Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов термальных источников камчатки
На правах рукописи
ГУМЕРОВ ВАДИМ МИРБАЕВИЧ Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов термальных источников Камчатки 03.01.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2011
Работа выполнена в лаборатории систем молекулярного клонирования Учреждения Российской академии наук Центра «Биоинженерия» РАН Научные руководители: доктор биологических наук Равин Николай Викторович кандидат биологических наук Марданов Андрей Владимирович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич кандидат биологических наук Черных Николай Александрович
Ведущая организация:
Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Защита диссертации состоится «24» июня 2011 г. в часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан «» мая 2011г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Исследование структур микробных сообществ, ассоциированных с высокотемпературными экологическими нишами, представляет интерес для фундаментальной микробиологии, в том числе эволюционной, поскольку многие обитающие в этих условиях микроорганизмы относятся к эволюционно древним ветвям бактерий и архей. Анализ структуры сообществ термофильных микроорганизмов проводился с момента их обнаружения микробиологическими методами, предполагающими получение и характеристику чистых культур микроорганизмов. В последние 20 лет также применяются не требующие культивирования молекулярные методы, основанные на ПЦР-амплификации и секвенировании фрагментов генов 16S рибосомной РНК. Применение методов анализа 16S рРНК показало, что, как правило, не более 0.1-1% микроорганизмов удается культивировать в лабораторных условиях. Эти работы позволили выявить новые филогенетические группы прокариот, в том числе таксоны высокого уровня, для многих из которых до настоящего времени не получено культивируемых представителей. Однако, применявшиеся до последнего времени методы анализа 16S РНК предполагали клонирование фрагментов генов 16S РНК и секвенирование отдельных клонов с помощью капиллярного электрофореза, что на практике позволяло проанализировать не более нескольких сот последо-вательностей 16S рРНК. Однако, многие природные сообщества могут содержать тысячи различных видов микроорганизмов (Huber et al., 2007).
Развитие методов геномного секвенирования в последние несколько лет позволило совершить качественный скачок в их производительности, заключающийся в возможности проведения единовременного анализа десятков сотен тысяч нуклеотидных последовательностей. Применение методов пиросеквенирования позволяет проводить «глубокую» характеристику микробного сообщества, выявляя не только доминирующие виды, но и минорные компоненты сообщества, а также количественно определять доли отдельных групп, что необходимо для реконструкции путей метаболизма сообщества в целом (Sogin et al., 2006).
За последние 30 лет из термальных источников Камчатки было выделено большое число новых термофильных бактерий и архей, в том числе представляющих обособленные филогенетические группы и характеризующихся различными типами метаболизма (Заварзин, 2004;
Лебединский и др., 2007).
Однако по сравнению с такими объектами, как гейзеры Исландии и Йеллоустонского парка США, биоразнообразие термофильных микроорганизмов Камчатки менее изучено. Помимо культуральных методов, для характеристики термофилов Камчатки использовались традиционные молекулярные методы анализа 16S рРНК, однако, число анализируемых независимых последовательностей в разных работах не превышало нескольких десятков. Таким образом, задача «глубокой» количественной характеристики сообществ термофильных микроорганизмов, в особенности горячих источников Камчатки, является актуальной и представляет интерес для фундаментальных исследований в области микробиологии и молекулярной биологии.
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является определение структур сообществ микроорганизмов термальных источников кальдеры вулкана Узон, Камчатка.
Для этого в работе решались следующие задачи:
1. Отбор образцов и выделение препаратов метагеномной ДНК из термальных источников кальдеры вулкана Узон, различающихся по температуре и кислотности.
2. Идентификация микроорганизмов на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рибосомной РНК, определенных методом пиросеквенирования.
3. Реконструкция путей метаболизма сообществ в целом на основе данных об их составе.
4. Определение полной нуклеотидной последовательности генома термофильной археи рода Vulcanisaeta, широко распространенного в кислых термальных источниках, анализ путей ее метаболизма и возможной экологической роли в термальных сообществах.
Научная новизна и практическая значимость работы Впервые проведена глубокая количественная характеристика состава сообществ микроорганизмов термальных источников Камчатки с помощью высокопроизводительного пиросеквенирования фрагментов генов 16S рРНК.
Определена зависимость состава и степени разнообразия микробных сообществ от температуры и рН. Установлено, что в источниках с нейтральным рН разнообразие микроорганизмов максимально при умеренно высоких температурах (55-58oС), при этом в сообществе доминируют термофильные бактерии, а доля архей незначительна. В кислых источниках (рН 3.7-4.1) большинство микроорганизмов сообществ составляют археи, причем в источнике с температурой около 50oС доминируют различные линии архей, не имеющие культивируемых представителей, в источниках с температурой 60 90oС, - кренархеи порядка Sulfolobales и наноархеи.
