Особенности внутриклеточного транспорта и биологическая активность рицина
На правах рукописи
ХАПЧАЕВ Шамиль Юсуфович ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РИЦИНА 03.00.25-03 – гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2009
Работа выполнена на Биологическом факультете Московского Государственного Университета (МГУ) имени М.В.Ломоносова.
Научный консультант: Кандидат биологических наук Мойсенович Михаил Михайлович МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва Научный консультант: Доктор биологических наук Егорова Светлана Григорьевна МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва
Официальные оппоненты: Доктор биологических наук Воробьёв Иван Андреевич Гематологический Научный Центр РАМН, Москва Кандидат биологических наук Домогатский Сергей Петрович ФГУ Российский кардиологический научно производственный комплекс Росмедтехнологий, Москва
Ведущая организация: ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроор ганизмов»
Защита состоится «21» апреля 2009 г. в 15 час 30 мин. на заседании диссертацион ного совета Д.501.001.52 при Московском Государственном Университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы Горы, д.1, корп.12, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, ауд. M-1.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова.
Автореферат разослан «» _ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова
Общая характеристика работы
Актуальность темы. Рицин (R60) – токсин из семян клещевины – состоит из ката литической (А- или RTA) и лектиновой (В- или RTB) субъединиц. RTB связывается с кле точными рецепторами и обеспечивает эндоцитоз токсина. Активность RTA по отношению к 28S рРНК эукариот влечёт за собой необратимую остановку синтеза белка и приводит к гибели клетки [Rutenber et al., 1991].
Обязательным этапом интернализации токсинов является попадание в ранний эн досомальный компартмент, дальнейшая транспортировка из которого зависит от того, с каким рецептором произошло связывание. Показано, что из ранних эндосом незначитель ная часть токсина попадает в эндоплазматический ретикулум (ЭР) [Rapak et al., 1997], но это количество настолько мало, что не выявляется методами электронной микроскопии [Sandvig and van Deurs, 1996].
Устойчивость гибридом, продуцирующих антитела против эпитопов RTA, экрани рованных в нативном токсине, показывает необходимость разделения субъединиц токсина для транслокации в цитозоль [Венедиктова и др, 2005]. Но до настоящего времени вы явить свободную RTA в клетке не удавалось.
Мы предположили, что восстановление дисульфидной связи и транслокация в ци тозоль происходит в ранних эндосомах. У рицина не обнаружен механизм создания пор, аналогичный таковому у дифтерийного токсина, но некоторые факты создают предпосыл ки возможности подобного транспорта из данного компартмента. Так, бльшая часть ин тернализованного токсина находится в связанной форме с рецепторами люминальной по верхности мембраны ранних эндосом [Moisenovich et al., 2004]. Наличие гидрофобных участков способно приводить к образованию агрегатов токсинов при их высокой концен трации. Агрегаты токсина, взаимодействуя одновременно с несколькими рецепторами, могут приводить к изменениям структуры и нарушению целостности эндосомальных мембран. Гидрофобные участки белков могут взаимодействовать с мембранами и погру жаться в них. Отрезок длиной в 12 аминокислотных остатков на С-конце RTA [Lamb et al., 1985], экранированный в цельном токсине, взаимодействует с бислойными мембранами лучше других гидрофобных доменов токсина. Оптимальными условиями для такого встраивания являются пониженные значения pH. В ранних эндосомах значение pH нахо дится в таком диапазоне и составляет pH 5,5. Такому встраиванию способствует также высокий уровень содержания ненасыщенных липидов и малое количество сфинголипидов и холестерина в мембранах эндосомального компартмента, приводящий к повышенной лабильности данных мембран. Особенности функционирования эндосом приводят к по стоянному отпочковыванию и слиянию везикул, что повышает вероятность нарушения целостности мембран, дестабилизированных агрегатами токсина.
Т.о., выяснение концентрации рицина, взаимодействующего с люминальной по верхностью эндосомальных мембран, является принципиальным для определения воз можности транслокации RTA из данного компартмента.
Особый интерес к рицину и родственным ему белкам (РИБ2) вызван возможностью создавать на их основе препараты для терапии аутоиммунных и онкологических заболе ваний. При разработке новых препаратов и совершенствовании существующих лекарст венных средств на основе РИБ2 чрезвычайно важно минимизировать возможные побоч ные действия. В частности, необходимо учитывать тот факт, что РИБ2 являются макромо лекулами и, по-видимому, могут оказывать различные воздействия на клетку-мишень. В связи с этим детальное изучение свойств разных представителей этого семейства токси нов, напрямую не связанных с ингибированием синтеза белка, представляет большой на учно-практический интерес.
