Взаимодействие гонадотропинов и биогенных аминов в контроле адаптации имаго дрозофилы к стрессирующим условиям (генетико физиологические аспекты)
На правах рукописи
ГРУНТЕНКО Наталия Евгеньевна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГОНАДОТРОПИНОВ И БИОГЕННЫХ АМИНОВ В КОНТРОЛЕ АДАПТАЦИИ ИМАГО ДРОЗОФИЛЫ К СТРЕССИРУЮЩИМ УСЛОВИЯМ (ГЕНЕТИКО ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ) 03.00.09 - ЭНТОМОЛОГИЯ, 03.00.15 - ГЕНЕТИКА
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Новосибирск – 2008
Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Раушенбах Инга Юрьевна
Официальные оппоненты: академик РАН, доктор биологических наук, профессор Иванова Людмила Николаевна доктор биологических наук, профессор Высоцкая Людмила Васильевна доктор биологических наук, профессор Глупов Виктор Вячеславович Ведущая организация Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, г. Москва
Защита состоится 6 мая 2008 г. на заседании диссертационного совета Д 003.033.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Институте систематики и экологии животных СО РАН (630091, г. Новосибирск, ул. Фрунзе, 11)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института систематики и экологии животных СО РАН Автореферат разослан 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Петрожинская Л.В.
Актуальность проблемы. Проблема стресса, давно привлекавшая внимание биологов, становится особенно значимой в настоящее время в связи с непрерывно ухудшающейся экологической ситуацией в мире. Эффективным способом защиты организмов от стрессорных воздействий является нейроэндокринная стресс-реакция. Cходство в нейрохимических и физиологических изменениях у беспозвоночных и позвоночных в ответ на стрессорное воздействие свидетельствует о том, что реакция на стресс – это совокупность древних, сохраненных в эволюции механизмов (Rauschenbach et al., 1987;
Jancovic-Hladni, 1991;
Cymborovski, 1991;
Neckameyer, Weinstein, 2005).
Известно, что ряд гормонов, задействованных в стресс-реакции насекомых, также контролирует приспособленность, важнейшими компонентами которой являются способность оставить потомство и способность адаптироваться к стрессирующим условиям (обзоры: Jancovic-Hladni, 1991;
Cymborovski, 1991;
Rauschenbach, 1991;
Раушенбах, 1997). Изучение закономерностей взаимодействия этих гормонов в контроле репродуктивной функции и жизнеспособности насекомых в стрессирующих условиях является одной из актуальных задач современной билогии, поскольку выяснение этих закономерностей имеет не только фундаментальное значение, но также может быть использовано при разработке новых мер защиты от насекомых-вредителей и способов успешного разведения полезных насекомых. Такого рода исследования требуют возможности фармакологического изменения уровня гормонов и проведения генетических экспериментов, для чего максимально удобной моделью является дрозофила, как наиболее изученный объект с генетической точки зрения, и дающий возможность быстрого получения больших выборок экспериментальных насекомых.
Установлено, что у имаго Drosophila стресс-связанными гормонами являются дофамин (ДА), октопамин (ОА), ювенильный гормон (ЮГ) и экдистероиды. Так, через 15 мин после начала стрессирования (38оС) содержание ДА резко возрастает за счет его выброса из депо, что сопровождается падением активности первого фермента синтеза ДА, тирозингидроксилазы (ТГ) (Rauschenbach et al., 1993, 1995b). Такая же картина наблюдается в системе метаболизма ОА (Sukhanova et al., 1997;
Hirashima et al., 2000b). Система метаболизма ЮГ после 180 мин стрессирования отвечает падением деградации гормона (возможным повышением его титра) (Rauschenbach et al., 1995a). После 60 мин стрессирования (а возможно и ранее) возрастает уровень 20 гидроксиэкдизона (20Э) (Раушенбах и др., 2000а).
Изучение генетического контроля этих компонентов стресс-реакции у D. virilis привело к заключению о существовании единого пускового звена для всех звеньев стресс-реакции (Раушенбах и др., 2000б). Однако, является ли таким пусковым звеном один из стресс-связанных гормонов, оставалось под вопросом.
Гонадотропная роль ЮГ и 20Э у насекомых давно не подвергаетcя сомнению (обз.: Simonet et al., 2004), однако до сих пор не выработано единой точки зрения на вклад каждого из гормонов в контроль оогенеза. Известно, что ЮГ регулирует метаболизм 20Э у самок насекомых (обзоры: Bownes, 1989;
Raikhel et al 2004). Показано также влияние 20Э на синтез ЮГ in vitro (Watson et al., 1986;
Granger et al., 1987). Однако влияет ли 20Э на метаболизм ЮГ in vivo и каков механизм взаимодействия этих гормонов в контроле размножения насекомых в нормальных и стрессирующих условиях не было исследовано.
В экспериментах in vitro показано, что экзогенные биогенные амины (ОА и ДА) влияют на метаболизм гонадотропинов (ЮГ и 20Э) (Thompson et al., 1990;
Woodring, Hoffmann, 1994;
Granger et al., 1996;
Hirashima et al., 1999a), но существует ли такое взаимодействие in vivo и как оно влияет на репродуктивную функцию в нормальных и стрессирующих условиях не установлено.
Поскольку биогенные амины, ОА и ДА, контролируют энергетический метаболизм насекомых, предполагали, что они должны играть роль в адаптации индивидуумов к неблагопрятным условиям (обз.: Раушенбах, Шумная, 1993).
Однако данные, подтверждающие это предположение, отсутствовали.
Установлено, что стресс-реакция личинок насекомых носит адаптивный характер, помогая им осуществить метаморфоз в стрессирующих условиях (Rauschenbach et al., 1987). Логично предположить, что стресс-реакция, имаго дрозофилы, включающая в себя изменения в метаболизме биогенных аминов и гонадотропинов (Rauschenbach et al., 1993, 1995a;
Hirashima et al., 2000a,b), также способствует адаптации. Это предположение нуждается в проверке.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является выяснение механизмов взаимодействия стресс-связанных гормонов имаго дрозофилы (гонадотропинов – 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона, и биогенных аминов - октопамина и дофамина) в контроле приспособленности (жизнеспособности в стрессирующих условиях среды и плодовитости).
Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Исследовать взаимодействие стресс-связанных гормонов дрозофилы в нормальных и стрессирующих условиях среды.
2. Выяснить, является ли один из стресс-связанных гормонов дрозофилы пусковым звеном для всех остальных.
3. Охарактеризовать течение оогенеза и гормональный статус самок дрозофилы при стрессовых воздействиях различной этимологии и при мутационном или фармакологическом изменении уровня стресс-связанных гормонов.
4. Проанализировать влияние стрессовых воздействий и измененных (в результате мутации или фармакологически) уровней каждого из стресс связанных гормонов на плодовитость D. virilis и D. melanogaster.
5. Установить влияет ли взаиморегуляция стресс-связанных гормонов на приспособленность дрозофилы.
6. Выяснить роль стресс-связанных гормонов в обеспечении адаптации дрозофилы на индивидуальном и популяционном уровннях.
Научная новизна. В работе впервые показано, что биогенные амины регулируют in vivo метаболизм ЮГ у самок дрозофилы: (1) мутации, изменяющие содержание ОА и ДА у D. melanogaster, вызывают изменения в уровне деградации ЮГ у самок, но не у самцов;
(2) экспериментальное изменение уровня ДА и ОА также вызывает у самок, но не у самцов D. virilis и D. melanogaster изменения в уровне деградации ЮГ. Причем ДА ингибирует деградацию гормона у молодых самок и стимулирует ее у половозрелых;
ОА ингибирует деградацию ЮГ у тех и других.
Впервые обнаружено, что в регуляции титра ЮГ дофамином существует обратная связь: (1) экспериментальное повышение титра ЮГ вызывает резкое снижение уровня ДА у молодых самок дрозофилы (D. virilis и D. melanogaster) и его повышение у половозрелых;
(2) снижение титра ЮГ в результате мутации повышает уровень ДА у молодых самок D. melanogaster.
Впервые in vivo продемонстрировано, что биогенные амины регулируют титр 20Э у самок дрозофилы: мутация, лишающая D. melanogaster ОА (ThnM18), резко снижает уровень 20Э, а экспериментальное повышение содержания ОА повышает уровень гормона у молодых самок D. virilis;
повышение содержания ДА также вызывает возрастание уровня 20Э у молодых самок D. virilis.
Впервые установлено, что 20Э регулирует in vivo метаболизм ЮГ и осуществляет это опосредованно через систему метаболизма ДА: (1) экспериментальное повышение титра 20Э увеличивает уровень ДА у молодых самок D. virilis и D. melanogaster и снижает его у половозрелых, вызывая тем самым сниженние деградации ЮГ у тех и других;
(2) резкое падение титра 20Э, вызываемое у D. melanogaster мутацией ecdysonless1 при рестриктивной температуре, напротив, снижает уровень ДА у молодых самок и повышает у половозрелых, приводя к резкому повышению деградации ЮГ у тех и других.
Впервые получены данные, свидетельствующие, что синтез и деградацция ЮГ у дрозофилы находятся в противофазе и под общим контролем: (1) мутация apterous56f D. melanogaster, вызывающая драматическое снижение синтеза ЮГ резко повышает деградацию гормона;
(2) экспериментальное повышение титра ЮГ у самок D. virilis вызывает резкое снижение его деградации.
Впервые выяснено, что ни один из стресс-связанных гормонов дрозофилы не является пусковым звеном в развитии стресс-реакции.