Определена полная нуклеотидная последовательность генома термоацидофильной археи рода Vulcanisaeta, широко распространенного в кислых термальных источниках. Анализ генома и путей метаболизма этой археи показал, что представители рода Vulcanisaeta могут играть важную экологическую роль в кислых гидротермах, завершая анаэробный цикл углерода и осуществляя полное окисление органических веществ.
Практическая значимость работы обусловлена биотехнологическим потенциалом термофильных микроорганизмов. Идентифицированные в геноме Vulcanisaeta moutnovskia гидролитические ферменты могут быть использованы для разработки новых биотехнологий, основанных на применении термостабильных ферментов.
Апробация работы Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", (г. Петропавловск-Камчатский, 2010), “Extremophiles 2010” (Португалия, 2010), 15-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука ХХI века» (г. Пущино, 2011), 11th International Symposium on Bacterial Genetics and Ecology "BAGECO 11" (Греция, 2011).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.
Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 141 странице машинописного текста и включают 36 рисунков и 19 таблиц. Диссертация состоит из разделов:
“Введение”, “Цель и задачи работы”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты”, “Обсуждение”, “Выводы”, “Cписок публикаций по теме диссертации”, “Cписок цитируемой литературы”, который содержит отечественных и 186 иностранных источников.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Кальдера вулкана Узон располагается в центральной части Восточного вулканического пояса Камчатки, ее формирование закончилось около 40 тыс. лет назад. В кальдере располагается большое количество термальных источников, характеризующихся различными значениями температуры и pH, а также химическим составом воды. В качестве объектов исследования были выбраны источники, различающиеся двумя важнейшими показателями, - температурой и рН воды. Это три «кислых» источника «1805», «1810» и «1884», различающихся по температуре, а также «нейтральный» источник Заварзина (Табл. 1). Пробы биоматериала (воды с взвесью грунта) были отобраны в ходе экспедиций в кальдеру Узон в 2008 и 2009гг.
Таблица 1. Основные физико-химические характеристики источников.
Источник «1884» «1805» «1810» Заварзина 55-58oС 50oC 60oC 89-91oC температура рН 6.3 4.0 3.7 4. Микробное сообщество воды источника Заварзина Источник Заварзина представляет собой мелкий бассейн размером 4.5 х 2.3 метра, наполняемый многочисленными термальными выходами, благодаря которым вода в источнике активно перемешивается. В менее горячих участках, расположенных по краям, дно источника покрыто цианобактериальным матом.
Отбор воды проводили в поверхностном слое, чтобы исключить попадание в пробу донных отложений.
Для проведения количественного анализа состава микробного сообщества использовали метод, основанный на пиросеквенировании вариабельного района V3 генов 16S рРНК. Для амплификации фрагментов генов 16S рРНК из препарата метагеномной ДНК были использованы «универсальные» праймеры U341F (5'-CCTACGGGRSGCAGCAG) и U515R (5' TTACCGCGGCKGCTGVCAC). Пиросеквенирование ПЦР фрагмента осуществляли на геномном анализаторе GS FLX (Roche). Данные анализировали с помощью пакета программ RDP Classifier (Cole et al., 2009). Сначала полученные последовательности разделяли на бактериальные и архейные с помощью RDP Naive Bayesian rRNA Classifier Version 2.0, в дальнейшем последовательности бактерий и архей анализировали отдельно. Анализ последовательностей V3 районов 16S рРНК архей и бактерий проводили с помощью Pyrosequencing pipeline, входящей в RDP Classifier. Для этого проводили выравнивание и кластерный анализ последовательностей.
Кластеризацию проводили на разных уровнях, характеризующихся различными расстояниями между кластерами (от 0 до 0.3), соответствующих разным таксономическим уровням. Для каждого кластера была выбрана «репрезентативная» последовательность, соответствующая «центру» кластера.
Состав сообществ определяли в результате таксономической классификации репрезентативных последовательностей кластеров.
В результате пиросеквенирования V3 района гена 16S рРНК микроорганизмов источника Заварзина было определено последовательности, из которых к бактериальным 16S рРНК было отнесено 35702, к архейным – 1666. Таким образом, археи составляют лишь около 4.5% микроорганизмов сообщества. Преобладание бактерий также характерно для нейтральных и слабощелочных источников Йеллоустонского парка;
археи могут являться доминирующим компонентом наиболее «экстремальных» местообитаний c температурами выше 80оС и низким рН.
Большая часть «репрезентативных» последовательностей кластеров имела гомологию на уровне выше 95% с 16S рРНК известных микроорганизмов;
в этом случае кластер относили к соответствующему роду. При отсутствии такого гомолога таксономическую классификацию кластера проводили в результате построения филогенетического дерева, включающего выборку последовательностей 16S рРНК.
Рисунок 1.
Состав микробного сообщества источника Заварзина Наибольшую долю (Рис. 1) в сообществе (32.3% всех последовательностей) составляли хемолитоавтотрофные бактерии типа Aquificae, родов Sulfurihydrogenibium (21.6%) и Thermosulfidibacter (10.7%).