Целью работы было изучение динамики образования свободной RTA и её накоп ления в органеллах клеток, предобработанных рицином.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать тест-систему для выявления свободной RTA внутри клетки. Используя эту тест-систему, изучить динамику накопления RTA в клетке. Определить ассоциа цию А-цепи с клеточными органеллами.
2. Определить концентрацию рицина в эндосомальном компартменте.
3. Сопоставить динамику накопления рицина в клетке с этапами её интоксикации.
4. Изучить эффекты рицина, непосредственно не связанные с остановкой синтеза белка.
Научная новизна работы. На основе полученных моноклональных антител созда на уникальная тест-система для определения свободной RTA внутри клетки. Установлено, что время, через которое в клетке выявляется свободная RTA, согласуется со временем остановки синтеза белка в предобработанных цельным токсином клетках и составляет 4 часа. Показано влияние А-цепи на митогенную активность и запуск апоптоза.
Практическая значимость. Исследования механизмов взаимодействия рицина с клеткой и, особенно, механизмов транслокации токсина в цитозоль, позволят повысить эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе токсинов;
сущест венно снизить или полностью исключить побочные эффекты, возникающие при их при менении;
значительно расширить область применения токсинов в клинической практике, в том числе за счет нанотехнологий. Разработанный метод инкапсуляции РИБ2 в полилак тидную матрицу может быть использован для создания лекарственных препаратов про лонгированного цитотоксического действия.
Апробация результатов и публикации. Результаты работы были доложены на международных конференциях: «Конференция биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова» (Россия, 2006), «Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology Annual Conference» (USA, 2007), «76th Congress of the European Atherosclerosis Society» (Finland, 2007), «Объединенный иммунологический форум» (Россия, 2008), на межлабора торных семинарах НИИ трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО), на межлабораторных семинарах кафедры физиологии микроорганизмов биологического фа культета МГУ, на межлабораторных семинарах в Биоцентре Университета им. Гете (Франкфурт-на-Майне, Германия). Апробация диссертации проведена на заседании ка федры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова 24 сентября 2008 г. По материалам диссертации опубликовано 8 печат ных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора лите ратуры, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выво дов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 137 страницах, иллюст рирована 38 рисунками и 3 таблицами. Список литературы содержит 245 источников.
Материалы и методы Выявление свободной RTA внутри клеток Клетки крысиной глиомы С6, мышиных фибробластов 3T3 и трансфецированной карциномы человека A431-Rab4-GFP выращивали на покровных стеклах в 2 мл полной среды DMEM + 10% коровьей эмбриональной сыворотки в присутствии токсинов в раз личных концентрациях при 37°C в течение 24 часов;
отмывали от компонентов среды и фиксировали 4,5% ПФА в течение 30 мин. Затем инкубировали с 0,1% Triton X-100 в те чение 10 мин и отмывали 5 раз. Обрабатывали растворами антител в течение часа. Полу ченные препараты анализировали на микроскопе Zeiss Axiovert 200M LSM 510 Meta («Zeiss», Германия).
Определение концентрации R60 и RTA в лизатах клеток, предобрабо танных R60.
Клетки линий С6 и 3T3 выращивали на чашках Петри 3 суток, после чего добавля ли 1 мкг/мл R60 и инкубировали при 37°С и 6% CO2 различные временные интервалы. За тем клетки отмывали от несвязавшегося токсина холодным раствором лактозы и механи чески снимали с пластика. Полученную взвесь центрифугировали (7 мин 1500 об/мин).
Супернатанты отбирали в новые пробирки, а осадок ресуспендировали в 350 мкл лизи рующего раствора (0,1М NaCl, 10мМ Na2HPO4, 1% Triton X-100 и 1мМ PMSF, pH 7,4), ин кубировали при 4°С 20 мин и центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин [Iversen et al., 2001].
Тест-систему 1RK2/2RK1bi использовали для определения концентрации R60, а 1RAK4/1RAK6bi – для определения концентрации RTA. В качестве контролей использо вали лизаты клеток соответствующих линий, не обработанных токсинами.
