Экспрессия генов ферментов биосинтеза полиаминов у галофитов и гликофитов при засолении и уф-в облучении
На правах рукописи
Иванов Юрий Валерьевич ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ БИОСИНТЕЗА ПОЛИАМИНОВ У ГАЛОФИТОВ И ГЛИКОФИТОВ ПРИ ЗАСОЛЕНИИ И УФ-В ОБЛУЧЕНИИ 03.00.12 – Физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва – 2008 2
Работа выполнена в лаборатории молекулярных и физиологических механиз мов адаптации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН и в Институте сельскохозяйственной биологии и биотехнологии Национального совета по научным исследованиям Италии (Италия, Милан)
Научный консультант:
кандидат биологических наук Радюкина Наталия Львовна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Кириченко Евгений Борисович кандидат биологических наук, доцент Пильщикова Наталия Владимировна
Ведущая организация: Вологодский государственный педагогический уни верситет
Защита состоится «17» июня 2008 г. в 13.00 ч на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Институте физиоло гии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, г. Москва, ул. Бота ническая, 35.
Факс: (495)977-80-18, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии рас тений им. К.А. Тимирязева РАН.
Автореферат разослан «15» мая 2008 года.
Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук Азаркович М.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В результате интенсивной хозяйственной дея тельность человека в последнее время произошло увеличение воздействия на растения неблагоприятных факторов среды. Особенно масштабным стало дей ствие таких факторов как засоление, тяжёлые металлы, усиление ультрафиоле тового излучения, химические загрязнители. Засоление, ультрафиолетовая ра диация, совместное их действие приводит к значительному снижению выхода сельскохозяйственной продукции и большим экономическим потерям. Иссле дование механизмов адаптации растений к действию абиотических факторов занимает ключевое положение в современной науке.
Общим характерным признаком действия стрессоров, является усиление генерации активных форм кислорода, связанное, в первую очередь, с наруше нием структуры и функций клеточных мембран, органелл клетки. В условиях окислительного стресса антиоксидантные ферменты могут быстро инактивиро ваться активным кислородом, и для индукции их синтеза de novo требуется оп ределённое время. Возможно, по этой причине в антиоксидантной системе за щиты принимают участие и низкомолекулярные антиоксиданты, к которым от носят и полиамины (путресцин, спермидин, спермин и кадаверин).
К настоящему времени роль полиаминов в растениях при действии раз личных видов стресса остаётся до конца не выясненной. Большинство работ о роли полиаминов при стрессе, было выполнено на ограниченном числе модель ных объектов. В связи с этим представляются важным изучение и оценка по тенциала устойчивости растений различных экологических групп при действии индивидуальных абиотических факторов, и их комплекса и вклада полиаминов в формирование защитного ответа. Такие исследования позволяют расширить понимание механизмов кросс-адаптации, что открывает большие перспективы для сельского хозяйства и сохранения биоразнообразия.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось сравнительное ис следование дифференциальной экспрессии генов ферментов биосинтеза поли аминов на фоне изменения их эндогенного уровня у галофитов и гликофитов при действии засоления и облучении ультрафиолетом В.
Задачи исследования:
1. Сравнить потенциал устойчивости исследуемых растений (Thellungiella halophila Mey., Plantago major L., Geum urbanum L.) к действию хлорида натрия и ультрафиолета В.
2. Изучить особенности изменений в содержании и спектре свободных полиаминов семейства путресцина при действии на растения NaCl.
3. Провести анализ профиля экспрессии генов биосинтеза полиаминов при действии NaCl у растений Thellungiella halophila Mey. и Plantago major L.
4. Изучить особенности изменений в содержании и спектре свободных полиаминов семейства путресцина при действии на растения ультрафиолета.
5. Провести анализ профиля экспрессии генов биосинтеза полиаминов при действии ультрафиолета у растений Thellungiella halophila Mey. и Plantago major L.
6. Исследовать содержание кадаверина и экспрессию гена лизиндекар боксилазы при действии NaCl и УФ-В у Thellungiella halophila и Plantago major.
Научная новизна. Впервые изучена динамика стресс-зависимой экспрес сии генов ферментов биосинтеза полиаминов у контрастных по устойчивости к ультрафиолету и засолению дикорастущих видов растений. Выявлены сущест венные различия в изменении содержания полиаминов и экспрессии генов ферментов их биосинтеза у одного и того же вида растения при действии раз личных стрессовых факторов. Впервые показано, что в отличие от засоления действие УФ-В облучения индуцирует органоспецифичный синтез кадаверина у Thellungiella halophila Mey. в листьях и у Plantago major L. в корнях.
