. И. Самойловой;
д.м.н. А. С. Владыко;
Л. А. Хватовой;
д.м.н. Н. Н. Полещуку;
к.б.н. З. Б. Квачевой;
Т. А. Абловой;
В. С. Дорони ну;
А. М. Марейко;
Н. И. Точко за помощь в выполнении отдельных разделов работы;
всем сотрудникам лаборатории клинической и экспериментальной микробиологии за по мощь в повседневной работе;
сотрудникам бактериологических лабораторий Минской го родской инфекционной клинической больницы, Детской инфекционной клинической больницы, 1 Городской клинической больницы, Городского и Дорожного Центров гигие ны и эпидемиологии, Главного управления лабораторно-профилактических и санаторно курортных учреждений г. Минска за оказанное содействие в сборе лабораторного мате риала.
РЭЗЮМЭ Лебядкова Наталля Валер’еўна БІЯЛАГІЧНАЯ ХАРАКТАРЫСТЫКА ІЗАЛЯТАЎ СLOSTRIDIUM DIFFICILE І РАСПРАЦОЎКА СІСТЭМ ДЛЯ КУЛЬТЫВІРАВАННЯ СТРОГІХ АНАЭРОБАЎ Ключавыя словы: Clostridium difficile, таксіны, таксігеннасць, біялагічныя ўласцівасці, генатып, антытаксічныя сывараткі, газагенеруючыя сістэмы.
Аб’ект і прадмет даследвання: пацыенты, абследаваныя з мэтай выдзялення C. difficile;
аб’екты навакольнага асяроддзя ў аддзяленнях рознага профілю клінічных бальніц г. Мінска;
ізаляты C. difficile;
лабараторныя жывёлы.
Мэта даследвання: распрацоўка метадалогіі правядзення мікрабіялагічнай дыягностыкі і маніторынгу анаэробных інфекцый, абумоўленых C. difficile ў Рэспубліцы Беларусь.
Метады: мікрабіялагічны, малекулярна-біялагічны, сералагічны, біялагічны, фізіка-хімічны, статыстычны.
Вынікі: атрыманы як непасрэдныя, (ізаляцыя C. difficile ад пацыентаў), так і ўскосныя (выяўленне гэтага мікраарганізма на аб’ектах навакольнага асяроддзя клінічных бальніц г. Мінска) доказы наяўнасці C. difficile асацыіраваных інфекцый ў Рэспубліцы Беларусь. Больш высокая рызыка іх развіцця магчыма ў аддзяленнях інтэнсіўнай тэрапіі і рэанімацыі, у навакольным асяроддзі якіх найбольш часта выяўлялі гэты патаген.
Вывучана таксігеннасть ізалятаў як на геномным (локус патагеннасці), так і на фенатыпічным узроўнях з колькасным вызначэннем таксінапрадукцыі ў культуры клетак. Ізаляты C. difficile дэманстравалі тыповыя для гэтага віда мікраарганізма марфалагічныя, культуральныя, цытатаксічныя, малекулярна біялагічныя ўласцівасці. Выяўлена, што папуляцыя C. difficile, якая цыркулявала на тэрыторыі рэспублікі, характэрызуецца пэўнай генетычнай структурай. Вызначана сем генагруп мікраарганізмаў з перавагай у структуры I і IV генатыпаў. Атрыманы іммунныя біялагічныя вадкасці да галоўнага фактару патагеннасці C. difficile – таксінакомплексу. Распрацаваны айчынныя каталітычная і безкаталізатарная газагенеруючыя сістэмы, прызначаныя для стварэння анаэробной атмасферы ў анаэрастате і ў поліэтыленавых пакетах.
Вобласць выкарыстання: мікрабіялогія, інфекцыйныя хваробы.
РЕЗЮМЕ Лебедкова Наталия Валерьевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ СLOSTRIDIUM DIFFICILE И РАЗРАБОТКА СИСТЕМ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СТРОГИХ АНАЭРОБОВ Ключевые слова: Clostridium difficile, токсины, токсигенность, биоло гические свойства, генотип, антитоксические сыворотки, газогенерирующие системы.
Объект и предмет исследования: пациенты, подвергшиеся обследо ванию с целью выделения C. difficile;
объекты внешней среды в отделениях различного профиля клинических больниц г. Минска;
изоляты C. difficile;
ла бораторные животные.
Цель исследования: разработать методологию проведения микробио логической диагностики и мониторинга анаэробных инфекций, обусловлен ных C. difficile в Республике Беларусь.
Методы: микробиологический, молекулярно-биологический, сероло гический, биологический, физико-химический, статистический.
Результаты: получены как прямые (изоляция C. difficile от пациен тов), так и косвенные (обнаружение данного микроорганизма на объектах внешней среды клинических больниц г. Минска) доказательства наличия C. difficile-ассоциированных инфекций в Республике Беларусь. Более высо кий риск их развития вероятен в отделениях интенсивной терапии и реани мации, во внешней среде которых наиболее часто обнаруживали этот пато ген. Изучена токсигенность изолятов как на геномном (локус патогенности), так и на фенотипическом уровнях с количественным определением токсино продукции в культуре клеток. Изоляты C. difficile проявляли типичные для данного вида микроорганизма морфологические, культуральные, цитотокси ческие, молекулярно-биологические свойства. Установлено, что популяция C. difficile, циркулирующая на территории республики, характеризуется гете рогенной генетической структурой. Выявлено семь геногрупп микроорга низмов с преобладанием в структуре I и IV генотипов. Получены иммунные биологические жидкости к главному фактору патогенности C. difficile – ток синокомплексу. Разработаны отечественные каталитическая и бескатализа торная газогенерирующие системы, предназначенные для создания анаэроб ной атмосферы в анаэростате и в рабочих полиэтиленовых пакетах.
Область применения: микробиология, инфекционные болезни.
SUMMARY Natalia V. Lebedkova BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF CLOSTRIDIUM DIFFICILE ISOLATES AND DEVELOPMENT SYSTEM FOR CULTIVATION OF STRICT ANAEROBES Key words: Clostridium difficile, toxins, toxigenicity, biological properties, genotype, antitoxic serum, gas-generating systems.
Object and subject of research: the patients, objects of environment of clinical hospitals of Minsk, isolates of C. difficile, laboratory animals.
The purpose of research: to elaborate of methodical approaches to the microbiological diagnostics and monitoring anaerobic the infections caused C. dif ficile in the Republic of Belarus.
Methods: microbiological, molecular-biological, serological, biological, physical and chemical, statistical.
Results: it was obtained both direct (isolation of C. difficile from patients) and indirect (detection of this microorganism on objects of hospitals environment) proves of the C. difficile-associated infections presence in Belarus. Higher risk of their reproduction is probable in intensive care units, where this pathogen was found most frequently in environment. The isolates toxigenicity has been investi gated on the genomic level (pathogenicity locus) as well as on the phenotypic one with detection of toxin production in cell culture. C. difficile isolates had typical for this microorganism morphological, cultural, cytotoxic, molecular-biological properties. It was established that C. difficile population, circulating on the territory of the republic had geterogenic genetic structure. There have been revealed seven genotypes of microorganisms with the prevalence of I and IV genotypes within the structure. Immune biological fluids to the main factor of pathogenicity of C. diffi cile, toxinocomplex, have been obtained. The gas-generating systems for anaerobic atmosphere creation in anaerobic jar and anaerobic bags have been developed.
Application area: microbiology, infectious diseases.