Впервые установлено, что тепловой стресс и голодание вызывают у самок D. virilis однотипные изменения в процессе оогенеза: задержку созревания вителлогенических ооцитов и деградацию части из них вследствие повышения титра 20Э, и накопление зрелых ооцитов, вызываемое повышением уровня ЮГ.
Впервые показано, что экспериментальное повышение титра ЮГ у самок D. virilis вызывает остановку откладки яиц, но не снижает их плодовитость, тогда как экспериментальное повышение титра 20Э не приводит к остановке откладки яиц, но вызывает длительное снижение плодовитости.
Впервые обнаружено, что отклонения (повышение/снижение) в уровне биогенных аминов вызывают резко негативные изменения в репродуктивной функции самок, но не самцов, дрозофилы в нормальных условиях. Вместе с тем мутации, изменяющие содержание аминов, обеспечивают мутантным самкам преимущество в стрессирующих условиях, ускоряя выход репродуктивной системы из состояния стресса.
Впервые продемонстрировано, что нарушение баланса гонадотропинов, ЮГ и 20Э, приводит к снижению термоустойчивости самок и самцов дрозофилы.
Впервые получены свидетельства того, что мутации, вызывающие повышение базального уровня ДА, снижают жизнеспособность дрозофилы при тепловом стрессировании, однако повышают ее при голодании.
Впервые установлено, что длительная селекция D. melanogaster по половой активности самцов в плюс и минус направлениях приводит к изменениям в системах метаболизма ЮГ и ОА у самок, а мутации, нарушающие ответ системы ЮГ на стрессор, приводя к снижению плодовитости в нормальных условиях, дают преимущество в оставлении потомства в стрессирующих условиях.
Впервые показано, что в природных популяциях D. melanogaster с высокой частотой встречаются мутантные самки с нарушенным ответом системы метаболизма ЮГ на действие стрессора.
Положения, выносимые на защиту.
1. У самок дрозофилы существует механизм взаиморегуляции стресс-связанных гормонов - биогенных аминов (ДА и ОА) и гонадотропинов (ЮГ и 20Э).
Наличие такого механизма позволяет сохранять баланс гонадотропинов в условиях, вызывающих изменения в уровне одного из них, и способствует адаптации на индивидуальном и популяционном уровнях.
2. Механизм ответа репродуктивной системы самок дрозофилы на различные стрессорные факторы универсален. Стрессирующие воздействия различной этимологии вызывают: замедление созревания вителлогенических ооцитов, деградацию части из них, накопление зрелых ооцитов, ингибирование экспрессии yolk protein генов, прекращение откладки яиц и снижение плодовитости в течение некоторого времени после ее возобновления. Для нормального течения оогенеза необходимо сохранение баланса гонадотропинов, ЮГ и 20Э.
3. Роль ЮГ и 20Э в регуляции оогенеза дрозофилы различна: завершающие стадии созревания ооцитов и процесс откладки яиц в норме и при стрессе регулируются ЮГ, а 20Э ответственен за развитие ооцитов на ранних вителлогенических стадиях и их деградацию при стрессе. Биогенные амины (ДА и ОА) регулируют процесс оогенеза и плодовитость самок, но не самцов, дрозофилы, изменяя, как нейрогормоны, титр гонадотропинов.
4. Взаиморегуляция стресс-связанных гормонов дрозофилы в условиях стресса генетически детерминирована: мутация в системе метаболизма одного из этих гормонов (ДА, ОА, ЮГ и 20Э) изменяет стресс-реактивность всех остальных, хотя ни один из них не является пусковым звеном стресс-реакции.
Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе данные развивают представления о механизмах взаимодействия стресс-связанных гормонов насекомых в контроле приспособленности и позволяют сделать выводы об адаптивности как самой стресс-реакции, так и полиморфизма по ней для популяций насекомых, что может быть использовано при разработке новых мер защиты от насекомых-вредителей и способов успешного разведения полезных насекомых.
Апробация работы. Результаты работы были доложены или представлены на 1, 2 и 3 съездах ВОГИС (Саратов, 1994;
Санкт-Петербург, 2000;
Москва 2004), на международных конференциях «Агробиология и биотехнология растений и животных» (Киев, 1997), «Современные концепции эволюционной генетики» (Новосибирск, 1997), «Адаптация организма к природным и экосоциальным условиям среды» (Бишкек, 1998), «Генетическая и онтогенетическая психонейро-эндокринология» (Новосибирск, 1999), «Молекулярно-генетические маркеры животных» (Киев, 1999), «Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии (Новосибирск, 2000), «Генетика и Селекция в Украине на Стыке тысячилетий» (Киев, 2001), «Биоинформатика регуляции и структуры генома» (Новосибирск, 2002) и «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), на VII, VIII и IX Международных конференциях по ювенильным гормонам (Иерусалим, 1999;
Кингз Бич, 2004;
Йорк, 2007), на XXX Всероссийском совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Санкт-Петербург, 2000), на VI Восточноевропейской конференции межународного общества нейробиологии беспозвоночных (Москва-Пущино, 2000), VI Европейском симпозиуме по экофизиологии беспозвоночных (Санкт-Петербург, 2001), на XVII, XVIII Европейских конференциях по исследованиям на Drosophila (Эдинбург, 2001;
Геттинген, 2003), на XV и XVI Международных симпозиумах по экдизону (Крит, 2002;
Гент 2006), на III Международной научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии» (Алматы, 2003), на XIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006) и на 2 Международном конгрессе по исследованию стресса (Будапешт, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 73 научных работы, из них статей – 41, в том числе в зарубежной печати – 15.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (733 источника). Работа изложена на 361 странице машинописного текста, включая 105 рисунков и схем и 13 таблиц.
Благодарности. Автор глубоко признателен сотрудникам лаборатории генетики стресса Института цитологии и генетики СО РАН Адоньевой Н.В., Сухановой М.Ж., Фаддеевой Н.В., и работавшим под руководством автора Ченцовой Н.А., Богомоловой Е.В., Карповой Е.К., а также сотруднику Института химической кинетики и горения СО РАН Алексееву А.А., которые принимали участие в осуществлении ряда экспериментов. Особую признательность автор выражает зав. лабораторией генетики стресса профессору И.Ю. Раушенбах, инициировавшей эту работу и активно ее поддерживавшей на всех этапах проведения. Автор благодарит профессоров Митрофанова В.Г., Захарова И.К., Кайданова Л.З., Вилсона Т. (США), Сегала Д. (Израиль), Монастириоти М.
(Греция), Хирша Дж. (США), Индру М. (Чехия) за предоставление линий D.
virilis и D. melanogaster. Особую благодарность автор выражает профессору М.
Баунс (Великобритания) за предоставление возможности проведения исследований оогенеза D. virilis в ее лаборатории.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Насекомые. Исследование было проведено на на двух линиях D. virilis, контрастных по реакции на тепловое воздействие (101 дикого типа и 147, несущая мутации brick, broken и detached в хромосоме-2 и термочувствительную условную личиночную леталь в хромосоме 6) и нескольких линиях D. melanogaster: дикого типа (Canton S и Oregon R), несущие мутации, изменяющие уровни 20Э (ecdysoneless1, прерывающая синтез экдизона при рестриктивной температуре (29оС)), ЮГ (Metoprene-tolerant27, снижающая рецепцию гормона, и apterous56f резко снижающая его синтез) и биогенных аминов (inactive, снижающая уровни ОА и ТА в результате понижения активности тирозиндекарбоксилазы (ТДК);
ThnM18, блокирующая биосинтез ОА и резко повышающая уровень тирамина (ТА) в результате отсутствия активности тирамин--гидроксилазы;
и ebony, вдвое повыщающая уровень ДА) и линия р845, из которой транспозицией Р-элемента получена линия ThnM18.
Также в работе использованы линии D. melanogaster ВА и НА, селектировнные Кайдановым с соавт. (1994) на высокую и низкую половую активность самцов, и ряд изо-самочьих линий D. melanogaster, полученных от самок, отловленных в регионе Горного Алтая, и любезно предоставленных И.К.Захаровым.
Культуры линий выращивали на стандартной питательной среде (Раушенбах, Лукашина, 1984) при температуре 25оС и плотности 20 личинок на 7 мл среды.
Синхронизацию культур проводили по вылуплению личинок и по вылету имаго.
Условия стрессирования. Мух стрессировали либо помещением в стаканы с обедненной питательной средой (голодание), либо - в термостат с температурой 38°С (тепловой стресс);
контрольных особей содержали на стандартной питательной среде при 25°С (особи линии ecd1 D. melanogaster содержались при пермиссивной (19°С) и рестриктивной (29°С) температурах).
Анализ жизнеспособности. При стрессировании голодом самцов и самок (отдельно) через сутки после вылета помещали в стаканы с обедненной питательной средой (20г агара, 4г сахарозы, 1л воды) и ежедневно переносили в новые стаканы, подсчитывая число особей погибших в течение суток. При тепловом стрессе мух помещали в термостат с температурой 38°С на (D. melanogaster) и 6 (D. virilis) часов;
число выживших подсчитывали через сутки после стрессирования. При исследовании влияния экзогенного ЮГ на жизнеспособность при тепловом стрессе мухам за 14 час до экспозиции (38°С, час) апплицировали 2 мкг ЮГ-III (Fluka), растворенного в ацетоне;
контрольным особям апплицировали ацетон;
число выживших подсчитывали через сутки после стресса. При оценке выживаемости мух с экспериментально повышенным уровнем 20Э, ОА и измененным уровнем ДА мух после вылета помещали в стакан с фильтровальной бумагой, смоченной раствором 0,5% сахарозы, 0,2% дрожжей с добавлением 60мкг 20Э (Sigma) или 5мг ОА (Sigma)/ДА (Sigma)/3 иодотирозина (3-ИТ, Sigma), и ежедневно переносили в новые стаканы (в контрольные культуры соответствующие реактивы не добавляли). Контрольных и подопытных мух соответствующего возраста помещали на 3,5ч о (D. melanogaster) или 5,5 ч (D. virilis) в термостат с температурой 38 С, и через сутки определяли число выживших.