При построении калибровочных кривых использовали данные для R60 и RTA, раз веденных на среде культивирования соответствующих линий клеток. Статистическую об работку результатов проводили в программе «Microsoft Excel 1997».
Получение конъюгатов белков с флуорохромами Конъюгацию с флуоресцентными красителями проводили по методикам, рекомен дованным производителями. Белки переводили в карбонатный буфер (pH 9,0), содержа щий 1 М NaHCO3, 20 mM лактозу, и концентрировали до 2 мг/мл. Затем смешивали рас творы белка и флуорохромы так, чтобы избыток красителя составлял 25-кратный моляр ный избыток. Инкубировали с перемешиванием 24 ч при комнатной температуре. С по мощью гельфильтрации на колонке PD10 c сорбентом Sephadex G-25 очищали пробы от несвязавшегося красителя. Переводили белок в ФСБ (рН 7,4) и считали соотношение бе лок / краситель по известным формулам.
Соотношение количества FITC к количеству белка составило: для рицина – 4,2;
для вискумина – 3,3. Количество групп Cy3, внесенных в одну молекулу белка, составляло:
для рицина – 2,1 группы, для вискумина – 2 группы, для антител серии RAK – 3 группы.
Анализ митогенной активности ингибиторов синтеза белка.
Клетки линии 3T3 выращивали на покровных стеклах в 40мм чашках Петри по описанной ранее методике [Rozengurt and Heppel, 1975]. К клеткам в лог-фазе добавляли рицин и циклогексимид (ЦГИ) в конечной концентрации 10-10М (для рицина) и 1мкг/мл (для ЦГИ). Через 3 часа после добавления токсинов в чашки Петри добавляли по 20 мкл стокового раствора колхицина (500 мкг/мл) (Fluka AG, Швейцария). Образцы фиксирова ли 4,5% параформальдегидом и анализировали на конфокальном микроскопе.
Оценка цитотоксических свойств РИБ2. SRB-тест.
Оценку действия цитотоксических агентов проводили путём связывания красителя сульфородамина В с белками по методике [Skehan et al., 1990] с модификациями [Worm et al., 2001].
Клетки в концентрации 10000 кл/мл в 100 мкл среды RPMI 1640, инкубировали в 96-луночных планшетах 24 часа. После этого добавляли по 100 мкл токсинов в концен трациях 10-18-10-10 М для РИБ2 и 0,001-10 мкг/мл для ЦГИ. Клетки с токсинами инкубиро вали 5 суток в CO2-инкубаторе в атмосфере, содержащей 6,1% СО2, при 37°С.
Из лунок удаляли 150 мкл среды культивирования. Планшет охлаждали и центри фугировали 7 мин при 300g и температуре 4°С. В лунки добавляли по 150 мкл 20% рас твора ТХУ и инкубировали на льду 1 час. Клетки отмывали 5 раз 1% раствором ТХУ и высушивали. Добавляли по 70 мкл SRB в лунку и инкубировали 30 мин в темноте при комнатной температуре. После 4 отмывок 1% раствором ТХУ добавляли по 70 мкл 1М Триса для выхода SRB и 130 мкл дистиллированной воды. Измеряли оптическую плотность при 490 нм на спектрофотометре Multiskan ® PLUS – 314.
Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу Инкапсуляцию вискумина в полилактидный носитель проводили на эксперимен тальной установке, подробно описанной ранее [Антонов и др., 2008] по алгоритму опи санному в статье [Хапчаев и др, 2008]. После выхода токсина из матрицы его свойства анализировали с использованием стандартного МТТ-теста [Agapov et al., 1999].
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия Изображения были получены на конфокальном лазерном сканирующем микроско пе (Axiovert 200M 510 Meta, Zeiss, Германия). Серии оптических срезов получали либо с одного из каналов, либо синхронно с двух. Установку размеров пинхола (pinhole) для по лучения изображений с высоким разрешением проводили согласно рекомендациям произ водителей системы. Для получения изображений использовали объективы Plan-Neofluar 40x/1,3 Oil Dic, Plan-Apochromat 63x/1,4 Oil Dic и Plan-Apochromat 100x/1,4 Oil. Настройки лазеров и анализирующих фильтров, рекомендованные производителем, подбирались ин дивидуального для каждого красителя. Диаметр пинхола – 1 диск Эйри (Airy unit), даю щий оптимальное соотношение сигнала к шуму. Анализ проводили, используя программ ное обеспечение Zeiss LSM 510Meta Software release 3.2, ImageJ 1.39q, AutoQuant 9.3, Imaris 5.1 и Adobe Photoshop CS2.