Sulfurihydrogenibium обычно встречаются в нейтральных источниках с температурой до 75°C (Reysenbach et al., 2005). Это микроаэрофильные микроорганизмы, среди которых встречаются как облигатные хемолитоавтотрофы, окисляющие серу и ее соединения с использованием кислорода в качестве акцептора электронов, так и факультативные гетеротрофы (O'Neill et al., 2008). В отличие от них представители Thermosulfidibacter являются анаэробами, окисляющими водород за счет восстановления серы (Nunoura et al. 2008). Также среди автотрофных микроорганизмов идентифицированы представители Thermodesulfobacteria (7.3%), гамма протеобактерии Thiofaba (7.6%), дельта-протеобактерии Desulfurella (2.6%), и бета-протеобактерии Thiomonas (0.6%). Цианобактерии, образующие мат на дне источника, в водной фазе составляли менее 0.2% микроорганизмов.
Меньшая доля приходится на органотрофные организмы. К ним относятся представители рода Calditerrivibrio типа Deferribacteres (12.1%). Известные до сих пор представители этого рода - органотрофные анаэробы, использующие в качестве акцептора электронов нитрат, восстанавливая его до аммония (Iino et al., 2008r). Распространенность Calditerrivibrio в источнике Заварзина может быть обусловлена одним из самых высоких на Узоне содержанием ионов нитрата в воде (0.5 мМ). Около 6.3% последовательностей отнесены к роду Fervidobacterium типа Thermotogae, представители которого анаэробно сбраживают органические вещества, в том числе гидролизуя различные белковые субстраты и полисахариды. Гетеротрофные бактерии также представлены бета-протеобактериями Tepidimonas (6.0%), представителями типов Deinococcus-Thermus (4.4%), Caldiserica (1.7%) и Dictyoglomi (1.6%).
Около 1.9% микроорганизмов относились к типу BRC1, не имеющему культивируемых представителей. Еще около 0.2% бактерий образуют новую филогенетическую ветвь уровня типа, представители которого были обнаружены только в источнике Заварзина.
Среди архей были обнаружены представители типов Euryarchaeota (42% архейных последовательностей, в основном представители порядка Thermoplasmatales), Crenarchaeota (50%), Korarchaeota (7.5%) и Nanoarchaeota (0.5%).
Проведенный филогенетический анализ позволил классифицировать абсолютное большинство микроорганизмов сообщества на уровне рода или семейства. Хотя филогенетическая близость не всегда коррелирует со сходством путей метаболизма микроорганизмов, полученные данные позволяют выдвинуть гипотезы о природе экологических взаимосвязей между основными группами микроорганизмов. Поскольку температура источника ниже верхней границы, возможен фотосинтез (около 70оС), первичная продукция при которой органического вещества может осуществляться как фотосинтетически, покрывающим дно источника цианобактериальным матом, так и хемолитоавтотрофно, в результате окисления восстановленных субстратов вулканического происхождения, поставляемых геотермальным потоком.
Хемолитоавторофная продукция может осуществляться в аэробных или микроаэрофильных условиях за счет окисления серы и ее восстановленных соединений (Thiofaba, Sulfurihydrogenibium), а в анаэробной зоне, - за счет окисления водорода с использованием в качестве акцептора электронов серы (Caldimicrobium, Thermosulfidibacter, Thiomonas). Еще один потенциальный источник энергии, метан, по-видимому, не используется в условиях источника Заварзина, поскольку мы не обнаружили представителей известных метанотрофных бактерий.
Образуемая фотосинтетиками и хемолитоавтотрофами, а также поступающая с поверхностными водами из окружающих низкотемпературных зон органика может использоваться разнообразными органотрофными микроорганизмами, представленными в основном анаэробами. В их число входят как бактерии, сбраживающие органические субстраты (Fervidobacterium, Dictyoglomus, Cadldisericum), так и осуществляющие ее полное окисление за счет использования в качестве акцептора электронов кислорода (Thermus), серы (Desulfurella) или нитрата (Calditerrivibrio).
В целом, источник Заварзина характеризуется разнообразием обитающих в нем термофильных прокариот. В нем представлены микроорганизмы различных таксонов высокого уровня, характеризующиеся разнообразными типами метаболизма. При этом не наблюдается абсолютное доминирование какой-либо одной группы микроорганизмов, например, Aquificae, которые составляли более 95% сообщества в высокотемпературных источниках Йеллоустонского парка (Spear et al, 2005). Вероятно, это обусловлено как сравнительно умеренными значениями температуры и рН, так и разнообразием процессов первичной продукции органических веществ.
Микробное сообщество источника «1884» Участок, с которого производился отбор образцов, представляет собой место выноса на поверхность углеводородов термальными водами. Для отбора проб с этого участка была выкопана ямка размером 20х30 см и глубиной около 20 см., которая немедленно заполнилась грунтовой водой, имевшей температуру 50oC и рН 4.0. Особенностью химического состава воды является высокое содержание сульфатов (384 мг/л) при практически полном отсутствии ионов нитрата и нитрита (менее 0.1 мг/л). Газовая фаза содержит CO2 (91.2%), H2S (3.2%), N2 (2.1%), CH4 (2.0%), и H2 (1.4%).