Приготовление препаратов яичников, окрашивание по Хечсту. Стадии развития ооцитов определяли в соответствии с King (1970), окрашивая яичники по Хечсту модифицированным методом Cоллера с соавторами (Soller et al., 1999) и анализируя препараты с использованием флюоресцентного микроскопа Zeiss Axioskop 2 Plus (программное обеспечение Axio Vision).
Анализ плодовитости. В опытах с тепловым стрессированием температурному воздействию (38°C, 4ч для D. virilis и 2ч для D. melanogaster) подвергали только самок (самцов отделяли за 16ч до и возвращали после окончания стрессирования). В опытах с голоданием мух либо на 3, либо на день помещали на обедненную питательную среду на 24 час. Оценку плодовитости мух при экспериментальном изменении уровня ОА, 20Э, ДА проводили в таких же условиях, как при изучении влиянии этих гормонов на выживаемость (в опытах с голоданием в питательный раствор не добавлялись дрожжи;
в опытах с 20Э гормон добавляли в раствор только в день стрессирования). Для изучения влияния ЮГ на плодовитость мух после аппликации под эфирным наркозом 1 (для D. melanogaster) или 2 (для D. virilis) мкг ЮГ-III (Fluka), растворенного ацетоне помещали в стаканы со стандартной питательной средой (контрольным особям апплицировали соответствующее количество ацетона). Во всех опытах мух ежедневно переносили на свежий корм и в каждом стакане подсчитывали число отложенных яиц и/или число вылупившихся потомков. Плодовитость рассчитывали как количество потомков/яиц на самку в сутки.
Нозерн-блот анализ. Суммарную РНК из приблизительно 100 взрослых мух, контрольных и стрессированных в течение 60 мин при 38oC, выделяли по методу Хомчински и Саски (Chomczynski, Sacchi, 1987). Горизонтальный электрофорез РНК проводили по методу, описанному Маниатисом (Maniatis et al., 1982);
на дорожку наносили 15 РНК. РНК переносили из агарозного геля на нейлоновую мембрану (MSI) методом вакуумного переноса раствором щелочи. Зонд для гибридизации был получен при помощи ПЦР с использованием праймеров из работы Гото и Кимуры (Goto, Kimura, 1998). Для мечения ДНК и для проведения ПЦР использовали киты «СибЭнзим», меченые нуклеотидтрифосфаты Amersham и кДНК D. melanogaster, любезно предоставленную А.В.Катохиным.
Гибридизацию вели в течение ночи при 38oC в гибридизационной смеси с 50% формамидом, 5SSPE, 1% SDS, 5xDenhardt и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося.
Гибридизация in situ проводилась по модифицированному Денг и Баунс (Deng, Bownes, 1997) методу Тоц и Пфифл (Tautz, Pfeifle, 1989).
Измерение содержания 20-гидроксиэкдизона проводили по методу Вайнрайта с соавторами (Wainwright et al., 1997), определяя количество экдистероидов в образцах сравнением площадей пиков с площадями пиков стандартов, и по методу Ченга и О’Коннора (Chang, O'Connor, 1979).
Измерение деградации ювенильного гормона проводили при помощи модифицированного (Rauschenbach et al., 1991) метода Хэммока и Спаркса (Hammock, Sparks, 1977).
Измерение активности ЮГ-эстеразы и ЮГ-эпоксидгидролазы осуществляли при помощи тонкослойной хроматографии по методу Ренуччи (Renucci et al., 1990) с использованием 3Н-ЮГ-III («NEN Research Products»), ЮГ-III («Sigma») и пластины для ТСХ с силикагелем («60 F 254 Merck»).
Измерение содержания дофамина проводили флюориметрическим методом Кудрявцевой и Бакштановской (1989), объединивших и модифицировавших варианты, изложенные в работах Майкеля с соавторами (Maiсkel et al., 1968) и Шлюмпфа с соавторами (Schlumpf et al., 1974), и методом высокоэффективной жидкоcтной хроматографии на хроматографе Agilent 1100 (Германия) с УФ детектором (280 нм), как описано в работе Грунтенко с соавт. (Gruntenko et al., 2007).
Измерение активности тирозиндекарбоксилазы осуществляли, используя незначительно модифицированный радиоизотопный метод МакКэмана с соавторами (McCaman et al., 1972).
Статистическая обработка результатов. Достоверность результатов оценивали, используя t-критерий Стьюдента, тест Колмогорова-Смирнова и двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA, пакет STATISTICA 6.0 for Windows, StatSoft Inc., 2001).
Стресс-реактивность рассчитывали, как процент изменения признака у каждой стрессированной особи по отношению к среднему значению для контрольной группы.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Механизмы взаимодействия стресс-связанных гормонов у имаго Drosophila в нормальных и стрессирующих условиях среды.
У имаго насекомых, у Drosophila в частности, ЮГ и 20Э, с одной стороны, задействованы в механизме стресс-реакции (Rauschenbach et al., 1995a;
Hirashima et al., 2000a), а с другой - играют роль гонадотропинов, регулируя синтез ЖБ и их поглощение ооцитами (обзоры: Koeppe et al., 1985;
Raikhel et al., 2004). Для регуляции обоих процессов необходимо четкое регулирование титра ЮГ и 20Э.
In vitro на нескольких видах насекомых показано, что метаболизм ЮГ и 20Э может регулироваться биогенными аминами (ОА и ДА), а 20Э влияет на синтез ЮГ (Whisenton et al., 1987;
Thompson et al., 1990;
Woodring, Hoffmann, 1994;
Granger et al., 1987, 1996;
Hirashima et al., 1999a,b). Однако такие исследования никогда не проводились на дрозофиле и, что более важно, in vivo. Механизм взаимодействия этих гормонов также оставался неясным.
Мы обнаружили (рис.1), что у самок с мутациями, резко изменяющими содержание биогенных аминов (линий ste и e D. melanogaster с удвоенным в результате мутации гена N--аланил-дофаминсинтетазы уровнем ДА (Hodgetts, Konopka, 1993) и ThnM18, лишенные ОА в результате нуль мутации гена тирамин--гидроксилазы (Monastirioti et al., 1996)), существенно изменен метаболизм ЮГ, причем двухфакторный (линия и возраст) ANOVA показал, что CS CS Tbh (пмоль/мин/особь) (пмоль/мин/особь) ebony p845 Рис. 1. Деградация деградация ЮГ деградация ЮГ ЮГ у 1-суточных и 6 ste 6-суточных самок 5 линий Canton S (СS), 4 p845, ThnM18, scarlet ebony (ste) и ebony 2 D. melanogaster.
1 1 Каждое значение – 0 0 среднее из 9- измерений.
молодые зрелые молодые зрелые эти изменения генетически детерминированы. Самки, лишенные ОА, как молодые, так и интенсивно размножающиеся, имеют уровень деградации ЮГ значительно более высокий, чем самки линии предшественницы, p845, и особи дикого типа (Canton S);
у молодых самок с удвоенным содержанием ДА (ste, e) деградация гормона значительно ниже, а у зрелых выше, чем у дикого типа. Это позволило заключить, что ОА оказывает ингибирующее влияние на активность ферментов деградации ЮГ у молодых и половозрелых самок дрозофилы, а ДА ингибирует деградацию ЮГ у молодых самок и стимулирует ее у зрелых.
Это заключение подтвердили результаты изучения воздействия экзогенных аминов на метаболизм ЮГ: кормление ОА мух линий дикого типа D. virilis (101) и D. melanogaster (Canton S, данные деградация ЮГ (пмоль/мин/муха).
контроль деградация ЮГ (пмоль/мин/муха).
контроль ДА ОА не приведены) снижает деградацию 20 cамки 18 ЮГ у самок, но не у самцов самки 16 (рис.2А);
кормление ДА снижает 14 самцы самцы 12 деградацию ЮГ у молодых самок, 10 повышает ее у зрелых и не 8 6 изменяет у самцов (рис.2Б). 4 Сходное стадия-зависимое влияние ДА на метаболизм ЮГ обнаружено 2-дн 6-дн 2-дн А Б 2-дн 7-дн 2-дн Грангер с соавторами (Granger et Рис.2. Влияние повышения содержания ОА (A) и al., 1996) у личинок Manduca sexta. ДА (Б) на уровень деградации ЮГ у молодых и зрелых самок и молодых самцов линии дикого Важно подчеркнуть, что типа (линия 101) D. virilis. Каждое значение – уровень деградации ЮГ может среднее из 5-10 измерений.