Результаты и обсуждение Тест-система для выявления свободной RTA в клетке.
Для детекции свободной A-субъединицы использовали тест-системы моноклональ ных антител (монАт) серии RAK, дискриминирующей RTA от цельного токсина [Вене диктова и др., 2005]. Вероятнее всего, эпитопы, распознаваемые данными антителами, на ходятся на поверхности области RTA, экранированной В-субъединицей в составе цельно го токсина.
Для разработки тест-системы, способной выявить свободную RTA в клетке, ис пользовали методы прямой или непрямой иммунофлуоресценции. Показано, что конъюга ты монАт-флуорохром сохраняют способность выявлять RTA (Рисунок 1).
1RAK6/RTA-bi 1. 1RAK6-Cy3/RTA-bi ОП 0. 0.1 0.3 0.5 1 5 10 100 Концентрация антигена (нг/мл) Рисунок 1. Сохранение 1RAK6-Cy3 способности выявлять RTA.
Конъюгация с Cy3 не изменила свойств монАт 1RAK6. После конъюгации антитела распознают свободную RTA также как и немодифицированные монАт.
Для выявления свободной RTA в клетках использовали метод непрямой иммуноф луоресценции. При использовании прямой иммунофлуоресценции соотношение сиг нал/шум оказалось очень низким. Кроме того, было обнаружено неспецифическое взаи модействие конъюгатов с митохондриями. Были выявлены отдельные скопления, содер жащие свободную RTA (См. Рисунок 2). Детектируемые объекты распределены по всей цитоплазме и имеют линейные размеры не менее 0,5 мкм, что свидетельствует о том, что это агрегаты из нескольких молекул, либо единичные молекулы RTA.
Рисунок 2. Детекция RTA внутри клетки.
Распределение 1RAK6-AMI-Alexa 546 в клетках глиомы С6. A – изображе ние клетки в проходящем свете;
Б – флу оресцентный сигнал от конъюгатов 1RAK6-AMI-Alexa 546, изображение полу чено путем совмещения всех оптических слоев («allmax»);
В – наложение А и Б. Линейка – 10 мкм.
количество детектируемых объектов 0 4 8 12 16 20 время инкубации с рицином, ч Рисунок 3. Накопление свободной RTA в клетках глиомы С Увеличение количества детектируемых объектов во времени. Каждая вре менная точка – у среднённые значения от подсчета 50 клеток. Динамика накопле ния RTA на других клеточных линиях была аналогичной, и различалась только абсолютными значениями.
Изменение количества RTA в клетке, происходящее во времени, оценивали по ко личеству детектируемых флуоресцентных объектов. Для этого на изображении, получен ном при регистрации флуоресценции от флуорохрома, выделяли объекты, размеры кото рых превосходили 20 пикселей. После этого подсчитывали количество подобных объек тов на 1 клетку. Свободная RTA не детектируется в клетках через час после внесения ри цина в среду культивирования. После 2 часов инкубации RTA выявлялась на клетках ли ний 3T3 и C6. Через 4 часа количество детектируемой свободной RTA возрастает и дости гает максимальных значений через 16 часов (См. Рисунок 3).
Использование в ТИФА тест-системы 1RAK4/1RAK6-bi позволило выявить А субъединицы рицина в клеточных лизатах после введения цельного токсина в среду инку бации. Расчёт показал, что на одну клетку приходится от 300 до 450 молекул RTA. Это значит, что детектируемые микроскопическими методами объекты представляют собой единичные молекулы или скопления из 2-3 молекул.
Объём, занимаемый рицином внутри клетки.
Для того, чтобы определить общий объём компартмента, в котором детектируется рицин, было получено 30 наборов оптических срезов с разрешением, при котором реаль ные размеры пикселя составляют 60 нм. Расстояние между двумя соседними оптическими слоями составило 100 нм. Реальное оптическое разрешение больше данных величин, но такое «избыточное» разрешение необходимо для корректной обработки изображений.
Необработанные данные имели реальное разрешение около 220 нм, однако аперту ра использованного объектива – 1,4 после математической обработки (деконволюции [Wallace et al., 2001]) позволяет получить виртуальное разрешение 140 нм. После уточ нения размеров везикул с помощью деконволюции в программе AutoQuant 9.3. был про анализирован общий объём флуоресцирующих объектов. Для этого обработанные изо бражения анализировали с использованием программного обеспечения Imaris 5.1. Сред ний анализируемый объём составляет 540±120 мкм3 до обработки и 215±40 мкм3 после.
