Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента
На правах рукописи
Гришин Дмитрий Викторович Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента Специальность: 03.00.23 – «Биотехнология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва-2009
Работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) Федерального агентства по образованию РФ, на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология».
Научный консультант: - Никитин Александр Викторович, доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты: - Миронов Александр Сергеевич, доктор биологических наук, профессор -Бибикова Маргарита Васильевна, доктор биологических наук, профессор Государственное научное учреждение
Ведущая организация:
«Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии РАСХН»
Защита состоится «_» _2009 г. в_часов на заседании объединённого диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им.Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., д.9, ауд. 443.
С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.
Автореферат разослан «_» 2009г.
Учёный секретарь диссертационного совета ДМ 212.204. кандидат технических наук Шакир И.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Фермент лактаза (-галактозидаза), расщепляющий лактозу молока имеет особое значение в раннем детстве, так как дисахарид лактоза, содержащийся в молоке является основным источником галактозы, которая участвует в синтезе галактоцереброзидов, необходимых для нормального развития ЦНС и сетчатки глаза. Уменьшение количества лактозы и производных её гидролиза может послужить развитию синдрома мальабсорбции (СМА), который выражается, в частности, в недостаточности лактазы и в сопряжённом с этим состоянием лактозонепереносимости [Ладодо К.С., 2000]. Наиболее эффективным способом профилактики и лечения СМА, является промышленное создание безлактозных продуктов, либо приём ферментных препаратов (мезофильная галактозидаза), расщепляющих лактозу.
Получение безлактозных молочных продуктов до сих пор остаётся достаточно трудоёмким процессом, базирующимся на длительном осаждении белка обезжиренного молока, растворении осажденного белка в щелочи или растворах щелочных солей и последующей распылительной сушке, после которой экстракцией специально подобранными растворителями удаляют собственно лактозу.
Получение ферментных препаратов для гидролиза -галактозидов также сводится к трудоёмкой химической очистке фермента, приводящей к его инактивации. Кроме того для использования в пищевой промышленности и медицине фермент должен нормироваться посодержанию ряда веществ, используемых для иммобилизации и элюции. Также, использование мезофильных ферментов, ограничено в тех случаях, когда производственный процесс необходимо проводить при повышенной температуре (выше 60оС).
Принципиально новым подходом к получению препаратов -галактозидаз с улучшенными характеристиками является биотехнологический приём, называемый fusion – технологией или технологией слитных (химерных) конструкций, когда в одной рамке трансляции объединяются генные последовательности разных белков [Miller, R. C., Kilburn, D. G. et al., 1989;
Gurvits, I. D., Velikodvorskaya G. А. et al., 2007]. Использование подобной технологии позволило создать фермент, обладающий улучшенными свойствами: повышенной термостабильностью и способностью к самостоятельному аффинному связыванию с биологически совместимыми субстратами, такими как декстран [Cavataio F. et al., 2005].
Положения, выносимые на защиту. 1. Рекомбинантная белковая конструкция ДСД-сп--ГАЛ содержащая декстрансвязывающий домен и каталитическую последовательность фермента термостабильной -галактозидазы и её штамм-продуцент. 2. Разработка методов очистки рекомбинантных белков, основанная на сочетании использования термостабильности целевого продукта и его декстрансвязывающих свойств. 3. Созданный плазмидный вектор с регуляторными областями и геном химерного белка ДСД-сп--ГАЛ. 4. Декстран белковый комплекс на основе белка ДСД-сп--ГАЛ и декстранового сорбента для гидролиза бета-галактазидов.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось создание гибридной (химерной) рекомбинантной белковой конструкции ДСД-сп--ГАЛ, имеющей декстрансвязывающий домен и активность термостабильной бета галактозидазы, её штамма-продуцента и исследование физико-химических свойств данного белка.
В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие основные задачи:
1. Получение мутантного гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С-конце.
2. Создание генной последовательности химерного белка ДСД-сп--ГАЛ.
с геном ДСД и геном термостабильной - галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus, объединёнными через спейсер.
3. Создание бактериального штамма-продуцента обеспечивающего эффективную экспрессию химерного рекомбинантного белка ДСД-сп- ГАЛ.
4. Изучение физико-химических свойств белковой конструкции ДСД-сп- ГАЛ.
5. Изучение ферментативной активности белка ДСД-сп--ГАЛ.
6. Оптимизация условий получения комплекса декстрана и белка ДСД-сп- ГАЛ. для гидролиза бета-галактозидов.
Научная новизна. На базе концепции слитных генно-инженерных конструкций впервые был спланирован и сконструирован рекомбинантный плазмидный вектор pGD-10, позволяющий осуществлять индуцированный биосинтез гибридного белка ДСД-сп--ГАЛ, обладающего одновременно декстрансвязывающими свойствами и активностью фермента термостабильной галактозидазы.
Впервые были получены бактериальные продуценты конструкции ДСД-сп- ГАЛ E.coli[pGD-10], обеспечивающие экспрессию целевого белка на уровне 10% от тотального белка клеток.