служить индикатором титра гормона у имаго дрозофилы. Действительно, синтез и деградация ЮГ у Drosophila находятся в противофазе и под общим контролем:
(1) деградация ЮГ у молодых самок D. melanogaster (Canton S в том числе) достоверно ниже, чем у половозрелых (рис. 1), а Алтарац с соавторами (Altaratz et al., 1991) показали, что уровень синтеза ЮГ у молодых самок Canton S D. melanogaster существенно выше, чем у половозрелых;
(2) мутация apterous56f приводит у самок D. melanogaster к параллельным значительному повышению деградации гормона (табл.1) и резкому сниженнию синтеза ЮГ (Altaratz et al., 1991);
(3) экспериментальное повышение титра ЮГ у самок D. virilis вызывает снижение деградации гормона (табл.2). О возможности единого контроля синтеза и деградации ЮГ у насекомых свидетельствуют также данные Ренуччи с соавторами (Renucci et al., 1990): овариоэктомия самок сверчка приводит к одновременным снижению синтеза и повышению деградации ЮГ.
Таким образом, резонно предположить, что повышение содержания ОА или Таблица 1. Активность (%) ЮГ-эстеразы Таблица 2. Деградация ЮГ (пмоль/мин/особь) (ЮГЭ) и ЮГ-эпоксидгидразы (ЮГЭГ) у 1 у самок линий 101 и 147 D. virilis через 5 час суточных самок линий Canton S и apterous56f после его аппликации.
D. melanogaster.
линия 101 линия apterous56f Canton S ацетон 12,28±1,14 11,53±0, ЮГЭГ: 19.8±0.5 22.5±0. ЮГ 5,51±0,76 4,97±0, ЮГЭ: 5.0±0.3 15.4±0. Примечание: каждое значение – среднее из Примечание: Каждое значение является измерений.
средним по результатам 3-5 хроматографий.
ДА не только снижает/повышает деградацию ЮГ у самок Drosophila, но и повышает/снижает его синтез, а, следовательно, повышает/снижает его титр.В регуляции ЮГ дофамином у самок дрозофилы существует обратная связь: у молодых самок ЮГ-дефицитной линии ap56f резко повышен уровень ДА (рис. 3) по сравнению с диким типом (Canton S и Oregon R). Вместе с тем, самцы ap56f не отличаются от дикого типа по этому параметру, то есть изменение уровня ДА у самок ap56f не является прямым следствием мутации (ген apterous кодирует транскрипционный фактор (Cohen et al., 1992)), а обусловлено вызываемым ею снижением титра ЮГ. Мы полагаем это результатом развития компенсаторной реакции (стимуляции синтеза и ингибирования деградации ЮГ повышенным уровнем ДА), направленной у молодых самок линии ap56f на увеличение титра ЮГ для инициации вителлогенеза. Это, также как 30 ацетон наличие обратной связи в регуляции уровня ЮГ ЮГ содержание ДА (нг/мг массы) дофамином, подтверждается экспериментами с апплицированием ЮГ молодым самкам линий 56f Canton S и ap : повышение титра ЮГ приводит к снижению содержания ДА у тех и других (рис.3). Мы также показали, что аппликация ЮГ молодым и половозрелым самкам дикого типа D. virilis снижает CS ap уровень ДА у первых и повышает - у вторых [25].
Рис. 3. Содержание ДА у 1 Отсутствие отличий по уровню ДА у самцов ap56f от суточных самок линий 56f apterous (ap) и Canton S самцов дикого типа [17], вкупе с нашими данными о (CS) D. melanogaster через том, что изменения уровней ДА и ОА не влияет на 1ч после аппликации ЮГ, растворенного в ацетоне.
метаболизм ЮГ у самцов дрозофилы (рис.2), Каждое значение – среднее из 5-10 измерений.
означает, что у самцов дрозофилы отсутствует взаиморегуляция ЮГ и биогенных аминов.
О существовании взаимной регуляции ЮГ и 20Э у Drosophila и о том, что ДА влияет на метаболизм 20Э опосредованно через систему метаболизма ЮГ, свидетельствуют следующие эксперименты. Повышение титра 20Э вызывает дозозависимые возрастание уровня ДА у молодых самок дикого типа D. virilis (рис.4), и снижение – у половозрелых [27]. [Заметим, что in vitro влияние 20Э на различные звенья метаболизма биогенных аминов показано для насекомых других видов (Hiruma, Riddiford, 1990;
Lehman et al., 2000;
Zufelato et al., 2004).] Обратной связи в этой регуляции, по содержание ДА(нг/мгмг массы) деградация ЮГ(пмоль/мин/муха) 15 видимому, не существует, так как мы 12 показали, что повышение уровня ДА у молодых самок вызывает повышение, а не 9 снижение титра 20Э [34]. А это, в свою 6 очередь, означает, что влияние ДА на 3 уровень 20Э опосредуется через систему метаболизма ЮГ. В самом деле, повышение 0 30 мкг 20Э 60 мкг 20Э 30 мкг 20Э 60 мкг 20Э контроль контроль титра ЮГ (снижение его деградации), вызываемое возрастанием уровня ДА у молодых самок (рис. 2Б), должно привести к Рис. 4. Влияние 20Э (добавление увеличению титра 20Э, т.к. известно, что ЮГ гормона в питательную среду) на уровень деградации ЮГ и активирует синтез экдизона в яичниках содержание ДА у молодых ( суточных) самок D. virilis линии 101.
молодых самок (обзоры: Kelley, 1994;
Каждое значение – среднее из 10- Simonet et al., 2004). измерений.
Действительно, мы показали [40], что у ЮГ-обработанных самок дикого типа D. virilis резко повышается титр 20Э.
Деградация ЮГ под действием экзогенного 20Э снижается (титр ЮГ повышается) дозозависимым образом как у молодых (рис.4), так и у половозрелых [27] самок D. virilis, что вкупе с данными о дозозависимом влиянии 20Э на содержание ДА, свидетельствует о том, что действие 20Э на метаболизм ЮГ у D. virilis опосредовано через систему метаболизма ДА. В самом деле, при прямом влиянии 20Э на метаболизм ЮГ, повышение титра последнего у молодых самок, кормленных 20Э, должно вызвать не повышение (рис.4), а снижение уровня ДА (рис.3).
ОА также влияет на титр 20Э в нормальных условиях: уровень 20Э у самок ThnM линии D. melanogaster, контроль CS ОА TBh лишенных ОА, ниже, чем у самок содержание 20Э (пкг/муха) содержание 20Э (пкг/муха) дикого типа (рис. 5А), а у самок линии дикого типа D. virilis, кормленных ОА – выше, чем у контрольных особей (рис.5Б). ОА может влиять на титр 20Э, как и ДА, изменяя уровень ЮГ 2 (рис. 1, 2А), но не исключено, что 1 помимо этого ОА может влиять на уровень 20Э непосредственно. О такой A Б 0 возможности свидетельствуют данные Рис.5. Влияние изменения уровня ОА на о влиянии ОА на синтез экдистероидов содержание 20Э у Drosophila. А - влияние мутации ThnM18, приводящей к полному in vitro у личинок Bombyx mori отсутствию ОА, на уровень 20Э у молодых самок D. melanogaster. Canton S – линия (Hirashima et al., 1999a).
дикого типа. Б - влияние повышения уровня Суммируя изложенное, мы ОА (кормления мух амином) на содержание 20Э у молодых самок дикого типа (линия 101) предлагаем следующую схему D. virilis. Каждое значение – среднее из 5- измерений.
взаиморегуляции биогенных аминов и гонадотропинов Drosophila в нормальных условиях (рис.6):
ДА повышает титр ЮГ (ингибирует деградацию и стимулирет синтез) у молодых самок и снижает его (стимулирует деградацию и ингибирует синтез) у половозрелых. Повышение титра ЮГ вызывает снижение уровня ДА у молодых самок и повышение - у зрелых. ОА повышает титр ЮГ и у молодых, и у половозрелых самок. 20Э регулирует титр ЮГ опосредованно через систему метаболизма ДА - увеличение титра 20Э повышает уровень ДА у молодых самок 20Э ДА ДA Рис. 6. Схема взаиморегуляции ЮГ молодые зрелые ювенильного гормона (ЮГ), 20 гидроксиэкдизона (20Э) и биогенных аминов у самок дрозофилы. Черными стрелками показано направление эффекта: вверх – возрастание, вниз OA снижение.
и снижает его у половозрелых, вызывая, тем самым, снижение деградации ЮГ (повышение его титра) у тех и других. ДА влияет на уровень 20Э опосредованно через систему метаболизма ЮГ. ОА влияет на уровень 20Э также опосредованно через систему метаболизма ЮГ.
Известно, что у имаго Drosophila стресс-реакция заключается в повышении уровня 20Э, ДА и ОА и снижении деградации ЮГ, которое, как было обосновано выше, указывает на повышение его титра (обзоры: Раушенбах, Шумная, 1993;
Раушенбах, 1997). Одной из задач настоящей работы была попытка выяснить, не является ли один из стресс-связанных гормонов дрозофилы (ЮГ, 20Э, ДА или ОА) пусковым звеном для остальных компонентов реакции. В случае, если бы пусковым звеном был ОА, особи лишенной ОА линии ThnM18 не реагировали бы на стресс гормональными изменениями.
Однако, мы показали [8, 22], что особи этой линии реагируют на стрессорное воздействие развитием стресс-реакции: у них снижаются активность ТДК (индикатор ответа системы метаболизма ОА) и деградация ЮГ (уровень гормона повышается), и возрастает уровень ДА. Если бы таким пусковым звеном являлся ДА, развитие стресс-реакции у мух с удвоенным уровнем амина (линий ste и e) должно было резко отличаться от дикого типа;
однако отличия в стресс реактивности систем метаболизма ЮГ и ОА (рис.7) у них не превышают тех, что имеют место быть у мух линии ThnM18, у которых содержание ДА не отличается от дикого типа [22].
100 система ДА система ОА 100 система ЮГ стресс-реактивность (%).