Ранее показано, что рицин равномерно распределён практически во всём объёме ранних эндосом, положительных по Rab4-ГТФазе [Moisenovich et al., 2004]. Т.о. объём компар тмента, содержащего токсин составляет не более 215 мкм3.
количество молекул рицина на 1. 1. клетку, х10 молекул 1. 1. 0. 0. 0. 0. 0 4 8 12 16 20 время инкубации с рицином, ч Рисунок 4. Накопление рицина в клетке.
Средние данные по количеству молекул рицина в клетках линии С6.
Использование твердофазного иммуноферментного анализа позволило определить среднее количество белка в клетке. В течение 4 часов количество рицина в клетке дости гает 17000 молекул и остаётся на этом уровне длительное время (См. Рисунок 4).
Показано, что средняя концентрация токсина в везикулярном компартменте, со держащем токсин, составляет не менее 1,31*10-7 М после деконволюции и не менее 5,25*10-8 М в случае необработанных данных. Столь высокая концентрация может приво дить к образованию агрегатов из молекул токсина и значительному нарушению целостно сти мембран, что способно инициировать транслокацию A-цепи в цитозоль.
Количество восстановленной RTA составляет 2-3% от количества детектируемого в клетке рицина. Столь малые количества и распределение А-цепи по клетке (отдельные молекулы или кластеры, содержащие несколько молекул), а также отсутствие чувстви тельных методов детекции, вероятно, и являются причиной того, что раньше обнаружить свободную цепь внутри клетки не удавалось.
Распределенеие свободной RTA в клетке Детекция свободной А-субъединицы в различных клеточных компартментах может свидетельствовать о возможности транслокации RTA из этих компартментов. Ранее пока зано, что большая часть рицина накапливается в ранне-эндосомальном компартменте [Moisenovich et al., 2004].
Анализ взаимного распределения свободной A-субъединицы рицина и цельного токсина проводили на клетках линий 3T3 и C6. Для этого клетки обрабатывали токсином, конъюгированным с флуоресцентным красителем FITC, после чего выявляли свободную RTA и определяли уровень совместного распределения (колокализации).
Рисунок 5. Отсутствие колокализации R60-FITC и RTA.
Совместное распределение R60-FITC (зелёные кластеры) и 1RAK6-AMI Alexa 546 (красные объекты) на клетках глиомы С6 через 4 часа инкубации с ток сином. Перед фиксацией клетки отмыли раствором лактозы для того, чтобы уб рать несвязавшийся рицин. Правый рисунок – оптический срез клетки, левый – диаграмма колокализации.
После 4 часовой инкубации с конъюгатом R60-FITC видно, что сигналы от рицина и его А-цепи находятся в непосредственной близости, но в большинстве своем легко раз личимы. Представлено изображение одной из 50 обработанных клеток (См. Рисунок 5). В левой части рисунка представлена диаграмма, отражающая распределение пикселей обоих цветов. По оси абсцисс отложена интенсивность флуоресценции канала, детектирующего сигнал от RTA (Ch3-T1), а по оси ординат – интенсивность флуоресценции R60-FITC (Ch2-T2). Уровень сигнала, считаемый шумом (Threshold), выставлен на 50 для обоих ка налов. Данная величина представлена на рисунке белой линией. Пересечение 2 линий Threshold обоих каналов делят диаграмму на 4 части, обозначенные номерами 1, 2, 3 и участок без обозначения. Колокализованными являются только пиксели, попавшие в зону 3 на данной диаграмме. В зонах 1 и 2 находятся пиксели только от одного из каналов, а в зоне без обозначения – пиксели без флуоресцентного сигнала;
на правом рисунке – это чёрный фон.
Коэффициенты колокализации рассчитываются как соотношение колокализован ных пикселей к общему количеству детектируемых в данном канале пикселей и могут быть числами от 0 (нет колокализации) до 1. Расчёт проводят для каждого канала по фор мулам:
пикселиCh1.колокализованные пикселиCh 2.колокализованные k1 = k2 = пикселиCh1.все пикселиCh 2.все Пиксели, с интенсивностью менее уровня Threshold, в подсчёте не участвуют. Ин тенсивность пикселей роли не играет. Средние значения коэффициентов колокализации для двух каналов равны 0,075±0,009 и 0,329±0,059. Это значит, что 7,5% RTA расположе но в тех же компартментах, где и цельный рицин, т.е. большая часть новообразованной RTA практически сразу транслоцируется из органелл, где накапливается рицин.