Практическая значимость. Полученные данные об изменении содержа ния и спектра полиаминов при действии засоления и УФ-В, а также изменение экспрессии генов их биосинтеза под действием этих факторов имеют большое значение для понимания формирования адаптивных процессов у галофитов и гликофитов. Полученные данные могут быть использованы в практике расте ниеводства, а теоретические обобщения – для разработки курсов лекций для студентов биологических специальностей.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на 10-й Пущин ской школе-конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века» (Пу щино, 2006);
I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт Петербург, 2006);
VI Международной конференции молодых учёных Леса Ев разии – Венгерский лес (Венгрия, Шопрон);
V международной школе-семинаре по экологии (Пущино, 2006);
VII Международной конференции молодых учё ных Леса Евразии – Русский север (Петрозаводск, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать 18 печатных работ, из которых 3 – статьи в основном журнале по специ альности «Физиология и биохимия растений» - «Физиология растений».
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, об зора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полу ченных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литерату ры. Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста и содержат 3 таблицы, 14 формул и 53 рисунка. Список цитируемой литерату ры включает 230 наименований, в т.ч. 215 иностранных.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования: Thellungiella halophila – представитель семей ства Brassicaceae, обладает высокой устойчивостью к различным видам абио тического стресса: к низкой влажности воздуха, к замораживанию и высокой засолённости. Благодаря малому размеру генома и родству с Arabidopsis thaliana, является модельным объектом для изучения устойчивости к абиотиче ским стрессам (Zhu, 2000;
Bressan et al., 2001;
Volkov et al., 2004;
Gong et al., 2005;
Griffith et al., 2007).
Plantago major. Подорожник большой – представитель семейства Plan taginaceae, растет почти на всех типах почв, характеризуется устойчивостью к действию высокогорной ультрафиолетовой радиации (Hong-Xu Ren et al., 1999;
Samuelsen, 2000;
Vicente et al., 2004).
Geum urbanum. Гравилат городской – многолетнее травянистое растение семейства Rosaceae, к условиям произрастания малотребователен, зимостоек и засухоустойчив, к действию засоления слабоустойчив (Радюкина, Иванов и др., 2007а).
В условиях водной культуры растения выращивали в камере фитотрона при 12-часовом световом периоде и мощности освещения 37,6 Вт/м2 люминес центных ламп Philips (F36W/54). Температура воздуха – 23±1C/15±1С, отно сительная влажность воздуха – 55/70% день/ночь.
Условия проведения опытов. Растения переносили на питательный рас твор, содержащий хлорид натрия в концентрации 100 мМ и выращивали в те чение 4-х сут. Пробы листьев и корней интактных растений отбирали через 12, 18, 24, 48, 72, 96 ч экспозиции растений в присутствии 100 мМ NaCl, фиксиро вали жидким азотом и хранили при температуре -70°С до проведения анализов.
Растения при обработке УФ-В переносили в камеру с ультрафиолетовыми лампами и облучали в течение 10, 20, 30 мин (дозы облучения 12,3 кДж/м2, 24, и 36,8 кДж/м2). После облучения растения помещали в камеру фитотрона для фотореактивации и через 24 ч отбирали пробы листьев и корней интактных растений, фиксировали жидким азотом и хранили при -70°С.
Свободные полиамины в растительной ткани определяли в виде их бен зоильных производных методом высокоэффективной жидкостной хроматогра фии (Flores and Galston, 1982).
Оценку уровня экспрессии генов ферментов биосинтеза полиаминов проводили методом обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Общую РНК выделяли из растительного материала с использовани ем RNAeasy Plant Mini Kit («Qiagen», Германия). Синтез кДНК проводили ме тодом обратной транскрипции с использованием ферментов и реактивов фирмы «Fermentas». ПЦР проводили в амплификаторе модели PTC1160 («BioRad», США). Для оценки результатов ПЦР проводили электрофорез нуклеиновых ки слот в 1,3% агарозном геле в присутствии бромистого этидия.
Специфические праймеры для проведения ПЦР генов биосинтеза по лиаминов конструировали с использованием кДНК последовательностей соот ветствующих генов A thaliana, Th. halophila и P. major базы данных Нацио нального Центра биотехнологической информации США, Национальной меди цинской библиотеки (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) в среде Vector NTI 9.0.0, InforMax.
Определение количества перекиси водорода проводили колориметриче ским методом, основанном на образовании окрашенного комплексного соеди нения – пероксида титана (Brennan, Frenkel, 1977). Активность каталазы оп ределял методом Maehly and Chance (1954). Общую активность супероксид дисмутазы определяли по методу Beauchamp, Fridovich (1971). В качестве кон курента СОД за супероксид радикалы использовали нитросиний тетразолий.
Эксперименты проводили в 3-х кратной биологической повторности. Ре зультаты обрабатывали общепринятыми методами статистики (Вольф, 1966;
Зайцев, 1984).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Действие хлорида натрия Для определения устойчивости растений к действию NaCl и выявлению летальных концентраций был проведен ряд экспериментов (Радюкина, Иванов и др, 2007а, 2007б), в которых установлено, что концентрация 100 мМ NaCl яв ляется стрессовой для всех исследуемых растений.
Thellungiella halophila Исследование ферментов антиоксидантной защиты показало снижение активности супероксиддисмутазы (СОД) в корнях на фоне увеличения экспрес сии гена Cu-Zn/СОД, что возможно связано с ингибированием фермента при действии NaCl (M’rah et al., 2006). В листьях, напротив, отмечается значитель ное увеличение активности СОД в течение 24 ч действия NaCl. Увеличение ак тивности коррелировало с увеличением экспрессии гена Cu-Zn/СОД за 18 ч.