80 CS ste v H CS CS ste ste h h v v R ia TB ia ia TB TB O p p Рис. 7. Стресс-реактивность систем метаболизма ДА, ОА и ЮГ у молодых самок линий ThnM (TBH), ее линии-редшественника р845, inactive (iav), scarlet ebony (ste) и линий дикого типа Canton S (CS) и Oregon R (OR) D. melanogaster.
Таким образом, ни один из изученных стресс-связанных гормонов имаго дрозофилы не является инициатором стресс-реакции.
Важно подчеркнуть, что изменения, происходящие в каждом звене стресс реакции при стрессорном воздействии, скоординированы, и координация эта генетически детерминирована: каждая мутация, затрагивающая одно из этих звеньев, влияет и на остальные. Так, у D. melanogaster мутация ebony, удваивающая содержание ДА, влияет на стресс-реактивность систем метаболизма ОА и ЮГ (рис.7);
мутации ThnM18 и inactive, изменяющие уровень ОА, изменяют стресс-реактивность систем метаболизма ЮГ и ДА (рис.7). Мы также показали, что мутация ap56f, вызывающая дефицит ЮГ, изменяет стресс реактивность систем метаболизма ДА и ОА [17], и термочувствительная мутация ecd1, вызывая прекращение синтеза 20Э при 29оС, влияет на уровень стресс реактивности систем ЮГ и ДА [31]. Эти данные хорошо согласуются с данными Раушенбах с соавторами (Раушенбах, 1997;
Хлебодарова и др., 1998;
Суханова и др., 1999;
Hirashima et al., 2000a,b,c) о генетическом контроле развития стресс реакции у D. virilis: мутация, локализованная в хромосоме 6, нарушает у особей линии 147 ответ на стресс систем метаболизма ОА, экдистероидов, ЮГ и ДА.
Основываясь на данных настоящей работы, мы представляем гормональные взаимодействия при стрессе у половозрелых самок дрозофилы следующим образом. Стрессирующее воздействие приводит к повышению уровня ОА, 20Э и ЮГ (Rauschenbach et al., 1995а;
Hirashima et al., 2000a,b);
повышение титра ОА, в свою очередь, вызывает повышение титра ЮГ и 20Э (рис.2А,6Б). ДА, хотя его уровень также поднимается при стрессе, не участвует, по нашему мнению, в этой системе взаимодействий, поскольку его повышение должно вызывать снижение деградации ЮГ у молодых самок и повышение у половозрелых (рис.1Б,2Б), а наши данные свидетельствуют, что она падает и у тех и у других [12]. А поскольку мы показали, что 20Э регулирует титр ЮГ опосредованно через систему метаболизма ДА (см. выше), изменение титра 20Э при стрессе не должно влиять на уровень ЮГ. ОА, напротив, может регулировать титр ЮГ в неблагоприятных условиях: увеличение содержания ОА должно вызывать падение уровня деградации ЮГ (рис.1А,2А) и у молодых, и у зрелых самок, что и имеет место у всех исследованных нами линий дрозофилы [7, 8, 15, 17].
Однако, падение деградации ЮГ (повышение его титра) при стрессе наблюдается и у лишенных ОА самок (линия ThnM18) [8], что свидетельствует о существовании еще некоего фактора, который, по-видимому, и является пусковым для возникновения стресс-реакции и инициирует изменения во всех стресс-связанных системах вне зависимости от их взаимодействия между собой.
Последнее согласуется с полученными ранее Раушенбах с соавторами (Rauschenbach et al., 1984, 1987;
Хлебодарова и др., 1998;
Суханова и др., 1999;
Раушенбах и др., 2000b) данными, свидетельствующими о наличии у D.virilis единого генетического контроля в ответе систем биогенных аминов и ЮГ на действие стрессора.
2. Стрессовые воздействия различной этимологии и измененные, в результате мутации или экспериментально, уровни стресс-связанных гормонов влияют на репродуктивную функцию самок Drosophila.
На рис. 8 приведены данные, демонстрирующие, что тепловое стрессирование, вызывающее у самок дикого типа (линия 101) D. virilis повышение титра 20Э и ЮГ (см. выше), приводит к изменениям в протекании оогенеза: деградации части вителлогенических ооцитов (стадии 8-10), задержке созревания ооцитов (прохождения через стадию 10), накоплению зрелых яиц (ооцитов 14 стадии) и ингибированию экспрессии yp генов. Последнее, вероятно, и является причиной задержки созревания части вителлогенических ооцитов при стрессе.
Сопоставление линий D. virilis дикого типа (101) и мутантной (147) по этим параметрам позволило нам сделать предположение о том, что деградация ранних вителлогенических ооцитов при стрессе вызывается повышением титра 20Э (и то, и другое наблюдается у самок обеих линий (Раушенбах и др., 2000а;
табл.3, рис.8G)), а накопление зрелых яиц – повышением уровня ЮГ за счет снижения его деградации (оба явления наблюдаются у линии 101, но не у 147 (табл.3, рис.8F)). Это предположение Таблица 3. Влияние теплового стрессирования на деградацию ЮГ (38оС, 4ч) и содержание 20Э (38оС, 3ч) у было подтверждено при молодых (1-суточных) самок линий 101 и 147 D. virilis.
изучении оогенеза и активность ЮГ-эстеразы содержание 20Э метаболизма ЮГ у самок (пмоль/мин/особь) (пкг/особь) линий 101 и 147 при другом 101 147 виде стресса, голодании.
контроль 25,8±0,6 (5) 18,4±1,0 (5) 12.98±0.47 (14) Мутация, нарушающая о 38 С 17,5±1,8 (5) 18,5±0,6 (5) 36.72±0.80 (7) ответ системы метаболизма Примечание: в скобках указано число измерений.
экспрессирующих гены 100 норма стресс A B % яйцевых камер, не желточных белков C D D 147 норма стресс 101 147 101 Е 45 101 контроль деградировавшие ооциты / общее 40 40 101 тепловой стресс число ооцитов стадий 8-14 (%) ооциты / общее число ооцитов 147 контроль 35 стадий 8-14 oocytes (%) 147 тепловой стресс 30 25 20 15 10 5 0 8 9 10 11-13 14 8 9 10 11-13.
стадии развития ооцитов стадии развития ооцитов F G Рис. 8. Влияние теплового стресса на экспрессию генов желточных белков (yp-генов) (A-E) и оогенез (F-G) 3-суточных самок линий D. virilis 101 и 147.
A,C - типичная in situ гибридизация яичников контрольных и B,D - стрессированных (38oC, 2ч) самок. E - доля яйцевых камер, не экспрессиирующих yp гены.
F - распределение по стадиям нормальных и G - дегенерирующих ооцитов в яичниках самок линий 101 и 147 в нормальных условиях и при тепловом стрессе (38oC, 4ч).
ЮГ на стрессор у линии 147, является термочувствительной (Rauschenbach et al., 1995). Мы показали, что на не тепловое стрессирование (голодание) система метаболизма ЮГ особей этой линии отвечает так же, как у дикого типа, снижением деградации гормона (повышением его титра) и, также как у дикого типа, при голодании у них накапливаются зрелые (14 стадии) ооциты [23].
Представление о том, что ЮГ контролирует завершающие стадии оогенеза и откладку яиц, а 20Э вносит больший вклад в контроль ранних вителлогенических стадий, мы подтвердили, обработав мух ЮГ и 20Э: ЮГ вызывает у самок дикого типа остановку откладки яиц, но не приводит к снижению плодовитости после ее возобновления в последующие дни, 20Э не останавливает овипозицию, однако снижает плодовитость в течение нескольких дней после обработки [23]. По-видимому, так проявляется дегенерация ранних вителлогенических ооцитов, происходящая у дрозофилы под действием экзогенного 20Э (Soller et al., 1999).
Ответ репродуктивной системы дрозофилы на действие стрессоров генетически детерминирован. Об этом свидетельствуют результаты проведенного нами сравнения распределений ооцитов по стадиям в яичниках самок линий 101, 147 и их F1 (101 x 147) гибридов, стрессированных высокой температурой (38оС, 4 час): мутация, препятствующая накоплению зрелых яиц у самок линии 147 оказалась рецессивной [18], так же как обнаруженная ранее (Rauschenbach et al., 1984;
Гренбэк и др., 1997) мутация, препятствующая у этих самок ответу системы метаболизма ЮГ на действие стрессора. Так как именно повышение уровня ЮГ вызывает накопление яиц (остановку их откладки) при стрессе (см. выше), мы полагаем, что это одна и та же мутация. С этим представлением хорошо согласуются данные, полученные нами при анализе влияния теплового стрессирования различной длительности (38оС, 1, 2 и 3 час) на метаболизм ЮГ и плодовитость линий 101, 147 и их F1 гибридов [19]. У самок линии 147 ни один из режимов стрессирования не влияет ни на уровень деградации ЮГ, ни на плодовитость. У гибридных самок и самок линии 101 часовое стрессирование не вызывает изменений этих параметров, при 2-х часовом – уровень деградации ЮГ начинает снижаться и наблюдается задержка откладки части яиц, при 3-х часовом – деградация ЮГ резко падает (титр гормона возрастает) и откладка яиц прекращается [19].
Мы также показали, что биогенные амины, изменяя, как нейрогормоны, метаболизм ЮГ и 20Э, регулируют репродуктивную функцию самок дрозофилы:
как снижение, так и повышение уровня ДА (в результате мутации или фармакологическое) оказывает негативное влияние на плодовитость;
кормление мух ОА вызывает дозозависимое снижение уровня плодовитости [28, 39].