Рисунок 6. Распределение R60 и RTA через 12 часов инкубации Клетки глиомы С6 через 12 часов инкубации с токсином. Правый рисунок – оптический срез клетки, левый – диаграмма колокализации. Сигналы от обоих флуорохромов расположены в одном и том же месте, что внешне выглядит как жёлтые объекты вместо зелёных и красных.
Через 12 часов инкубации с рицином практически весь рицин и его А-цепь оказы ваются в одном компартменте. 76±4,5% RTA и 78±6,3% R60 находятся в одинаковых ком партментах, что может быть свидетельством остановки везикулярного транспорта в клет ках, обработанных токсином. На диаграмме (См. Рисунок 6) видно, что общее распреде ление пикселей представляет собой одну область, расположенную на прямой линии, в то время как на начальных этапах интенсивности флуоресценции обоих каналов увеличива ются независимо (См. Рисунок 5). Наличие неколокализованной свободной RTA объясня ется ее выходом из компартмента, содержащего рицин на более ранних этапах. При этом A-цепь распределяется по цитоплазме, что не позволяет увидеть отдельные скопления.
Остановка синтеза белка, вызванная RTA, транслоцировавшейся ранее, приводит к оста новке внутриклеточного транспорта. В результате, новообразующаяся RTA остаётся в компартменте, в котором она образовалась и оказывается колокализованной с рицином.
Для определения компартмента, содержащего свободную RTA, клетки глиомы С инкубировали с рицином, фиксировали 4% ПФА и обрабатывали конъюгатом 1RAK6 AMI-Alexa 546 для выявления А-цепи. После этого добавляли маркёры клеточных орга нелл и анализировали взаимное расположение.
Конканавалин А широко используется в качестве маркёра ЭР. Конъюгат WGA FITC использовали в качестве маркёра ЭР и аппарата Гольджи. Показано, что RTA не по падает ни в аппарат Гольджи, ни в эндоплазматический ретикулум (См. Рисунок 7). Также свободная RTA не обнаружена в ядре, митохондриях и лизосомах.
Накопление рицина в ранних эндосомах показано ранее [Moisenovich et al., 2004].
Высокий уровень колокализации рицина и его каталитической субъединицы после оста новки синтеза белка и следующей за этим остановки внутриклеточного транспорта, по зволяет предполагать, что RTA накапливается в ранних эндосомах. Т.о. наиболее вероят ным местом в клетке, где происходит восстановление дисульфидной связи с высвобожде нием RTA, является ранне-эндосомальный компартмент.
Рисунок 7. Распределение 1RAK6-AMI-Alexa 546 и WGA-FITC.
Взаимное распределение 1RAK6-AMI-Alexa 546 и WGA-FITC в клетках глиомы С6. A – флуоресцентный сигнал от конъюгатов 1RAK6-AMI-Alexa 546;
Б – флуоресцентный сигнал от конъюгата WGA-FITC;
В – наложение А и Б;
Г – нало жение В на изображение клетки в проходящем свете. Изображения А, Б и В полу чены путём совмещения всех оптических слоев («allmax»). Линейка – 10 мкм.
Митогенное действие рицина Анализ изображений клеток, предобработанных рицином, выявил незначительное увеличение митотического индекса. Известно, что величина этого показателя для линии 3T3 в норме составляет примерно 0,5-1,5%. Для изучения влияния рицина на митотиче ский индекс культуры и оценки достоверности полученных данных использовали колхи цин в концентрации 1 мкМ для увеличения митотического индекса.
25% Митотический индекс 20% 15% 10% 5% 0% ин н н ин н с са ци ци ци ча ль иц иц ча хи хи хи ро х лх ол ол ол ол ин нт Ко ин Ко +К +К иц +К +К иц лх ГИ LI TB B лх RT M Ко Ц +R Ко 0+ ГИ 0+ R Ц R Рисунок 8. Митотический индекс Клетки инку бировали в присутствии токсинов 4 часа (кроме часовой точки с R60), после чего добавляли 1 мкМ колхицин, для у величения митотического ин декса.