Динамика активности СОД и каталазы в растениях Th. halophila согласу ется с галофитной природой данного растения и указывает, что данная концен трация 100 мМ является стрессовой.
Действие 100 мМ NaCl на растения Th. halophila вызывало увеличение общего содержания свободных полиаминов в корнях и листьях в первые сутки эксперимента (рис. 1). В последующие 48 ч в этих частях растений содержание свободных полиаминов снижалось, причём наиболее интенсивно в корнях.
нмоль/г свежей массы Рисунок 1 – Общее содержание свободных полиаминов в растениях Th. halophila при действии 100 мМ NaCl корни листья 0 24 48 72 Экспозиция, ч В динамику общего содержания свободных ПА в корнях и листьях наи больший вклад вносило изменение содержания спермидина (Спд). Хотя уро вень путресцина (Пут) был низким, в течение первых суток воздействия проис ходило увеличение его содержания, особенно заметное в листьях (рис. 2).
Увеличение содержания Пут коррелировало с усилением экспрессии гена аргининдекарбоксилазы (особенно в листьях) через 12 ч действия NaCl (рис. 3).
корни листья 200 нмоль/г свежей массы нмоль/г свежей массы 150 100 50 0 24 48 72 0 24 48 72 Экспозиция, ч Экспозиция, ч Пут Спд Спм Пут Спд Спм Рисунок 2 – Спектр свободных ПА в растениях Th. halophila при действии 100 мМ NaCl Актин Актин АДК АДК SАМС SАМС SАМДК SАМДК СПДС СПДС СПМС СПМС Листья Корни Экспозиция, Экспозиция, ч ч 0 12 18 24 48 72 0 12 18 24 48 72 Рисунок 3 – Профили экспрессии генов ферментов биосинтеза ПА в растениях Th. halophila при действии 100 мМ NaCl Исследование экспрессии генов, кодирующих ферменты следующих эта пов биосинтеза ПА показало, что через 12 ч после начала действия засоления увеличивается уровень транскрипта гена S-аденозилметиониндекарбоксилазы (SАМДК) – ключевого фермента биосинтеза ПА. Особенно заметно это увели чение в листьях растений.
Наблюдаемое в течение первых суток действия NaCl в корнях и листьях увеличение содержания эндогенного Спд коррелировало с увеличением экс прессии гена СПДС1, кодирующего фермент спермидинсинтазу (рис. 3). При чиной наблюдаемого снижения содержания Спд в корнях после 24 ч действия засоления на фоне стабильно высокой экспрессии гена СПДС1, кодирующего его синтез, было увеличение окислительной деградации полиаминов, что под тверждалось увеличением содержания диаминопропана (ДАП) в корнях расте ний. ДАП является продуктом окислительной деградации Спд. В листьях на блюдалось лишь незначительное увеличение содержания ДАП.
Полученные данные свидетельствуют, что регуляция содержания свобод ных ПА в растениях Th. halophila при действии NaCl происходила как на уров не экспрессии генов ферментов их биосинтеза, так и на уровне катаболизма (окислительная деградация). Действие стресса приводило к увеличению содер жания свободных ПА в первые сутки и снижению их содержания в дальней шем. Снижение содержания Спд через 48 ч действия засоления на фоне ста бильно высокой экспрессии генов ферментов его биосинтеза обусловлено ин тенсивным синтезом Спм и повышением окислительной деградации.
Анализ экспрессии генов ферментов биосинтеза показал, что действие за соления индуцировало два ключевых гена – АДК и SАМДК. Уровень экспрессии остальных исследованных генов биосинтеза ПА при действии засоления оста вался на стабильно высоком уровне. Полученные данные показали, что в пер вые сутки действия засоления ПА активно участвовали в защитном ответе рас тения. При этом расходование их индуцировало увеличение уровня транскрип тов ключевых генов биосинтеза ПА.
Plantago major Растения Plantago major относятся к гликофитному ряду, и для них кон центрация 100 мМ NaCl является стрессом средней силы. Функционирование антиоксидантных ферментов в растениях P. major свидетельствовало: 1) анти оксидантные защитные системы у данного растения органоспецифичны;
2) ак тивность их в корнях, по-видимому, определяла солеустойчивость всего расте ния, что иллюстрировалось высокой конститутивной и стресс-зависимой ак тивностью СОД в корнях.
В отличие от растений Th. halophila действие засоления на растения P.
major приводило к снижению общего содержания свободных ПА в корнях и листьях в течение 18 ч. В последующем изменение содержания ПА носило вол нообразный характер (рис. 4), что может свидетельствовать об интенсивном расходовании ПА и синтезе de novo.