Вместе с тем, мы установили, что резкое изменение (снижение) уровней ЮГ [17] или ДА [28] не влияет на уровень плодовитости самцов дрозофилы, что согласуется с нашим заключением (см. выше) об отсутствии у самцов дрозофилы механизма взаиморегуляции ЮГ и биогенных аминов.
Итак, можно заключить, что механизм ответа репродуктивной системы самок Drosophila на стрессирующие факторы различной природы универсален (рис 9):
(1) возрастают титры ОА, 20Э и снижается деградация ЮГ (возрастает его титр);
OA 20Э (2) 20Э вызывает резорбцию части вителлогенических замедление созревания частичная рецорбция ооцитов и замедление их защита от 20Э ЮГ созревания, что приводит к индуцированной резорбции длительному снижению рецорбция плодовитости;
задержка (3) ЮГ вызывает задержку откладки яиц откладки яиц, и защищает плодовитость часть ооцитов от 20Э Рис. 9. Схема воздействия гормонов стресса на индуцированной резорбции.
плодовитость дрозофилы в неблагоприятных условиях.
Черными стрелками показано направление эффекта: вверх – возрастание, вниз - снижение.
3. Роль стресс-связанных гормонов в адаптации индивидуумов к стрессирующим воздействиям различной этимологии.
Помимо плодовитости, стресс-связанные гормоны дрозофилы влияют на еще одну важную компоненту приспособленности - жизнеспособность особей в стрессирующих условиях. Так, повышенние базального уровня ДА (уровня амина у мух в нормальных условиях) коррелирует со сниженной выживаемостью при тепловом стрессе: (1) Самцы, имеющие значительно более высокий базальный уровень ДА, чем самки, хуже выживают при тепловом стрессе (рис.10). [Аналогичная закономерность (более высокий уровень ДА и более низкая устойчивость к тепловому стрессу у самцов) продемонстрирована недавно для москитов Aedes aegypti (Andersen et al., 2006).] (2) Особи c мутацией ebony (линии ste и e), удваивающей содержание ДА, имеют резко сниженный по сравнению с диким типом (Canton S и Oregon R) уровень выживаемости при тепловом стрессе (рис.10А). (3) Кормление особей D. virilis (рис. 10Б) ДА также приводит к снижению выживаемости при тепловом стрессировании.
С другой стороны, мутация ebony приводит к повышению выживаемости при 100 100 контроль Рис. 10. Влияние (А) самки самцы ДА теплового стресса (38оС, 4ч) выживаемость (%) выживаемость (%) 80 80 на выживаемость 1-суточных 70 особей D. melanogaster линий 60 дикого типа Canton S (CS) и 50 Oregon R (OR), и мутантных 40 ThnM18 (TBh), scarlett ebony 30 (ste) и ebony (e) и (Б) 20 кормления дофамином на 10 жизнеспособность при тепловом стрессе (38оС, 5,5ч) самцы самки 4-суточных самок и самцов CS CS OR OR TBh ste e TBh ste А Б линии 101 D. virilis.
голодании (рис.11). Вероятно, это объясняется тем, что голодание у мух приводит, как мы показали [22], к выживаемость (%) резкому снижению уровня ДА, контролирующего у насекомых энергетический гомеостаз (Wright, ebony ste 1987), причем у особей дикого CS типа он снижается вдвое, тогда 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 как у мутантов приближается к дни после вылета уровню, характерному для дикого Рис. 11. Влияние длительного голодания на типа в норме. Таким образом, выживаемость самок линий Canton S (CS), ebony и scarlet ebony (ste) D. melanogaster.
наличие в природных популяциях особей, несущих аллели, различного базального уровня ДА, (в том числе меланистов с высоким уровнем амина) способствует адаптации популяции в целом, позволяя переносить неблагоприятные условия различной этимологии без катастрофической потери численности.
Мы установили, что изменение базальных уровней ЮГ и 20Э также влияет на устойчивость дрозофилы к действию стрессоров: экспериментальное повышение уровня ЮГ или 20Э у особей дикого типа приводит к резкому снижению устойчивости обоих полов к действию высокой температуры [41].
ОА, видимо, не играет роли в адаптации индивидуумов к стрессирующим условиям: даже полное его отсутствие (линия ThnM18) никак не сказывается на выживаемости особей обоих полов в условиях теплового стресса (рис.11А).
4. Роль стресс-связанных гормонов в обеспечении адаптации Drosophila на популяционном уровне.
Как мы показали выше, статус стресс-связанных гормонов влияет на основные компоненты приспособленности Drosophila. Далее приведены свидетельства того, что возможно и обратное: изменения в приспособленности, возникающие в процессе селекции по адаптивно значимым признакам или в результате мутаций, вызывают изменения в уровне стресс-связанных гормонов.
Мы показали [7, 13], что мутация Met27, нарушающая рецепцию гормона (Shemshedini et al., 1990) и обеспечивающая устойчивость D. melanogaster к инсектициду-метопрену (Shemshedini, Wilson, 1990) приводит к (1) изменениям в системе ЮГ: снижению его деградации в нормальных условиях и (2) возникновению устойчивости репродуктивной системы к действию высокой температуры (хотя в нормальных условиях их плодовитость снижена): при тепловом стрессе у самок линии v Met27 не наблюдается задержки в откладке яиц, как это происходит у всех остальных исследованных нами линий.
Последнее было неожиданным, так как мы обнаружили, что система метаболизма ЮГ у самок v Met27 отвечает на действие стрессора снижением деградации гормона (повышением его титра), что должно вызывать задержку откладки яиц (см. выше). По-видимому, нарушение рецепции ЮГ приводит к тому, что ткани-мишени (фолликулярные клетки и яйцевые камеры) не воспринимают изменений в его уровне и самки продолжают откладывать яйца в стрессирующих условиях.
Еще более ярким примером взаимосвязи стресс-связанных гормонов и приспособленности являются результаты проведенного нами исследования статуса стресс-связанных гормонов у линий ВА и НА, полученных Кайдановым и др. (1994) в результате длительной селекции по половой активности самцов в плюс и минус направлениях. Линии НА, селектированные на снижение половой активности самцов, характеризуются термоустойчивостью, плодовитостью, двигательной активностью, рецептивностью самок и продолжительностью жизни имаго существенно более низкими, чем линии ВА, селектированные на повышение половой активности самцов (Кайданов и др., 1994). Мы обнаружили [4, 6], что отбор как в плюс, так и минус направлениях, повлиял на системы метаболизма двух стресс-связанных гормонов, ЮГ и ОА, у самок. То, что селекция на изменение приспособленности самцов привела к изменениям в метаболизме стресс-связанных гормонов у самок, хорошо согласуется с концепцией общей или множественной стресс-устойчивости, сформулированной Хоффманом и Парсонзом (Hoffmann, Parsons, 1991) на основании ряда селекционных экспериментов, межлинейных сравнений и корреляционного анализа (Hoffmann, Parsons, 1989a,b). Так, селекция самок D. melanogaster на устойчивость к голоданию привела к возникновению множественной стресс устойчивости (к обезвоживанию, окислительному и химическому стрессам) как у самок, так и у самцов селектированных линий (Harshman et al., 1999).
Мы предполагаем, что причиной широкого распространения особей с повышенным уровнем ДА (меланистических форм) в природных популяциях разных видов (обзор: Wright, 1987) может являться не только их индивидуальная устойчивость к некоторым типам стресса (см. выше), но и преимущество, получаемое их репродуктивной системой в стрессирующих условиях. Так, мы показали, что особи с мутацией ebony имеют сниженную плодовитость в нормальных условиях, но у них быстрее восстанавливается ее уровень после теплового стрессирования (рис.12). Последнее, очевидно, связано с более быстрым падением деградации ЮГ (возрастанием его титра) у половозрелых мутантных самок при стрессе [12, 15], что, согласно нашим данным [23] и результатам Соллера с соавторами (Soller et al., 1999), обеспечивает защиту большего числа ооцитов от 20Э индуцированной резорбции.
Canton S Рис. 12. Влияние теплового 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 стресса (38оС, 2 час, показан стрелкой) на плодовитость особей линий scarlet ebony Canton S и scarlet ebony D. melanogaster. По осям:
абсцисс – дни после вылета, ординат - плодовитость (потомки/самка/сутки).
Светлые кружки – 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 контроль, темные – опыт.
Адаптивность полиморфизма по метаболизму ЮГ следует также из результатов нашего исследования реакции репродуктивной системы самок линии 147 D. virilis на тепловое стрессирование [2, 3]. При стрессе особи, не имеющие мутаций в системе метаболизма ЮГ, прекращают откладывать яйца [3, 23] из-за повышения титра ЮГ, а самки, подобные особям линии 147, несущим мутацию, препятствующую ответу системы метаболизма ЮГ на действие стрессора (таб. 3), продолжают откладывать яйца и, тем самым, несмотря на сниженный уровень плодовитости в нормальных условиях [2, 3], получают преимущество в оставлении потомства, когда популяция оказывается в ситуации часто повторяющихся стрессорных воздействий.
Это предположение подтверждают результаты проведенного нами мониторинга двух природных популяций D. melanogaster по системе метаболизма ЮГ: в обеих популяциях с высокой частотой (55,6 и 64%, соответственно) встречаются самки со сниженным уровнем деградации ЮГ, не изменяющимся при тепловом стрессе [1].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основным итогом работы стало построение модели взаимоотношений стресс связанных гормонов насекомых (биогенных аминов и гонадотропинов) в нормальных условиях среды и определение роли, которую эти взаимоотношения играют в контроле приспособленности.