Инкубация с рицином в концентрации, приводящей к гибели 50% клеток через 24 часа, в 2 раза увеличивает митотический индекс клеток линии 3T3 по сравнению с кон трольными значениями. Данный эффект связан с активностью свободной RTA. Это следу ет из анализа воздействия смеси свободной RTB и ЦГИ – низкомолекулярного ингибитора синтеза белка, который мы использовали в качестве аналога RTA. Известно, что ЦГИ инактивирует рибосому так же, как и A-цепь рицина. Воздействие как отдельного ЦГИ, так и в паре с RTB приводит к полному подавлению вступления клеток в митоз.
Обнаружено, что митогенную активность свободная RTA проявляет только после транслокации в цитозоль. Так, часовая инкубация с рицином не повышает митотического индекса, а через 4 часа – время, через которое RTA накапливается в цитозоле в количест вах, достаточных для детекции – митотический индекс повышается (См. Рисунок 8). Дан ный эффект наблюдается и при воздействии вискумина, что подтвержает наличие подоб ных свойств у A-цепей других РИБ2. Небольшие различия в действии рицина и вискуми на, вероятно, объясняются различными путями внутриклеточного транспорта и могут быть следствием различий в цитотоксической активности данных токсинов.
Было изучено влияние низких нелетальных концентраций рицина и вискумина на пролиферативную активность клеток. Для этого использовали SRB-тест, позволяющий определять общее количество белка (См. Рисунок 9). ЦГИ, используемый в качестве по ложительного контроля в широком диапазоне концентраций (10-5-10 мкг/мл) в данных ус ловиях не приводил к изменению митотического индекса.
На рисунке видно различие в действии двух РИБ2. Достаточно высокие концентра ции R60 практически не влияют на пролиферативную активность клеток. Но при сниже нии концентрации токсина эффект воздействия может достигать 400% от значений, полу ченных на клетках не подвергавшихся обработке токсинами (См. Рисунок 9). Это позво ляет сделать вывод, что РИБ2 не только ингибируют синтез белка, но и обладают допол нительными действиями при попадании в цитозоль.
400% Накопление белка в % от контроля R 300% ML 200% 100% 0% -18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 - Концентрация токсинов Рисунок 9. Митогенное действие низких концентраций РИБ Влияние низких концентраций R60 и ML1 на пролиферацию. Значения на оси абсцисс – концентрации токсинов 10 - 1 8 -10 - 1 0 M соответственно.
Апоптотические изменения под действием РИБ Инкубация с рицином приводит не только к увеличению митотического индекса, но и к запуску апоптоза. Активация апоптоза происходит при изменении соотношения про- и анти-апоптотических белков в клетке. Остановка синтеза белка приводит к измене нию этого соотношения, однако не является единственным условием для запуска апопто за. Образование фрагментов ДНК с молекулярной массой 180-200 пар нуклеотидов явля ется свидетельством того, что клетки вступили на апоптотический путь гибели и в них уже активированы эффекторные каспазы. Для количественного определения клеток с фрагментированной ДНК использовали метод проточной цитофлуориметрии. Количество деградировавшей ДНК, разрушенной под действием токсинов и достаточное для детек ции, наблюдается через 24 часа, и достигает максимальных значений, близких к 100%, че рез 48 часов (См. Рисунок 10). При этом ни в контрольных клетках, ни в клетках, инкуби ровавшихся с циклогексимидом, деградации ДНК не выявлено. Вероятно, изменение структуры рибосомы, происходящее под действием РИБ2 и приводящее к риботоксиче скому стрессу, играет в этом существенную роль.
% клеток от общего SubG1 Контроль количества SubG1 R 50 SubG1 ML 0 12 24 36 время инкубации, ч Рисунок 10. Апоптотические изменения под действием РИБ Через 24 часа под действием токсинов детектируются клетки в фазе SubG1.
Фрагментация ядер является характерным морфологическим признаком поздних стадий апоптоза. Действие рицина приводит к фрагментации 10% ядер уже через 24 часа.
При этом наблюдается фрагментация на разных стадиях, что свидетельствует о том, что апоптотическая реакция началась ранее регистрируемого времени.
Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу.
Высокая токсичность рицина не позволяет использовать его для терапии онкологи ческих заболеваний, однако для вискумина подобные исследования проводятся [Thies et al., 2008]. Использование инкапсулированного в полилактидный носитель вискумина мо жет быть более эффективным вследствие биодеградации носителя и постепенного высво бождения лекарственного препарата.
Нами была получена полилактидная матрица с инкапсулированным вискумином, которая при деградации высвобождала токсин. Использование нового метода сверхкрити ческой флюидной инкапсуляции позволило сохранить цитотоксические свойства токсина.
Выводы 1. Разработана тест-система на основе панели моноклональных антител против рицина, позволяющая выявлять изолированную A-цепь рицина (RTA) внутри клетки.
2. Показано, что совместное распределение нативного токсина и его свободной А-субъединицы на начальных этапах интоксикации клетки не превышает 10%, а че рез 18–20 часов достигает практически 80%.
3. При комплексном использовании иммунохимических методов и конфокальной мик роскопии установлено, что концентрация токсина в ранних эндосомах может состав лять не менее 1,31*10-7 М/л, а в отдельных везикулах достигает величины 10-5 М/л.
4. Показано, что свободная RTA не колокализуется с маркёрами эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, лизосом, клеточного ядра и митохондрий.
5. В предварительно обработанных цельным токсином клетках линий 3Т3, С6, А431 А субъединица рицина выявляется через 4 часа, что согласуется со временем остановки биосинтеза белка в этих клетках.
6. Обнаружено, что обработка клеток линий 3T3, C6 и A431 низкими концентрациями (от 10-18 М до 10-10 М) рицина или вискумина усиливает пролиферацию клеток и че рез 5 суток увеличивает долю делящихся клеток в два-четыре раза.
7. Включение токсинов в полилактидную матрицу методом «сухой» сверхкритической флюидной инкапсуляции позволяет получать лекарственные препараты пролонгиро ванного действия. Показано, что эта процедура не влияет на иммунохимические и цитотоксические свойства вискумина.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Венедиктова О.А, Попова Е.Н., Хапчаев Ш.Ю., Новиков К.Н., Егорова С.Г. Сравни тельный анализ цитотоксической активности конъюгатов с различными векторными молекулами. Материалы международной научной конференции, Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, биологический факультет, 16–19 мая 2006 г. – М.: МАКС Пресс 2006. – 118 с.
2. Хапчаев Ш.Ю. Взаимодействие рибосом-инактивирующих белков с клеткой мишенью. Материалы международной научной конференции, Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, биологический факультет, 16–19 мая 2006 г. – М.: МАКС Пресс 2006. – 118 с.
3. Е.Н. Попова, Ш.Ю. Хапчаев, С.Г. Егорова, И.А. Демина, О.А. Венедиктова, И.И.
Агапов, М.М. Мойсенович. Мышиные моноклональные антитела против рици на не реагируют с агглютинином рицина. Российский иммунологический жур нал, 2007, том 1(10), №. 3–4 с.59-65.
4. A.N. Orekhov, Sh.Y. Khapchaev, O.L. Pustovalova, I.V. Andrianova, M.M. Moisenovich.
Lipoprotein Accumulation and Antigen-Presentation in Grossly Normal Human Aorta.
Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology Annual Conference 2007. Chicago, IL, April 19–21. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007;
27:e35-e137.
5. Moisenovich M.M., Khapchaev Sh.Y., Pustovalova O.L., Orekhov A.N. Lipoprotein Accumulation and Antigen-Presentation in Human Aorta. 76th Congress of the European Atherosclerosis Society, Helsinki, Finland, June 10-13, 2007. Atheroscler Suppl 2007 Jun;
8(1):1-234.
6. Ш.Ю. Хапчаев, А.Ю. Архипова, М.М. Мойсенович. Влияние ингибиторов син теза белка на клетки линий 3T3 и A431. Российский иммунологический журнал, 2008, т.2(11), №2-3: с 316.
7. Мойсенович М.М., Пустовалова О.Л., Хапчаев Ш.Ю., Почаев В.А., Орехов А.Н.
HLA-DR-положительные клетки в интиме аорты человека. Сборник статей «Иннова ционные микроскопические методы исследования в образовательном процессе». Из дательство «Кволитайп» Москва, 2008, с.27-36.
8. Ш.Ю. Хапчаев, И.И. Агапов, М.М. Мойсенович, А.А. Рамонова, С.Э. Богородский, И.С. Мусаэлян, В.К. Попов. Цитотоксическая активность вискумина, инкапсулированного в полилактидную матрицу с помощью сверх критического диоксида углерода. Биотехнология, 2008. т.5: c.43-49.