Преобладающим ПА в обоих органах, как и у растений Th. halophila, яв лялся Спд. Отмеченные колебания в общем содержании свободных ПА, как у Th. halophila, обусловлены изменением уровня Спд (рис. 5). Динамика измене ния содержания Спд в корнях была сходна с таковой в листьях, различия каса лись лишь количества данного ПА. На этом фоне изменения в содержании дру гих исследованных ПА практически не происходило. Подобная динамика со держания свободных ПА позволяет заключить, что растения Pl. major являются достаточно устойчивыми к действию NaCl (Kuznetsov, Shevyakova, 2007).
нмоль/г свежей массы Рисунок 4 – Общее содержание свободных ПА в растениях P.
100 major при действии 100 мМ NaCl корни листья 0 24 48 72 Экспозиция, ч При действии засоления у растений P. major наблюдались изменения уровней экспрессии генов метионинсинтазы (МетС) и S-аденозилметионинсин тазы (SАМС) в обоих органах, однако уровень экспрессии ключевого фермента биосинтеза ПА – SАМДК изменялся только в листьях (рис. 6). По сравнению с Th. halophila увеличение экспрессии гена SАМДК у P. major наблюдается на 6 12 ч позднее, что согласно литературным данным (Li, Chen, 2000), свидетельст вует о меньшей устойчивости P. major к действию засоления.
корни листья 150 нмоль/г свежей массы.
нмоль/г свежей массы.
100 50 0 0 24 48 72 96 0 24 48 72 Экспозиция, ч Экспозиция, ч Пут Спд Спм Пут Спд Спм Рисунок 5 – Спектр свободных ПА в растениях P. major при 100 мМ NaCl Актин Актин МетС МетС SАМС SАМС SАМДК SАМДК СПДС СПДС СПМС СПМС СПМС2 не обнаружено СПМС Листья Корни Экспозиция, Экспозиция, ч ч 0 12 18 24 48 72 0 12 18 24 48 72 Рисунок 6 – Профили экспрессии генов ферментов биосинтеза ПА в растениях P. major при действии 100 мМ NaCl Снижение содержания Спд в обеих частях растений происходило на фоне стабильной экспрессии гена СПДС1 в корнях и листьях, что отчасти объясняет ся повышением синтеза Спм. В корнях растений экспрессия генов сперминсин тазы (СПМС1 и СПМС2) оставалась стабильной в течение эксперимента с вы раженным увеличением через 48 ч, что сопровождалось транзиторным увели чением Спм.
Увеличения содержания продукта окислительной деградации полиаминов – ДАП, характерного для растений Th. halophila, у растений P. major не наблю далось, что может свидетельствовать или о недостаточно активном процессе окислительной деградации или о быстром включении ДАП в последующие ме таболитические реакции, что, возможно, является особенностью данного вида.
Таким образом, действие засоления в первые сутки вызывало разнона правленные изменения в общем содержании свободных ПА у растений P. major и у Th. halophila. В последующие 48 ч у этих растений общее содержание сво бодных ПА снижалось. Однако действие стресса вызывало изменения в уровне экспрессии ключевых генов биосинтеза ПА, что свидетельствует о необходи мости поддержания пула ПА на определенном уровне для преодоления стрес сорного воздействия.
Geum urbanum Среди исследованных растений G. urbanum оказался наименее устойчи вым к действию NaCl. На протяжении 2-х сут. воздействия происходило сни жение активности СОД. После 2-х сут. активность СОД восстанавливалась в корнях и листьях. Действие NaCl приводило к повышению содержания H2O2 в корнях и листьях уже через 24 ч, выявлена прямая коррелятивная связь дина мики активности каталазы и содержания пероксида водорода. Наблюдаемые изменения в активности антиоксидантных ферментов, особенно в первые сутки, свидетельствовали о нарушении нативной структуры белка в результате пас сивного поступления ионов натрия (Радюкина, Иванов и др., 2007а).
Действие 100 мМ NaCl вызвало незначительное повышение содержания ПА в течение первых суток и стремительное его падение уже через 48 ч (рис.
7). Такая динамика была характерна как для корней, так и для листьев. При этом корни обладали более высоким уровнем ПА по сравнению с листьями.
Доминирующим ПА в обеих частях растений, и особенно в корнях, яв лялся Пут, что отличает G. urbanum от других исследованных растений. Сни жение общего уровня ПА обусловлено именно снижением содержания Пут. На этом фоне в этих частях растений также наблюдалось снижение содержания Спд, причём в корнях более значительно, чем в листьях (рис. 8).
нмоль/г свежей массы Рисунок 7 – Общее содержание свободных ПА в растениях G. urbanum при действии 100 мМ NaCl корни листья 0 24 48 Экспозиция, ч 200 листья корни нмоль/г свежей массы.
нмоль/г свежей массы.
100 50 0 0 24 48 72 0 24 48 Экспозиция, ч Экспозиция, ч Пут Спд Спм Пут Спд Спм Рисунок 8 – Содержание свободных ПА в растениях G. urbanum при действии 100 мМ NaCl Динамику содержания Пут, по-видимому, можно объяснить интенсивным синтезом Спд и Спм и их расходованием для устранения повреждающих эф фектов NaCl.
Воздействие УФ-В Thellungiella halophila Действие УФ-облучения приводило к повышению активности СОД в ли стьях на фоне усиления экспрессии генов Cu-Zn/СОД и Mn/СОД и снижению её активности в корнях при снижении количества транскриптов. При всех иссле дованных дозах облучения значительно возрастало содержание H2O2 в корнях, что возможно связано с его транспортом из листьев и выполнением им сиг нальной роли (Cheesman, 2006). Уровень активности каталазы в корнях при всех исследованных экспозициях к УФ-В оставался практически неизменным.
Действие УФ-В облучения приводило к резкому увеличению содержания свободных ПА в листьях Th. halophila и незначительному снижению содержа ния ПА в корнях (рис. 9). Анализ спектра свободных ПА показал, что измене ние общего содержания ПА определялось доззависимым накоплением Пут в листьях (рис. 10).
1000 листья корни нмоль/г свежей массы.
Рисунок 9 – Общее содержание ПА в растениях Th. halophila при УФ-В облучении 0 10 20 Экспозиция, мин Пут корни листья 700 Пут Спд Спд нмоль/г свежей массы.
нмоль/г свежей массы.
Спм Спм 0 10 20 0 10 20 Экспозиция, мин Экспозиция, мин Рисунок 10 – Спектр свободных ПА в растениях Th. halophila при УФ-В облучении Действие всех исследованных доз УФ-В облучения приводило к незначи тельному усилению экспрессии гена АДК в листьях (рис. 11), которое не могло определять значительное (в 4-7 раз) накопление Пут (рис. 10).
Актин Актин не обнаружено АДК АДК МетС МетС SАМС SАМС SАМДК SАМДК СПДС СПДС СПМС СПМС ЛДК ЛДК Корни Листья Экспозиция, Экспозиция, мин мин 0 10 20 0 10 20 Рисунок 11 – Профили экспрессии генов ферментов биосинтеза ПА в растениях Th. halophila при УФ-В облучении При действии УФ-В в листьях наблюдалась устойчивая экспрессия гена МетС, снижающаяся лишь при максимальной дозе воздействия. Отмечено доз зависимое увеличение числа матриц SАМС. При действии малой и средней доз УФ-В наблюдалась стабильная экспрессия гена SАМДК, что свидетельствовало о достаточном уровне аминопропила, участвующего в синтезе Спд и Спм. На блюдаемое усиление экспрессии гена СПДС1 в листьях при действии УФ-В не приводило к увеличению содержания Спд. В то же время изменения в экспрес сии гена СПМС коррелировали с изменениями в содержании свободного Спм.
В отличие от действия засоления УФ-В облучение в листьях вызывало стресс-индуцируемый синтез кадаверина (рис. 12) и усиление экспрессии гена лизиндекарбоксилазы (ЛДК) (рис. 11). В корнях наблюдалось транзиторное по вышение экспрессии гена ЛДК, однако самого кадаверина в данном экспери менте не обнаружено, что вероятно, связано с транспортом кадаверина в ли стья, как это было показано на других растениях (Кузнецов и др. 2003).
Действие малой и средней доз УФ-В облучения практически не вызывало окислительной деградации ПА, о чём свидетельствует лишь незначительное увеличение содержания ДАП.
листья нмоль/г свежей массы.
Рисунок 12 – Содержание кадаверина в растениях Th. halophila при УФ-В облучении 0 10 20 Экспозиция, мин Наблюдаемое стресс-зависимое накопление Пут в листьях Th. halophila можно объяснить блокированием путей синтеза Спд и Спм на посттранскрипи цонном уровне образующимся этиленом, о чём косвенно свидетельствует обра зование кадаверина. Таким образом, при действии УФ-В Th. halophila исполь зует защитные механизмы, эволюционно выработанные для защиты от дейст вия засоления. Метаболизм ПА при этом виде стресса существенным образом меняется: ингибируется синтез ПА путресцинового ряда на посттранскрипци онном уровне и синтезируется кадаверин.
Plantago major В отличие от Th. halophila, действие всех исследованных доз УФ-В облу чения приводило к снижению активности СОД в листьях и корнях. Это сниже ние не зависело от мощности облучения и происходило на фоне усиливающей ся экспрессии гена Cu-Zn/СОД в листьях, и снижения уровня транскриптов в корнях. На фоне стабильного содержания H2O2 в листьях растений, в корнях отмечено доззависимое повышение содержания пероксида водорода, обуслов ленное, по всей видимости, активацией дыхания, вызванного стрессом.
Действие малой и средней доз УФ-В облучения вызывало снижение уровня свободных ПА в листьях P. major ниже уровня в контроле. Только при максимальной экспозиции к УФ-В общее содержание свободных ПА в листьях приближалось к значениям в контроле (рис. 13). Это существенно отличало P.
major от Th. halophila. Однако в корнях P. major действие малых доз УФ-В при водило к увеличению общего содержания ПА, а высоких доз – к его снижению.
листья корни нмоль/г свежей массы.
Рисунок 13 – Общее содержание ПА в растениях P. major при УФ-В облучении 0 10 20 Экспозиция, мин В отличие от Th. halophila, при малой и средней дозах облучения в расте ниях P. major происходило снижение эндогенного уровня Пут (рис. 14).
250 листья корни Пут Пут Спд Спд нмоль/г свежей массы.
200 нмоль/г свежей массы.
Спм Спм 0 10 20 0 10 20 Экспозиция, мин Экспозиция, мин Рисунок 14 – Спектр свободных ПА в растениях P. major при УФ-В облучении В листьях P. major наблюдалось доззависимое увеличение экспрессии всех исследованных генов биосинтеза ПА (рис. 15). В отличие от растений Th.
halophila, у P. major даже при максимальной экспозиции к УФ-В наблюдалось усиление экспрессии гена SАМДК в листьях. Наблюдалась устойчивая доззави симая экспрессия генов МетС и SАМС. Однако, усиление экспрессии генов, в том числе и генов СПДС1 и СПМС1 не приводило к увеличению эндогенного содержания Спд и Спм (рис. 14).
Актин1 Актин МетС МетС SАМС SАМС SАМДК SАМДК СПДС СПДС СПМС СПМС СПМС не обнаружено СПМС Корни Листья Экспозиция, Экспозиция, мин мин 0 10 20 0 10 20 Рисунок 15 – Профили экспрессии генов ферментов биосинтеза ПА в растениях Plantago major при УФ-В облучении В корнях P. major, в отличие от листьев, наблюдалось понижение экс прессии всех исследованных генов ферментов биосинтеза ПА (рис. 15). Отме чено понижение экспрессии гена ключевого фермента – SАМДК, а также пони жение экспрессии генов МетС и SАМС. На фоне понижения экспрессии генов СПДС1, СПМС1 и СПМС2 в корнях P. major, тем не менее происходило увели чение содержания эндогенных Спд и Спм (рис. 14, 15).
В отличие от Th. halophila действие УФ-В на растения P. major, приводи ло к стресс-зависимому накоплению кадаверина в корнях (рис. 16).
Снижение содержания Спд в корнях при средней и сильной дозах облу чения УФ-В, возможно связано с повышенной окислительной деградацией, о чём свидетельствует доззависимое увеличение содержания диаминопропана.
корни нмоль/г свежей массы.
Рисунок 16 – Содержание кадаверина в растениях P. major при УФ-В облучении 0 10 20 Экспозиция, мин Наблюдаемые незначительные изменения в содержании ПА в листьях, на фоне повышения экспрессии генов биосинтеза, свидетельствуют об интенсив ном расходовании ПА для устранения повреждающих эффектов УФ-В облуче ния. В корнях снижение общего содержания ПА проходило на фоне снижения экспрессии генов биосинтеза. При этом незначительное увеличение содержания Спд и Спм не вносило существенного вклада в изменение общего пула ПА.
Действие УФ-В на растения P. major в отличие от засоления индуцировало син тез кадаверина в корнях. У растений Th. halophila синтез кадаверина при дейст вии УФ-В инициировался в листьях.
Geum urbanum Действие УФ-В облучения приводило к повышению уровня СОД в листь ях G. urbanum и практически не оказывало действия на изменение активности СОД в корнях. Содержание H2O2 увеличивалось при действии всех исследован ных доз УФ-В. В корнях, напротив, наблюдалось практически доззависимое снижение содержания H2O2. Подобная динамика наблюдалась и в активности каталазы, что можно объяснить подавлением метаболических процессов во время адаптации растения к действующему стрессорному фактору.
Действие всех исследованных доз УФ-В облучения на G. urbanum приво дит к накоплению свободных ПА в листьях, как и у Th. halophila. При этом уве личение общего содержания ПА в листьях не характеризуется дозовой зависи мостью. На общее содержание ПА в корнях действие УФ-В облучения сущест венного влияния не оказывало (рис. 17).
листья нмоль/г свежей массы.
корни Рисунок 17 – Общее содержание ПА в растениях G. urbanum при действии УФ В облучения 0 10 20 Экспозиция, мин В листьях G. urbanum отмечено резкое увеличение содержания Пут при всех исследованных экспозициях к УФ-В (рис. 18). Существенных изменений в содержании Спд не выявлено. Тем не менее, уровень Спм увеличивался при средней и сильной степенях воздействия.
В корнях растений лишь при малой дозе воздействия наблюдалось увели чение содержания Пут. Уровень остальных ПА – Спд и Спм при всех исследо ванных дозах воздействия изменялся в пределах контроля.
500 Пут корни листья Пут Спд Спд 400 Спм нмоль/г свежей массы.
нмоль/г свежей массы.
Спм 0 10 20 0 10 20 Экспозиция, мин Экспозиция, мин Рисунок 18 – Спектр свободных ПА в растениях Geum urbanum при действии УФ-В облучения Действие всех исследованных доз УФ-В облучения приводило к накопле нию ДАП в корнях растений, что может свидетельствовать о повышении окис лительной деградации ПА. В то же время, в листьях растений стресс-зависимых изменений содержания ДАП не отмечено.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные исследования показали, что при действии двух видов стрес са (NaCl и УФ-В) у исследованных видов растений наблюдались разнонаправ ленные изменения в содержании свободных ПА. Наиболее существенное по вышение содержания свободных ПА, в основном Пут, наблюдалось при дейст вии УФ-В.
Анализ экспрессии ключевых генов биосинтеза ПА у Th. halophila Mey и P. major L. показал существенные изменения в уровне их транскриптов при обоих видах стресса. При засолении повышение общего содержания ПА было заметно только в первые сутки в корнях и листьях Th. halophila Mey. Одновре менно с этим, усиливалась экспрессия ключевых генов биосинтеза ПА – АДК и SАМДК, экспрессия остальных генов этого пути оставалась высокой. Для P. ma jor L. на фоне снижения общего содержания ПА увеличивался уровень транс криптов генов МетС и SАМДК. Основным отличием в действии засоления и ультрафиолета был индуцируемый последним органоспецифичный синтез ка даверина в корнях P. major L. и листьях Th. halophila Mey.
Показано, что оба стресса вызывали изменения в содержании и спектре свободных ПА у всех изученных растений, что свидетельствует об участии этих низкомолекулярных соединений в защитном ответе растения и необходимости поддержания пула ПА на определенном уровне. Кроме того, изменение экс прессии генов при действии двух изученных стрессоров свидетельствует о транскрипционном контроле уровня свободных ПА. При этом более сильный окислительный стресс, вызываемый действием УФ-В, изменял и уровень экс прессии большего числа генов биосинтеза ПА.
Вторым возможным механизмом регуляции уровня свободных ПА явля ется их окислительная деградация полиаминоксидазой и диаминоксидазой, о чём свидетельствовали изменения в содержании ДАП – продукта окислитель ной деградации ПА.
Исследования активности СОД, ключевого фермента антиоксидантной защиты выявили, зависящие от вида растения, органоспецифичные изменения при действии стрессоров. Функционирование СОД при действии засоления и УФ-В облучения было необходимым, но недостаточным условием, опреде ляющим адаптационный потенциал исследованных растений. По этой причине увеличение пула ПА, как неферментативных антиоксидантов могло обеспечи вать адаптацию растений к действию исследованных неблагоприятных факто ров.
ВЫВОДЫ 1. Благодаря использованию дикорастущих травянистых растений (Thel lungiella halophila Mey., Plantago major L., Geum urbanum L.) расширен спектр модельных объектов для выявления участия полиаминов в адаптации растений к стрессорным факторам (NaCl, УФ-В).
2. Показано, что изменения в уровнях свободных полиаминов при дейст вии NaCl и УФ-В разнонаправлены, органоспецифичны и зависят от вида рас тений.
3. Действие засоления на галофит Thellungiella halophila существенно из меняли экспрессию SАМДК – ключевого гена биосинтеза полиаминов, как в ли стьях, так и в корнях.
4. Установлено, что изменения в экспрессии генов биосинтеза Спд (СПДС) и Спм (СПМС) при засолении не коррелировали с изменением эндо генного уровня этих полиаминов у Thellungiella halophila и Plantago major, что свидетельствует о регуляции их биосинтеза на посттранскрипционном уровне.
5. У среднеустойчивого к засолению Plantago major, по сравнению с га лофитом Thellungiella halophila, этот вид стресса вызывал изменения в экспрес сии большего числа генов биосинтеза полиаминов: СПМС1 и СПМС2 в корнях, и генов SАМДК1, SАМС, СПДС1 и СПМС1 – в листьях.
6. Действие исследованных доз УФ-В вызывало усиление экспрессии всех генов биосинтеза полиаминов в листьях Thellungiella halophila и Plantago major, но не приводило к накоплению свободных Спд и Спм.
7. Особенностью действия УФ-В на растения Thellungiella halophila и Plantago major является стресс-индуцируемый органоспецифичный синтез ка даверина.
Список публикаций по теме диссертации 1. Карташов А.В., Иванов Ю.В., Радюкина Н.Л., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. Активация некоторых защитных систем в растениях Thellungiella halophila при действии NaCl // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. Естествен ные науки. №1(5). Выпуск посвящен 60-летию Естественно-географического факультета. Пенза. Изд-во ПГПУ, 2006. – С. 57-61.
2. Иванов Ю.В., Карташов А.В., Радюкина Н.Л., Шевякова Н.И. Функ ционирование NaCl индуцированной защитной системы в растениях галофит ного и гликофитного типов // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 10-я Пущин ская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН (Пущино, 17-21 апреля 2006 года).
3. Карташов А.В., Иванов Ю.В., Радюкина Н.Л. Сравнительный анализ стресс-реакции растений гравилата городского (Geum urbanum L.), вызванной воздействием различных солей // Экология 2006: эстафета поколений. Мате риалы конференции V Пущинской международной школы-семинара по эколо гии. М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2008. – С. 12-15.
4. Иванов Ю.В., Карташов А.В., Радюкина Н.Л., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. Действие различных концентраций NaCl на дикорастущие травянистые растения средней полосы России // Леса Евразии – Венгерский лес: Материалы VI Международной конференции молодых учёных. – М.: МГУЛ, 2006. – С. 67 5. Kuznetsov Vl.V., Rakitin V.Yu., Radukina N.L., Ivanov Yu.V., Shevyakova N.I.// Stress-accelerated spermine production in leaves of Thellungiella halophila is not controlled at the level of expression of SPDS gene. An.meeting of ASPB, Boston 2006, Abstrats, p.278.
6. Иванов Ю.В., Карташов А.В., Радюкина Н.Л., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. Индукция защитной системы в растениях гравилата городского под дей ствием NaCl // Актуальные проблемы лесного комплекса/ Под ред. Е.А. Пам филова. Сб. науч. тр. по итогам междунар. науч.-техн. конф. Вып. 13. – Брянск:
БГИТА, 2006. – С. 181- 7. Иванов Ю.В., Радюкина Н.Л., Кузнецов Вл.В. The defense response of Thellungiella halophila for NaCl stress // Материалы I (IX) Международной Кон ференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (21-26 мая 2006). – СПб. Из дательство ГЭТУ, 2006. – С. 151-152.
8. Радюкина Н.Л., Иванов Ю.В., Карташов А.В., Шевякова Н.И., Ракитин В.Ю, Хрянин В.Н., Кузнецов Вл. В. Изучение индуцибельных и конститутив ных механизмов устойчивости к солевому стрессу у гравилата городского // Физиология растений, 2007, Т.54, 692-698.
9. Радюкина Н.Л., Карташов А.В., Иванов Ю.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл. В. Сравнительный анализ функционирования защитных систем у предста вителей галофитной и гликофитной флоры в условиях засоления // Физиология растений, 2007, Т.54, 902-912.
10. Карташов А.В., Иванов Ю.В., Радюкина Н.Л. Системы стресс толерантности подорожника большого (Plantago major L.) // Леса Евразии Русский север: Материалы VII Международной конференции молодых ученых.
- М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2007. - 100-101.
11. Радюкина Н.Л., Иванов Ю.В., Карташов А.В., Окислительный стресс у растений // Леса Евразии - Русский север: Материалы VII Международной кон ференции молодых ученых. - М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2007. - 120-121.
12. Радюкина Н.Л., Иванов Ю.В., Карташов А.В., Окислительный стресс у растений при действии неблагоприятных факторов окружающей среды // Эко логия почвы. Круговорот элементов в экосистемах и почвах. Материалы XV Всероссийской школы. Программа краткое содержание докладов. Пущино:
ОНТИ ПНЦ РАН. 2007. С. 41.
13. S. Mapelli, I. Brambilla, Y. Ivanov, N. Radukina, Vl. Kuznetsov. UV-B Radiation and Salt Stress Interaction on Biochemical and Physiological Events in Ice Plant // Современная физиология растений: от молекул до экосистем: Материа лы докладов международной конференции (в трех частях). Часть 2. (Сыктыв кар, 18-24 июня 2007 г.). - Сыктывкар, 2007. - С. 5- 14. Карташов А.В., Иванов Ю.В., Пашковский П.П., Радюкина Н.Л., Куз нецов Вл.В. Исследование ранней индукции защитных систем растений подо рожника большого (Plantago major L.) под действием NaCl // Современная фи зиология растений: от молекул до экосистем: Материалы докладов междуна родной конференции (в трех частях). Часть 2. (Сыктывкар, 18-24 июня 2007 г.).
- Сыктывкар, 2007. - С. 176-177.
15. Иванов Ю.В., Карташов А.В., Радюкина Н.Л., Кузнецов Вл.В. Измене ние содержания свободных полиаминов в растениях Thellungiella halophila Mey. при прогрессирующем засолении NaCl // Современная физиология расте ний: от молекул до экосистем: Материалы докладов международной конферен ции (в трех частях). Часть 2. (Сыктывкар, 18-24 июня 2007 г.). - Сыктывкар, 2007. - С. 158-159.
16. Ivanov Y.V., Radukina N.L., Kuznetsov Vl.V. Investigation of polyamines content and composition in Geum urbanum L. under salt stress // 2-nd International Symposium: Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Apply ing in Agriculture. Abstracts 8-12 October 2007 Kyiv, Ukraine. P. 59.
17. Radukina N.L., Ivanov Y.V., Kartashov A.V. Kuznetsov Vl.V. The Free Polyamines in Glycophyte Plantago major and Halophyte Thellungiella halophila under Salt Stress // 2-nd International Symposium: Plant Growth Substances: Intra cellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture. Abstracts 8-12 October 2007 Kyiv, Ukraine. P. 109.
18. Карташов А.В., Радюкина Н.Л., Иванов Ю.В., Пашковский П.П., Шевя кова Н.И., Кузнецов Вл.В. Роль антиоксидантных систем при адаптации дико растущих видов растений к солевому шоку // Физиология растений, 2008, Т. 55, в печати.