При стрессе изменения, происходящие в этой системе взаимодействий, приводят к развитию универсальной реакции репродуктивной системы самок насекомых, способствующей адаптации на популяционном уровне. Так, задержка откладки яиц, вызываемая повышением титра ЮГ, позволяет популяции «переждать» кратковременные неблагоприятные условия без значительной потери потенциальной численности, а деградация части вителлогенических ооцитов и снижение плодовитости, вызываемое повышением титра 20Э, позволяет уменьшить конкуренцию за пищевые ресурсы в следующем поколении, если стрессирующие условия сохраняются длительное время.
Адаптивным для популяции является полиморфизм как по базальному уровню стресс-связанных гормонов, так и по способности последних отвечать на стрессирующее воздействие. Различый базальный уровень ДА обеспечивает устойчивость к различным видам стресса и, следовательно, полиморфизм по этому признаку препятствует резкой потере численности при попадании популяции в неблагоприятные условия различной этимологии. А наличие в популяции особей с мутациями, изменяющими ответ на стресс системы ЮГ, позволяет сохранять численность при существовании в условиях часто повторяющихся стрессовых воздействий, поскольку особи с такими нарушениями, хотя и имеют сниженную плодовитость, но продолжают откладывать яйца в условиях стресса.
Эта точка зрения хорошо согласуется с представлениями Северцова (1990) о том, что внутривидовая изменчивость является не столько материалом для эволюционных преобразований, сколько специальным механизмом, повышающим стабильность вида как системы: наличие двух или большего числа дискретных или плавно переходящих друг в друга генетически детерминированных морф обеспечивает популяциям возможность существования в колеблющихся условиях среды.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что у самок Drosophila virilis и D. melanogaster существует механизм взаиморегуляции стресс-связанных гормонов (биогенных аминов дофамина и октопамина, и гонадотропинов - ювенильного гормона и 20 гидроксиэкдизона) в нормальных условиях среды: дофамин и октопамин регулируют метаболизм ювенильного гормона и, через него, титр 20 гидроксиэкдизона;
регуляция метаболизма ювенильного гормона дофамином носит онтогенетический характер, и в ней существует обратная связь;
ювенильный гормон регулирует титр 20-гидроксиэкдизона, и в этой регуляции есть обратная связь, опосредованная через систему метаболизма дофамина. У самцов подобный механизм не выявлен.
2. Продемонстрировано, что наличие механизма взаиморегуляции стресс связанных гормонов повышает приспособленность: фармакологическое увеличение уровня дофамина или 20-гидроксиэкдизона у самок линии D. melanogster с мутацией, резко снижающей синтез ювенильного гормона, ускоряет их созревание и повышает плодовитость молодых особей.
3. Установлено наличие генетически детерминированного взаимодействия стресс-связанных гормонов дрозофилы в условиях стресса: мутация в системе метаболизма одного из них нарушает стресс-реактивность всех остальных, однако ни дофамин или октопамин, ни ювенильный гормон или 20-гидроксиэкдизон не являются пусковым звеном стресс-реакции дрозофилы.
4. Обнаружено, что механизм ответа репродуктивной системы дрозофилы на различные стрессорные факторы (высокую температуру, голодание) включает деградацию части ранних вителлогенических ооцитов (стадии 8, 9);
задержку прохождения ооцитов через стадию 10;
накопление зрелых ооцитов 14 стадии;
ингибирование экспрессии yolk protein генов;
прекращение откладки яиц и снижение плодовитости в течение некоторого времени после ее возобновления.
5. Установлено, что завершающие стадии созревания ооцитов и процесс откладки яиц в норме и при стрессе регулируются у дрозофилы ювенильным гормоном, а за развитие ооцитов на ранних вителлогенических стадиях и деградацию ооцитов при стрессе ответственен 20-гидроксиэкдизон.
Продемонстрировано, что биогенные амины регулируют процесс оогенеза и плодовитость самок, но не самцов, дрозофилы, изменяя, как нейрогормоны, титр гонадотропинов.
6. Обнаружено, что изменение базального уровня (уровня в нормальных условиях) дофамина снижает выживаемость особей D. virilis и D. melanogaster при высокой температуре, но повышает их жизнеспособность при голодании. Термоустойчивость мух так же зависит от базального уровня ювенильного гормона и 20-гидроксиэкдизона (снижается при их повышении), но не зависит от уровня октопамина.
7. Продемонстрировано, что изменения в приспособленности (жизнеспособности в условиях стресса и плодовитости), возникающие в результате мутаций или селекции по адаптивно значимым признакам, приводят к изменениям в системе метаболизма стресс-связанных гормонов, и наоборот, изменения в метаболизме последних приводят к изменениям в приспособленности дрозофилы.
8. Показано, что нарушение ответа системы метаболизма ювенильного гормона на действие стрессора приводит к сниженнию плодовитости самок D. virilis и D. melanogaster в нормальных условиях, но дает им преимущество в оставлении потомства в стрессирующих условиях. Обнаружено, что особи, имеющие такие нарушения, с высокой частотой встречаются в природных популяциях D. melanogaster.
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Грунтенко Н.Е., Хлебодарова Т.М., Гренбэк Л.Г., Захаров И.К., Раушенбах И.Ю. Полиморфизм природных популяций Drosophila melanogaster по уровню метаболизма ювенильного гормона и реакции на тепловой стресс // Генетика. – 1995. – Т. 31. – С. 201-204.
2. Грунтенко Н.Е., Хлебодарова Т.М., Мазуров М.М., Гренбэк Л.Г., Суханова М.Ж., Шумная Л.В., Захаров И.К., Хэммок Б.Д., Раушенбах И.Ю. Роль метаболизма ювенильного гормона в адаптации популяций Drosophila к стрессирующим условиям среды // Генетика. – 1996. – Т. 32. – С. 1191-1198.
3. Rauschenbach I.Yu., Gruntenko N.E., Khlebodarova T.M., Mazurov M.M., Grenback L.G., Sukhanova M.Jh., Shumnaja L.V., Zakharov I.K., Hammock B.D.
The role of the degradation system of the juvenile hormone in the reproduction of Drosophila under stress // J.Insect Physiol. – 1996. – V. 42. – P. 735-742.
4. Грунтенко Н.Е., Хлебодарова Т.М., Анкилова И.А., Суханова М.Ж., Кайданов Л.З., Раушенбах И.Ю. Селекция по половому поведению изменяет метаболизм ювенильного гормона у Drosophila melanogaster // Генетика. – 1998. – Т. 34. – С. 480-485.
5. Грунтенко Н.Е., Раушенбах И.Ю. Роль ювенильного гормона в контроле размножения насекомых // Успехи совр. биол. – 1998- Т. 118. – С. 687-692.
6. Gruntenko N.Е., Khlebodarova Т.М., Sukhanova М.Jh., Vasenkova I.А., Kaidanov L.Z., Rauschenbach I.Yu. Prolonged negative selection of Drosophila melanogaster for a character of adaptive significance disturbs stress reactivity // Insect Biochem. Mol. Biol. – 1999. – V.29. – P. 445-452.
7. Gruntenko N.E., Khlebodarova T.M., Vasenkova I.A., Sukhanova M.Jh., Wilson T.G., Rauschenbach I.Yu. Stress-reactivity of a Drosophila melanogaster strain with impaired juvenile hormone action // J. Insect Physiol. – 2000. - V. 46. - P.
451-456.
8. Gruntenko N.E., Wilson T.G., Monastirioti M., Rauschenbach I.Yu. Stress reactivity and juvenile hormone degradation in Drosophila melanogaster strains having stress-related mutations // Insect Biochem. Mol. Biol. – 2000. – V. 30. – P.
775-783.
9. Gruntenko N.E., Monastirioti M., Wilson T.G., Chentsova N.A., Sukhanova M.Zh., Rauschenbach I.Yu. Role of stress response in adaptation of individuals and populations (Drosophila model) // Proceedings of the international conference “Biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia”. – Novosibirsk. – 2000. – V. 1. – Part 1. – P. 31-33.
10. Грунтенко Н.Е., Монастириоти М., Раушенбах И.Ю. Биогенные амины контролируют метаболизм ювенильного гормона у имаго Drosophila melanogaster // Докл. РАН. – 2001. – Т. 376. – С. 427-429.
11. Грунтенко Н.Е., Андреенкова Е.В., Монастириоти М., Раушенбах И.Ю.
Биогенные амины негативно регулируют активность синтезирующих их ферментов у имаго Drosophila // Докл. РАН. – 2001. – Т. 379. – С. 567-569.
12. Раушенбах И.Ю., Грунтенко Н.Е., Ченцова Н.А., Хирашима А., Суханова М.Ж., Андреенкова Е.В., Глазко Г.В. Взаимодействие гормонов в контроле репродуктивной функции самок Drosophila в условиях стресса генетически детерминировано // Генетика. – 2001. – Т. 37. – С. 1243-1250.
13. Грунтенко Н.Е., Хлебодарова Т.М., Васенкова И.А., Уилсон Т.Г., Ченцова Н.А., Раушенбах И.Ю. Мутация, нарушающая рецепцию ювенильного гормона, изменяет репродуктивные характеристики Drosophila melanogaster в норме и при стрессе // Труды международной конференции “Генетика i Селекцiя в Украiнi на Межi Тисячщлiть”. – Киiв. – 2001. – Т. 1. – С. 238-241.