Впервые была предложена высокоэффективная схема выделения, очистки и иммобилизации рекомбинантного белка ДСД-сп--ГАЛ на декстрановом сорбенте, основанная на уникальных свойствах декстрансвязывающего домена и позволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 90%.
Практическое значение работы. Разработанная схема получения штамма продуцента химерного белка ДСД-сп--ГАЛ, а также способ очистки и иммобилизации данного белка на декстрановых сорбентах могут найти применение в медицине, в качестве компонентной базы при создании комплексных препаратов для профилактики синдрома мальабсорбции. Также комплекс данной белковой конструкции с декстраном может быть использован в пищевой промышленности при реализации схем получения безлактозных продуктов.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 14 октября 2009г.
на заседании кафедры ЭиПБ МГУИЭ. Основные результаты исследований были представлены на XII Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 7– сентября 2009, С 17., на VI Молодёжной науч. конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 5 апреля 2006 г. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, отражающих основное содержание работы.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 125 страницах;
содержит 28 рисунков и 5 таблиц;
состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждений, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 110 наименований и приложений.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Создание бактериальных штаммов продуцентов белка ДСД-сп- -ГАЛ 1.1. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего клонирование гена и экспрессию белка LacZThEh Одним из наиболее значимых ферментов в группе гликозилгидролаз является термостабильная - галактозидаза из Thermoanaerobacter ethanolicus, кодируемая геном LacZThEh (-ГАЛ). Данный фермент способен продолжительно действовать при высоких температурах (65-80оС) и в широком диапазоне рН 5,0-7, [Volkov I. Yu. et al., 2005]. Поэтому ген этого белка был выбран в качестве одного из объектов наших исследований. Биоинформационные последовательности галактозидазы аннотированы в банке данных UniProt под номером Y08557. Т.к.
плазмида pQELacZThEh (pR624, любезно предоставлена сотрудниками.
лаборатории МДиГК ВНИИСБ Сергиенко О.В. и Анисимовой С.В.) с геном галактозидазы Thermoanaerobacter ethanolicus ранее уже была получена на базе коммерческого вектора серии pQE, то нашей задачей, на данном этапе, явилось создание продуцента способного обеспечить эффективность клонирования и экспрессии гена данного белка в клетках E. coli.
Плазмида pQELacZThEh была трансформирована в клетки E. coli DH методом электропорации. Была изучена экспрессия генов белка - галактозидазы штамма E. coli DH5 (pQELacZThEh), что являлось одним из важнейших условий предстоящей генно-инженерной работы. Индукция экспрессии гена проводилась по стандартному протоколу фирмы Quagene. Однако изучение экспрессии с помощью электрофореза в 12% ПААГ по Лэммли показало отсутствие белковых полос ожидаемого молекулярного веса. На основе анализа данных литературы, был сделан вывод о том, что эффективность гетерологичной экспрессии гена белка LacZThEh в E. coli оказалась более успешной при включении в состав среды LB, на время индукции 10мМ СаCl2, 10mM MnCl2, увеличении доли индуктора ИПТГ с 0, до 0,5 мМ, а также при изменении времени индукции с 3 ч (при 37оС) до 15 ч (при комнатной температуре). В результате проделанной работы, нам удалось получить эффективный продуцент позволяющий выделить в препаративных количествах методом щелочного лизиса плазмидную ДНК, с геном термостабильной галактозидазы, а также обеспечивающий экспрессию белка LacZThEh (-ГАЛ) на уровне 10 -15% от тотального белка штамма.
1.2. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию белка DBD(Gly-Ser) 1.2.1. Получение и клонирование гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides ДСД (DBD – dextran binding domain) или декстрансвязывающий домен относится к группе карбогидратсвязывающих модулей (КСМ) это часть комплекса гидролитических внеклеточных ферментов ряда бактерий. В данном случае особый интерес представляет каталитический домен декстрансахаразы из Leuconostoc mesenteroides. Этот белковый домен интересен своей способностью специфически связываться с различными формами декстрана. Известно, что бактерии рода Leuconostoc (Leuconostoc lactis, Leuconostoc dextranicum и Leuconostoc mesenteroides) используются в пищевой промышленности в качестве заквасочных культур при производстве молочнокислых продуктов и квашеной капусты, поэтому в качестве источников микроорганизмов рода Leuconostoc могут служить различные пищевые продукты молочнокислого брожения.
Образцы квашеной капусты и простокваши суспендировались в жидкой селективной питательной среде (сахароза 100г/л;
дрожжевой экстракт 2,5 г/л;
K2HPO4 5 г/л;
(NH4)2SO4 0,2 г/л;
MgSO4x7H2O 0,2 г/л;
NaCl 1,0 г/л.) в которую засевались порции соответствующего образца. Далее, после 18 ч. инкубации (26оС, 150 об/мин), аликвоты из выращиваемого объёма переносились на 2% агаризованную питательную среду того же состава и инкубировались в течение ч. при 26оС [Dimic G. R., 2006]. Целевые колонии, образованные бактериями рода Leuconostoc имели вид слизистых опалесцирующих капель. После скрининга, изолированные клоны выращивались в жидкой селективной среде, для последующего выделения хромосомной ДНК методом. Ген декстрансвязывающего домена был получен благодаря ПЦР, с помощью прямого и обратного праймеров (искусственно введённые сайты рестриктаз подчёркнуты), фланкирующих генную последовательность ДСД, при этом в качестве ДНК матрицы использовалась хромосомная ДНК Leuconostoc mesenteroides, выделенная методом фенол хлороформной экстракции. В работе использовались олигонуклеотиды, синтезированные в ЗАО «Синтол» и ЗАО «Евроген»:
GBD11F CCACCGCCATGGATGGGATCCACAAATCAGTATTATCAATTAGCAGATGGTAAA NcoI BamHI RevGBD AGACTAAGATCTGGCTGACACAGCATTTCCATTATTATCAAA BglII Для клонирования продукт амплификации встраивался в коммерческий вектор pQE6 (Quageen, USA), методом лигирования полученных рестрикционных фрагментов по сайтам рестрикции NcoI, BglII/BamHI. Затем полученная плазмидная ДНК (pQEDBD) (Рис. 1.) выделялась из трансформантов методом щелочного лизиса, после чего нуклеотидная последовательность целевого гена была подтверждена с помощью рестрикционного анализа и секвенирования на автоматическом секвенаторе.
Promoter SD Mat. Peptide Terminator Рис. 1. - Организация генно-инженерной конструкции с геном ДСД (DBD) в плазмиде pQEDBD.
1.2.2. Получение экспрессионной плазмиды pQEDBDsp с геном ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С-конце.
1.2.2.1. Получение гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С конце и создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка DBD(Gly Ser)5.
Декстрансвязывающий домен, используемый в наших исследованиях должен быть пространственно удалён от бета-галактозидазы, что требует наличия ряда отличий от ДСД, аннотированного во Всемирном генбанке. Прежде всего, отличие заключается в необходимости присутствия на С-конце аминокислотной последовательности белка глицин-серинового спейсера (Gly-Ser)5, который необходим для пространственного разделения различных функциональных доменов. Создание гена DBD(Gly-Ser)5 или иначе ДСД-сп, кодирующего белок ДСД и глицин-сериновый спейсер (сп), осуществлялось в два этапа методом «праймеропосредованной прогулки», при этом происходило постепенное наращивание С-концевой спейсерной последовательности для чего были спланированы следующие корректирующие праймеры:
GBD11F CCACCGCCATGGATGGGATCCACAAATCAGTATTATCAATTAGCAGATGGTAAA NcoI BamHI RevDBD-1: 5’-GGAGCCAGAACCCGGGGATCTTGCTGACAC-3’ RevDBD-2: 5’-AACTAAGCTTAGATCTGGCGCCAGAACCGGAACCAGAGCCGGAGCCAGAACC-3’ HindIII BglII На первом этапе «праймеропосредованной прогулки» использовались праймеры GBD11F и RevDBD-1, на втором - GBD11F и RevDBD-2, последний спланирован внахлёст с RevDBD-1. В качестве матрицы для проведения ПЦР использовали плазмидную ДНК pQEDBD в концентрации 0,3 мг/мл.
Promoter SD Mat. Peptide Spacer Terminator Рис. 2. - Организация генно-инженерной конструкции pQEDBDsp.
Далее, по сайтам рестрикции NcoI и HindIII скорректированный ген ДСД, был интегрирован в бактериальный вектор pQE6 (Quageen, USA), в процессе чего была сконструирована экспрессионная плазмида pQEDBDsp (Рис. 2.). В результате манипуляций был получен плазмидный вектор содержащий скорректированный ген ДСД с С-концевым спейсером.Идентичность клонированного в составе вектора pQEDBDsp гена ДСД-сп (размер гена 500 п.н.) была подтверждена с помощью ПЦР (рис. 3), посредством использовавшихся ранее прямого (GBD11F) и обратного праймеров (Revgal), при тех же параметрах ПЦР.
Рис. 3. - Электрофорез ПЦР продуктов в 1% агарозном геле.
1.Отрицательный контроль (MQ, Taq полимераза ед.ак);
2.Отрицательный контроль (pQE6, Taq полимераза 5ед.ак);
3. ПЦР продукт гена белка ДСД сп, проба №1 (500 п.н.);
4. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп, проба №2 (500 п.н.);
5. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп, проба №3 (500 п.н.);
6. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп, проба №4 (500 п.н.);
7. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп, проба №5 (500 п.н.);
8.
Маркер мол. веса (100 b.p.).
1.2.3. Создание бактериальных продуцентов белка DBD(Gly-Ser)5.
Плазмида pQEDBD(Gly-Ser)5 (или pQEDBDsp) была трансформирована в клетки E. coli DH5a методом электропорации. Была проверена возможная экспрессия генов химерного белка в штамме E. coli DH5a. с помощью ИПТГ.
Анализ экспрессии на основании электрофореза в 17% ПААГ по Лэммли показал присутствие белковых полос ожидаемого молекулярного веса 16 кДа с уровенем экспрессии 25-30% от тотального белка клетки (Рис. 4.).
Рис. 4. - Анализ экспрессии белкa ДСД-сп в клетках E. coli DH5a. (электрофорез в 12% ПААГ по Леммли).
1) Маркер молекулярного веса, лизоцим 14 кДа, 2) E.
coli DH5a. [pQEDBDsp], образец№1, индукция - 16,0 кДа, 3) E. coli DH5a. [pQEDBDsp], образец№2, индукция - 16, кДа, 4) E. coli DH5a. [pQEDBDsp], образец№1, до индукции, 5) E. coli DH5a [pQEDBDsp], образец№2, до индукции.
1.3. Создание бактериального штамма-продуцента обеспечивающего экспрессию химерного белка ДСД-сп--ГАЛ в цитоплазме клеток E. coli.
1. 3. 1. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка ДСД-сп- ГАЛ.
Для создания экспрессионной плазмиды pQEDBDspLacZThEh (далее pGD10) с геном целевого химерного белка ДСД-сп--ГАЛ было осуществлено лигирование плазмидной конструкции с геном термостабильной бета-галактозидазы pQELacZThEh гидролизованной эндонуклеазами рестрикции BamHI/BglI и плазмидного вектора с геном ДСД со спейсером pQEDBDsp, гидролизованной рестриктазами BglII/BglI. Процессы дальнейшего лигирования, молекулярного субклонирования в E.coli DH5a и выделения плазмидной ДНК проводились по стандартным методикам [Маниатис Т. и др., 1984].
Идентичность клонированного в составе вектора pGD-10 гена ДСД-сп- ГАЛ размером 2683 п.н. была подтверждена с помощью рестрикционного скрининга, секвенирования на автоматическом секвенаторе MegaBace (Amersham Bioscience corp., CША) (ЗАО Евроген), а также посредством полимеразно-цепной реакции, в присутствии прямого (GBD11F) и обратного праймеров (Revgal):
GBD11F 5’ CCACCGCCATGGATGGGATCCACAAATCAGTATTATCAATTAGCAGATGGTAAA 3’ Revgal: 5’ GAGAAGACGAAAGGGCCTATAACGCCTATTTTTATAGGTTAAAATG 3’ Рис. 5. - Электрофорез ПЦР продуктов в 1% агарозном геле.
1. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп- ГАЛ, проба №1 (2683 п.н.);
2.
Отрицательный контроль (pQE6, Taq полимераза);
3. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп--ГАЛ, проба №2 (2683 п.н.);
4.
Отрицательный контроль (pQE6, Taq полимераза);
5. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп--ГАЛ, проба №3 (2683 п.н.);
6.
Отрицательный контроль (pQE6, Taq полимераза);
7. Маркер мол. веса (фаг лямбда EcoRI/HindIII).
Параметры амплификации: 95оС – 5 мин;
(94оС – 20с, 67 оС - 30с, 72оС – 2,5мин.)x30;
72оС – 5мин;
10оС – хранение. Режим амплификации – точный.
Продукты амплификации детектировались в 1% агарозном геле (Рис.5). Таким образом была получена экспрессионная конструкция с геном целевого химерного белка (Рис. 6.).
Promoter SD DBD Spacer LacZThEh Terminator Рис. 6. - Организация генно-инженерной конструкции pGD10.
1.3.2. Создание бактериальных продуцентов гена белка ДСД-сп--ГАЛ.
Плазмида pGD10 была трансформирована в клетки E. coli DH5a методом электропорации. Была проверена возможная экспрессия генов химерного белка ДСД-сп--ГАЛ с помощью ИПТГ. Анализ экспрессии посредством электрофореза в 12% ПААГ по Лэммли показал присутствие белковых полос ожидаемого молекулярного веса 102,3 кДа, однако, при этом уровень экспрессии был достаточно низок (менее 5% от тотального белка штамма). Известно, что уровень экспрессии многих белков варьирует в различных штаммах E. coli. Также время индукции влияет на количество продуцируемого белка. Очевидно, что проверка возможного повышение уровня экспрессии белка ДСД-сп--ГАЛ с помощью данных подходов просто необходима в рамках данной работы.
1.3.3. Оптимизация условий экспрессии белка ДСД-сп--ГАЛ 1.3.3.1. Оптимизация времени индукции.
Для оптимизации индукции целевого белка в клетках штамма продуцента мы варьировали время индукции (с 2 часов при 37 оС до 15 часов при комнатной температуре). В результате проведенных экспериментов оказалось, что увеличение времени индукции до 15 ч вызывает повышение уровня экспрессии (Рис.7.).
Очевидно, что изменение времени индукции является одним из решающих факторов влияющим на уровень экспрессии целевого белка.
1.3.3.2. Оптимизация количества индуктора.
По данным литературы известно, что хромосомная ДНК клеток Th.
Ethanolicus и L. mesenteroides имеет много сходного с клетками E. coli, по количеству GC пар азотистых оснований. Для клеток E. coli характерным является наличие примерно 60% GC.
Рис. 7. - Электрофорез в 10% ПААГ в присутствии SDS.
1. Штамм DH5a – до индукции, 2. Штамм DH5a [pGD10] – до индукции, 3. Штамм DH5a – индукция, 4. Штамм DH5a [pGD10] – индукция, 5.
Штамм DH5a до индукции;
термолиз (75оС, 45 мин), 6. Штамм DH5a [pGD10] – до индукции;
термолиз (75оС, 45 мин), 7.
Штамм DH5a [pGD10] – индукция;
термолиз (75оС, 45 мин), 8. Штамм DH5a – индукция;
термолиз (75оС, 45 мин), 9.
Маркер мол. веса (Taq полимераза, 94,5кДа).
Таким образом, полученный нами химерный белок имеет оптимальные для E. coli кодоны и трансляция гена данного белка в этих клетках предельно эффективна. Поэтому, кроме времени индукции на этот процесс может значительно повлиять в основном лишь конечная концентрация индуктора. Как и в § 1.1. было показано значительное улучшение продукции белка при увеличении количества индуктора ИПТГ с минимальных конечных значений 0,1мМ до максимальных – 0,5мМ.
1.3.3.3. Оптимизация ионного состава ростовой среды.
Анализ экспериментальных данных из § 1.1., показывает то, что эффективность гетерологичной экспрессии гена белка ДСД-сп--ГАЛ, также должна быть выше в присутствии ионов двухвалентных металлов (Ca2+ и Mn2+), как уже было отмечено ранее это, вероятно, связано с тем, что данные ионы находятся в составе простетических групп фермента, определяя правильный фолдинг (пространственную укладку) конечного белкового продукта.
В соответствие с полученными данными в состав ростовой среды LB, на время индукции включали 10мМ СаCl2, 10mM MnCl2 и 0,5 мМ ИПТГ, а также увеличили время индукции с 3 до 15 ч., при этом была получена экспрессия рекомбинантного белка на оптимальном уровне 10% от тотального белка клетки.
Таким образом, был создан штамм-продуцент белка ДСД-сп--ГАЛ и были оптимизированы условия его экспрессии.
2. Изучение физико-химических свойств белковой конструкции ДСД-сп- ГАЛ.
2.1. Анализ растворимости и термостабильности белка ДСД-сп--ГАЛ в лизатах клеток E. coli штамма DH5a.
Pис. 8. - Анализ растворимости белка ДСД-сп--ГАЛ, экспрессия в E. coli DH5a в 10% ПААГ с SDS.
1. Штамм E. coli DH5a – индукция, без термолизиса, 2. Штамм DH5a [pGD10] – до индукции, без термолизиса, 3.
Штамм DH5a [pGD10] –индукция, без термолизиса, 4. Штамм DH5a [pGD10] – супернатант, индукция, термолизис (75оС, 45 мин), 5. Штамм DH5a [pGD10] – супернатант, до индукции, термолизис (75оС, 45 мин), 6. Штамм DH5a [pGD10] – осадок, до индукции, термолизис (75оС, 45 мин), 7. Штамм DH5a [pGD10] –осадок, индукция, термолизис (75оС, 45 мин), 8. Маркер мол. веса (Taq полимераза, 94,5кДа).
Для анализа физико-химических свойств белка ДСД-сп--ГАЛ была изучена его растворимость в клетках E. coli штамма DH5a (Рис. 8.). Суть метода заключается в изучении распределения целевого белкового продукта между осадком и супернатантом, после термолизиса и последующего осаждения.
Изучение растворимости белка ДСД-сп--ГАЛ в клетках E.coli штамма DH5a показало, что химерный белок синтезируется на 70% в растворимой форме (Рис.8, трек№4).
Поскольку одной из функциональных составляющих полученного белка является аутентичная аминокислотная последовательность термостабильного фермента бета-галактозидазы, поэтому функция термостабильности является доминантной и переходит на химерный белок в целом. Для доказательства этого предположения клеточные осадки подвергали ультразвуковой дезинтеграции и термолизу в течение 45 мин. при 75оС с последующим осаждением в поле центробежных сил, после чего собирали супернатант (растворимая фракция белка).
Т.к. растворимость белка при термолизе составила порядка 70 %, это говорило о его выраженной термостабильности (рис 7;
8).
2. 2. Изучение ферментативной активности белка ДСД-сп--ГАЛ в лизатах клеток E. coli штамма DH5a.
Благодаря термостабильности полученного белка для изучения его свойств не требовалось прибегать к сложным системам очистки. Осадок клеток был заморожен, затем ресуспендирован в рабочем буфере «В» (10 мM Tris-HCl, pH7.4;
MgCl2 10 мM;
ZnCl2 1 мM ;
EDTA 1 мM;
-меркаптоэтанол 1 мM;
0.1% Tween 20;
0.1% (v/v) Triton X100) с лизоцимом в концентрации 1мг/мл, после чего был повторно заморожен при –70oC, что способствовало более полному и мягкому разрушению клеточных структур для освобождения целевого продукта. После данных манипуляций лизат клеток был прогрет в течение 45 мин. при 75оС и после осаждения при центрифугировании в супернатанте присутствовал целевой белок в достаточном количестве для изучения его ферментативной активности. Из литературных источников известно, что наиболее высокую удельную активность после лактозы фермент -галактозидаза проявляет на бесцветном химическом субстрате ОНФГ, который в её присутствии гидролизуется до галактозы и окрашенного в желтый цвет о-нитрофенила, количество которого можно измерить на спектрофотометре по поглощению при 420 нм. Экстраполируя эти данные на полученный химерный белок ДСД-сп--ГАЛ было решено изучить субстратную специфичность и его ферментативную активность на хромогенном гомологе лактозы - ОНФГ. При этом аликвоты супернатанта с нашим белком инкубировались в присутствии ОНФГ (4 мг/мл) в течение 15 мин., 30 мин., 1 ч., ч. при 25, 55 и 75оС, при широком диапазоне рН (4,5 – 9,0). В ходе развития желтого окрашивания реакция прерывается добавлением инактиватора 1M Na2CO3.
В каждой пробирке с соответствующим разведением белка измеряем оптическую плотность при = 420 нм. Измеряемая величина складывается из поглощения о нитрофенола (420нм) и рассеяния света клетками (600нм) [100]. Используя эти данные, можно вычислить истинное поглощение о-нитрофенола, или – в условных единицах – активность фермента в 1мл раствора (), по следующей формуле:
1000 * D (1) t *V * D где D420– измеренные значения для реакционной смеси, D600 отражает плотность клеточной суспензии перед определением, 1000 – из расчёта того, что при полной индукции получается около 1000 ед. активности, t – время реакции в мин. и – объём культуры, взятой для определения, в мл. Эта величина пропорциональна увеличению количества о-нитрофенола в 1 мин. на одну бактериальную клетку [Craven G.R. et al., 1965]. Таким образом, была изучена удельная галактозидазная активность белка ДСД-сп--ГАЛ в динамике, которая составила ед.ак./мкл, при этом было доказано, что максимальная его активность сохранялась в широком диапазоне рН, даже в ходе 2-х часовой инкубации при 75оС.
2.3. Хроматографическое выделение белка ДСД-сп--ГАЛ и изучение его декстрансвязывающих свойств.
Данное исследование являлось чрезвычайно важным этапом работы, т.к. оно позволило не только получить рекомбинантный белок ДСД-сп--ГАЛ в препаративных количествах, но и изучить его декстрансвязывающие свойства. Для планирования стратегии хроматографической очистки белка на ионообменниках был необходим расчёт изоэлектрической точки и изучение аминокислотного состава нашего белка. Изоэлектрическая точка белковой конструкции была определена посредством программы для обработки биоинформационных последовательностей DNASIS v 2.5 Hitachi Software Endgineering Co., Ltd. и находилась в пределах 5,54. Кроме того, данный пакет программ позволил осуществить трансляцию нуклеотидной последовательности, что дало возможность изучить аминокислотный состав полученного белка: положительнозаряженные аминокислоты – Arg (R) – 4%;
His (H) – 3,4%;
Lys (K) – 6,8%;
отрицательнозаряженные аминокислоты – Asp (D) – 7,4%;
Cys (C) – 1,0%;
Glu (E) – 6,8%;
Tyr (Y) – 5,9%.
2.3.1. Катионообменная хроматография Выбор катионообменной хроматографии обусловлен достаточно высоким содержанием в целевом белке положительнозаряженных аминокислотных остатков. Ионообмен проводили на катионообменной смоле СМ-Toyopearl (Tosoh Bioscience LLC). Элюированный градиентом соли (0 М - 1,0 М NaCl в рабочем буфере) белок обессоливали посредством гельфильтрации на полистирольном сорбенте HW50-Toyopearl (Tosoh Bioscience LLC) после чего он был осаждён высаливанием с помощью 3M (NH4)2SO4 с последующим досаждением в поле центробежных сил (10 мин., при 4000 об/мин). После измерения массы полученного белкового осадка его растворяли в конечном буфере Buf.B (рН7,4), до конечной концентрации 1 мг/мл.
2.3.2. Изучение декстрансвязывающих свойств целевого белка.
Рис.9 – Изменение оптической плотности (OD) от времени контакта сорбента с раствором белка.
Сорбционную активность исследуемого белка по отношению к декстрану проводили в статических условиях, для чего сорбент (декстран Sefhadex G75) в количестве 0,5 г смешивали с 5 мл раствора белка в Buf.B, полученного после катионообменной хроматографии (1,0 мг/мл). Сорбент оставляли в контакте с раствором на 0,5-6,0 часа (37оС) при перемешивании. Затем, суспензию помещали в микроколонку (100x10мм), продолжая инкубацию. При этом периодически элюировали самотёком по 1 мл раствора через нижний штуцер микроколонки, проводя определение содержания в пробах остаточного белка методом Бредфорд с использованием калибровочных кривых [Bradford M.M., 1976]. OD растворов изучали методом колориметрии по изменению оптической плотности при длине волны 595 нм. На рис. 9. показана зависимость оптической плотности от времени контакта образца сорбента с раствором белка, на графике видно, что оптическая плотность исследуемых образцов (элюатов) со временем уменьшается, что говорит о способности химерного белка, за счёт наличия в нём декстрансвязывающего домена сорбироваться на декстране.
Рис. 10 – Изотерма адсорбции исследуемого белка.
Оптимальное время адсорбции белка составляет около 4-6 час. Дальнейшее контактирование сорбента с раствором белка не дает существенных изменений оптической плотности.
Адсорбционную емкость сорбентов определяли по формуле:
Сн Ск V А= (2) m где Сн – начальная концентрация белка в растворе, мг/л;
Ск – конечная концентрация белка в растворе, мг/л;
m - навеска сорбента, г;
V - объем раствора белка, л.
Изотерма адсорбции образца белка, рассчитанная исходя из экспериментальных данных показана на рис.10.
Степень связывания белка из раствора определяли по формуле:
Сн Ск 100% = (3) Сн Проведенные исследования показали, что степень связывания белка декстраном составила 62%, что говорило о эффективности аффинного связывания рекомбинантного белка ДСД-сп--ГАЛ с декстраном.
3. Изучение степени очистки белка ДСД-сп--ГАЛ посредством аффинной хроматографии на декстране.
На колонку (100x10мм) с сорбентом (декстран Sefhadex G75) уравновешенную Buf.B наносили 2 мл лизата клеток с белком. Сорбент оставляли в контакте с лизатом на 4,0 часа (37оС). Затем, колонку отмывали от клеточного дебриса тремя объёмами рабочего буфера, аффинно связавшийся на сорбенте белок элюировали с колонки градиентом NaCl 0-3М.
При скорости элюирования 20 см3/ч проводили сбор фракций ( = 250 нм).
Для выявления целевой фракции наносили по 12 мкл каждой на 12% ПААГ в присутствии SDS с окраской по Кумасси. Далее, после объединения фракций с максимальным количеством белка освобождались от NaCl при помощи гельфильтрации. На следующем этапе белок концентрировали высаливанием до концентрации 1мг/мл. На конечном этапе производилось сравнительное исследование степени очистки белка в 10% ПААГ, после катионообменной и аффинной хроматографии (рис.11).
Pис. 11. - Сравнение методов очистки белка, в 12% ПААГ с SDS.
1. Штамм E. coli DH5a – индукция (2мкл), 2. Штамм DH5a [pGD10] – индукция, после хроматографии на CM-Toyopearl, 3.
Штамм DH5a [pGD10] – индукция, после аффинной хроматографии на декстране, 4.
Штамм E. coli DH5a – до индукции (4мкл).
Сравнительное исследование показало высокую константу связывания химерного белка с декстраном в широком диапазоне ионной силы (0-3М NaCl), а также преимущества tag-аффинной хроматографии на декстране над катионообменной, т.к. степень очистки в первом случае составила 90%, что на 20 25% выше, чем после катионообмена.
4. Сравнение зависимости ферментативной активности белков ДСД-сп--ГАЛ и LacZThEh от времени, pH и температуры.
На данном этапе исследования, относительно положительного контроля, в качестве которого выступала термостабильная бета-галактозидаза Thermoanaerobacter ethanolicus (LacZThEh), были получены графические зависимости активности очищенного рекомбинантного фермента ДСД-сп--ГАЛ от таких физических характеристик как температура, время и рН среды (рис.12). При этом, за 100% активности была принята активность бета-галактозидазы LacZThEh, рассчитанная при 15 мин. инкубации её с субстратом ОНФГ.
В опыте были определены зависимости активности ферментов от величины pH, времени и температуры. При этом было установлено, что максимальная активность фермента ДСД-сп--ГАЛ смещена относительно контроля в щелочную область (LacZThEh ) и наблюдается в диапазоне pH 7,0 – 8,0. При этом 70% и более активности сохранялось при рН 6,8- 8,2 (рис.12а.).
Тип графической зависимости активности химерного фермента от его температурного оптимума сходен с таковым у положительного контроля, однако при этом, также наблюдается незначительное смещение линии графика относительно контрольного фермента (LacZThEh).
При этом температурный оптимум полученной нами белковой конструкции незначительно уступал контролю и варьировался в пределах 60 – 750С (рис.12б.). В соответствие с полученными данными, рекомбинантный белок ДСД-сп--ГАЛ, по своей стабильности во времени, имел незначительные преимущества перед контрольным образцом, сохраняя высокие показатели активности после 5-ти часовой инкубации (при оптимальных для него условиях: 65-70оС;
рН 7,4), однако по прошествии этого периода, практически дублировал данные полученные для контроля (рис.12в.).
5. Оптимизация условий получения комплекса декстрана и рекомбинантного белка ДСД-сп--ГАЛ.
Завершающим этапом данной работы явилось создание модельной колоночной системы для ферментации бета-галактозидов, на базе комплекса декстрана и рекомбинантного белка ДСД-сп--ГАЛ.
Pис. 13. - Анализ лактазной активности комплекса декстрана и белка ДСД-сп--ГАЛ, посредством тонкослойной хроматографии.
1. К1 (–) отрицательный контроль 1% лактоза, 2. К (–) отрицательный контроль 6% лактоза, 3. К1 (+) положительный контроль смесь галактозы и глюкозы 1%, 4. К2 (+) положительный контроль смесь галактозы и глюкозы 6%, 5. Опытный образец (лактоза (1%) + декстран-белковый комплекс), 6.
Опытный образец (лактоза (6%) + декстран-белковый комплекс), Использование в составе химерной конструкции ДСД позволяет не только эффективно выделить и очистить белок от примесей штамма продуцента, но и иммобилизовать его на декстране посредством аффинного взаимодействия декстрансвязывающего домена. Принимая в расчёт данные, полученные в исследованиях, проведённых на предыдущих этапах, для исследований была выбрана колонка (100x10мм), которая заполнялась сорбентом (декстран Sefhadex G75) и уравновешивалась Buf.B. На колонку наносили 2 мл раствора белка (1мг/мл), оставляя белок в контакте с сорбентом в течение 4,0 часов (37оС). Затем, колонка отмывалась тремя объёмами рабочего буфера, который полностью удалялся с последующим подсушиванием комплекса в колонке, после чего через колонку с декстран-ферментным комплексом последовательно пропускались растворы 1 и 6% лактозы, (t=60-65оС). Собранные элюаты с продуктами расщепления лактозы оценивались посредством тонкослойной хроматографии (ПТСХ-АФ-А-УФ "Merck") (рис.13). На следующем этапе через расконсервированную колонку, при тех же условиях, были пропущены растворы ОНФГ (0,4мг/мл) и Xgal (1мг/мл). После прохождения через декстран-белковый комплекс, в ходе гидролиза хромогенных субстратов, образовывающийся в случае ОНФГ - 2-нитрофенол, окрашивал элюат и декстран в колонке в насыщенный жёлтый цвет, в то время как накапливающийся в результате гидролиза Xgal - 5,5' дибром-4,4'-дихлор-индиго, придавал декстрану и элюату голубой оттенок.
Пропускание через колонку 50 объёмов раствора лактозы и ОНФГ при скорости элюции 10 см3/ч и температуре 65оС не приводило к значительному снижению эффективности ферментативного гидролиза бета-галактозидов, при этом значения расчётной удельной активности в опытах приближались к первоначальному уровню и в пересчёте на массу фермента в декстран-белковом комплексе соответствовали 3-5 ед/мкг, это следовало из того расчета, что адсорбционная ёмкость, исследованная ранее составляла 6,2 мг белка на 1г сорбента, т.е., учитывая реальный коэффициент гидратации сорбента (15-20 мл/г) - 0,2 – 0,4 мкг белка на мкл водного декстрана. Также в процессе проведённых нами исследований была рассчитана константа Михаэлиса-Ментен фермента в декстран-белковом комплексе, составившая 9,5х10-4. Было установлено, что свободный химерный белок за период десятичасовой инкубации при 65-700С, рН 7,4 и оптимальном ионном составе терял 50% своей активности, в то время как эта же белковая конструкция, но иммобилизованная на декстране утрачивала лишь 5-10% своей удельной активности. Таким образом, суммируя полученные данные тонкослойной хроматографии и хромогенного проточного гидролиза можно говорить о том, что полученный нами рекомбинантный химерный белок ДСД-сп--ГАЛ способен оставаться в стабильном комплексе с декстраном и в течение длительного времени осуществлять гидролиз различных бета-галактозидов.
По результатам настоящей работы нами были поданы две заявки на патент.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 1) Разработан способ получения гибридного белка ДСД-сп--ГАЛ, отличающегося наличием аутентичной последовательности декстрансвязывающего домена, объединённой через глицин-сериновый спейсер с последовательностью термостабильной бета-галактозидазы 2) Сконструирована экспрессионная плазмида pGD-10, кодирующая химерный белок ДСД-сп--ГАЛ.
3) Создан штамм E.coli [pGD-10] - продуцент белка ДСД-сп--ГАЛ.
Оптимизированы условия индукции и синтеза химерной белковой конструкции, вследствие чего был достигнут уровень экспрессии целевого белка 10% от общего белка E. сoli.
4) Определены физико-химические показатели и удельная ферментативная бета-галактозидазная активность гибридного белка ДСД-сп--ГАЛ.
5) Получен комплекс декстрана и белка ДСД-сп--ГАЛ, который может быть использован в качестве компонентной базы для ферментативного гидролиза различных бета-галактозидов в пищевой промышленности и медицине.
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ 1) Гришин Д.В. Характеристика термостабильных гистоноподобных белков из разных биологических источников. В сб. тезисов: VI Молодёжной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», М., Россия, 5 апреля 2006, С 7-9.
2) Гришин Д.В. Разработка новой химерной белковой конструкции для гидролиза бета-галактозидов // Антибиотики и химиотерапия. - 2009. - Т 54. С. 3-7.
3) Гришин Д.В., Никитин А.В. Перспективы профилактики и лечения синдрома мальабсорбции // Антибиотики и химиотерапия. – 2009. - №3-4, С 49-51.
4) Гришин Д.В., Никитин А.В. Создание химерной белковой конструкции для твердофазного гидролиза бета-галактозидов и изучение её физико-химических свойств // Естественные и технические науки. – 2009. - № 5, С 131-133.
5) Гришин Д.В., Никитин А.В., Бирюков В.В. Создание новой рекомбинантной белковой конструкции для ферментативного гидролиза бета-галактозидов. В сб. тезисов: XII Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 7– сентября 2009, С 17.