Для амплификации последовательностей V3 регионов были использованы две пары праймеров: «универсальные» праймеры U341F/ U515R и пара праймеров A333F (5' – TCCAGGCCCTACGGG)/ U534Rm (5' GWATTACCGCGGCKGCTG) для детекции архейных 16S рРНК. Оба ПЦР фрагмента были просеквенированы на GS FLX (Roche). Набор, полученный с помощью «универсальных» праймеров содержал 12234 бактериальных и архейных последовательностей V3 регионов 16S рРНК, таким образом, археи составляют как минимум 70% всех микроорганизмов. Поскольку с помощью «универсальных» праймеров нам не удалось детектировать некоторые некультивируемые линии кренархей, реальная доля архей в сообществе может быть даже выше. Набор данных, полученных с «архейными» праймерами, состоял из 35479 последовательностей, из которых 29837 представляли 16S рРНК архей, а остальные либо были бактериальными, либо не имели гомологии с 16S рРНК. Таким образом, 12234 бактериальные последовательности из «универсального» набора использовали для характеристики бактерий, а архейных последовательностей из «архейного» набора данных – для анализа архейного компонента сообщества источника «1884».
Микробное сообщество источника «1884» имело крайне необычный состав. В отсутствии фотосинтеза первичная продукция органических веществ может обеспечиваться за счет использования неорганических субстратов вулканического происхождения, к которым относятся метан, водород и восстановленные соединения серы, присутствующие в «1884». Наиболее многочисленная группа бактерий (41% всех бактериальных последовательностей, Рис. 2) относилась к типу Verrucomicrobia, однако большинство последовательностей имело низкий уровень гомологии с культивируемыми представителями этого типа. Поэтому для более точной таксономической идентификации этой группы было построено филогенетическое дерево (Рис. 3), включающее репрезентативную выборку последовательностей 16S рРНК представителей Verrucomicrobia и репрезентативные последовательности кластеров, отнесенные к Verrucomicrobia.
Структура этого филогенетического дерева показывает, что последовательности из источника «1884» относятся к недавно открытой линии Verrucomicrobia, объединяющей термоацидофильных метанотрофов.
Рисунок 2. Состав бактериального компонента микробного сообщества источника «1884» Метанотрофные бактерии типа Verrucomicrobia были выделены практически одновременно в трех географически изолированных вулканических районах (Италия, Новая Зеландия и Камчатка);
они растут, получая энергию за счет аэробного окисления метана при рН в диапазоне 0.8-6.0 и температурах 40 65°С (Dunfield et al. 2007;
Pol et al. 2007;
Islam et al. 2008). Метан используется и как источник углерода. Один из штаммов - Methylacidiphylum kamchatkensis был выделен из горячего источника Восточного термального поля кальдеры Узон, имеющего температуру 52oC и рН 3.0 (Islam et al. 2008). Наши результаты показывают, что метанотрофные представители Verrucomicrobia составляют экологически-значимую часть микробного сообщества.
Proteobacteria составляют около четверти бактерий сообщества, к ним относится вторая по численности группа бактерий, - гамма-протеобактерии рода Acidithiobacillus (19% всех бактериальных последовательностей). Эти бактерии являются ацидофильными аэробными хемолитоавтотрофами, получающими энергию за счет окисления металлов и неорганических соединений серы, и фиксирующими СО2 через цикл Кальвина (Valdes et al., 2008). Acidithiobacullus образуют сульфат в качестве продукта окисления серы и ее восстановленных соединений (напр. сероводорода), поэтому именно их активность может объяснять высокую концентрацию сульфатов в источнике и низкий рН (4.0), оптимальный для роста метанотрофов.
Рисунок 3. Филогенетическое дерево, построенное методом Neighbour-joining, включающее последовательности 16S рРНК клонов, отнесенных к Verrucomicrobia (KamMFB22 - KamMFB26) и различных представителей типа Verrucomicrobia. Доли кластеров в общем числе бактериальных последовательностей 16S рРНК указаны в процентах.. VTAM, - кластер термоацидофильных метанотрофов (Islam et al. 2008).
Около 12% бактериальных последовательностей относились к типу Firmicutes. Большинство из них (9% всех бактерий) представляли род Geobacillus, представители которого осуществляют аэробную деградацию углеводородов (Nazina et al. 2001).
В отличие от бактерий, менее чем 5% архейных последовательностей имели гомологию на уровне 95% и выше с 16S рРНК с какого-либо известного микроорганизма и, следовательно, могли быть отнесены к определенному роду.
Около 39% архей (Рис. 4) образуют несколько филогенетических линий, относящихся к порядку Thermoplasmatales, включающему ацидофильные микроорганизмы, окисляющие органические вещества, используя в качестве акцептора электронов кислород или, в анаэробных условиях, серу. Клоны с близкими последовательностями 16S РНК (97-99% идентичности) были найдены в кислых термальных источниках или грунте в различных вулканических районах.
Рисунок 4. Состав архейного компонента микробного сообщества источника «1884» Кренархеи порядка Fervidicoccales (Perevalova et al. 2010) составляют около 9.1% всех архей (Рис. 4). Эти микроорганизмы, растущие при умеренно высоких температурах и слабой кислотности (для F. fontis диапазон роста 55 85oС, диапазон рН 4.5-7.5), анаэробно сбраживают органические вещества с образованием ацетата и водорода. Среди кренархей были обнаружены представители известных «культивируемых» термофильных порядков Acidilobales (род Acidilobus), Sulfolobales (род Sulfolobus) и Thermoproteales (роды Thermoproteus, Vulcanisaeta и Thermofilum), но они составляли лишь незначительную часть сообщества.
Около 47% всех архейных последовательностей представляли различные линии кренархей, не имеющие культивируемых представителей и известные только по последовательностям 16S рРНК, выделенным из природных источников. Большая часть (33% всех архей) принадлежит к Miscellaneous crenarchaeal group I (MCG1) и кластеризуется с клоном pJP89, первоначально детектированном в термальном источнике Йеллоустонского парка США (Barns et al. 1996). Близкие к найденным в этой работе клоны были обнаружены в термальных источниках Йеллоустонского парка США, Исландии, Болгарии.
Большинство из них, однако, были детектированы в высокотемпературных местообитаниях с нейтральным рН. Возможно, умеренно термоацидофильные условия оптимальны для роста этих организмов, обнаруживаемых в высокотемпературных условиях лишь как минорные компоненты сообщества.
Широкая распространенность pJP89-подобных кренархей и некультивируемых линий порядка Thermoplasmatales свидетельствует о том, что эти группы могут играть важную экологическую роль в термофильных сообществах. Дальнейшие исследования, предполагающие культивирование и/или метагеномное секвенирование этих архей, могут прояснить пути их метаболизма и экологические роли.
В целом, литоавтотрофы составляют более половины бактериальной популяции, однако, их доля составляет всего лишь около 20% от всего сообщества, в котором 70% составляют археи. Другие микроорганизмы сообщества являются органотрофами (Fervidicoccales, Geobacillus, Actinobacteria), или их функциональная роль не может быть предсказана исходя из таксономической принадлежности (некультивируемые линии бактерий и архей). Поэтому можно предположить, что в сообществе присутствуют неизвестные группы термофильных литоавтотрофов, либо что сообщество зависит от притока органических веществ извне, с дождевыми водами, поступающими из окружающих районов.
Микробные сообщества кислых термальных источников «1805» и «1810» Источники «1805» и «1810» представляли собой замкнутые бассейны размерами примерно 1 х 2 м, в которых, в отличие от источника Заварзина, не наблюдался постоянный приток воды из гидротермальных выходов. Источники располагаются на расстоянии около 20 метров друг от друга, имеют близкие значения рН (3.7 и 4.1), но отличаются по температуре, составляющей 60oC в «1805» и 89-91oC в «1810». Сравнение этих источников, а также «1884», должно было выявить зависимость состава термоацидофильных микробных сообществ от температуры.
Для амплификации последовательностей V3 регионов была использована пара «универсальных» праймеров U341F/ U515R. Для образца «1805» было идентифицировано 13675 бактериальных и 17965 архейных последовательностей 16S рРНК, для образца «1810», - 9246 и последовательностей, соответственно. Таким образом, в обоих источниках археи составляют более половины микробного сообщества.
В источнике «1805» наибольшую долю в сообществе (36% всех бактериальных последовательностей 16S рРНК) составляли представители типа Aquificae (Рис. 5) относящиеся к роду Hydrogenobaculum. Представители этого рода являются аэробными хемолитоавтотрофами, они широко распространены и часто являются доминирующими в кислых источниках Йеллоустонского парка с высоким содержанием серы. Однако, Aquificales отсутствовали в более горячем источнике «1810». Вероятно, в этом случае сочетание экстремально высокой температуры, кислотности и восстановленной анаэробной среды исключает развитие Aquificales.
Рисунок 5. Состав бактериального компонента микробных сообществ источников «1805» (слева) и «1810» (справа).
Неожиданным оказалось обнаружение в обоих источниках различных групп бактерий, не описанных как гипертермофилы. За исключением Aquificales в обоих источниках были обнаружены одни и те же группы бактерий, Firmicutes (Bacillus sp.), Alphaproteobacteria (Sphingomonas sp. и Caulobacter sp.), Betaproteobacteria (Burkholderia sp.), Gammaproteobacteria (Acidithiobacillus sp. и Halomonas sp.) и др. Более того, если исключить из рассмотрения Aquificales, относительные доли основных групп бактерий в источниках «1805» и «1810» окажутся практически одинаковыми. Наиболее вероятным объяснением эти данных является то, что бактерии, за исключением Aquificales в источнике «1805», являются не естественными компонентами этих сообществ, а попали в источники извне, с дождевыми водами из окружающих низкотемпературных районов. Оба источника расположены вблизи друг от друга, что объясняет сходство состава «экзогенных» бактерий. Кроме того, в источниках «1805» и «1810» отсутствует постоянный приток воды из гидротермальных выходов, который мог бы постоянно обновлять воду источника, удаляя попавшие извне микроорганизмы. Таким образом, если сделанное нами предположение верно, единственной группой бактерий, обитающих в «1805», являются Aquificales, относящиеся к роду Hydrogenobaculum, а в источнике «1810» бактерии вообще отсутствуют.
В отличие от бактерий, большинство архей микробных сообществ источников «1805» и «1810» относятся к известным линиям термофилов (Рис. 6).
Доминирующей группой в обоих источниках являются кренархеи порядка Sulfolobales, - типичные обитатели кислых горячих источников, например, сульфатар. Именно эти в основном аэробные археи, окисляющие водород и серу, являются первичными продуцентами в термоацидофильных сообществах.
Рисунок 6. Составы архейного компонента микробных сообществ источников «1805» и «1810» В источнике «1805» около 13% архей относятся к порядку Acidilobales (Prokofeva et al, 2009), культвируемые представители которого являются термоацидофильными анаэробными гетеротрофами, осуществляющие полное окисление органических веществ в процессе серного дыхания (Mardanov et al., 2010). Порядок Thermoproteales представляют кренархеи родов Vulcanisaeta (5% архей) и Thermoproteus (1%). Около 17% архейных последовательностей были представлены различными «некультивируемыми» линиями кренархей. Эти микроорганизмы отличались от «некультивируемых» кренархей источника «1884» и были филогенетически удалены от линии MCG1. Эуриархеи составляли незначительную долю сообщества и были представлены порядками Thermoplasmatales (2.3% архей) и Halobacteriales (0.6%).
Наиболее интересным результатом является идентификация в источниках «1805» и «1810» наноархей, составлявших, соответственно, 5% и 24% архей. Тип Nanoarchaeota представлен единственным культивируемым видом Nanoarchaeum equitans (Huber et al. 2002), растущим в ассоциации с кренархеей Ignicoccus hospitalis в глубоководных гидротермах. Анализ генома N. equitans, минимального по длине (490 т.п.н.) среди всех живых организмов, за исключением внутриклеточных паразитов, выявил потерю многих биосинтетических путей, что предполагает симбитический или паразитический образ жизни (Waters et al. 2003). Относящиеся к наноархеям последовательности 16S рРНК были идентифицированы в различных морских и наземных гидротермах, а также в мезофильных экологических нишах с высокой соленостью. Однако, во всех случаях наноархеи не составляли значительной доли микробного сообщества. Ранее описанные симбионты наноархей, кренархеи порядка Desulfurococcales, не были обнаружены в исследованных нами кислых термальных источниках, что предполагает существование других хозяев. Большая доля наноархей в источнике «1810» по сравнению с «1805» коррелирует с увеличением долей кренархей рода Thermoproteus (12% / 1%) и эуриархей порядка Halobacteriales (5% / 1%), что позволяет предположить принадлежность симбионтов наноархей к одной из этих групп. Однако, многочисленность наноархей в экстремально термоацидофильных микробных сообществах может свидетельствовать и в пользу возможности того, что эти наноархеи являются не симбиотическими, а свободноживущими организмами.
Оценка биоразнообразия микробных сообществ Важнейшим преимуществом метода пиросеквенирования по сравнению с традиционными молекулярными методами анализа 16S рРНК, является возможность единовременного определения десятков тысяч независимых последовательностей, что позволяет описывать разнообразие «сложных» сообществ, включающих сотни видов организмов. Однако, частота ошибок при пиросеквенировании значительно выше, чем при использовании традиционного Сэнжеровского метода, причем большая часть ошибок приходится на гомополимерные участки. Такие последовательности с ошибками, принимаемые за новые организмы, могут искажать истинную картину биоразнообразия, завышая реальное число филотипов в десятки раз, особенно на низких таксономических уровнях.
Для решения этой проблемы были использованы два недавно разработанных метода. Во-первых, с помощью программы AmpliconNoise из анализа были исключены последовательности низкого качества, а последовательности, различающиеся числом нуклеотидов, прочтенных в гомополимерных участках, были сгруппированы в объединяющие их кластеры, в дальнейшем рассматривавшиеся как одна последовательность, повторенная соответствующее число раз. Затем были исключены последовательности, встречающиеся в полном наборе данных только один раз и с высокой вероятностью являющиеся следствием ошибок секвенирования, а не реальным редко встречающимся филотипом. В разных образцах их доля составляла 2-5% всех последовательностей. Прошедшие фильтрацию последовательности использовали для определения биоразнообразия микроорганизмов. Оценку таксономической сложности сообществ проводили с помощью построения кривых, иллюстрирующих зависимость числа детектированных филотипов (т.е.
числа кластеров) от числа проанализированных последовательностей для различных уровней сходства нуклеотидных последовательностей.
Графики, представленные на Рис. 7 для источника Заварзина, показывают, что достигнутый объем секвенирования достаточен для полной характеристики биоразнообразия сообщества, поскольку при увеличении числа анализируемых последовательностей графики выходят на плато, т.е. дальнейшее увеличение числа просеквенированных последовательностей уже не приводит к обнаружению новых филотипов. В целом, микробное сообщество источника Заварзина включает более ста видов бактерий, другие исследованные сообщества также содержали десятки-сотни видов микроорганизмов.
Таким образом, применение пиросеквенирования позволило идентифицировать все основные группы микроорганизмов, количественно определить их доли в сообществах, и проанализировать пути метаболизма сообществ в целом. Напротив, использование традиционных молекулярных методов, предполагающих клонирование и секвенирование нескольких десятков-сотен последовательностей, позволило бы выявить лишь небольшую часть микроорганизмов (Рис. 7).
Рисунок 7. Зависимость числа филотипов разного уровня (вертикальная шкала, кластерные расстояния 0.03, 0.05 и 0.1) от числа анализируемых последовательностей V районов 16S рРНК (горизонтальная шкала) для бактерий источника Заварзина.
Секвенирование и анализ генома термоацидофильной археи Vulcanisaeta moutnovskia Представители рода Vulcanisaeta встречаются во всех трех исследованных кислых термальных источниках кальдеры Узона. На момент начала работы ни для одного представителя рода Vulcanisaeta не была определена полная геномная последовательность, поэтому для определения экологической роли, которую могут играть эти археи в термоацидофильных сообществах, мы провели полный сиквенс генома Vulcanisaeta moutnovskia 768-28. Эта архея может расти на белковых субстратах и некоторых сахарах, использую серу в качестве акцептора электрона (Prokofeva et al., 2005).
Полная нуклеотидная последовательность генома V. moutnovskia была определена методом пиросеквенирования. Геном V. moutnovskia является кольцевой хромосомой длиной 2.298.983 нт., внехромосомные элементы обнаружены не были. Поиск открытых рамок считывания выявил потенциальных белок-кодирующих генов, занимающих 88% хромосомы. В результате сравнения с базами данных белковых последовательностей функции 65% предполагаемых белков были предсказаны с различной степенью детализации и достоверности.
Анализ путей метаболизма V. moutnovskia выявил различные гликолитические ферменты, которые могут обеспечивать гидролиз белковых субстратов и полисахаридов. Окисление глюкозы может осуществляться через модифицированные пути Эмбдена-Мейергофа и Энтнера-Дудорова.
Образовавшийся пируват может окисляться пируват: ферредоксин оксидоредуктазой до ацетил-СоА и далее до ацетата ацетил-СоА синтетазой с образование АТФ. Геном Vulcanisaeta moutnovskia кодирует полный набор ферментов пути бета-окисления жирных кислот, что предполагает возможность использования организмом длинноцепочечных жирных кислот. Образующийся ацетил-СоА затем может окисляться до ацетата с образованием АТФ.
V. moutnovskia может запасать энергию как в процессе субстратного фосфорилирования, так и в процессе анаэробного дыхания в присутствии внешнего акцептора электронов. В присутствии серы или сульфата ацетил-СоА, образующийся в результате метаболизм сахаров, белков и жирных кислот может не только сбраживаться до ацетата, но и окисляться до СО2 в окислительном цикле трикарбоновых кислот (ТСА), все ферменты которого кодируются геномом V. moutnovskia. В ходе анаэробного дыхания в присутствии соединений серы восстановленный ферредоксин и NAD(P)H, образованные в цикле трикарбоновых кислот, могут быть окислены в результате согласованной работы набора мембран-связанных белковых комплексов и цитоплазматических белков, приводящей к образованию трансмембранного протонного градиента. Анализ генома выявил мембран-связанный ферредоксин: NAD(P)+ оксидоредуктазный комплекс (FNOR), который может акцептировать электроны от восстановленного ферредоксина и передавать их на NAD(P)+. В ходе этого процесса происходит перенос протонов через мембрану и формируется протонный градиент. Восстановленный NAD(P)H в дальнейшем может окисляться NAD(P)H:S оксидоредуктазой (NSR) с образованием H2S.
У многих термофильных архей, рост которых стимулируется в присутствии серы, восстановление серы осуществляется не только посредством комплекса FNOR и цитоплазматической NSR, но и посредством мембран связанной сероредуктазы, осуществляющей реакцию 2Н+ + 2e- + S0 = H2S.
Однако, в геноме V. moutnovskia два из трех генов, кодирующих субъединицы сероредуктазы, делетированы. Акцептором электронов у некоторых кренархей порядка Thermoproteales может служить нитрат, однако, гены мембран связанной нитрат редуктазы у V. moutnovskia также отсутствуют. Анализ генома V. moutnovskia выявил полный набор генов, кодирующих ферменты пути восстановления сульфатов, крайне редко встречающегося у архей и на сегодняшний день описанного только у эуриархеи Archaeoglobus fulgidus и кренархеи Caldivirga maquilingensis.
Таким образом, дыхательная цепь, функционирующая в присутствии соединений серы, является разветвленной. Во-первых, электроны от восстановленного ферредоксина могут быть использованы системами FNOR и NSR, что сопряжено с трансмембранным транспортом протонов. Часть электронов от FNOR, а также электроны от сукцинат:хинон оксидоредуктазы, являющейся мембранным компонентом ТСА, могут передаваться на хиноны в цитоплазматическую мембрану. Конечным акцептором электронов в этом случае могут являться сульфат и сульфит в процессе сульфат-редукции.
Трансмембранный протонный градиент может также генерироваться в результате работы интегральной мембранной пирофосфотазы, транспортирующей протоны. Протонный градиент, являющийся результатом действия протонных насосов и пирофосфатазы, может использоваться АТФ синтазой A1Ao типа для синтеза АТФ, сопряженного с переносом протонов внутрь клетки.
Таким образом, представители рода Vulcanisaeta могут играть важную экологическую роль в кислых горячих источниках, завершая анаэробный цикл углерода посредством анаэробного окисления органических веществ.
ВЫВОДЫ 1. Методом пиросеквенирования вариабельного участка V3 гена 16S рРНК определены составы микробных сообществ четырех термальных источников кальдеры вулкана Узон, различающихся температурой и рН воды.
2. Наибольшее разнообразие микроорганизмов при отсутствии доминирования какой-либо одной группы обнаружено в источнике Заварзина, имеющего нейтральный рН (6.3) и умеренно-высокую температуру воды (55-58oС).
Большую часть сообщества составляли бактерии Aquificae, Deferribacteres, Thermodesulfobacteria, Thermotogae, Deinococcus-Thermus, гамма- и бета протеобактерии;
археи составляли менее 5% всех микроорганизмов.
3. В кислых источниках (рН 3.7-4.1) археи составляли большинство микроорганизмов. В источнике с температурой около 50oС преобладали различные линии архей, не имеющие культивируемых представителей, а большую часть бактерий составляли Verrucomicrobia и гамма протеобактерии рода Acidithiobacillus. В источниках с температурой 60-90oС доминировали кренархеи порядка Sulfolobales и наноархеи.
4. Определена полная нуклеотидная последовательность генома термоацидофильной археи Vulcanisaeta moutnovskia. Анализ генома и путей метаболизма этой археи показал, что помимо сбраживания органических субстратов, V. moutnovskia может осуществлять их полное окисление до CO и Н2О в окислительном цикле трикарбоновых кислот.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Марданов А.В., Гумеров В.М., Белецкий А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В., Скрябин К.Г. Характеристика биоразнообразия термофильного микробного сообщества методом параллельного пиросеквенирования // Доклады Академии наук. – 2010 – Т. 432 – С. 544-548.
2. Гумеров В.М., Марданов А.В., Белецкий А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов в источнике Заварзина, кальдера Узон, Камчатка // Микробиология. – 2011 – Т. 80 – С.
258-265.
3. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Beletsky A.V., Perevalova A.A., Karpov G.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. Uncultured archaea dominate in the thermal groundwater of Uzon Caldera, Kamchatka // Extremophiles. – 2011 – V.
15 – P. 365-372.
4. Gumerov V.M., Mardanov A.V., Beletsky A.V., Prokofeva M.I., Bonch Osmolovskaya E.A., Ravin N.V., Skryabin K.G. Complete genome sequence of “Vulcanisaeta moutnovskia” strain 768-28, a novel member of the hyperthermophilic crenarchaeal genus Vulcanisaeta // J. Bacteriol. – 2011 – V. – P. 2355-2356.
5. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V.
Molecular analysis of microbial communities of hydrothermal environments of Uzon Caldera // International Workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles". 12-18 August, 2010, Petropavlovask Kamchatsky.
Abstract
book - P. 18.
6. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V.
Microbial diversity of thermal springs of Uzon Caldera, Kamchatka, as revealed by 454 pyrosequencing // International conference “Extremophiles 2010”. 12- September, 2010, Azores, Portugal. Abstract book - P. 250.
7. Гумеров В.М., Марданов А.В., Равин Н.В. Молекулярный анализ микробных сообществ термальных источников кальдеры Узон методом параллельного пиросеквенирования // 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых “Биология-наука ХХI века”. 18-22 апреля 2011, г. Пущино.
Сборник тезисов - С. 362.
8. Gumerov V.M., Mardanov A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V.
Microbial diversity in acidic hot springs of Uzon caldera, Kamchatka, as revealed by pyrosequencing of 16S RNA genes // 11th International Symposium on Bacterial Genetics and Ecology “BAGECO-11”. 29 May-02 June, 2011, Corfu, Greece. Abstract book.