14. Gruntenko N.E., Adonjeva N.B., Karpova E.K., Chentsova N.A., Faddeeva N.V., Rauschenbach I.Yu. Dopamine and juvenile hormone in the control of Drosophila reproduction under normal conditions and heat stress // Proceedings of the third international conference on Bioinformatics of genome regulation and structure BGRS’2002. – Novosibirsk. – 2002. – V. 4. – P. 72-74.
15. Chentsova N.A., Gruntenko N.E., Andreenkova E.V., Adonyeva N.V., Rauschenbach I.Yu. Stress response in Drosophila melanogaster strain inactive with decreased tyramine and octopamine content // J. Comp. Physiol. B. – 2002. – V. 172. – P. 643-650.
16. Раушенбах И.Ю., Адоньева Н.В., Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К., Ченцова Н.А., Фаддеева Н.В. Синтез и деградация ювенильного гормона у Drosophila находятся под общим контролем // Докл. РАН. – 2002. – Т. 386. – С. 136-138.
17. Gruntenko N.Е., Chentsova N.A., Andreenkova E.V., Bownes M., Segal D., Adonyeva N.V., Rauschenbach I.Yu. Stress response in a juvenile hormone deficient Drosophila melanogaster mutant apterous56f // Insect Mol. Biol. – 2003. – V. 12. – N. 4. – P. 353-363.
18. Gruntenko N.Е., Bownes M., Terashima J., Sukhanova M.Zh., Rauschenbach I.Yu.
Heat stress affects oogenesis differently in wild type Drosophila virilis and a mutant with altered juvenile hormone and 20-hydroxyecdysone levels // Insect Mol. Biol. – 2003. – V. 12. – N. 4. – P. 393-404.
19. Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К., Раушенбах И.Ю. Ювенильный гормон контролирует откладку яиц у Drosophila при тепловом стрессе // Докл. РАН.
– 2003. – Т. 392. – N. 2. – С. 283-285.
20. Раушенбах И.Ю., Грунтенко Н.Е., Баунс М., Карпова Е.К., Ченцова Н.А., Суханова М.Ж., Адоньева Н.В. При стрессе экдистероиды контролируют ранние, а ювенильный гормон поздние стадии оогенеза у Drosophila // Докл.
РАН. – 2003. – T. 389. – N. 1. – С. 139-141.
21. Раушенбах И.Ю., Ченцова Н.А., Грунтенко Н.Е., Фаддеева Н.В., Богомолова Е.В. Баланс аллелей, регулирующих базальный уровень дофамина у Drosophila, адаптивен для популяции // Докл. РАН. – 2003. – T. 393. – N. 6. – С. 847-848.
22. Gruntenko N.Е., Chentsova N.A., Andreenkova E.V., Karpova E.K., Glazko G.V., Monastirioti M., Rauschenbach I.Yu. The effect of mutations altering biogenic amine metabolism in Drosophila on viability and the response to heat stress // Arch. Insect Biochem. Physiol. – 2004. – V. 55. – N. 2. – C. 55-67.
23. Raushenbach I.Y., Gruntenko N.E., Bownes M., Adonieva N.V., Terashima J., Karpova E.K., Faddeeva N.V., Chentsova N.A. The role of juvenile hormone in the control of reproductive function in Drosophila virilis under nutritional stress // J.
Insect Physiol. – 2004. – V. 50. – P. 323-330.
24. Грунтенко Н.Е., Раушенбах И.Ю. Адаптивное значение генов, контролирующих уровень биогенных аминов Drosophila // Генетика. – 2004. – Т. 40. – N. 7. – С. 869-876.
25. Раушенбах И.Ю., Грунтенко Н.Е., Ченцова Н.А., Адоньева Н.В., Карпова Е.К.
Наличие обратной связи в регуляции титра ювенильного гормона биогенными аминами у Drosophilidae // Докл. РАН. – 2004. – Т. 397. – N. 3. – С. 427-429.
26. Раушенбах И.Ю., Адоньева Н.В., Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К., Фаддеева Н.В. Ювенильный гормон контролирует процесс откладки яиц и плодовитость Drosophila virilis при голоде // Онтогенез. – 2004. – Т. 35. – N. 5.
– С. 366-371.
27. Gruntenko N.E., Karpova E.K., Adonyeva N.V., Chentsova N.A., Faddeeva NV, Alekseev A.A., Rauschenbach I.Yu. Juvenile hormone, 20-hydroxyecdysone and dopamine interaction in Drosophila virilis reproduction under normal and nutritional stress conditions // J. Insect Physiol. – 2005. – V. 51. – P. 417-425.
28. Gruntenko N.E., Karpova E.K., Alekseev A.A., Chentsova N.A., Saprykina Z.V., Bownes M., Rauschenbach I.Yu. Effects of dopamine on juvenile hormone metabolism and fitness in Drosophila virilis // J Insect Physiol. – 2005. – V. 51. – P. 959-968.
29. Раушенбах И.Ю., Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К., Адоньева Н.В., Алексеев А.А., Володин В.В. 20-гидроксиэкдизон взаимодействует с ювенильным гормоном и дофамином в контроле плодовитости Drosophila virilis // Докл.
РАН. – 2005. – Т. 400. – С. 847-849.
30. Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К., Алексеев А.А., Фаддеева Н.В., Раушенбах И.Ю. Экспериментальное снижение уровня дофамина драматически снижает приспособленность Drosophila virilis // Докл. РАН. – 2005. – Т. 401. – С. 424 426.
31. Карпова Е.К.,. Грунтенко Н.Е, Раушенбах И.Ю. Ген ecdysoneless1 регулирует метаболизм ювенильного гормона и дофамина у Drosophila melanogaster // Генетика. – 2005. – Т. 41. – N. 11. – C. 1480-1486.
32. Раушенбах И.Ю., Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К., Адоньева Н.В., Алексеев А.А., Ченцова Н.А., Шумная Л.В., Фаддеева Н.В. Механизм влияния мутации apterous56f на репродуктивную функцию Drosophila melanogaster // Генетика.
– 2006. – Т. 42. – N. 2. – С. 169-176.
33. Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К., Алексеев А.А., Н.А. Ченцова, Шумная Л.В., Ушакова М.А., Раушенбах И.Ю. Повышение уровня дофамина ускоряет половое созревание особей Drosophila melanogaster с дефицитом ювенильного гормона // Докл. РАН. – 2006. – Т. – 406. – N. 4. – С. 561-563.
34. Раушенбах И.Ю., Ченцова Н.А., Алексеев А.А., Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К.
Дофамин влияет на уровень 20-гидроксиэкдизона у самок Drosophila virilis // Докл. РАН. – 2006. – Т. 407. – N. 5. – С. 715-717.
35. Раушенбах И.Ю., Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К., Алексеев А.А., Ченцова Н.А.
Влияние октопамина на репродуктивную функцию Drosophila melanogaster опосредуется гонадотропинами // Докл. РАН. – 2006. – Т. 410. – N. 5. – С.
407-409.
36. Раушенбах И.Ю, Ченцова Н.А., Грунтенко Н.Е., Алексеев А.А., Комарова Т.Н., Васильев В.Г. Октопамин регулирует уровень 20-гидроксиэкдизона у самок Drosophila // Докл. РАН. – 2006. – Т. 411. – N. 1. – C. 461-463.
37. Раушенбах И.Ю., Карпова Е.К., Грунтенко Н.Е., Сапрыкина З.В., Шумная Л.В., Фаддеева Н.В. Биогенные амины, как нейрогормоны, регулируют репродуктивную функцию Drosophila // Онтогенез. – 2007. – Т. 38. – N. 1. – C.
52-58.
38. Раушенбах И.Ю., Карпова Е.К., Грунтенко Н.Е., Шумная Л.В., Фаддеева Н.В.
Влияние биогенных аминов на метаболизм ювенильного гормона в норме и при тепловом стрессе у самцов Drosophila // Докл. РАН. – 2007. – Т. 413. – N.
1. – С. 135-137.
39. Gruntenko N.E., Karpova E.K., Alekseev A.A., Chentsova N.A., Bogomolova E.V, Faddeeva N.V., Saprykina Z.V., Bownes M., Rauschenbach I.Yu. Effects of octopamine on juvenile hormone metabolism, dopamine and 20-hydroxyecdysone contents and reproduction in Drosophila // Arch. Insect Biochem. Physiol. – 2007.
– V. 65. – N. 2. – P. 85-94.
40. Rauschenbach I.Yu., Chentsova N.A., Alekseev A.A., Gruntenko N.Е., Adonyeva N.V., Karpova E.K., Komarova T.N., Vasiliev V.G., Bownes M. Dopamine and octopamine regulate 20-hydroxyecdysone level in vivo in Drosophila // Arch.
Insect Biochem. Physiol. – 2007. – V. 65. – N. 2. – P. 95-102.
41. Раушенбах И.Ю., Грунтенко Н.Е., Адоньева Н.В., Шумная Л.В., Фаддеева Н.В. Нарушение баланса гонадотропинов снижает приспособленность Drosophila // Докл. РАН. – 2007. – Т. 415. – N. 1. – С. 139-147.
42. Gruntenko N.E., Rauschenbach I.Yu. 20-hydroxyecdysone, juvenile hormone and biogenic amines: mechanisms of interaction in control of Drosophila reproduction under normal and stressful conditions // In Ecdysone, structures and functions. – Berlin: Springer, – in press.
Подписано к печати 00.00.2008 г.
Формат бумаги 60х90 1/16. Печ. л. 2. Уч.-изд. л. 1, Тираж 100 экз. Заказ 00.
Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева,