Удк 577.151.02, 577.151.042, 579.017.7 особенности устройства цитохромоксидазы ba3 из термофильной бактерии thermus thermophilus

на правах рукописи

Анастасия Валерьевна Калинович УДК 577.151.02, 577.151.042, 579.017.7 ОСОБЕННОСТИ УСТРОЙСТВА ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ ba3 ИЗ ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ Thermus thermophilus 03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011

Работа выполнена в отделе молекулярной энергетики микроорганизмов НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор биологических наук Константинов Александр Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Андреев Игорь Михайлович кандидат биологических наук Арцатбанов Владислав Юрьевич

Ведущая организация: Воронежский Государственный Университет (кафедра генетики, цитологии и биоинженерии)

Защита диссертации состоится «_14_» марта 2011 г. в на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В.

Ломоносова, Биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «» _ 2011 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цитохромоксидаза (ЦО1) – терминальный фермент дыхательной цепи митохондрий и многих бактерий. ЦО катализирует восстановление кислорода цитохромом с, сопряженное с образованием Н+.

Большинство терминальных оксидаз относится к так называемому гем медному семейству, в котором на основании особенностей устройства протонных каналов выделяют классы А, В и С. К группе А принадлежат наиболее изученные оксидазы: ЦО митохондрий и многие бактериальные оксидазы. Они содержат три протонных канала (K, D и H), для двух из которых (K и D) участие в переносе протонов доказано экспериментально.

Терминальные оксидазы класса В исследованы в гораздо меньшей степени.

Наиболее древними и хуже всего изученными являются оксидазы класса С.

Оксидазы класса В появились в эволюции позднее, а самыми «молодыми» являются, по-видимому, оксидазы класса А. Сравнение эволюционно далеких друг от друга оксидаз важно для нахождения общих закономерностей, сохранившихся в процессе эволюции фермента, а значит, наиболее важных.

Кроме того, оно позволяет определить особенности, связанные с адаптацией организмов (к высоким температурам, кислой среде и др.). Самым изученным представителем оксидаз класса B является ЦО типа ba3 из термофильной эубактерии Thermus thermophilus. Это единственная оксидаза класса В, для которой расшифрована трехмерная структура. Как и оксидазы класса А, фермент содержит три потенциальные протонные канала. Для одного из них прослеживается отдаленная гомология с К-каналом ЦО группы А, функциональная роль двух остальных пока не выявлена. Согласно работе (Kannt, 1998), оксидаза ba3 переносит протоны через мембрану с меньшей эффективностью (Н+/ = 0,5), чем оксидазы класса А (Н+/ = 1). В последнее Список принятых сокращений: ЦО – цитохромоксидаза, КД – круговой дихроизм, МКД – магнитный круговой дихроизм, ДАД – 2,3,5,6-тетраметил-п-фенилендиамин, ТМФД – N,N,N,N-тетраметил-п-фенилендиамин, ФМС – феназинметасульфат, ЭДТА – + этилендиаминтетраацетат, Н – трансмембранная разность электрохимических потенциалов иона водорода, – трансмембранная разность электрических потенциалов.

время все больше указаний на то, что механизмы перекачки протонов через мембрану у гем-медных оксидаз разных классов могут различаться. Важно установить, коррелируют ли выявленные при анализе геномов различия в структуре протонных каналов с другими свойствами оксидаз, в первую очередь – с устройством центра восстановления кислорода. Традиционный подход к изучению кислород-редуктазного центра ЦО состоит в исследовании взаимодействия фермента с такими лигандами, как CO, HCN, H2S, H2O2 и др., которые могут рассматриваться, как аналоги естественного субстрата, О (Koutsoupakis, 2002;

Maramoto, 2010).

Цели работы. Целью настоящей работы являлось исследование особенностей устройства каталитического центра ЦО ba3 из Thermus thermophilus в сравнении с митохондриальной ЦО аа3-типа.

Основные задачи исследования заключались в том, чтобы: (1) сопоставить оптические характеристики гемовых центров оксидазы ba3 из T. thermophilus со спектральными свойствами оксидаз аа3 типа;

(2) изучить связывание окисленной оксидазы ba3 с лигандами трехвалентного железа гема а (цианидом, перекисью водорода, азидом);

(3) изучить взаимодействие ba восстановленной ЦО с цианидом и СО;

(4) выявить наличие гемосопряженных ионизируемых групп в ЦО типа ba3;

(5) исследовать возможную роль «кислородного канала» в проникновении лигандов в кислород-редуктазный центр оксидазы типа ba3.

Научная новизна и практическая значимость. Результаты исследования каталитического центра ЦО ba3 из T. thermophilus, изложенные в настоящей работе, получены впервые. Обнаружено, что цитохром ba3 образует два разных цианидных комплекса с восстановленным гемом а3, формирование которых определяется условиями восстановления фермента. При полном восстановлении в строго анаэробных условиях образуется комплекс, сходный с митохондриальным аналогом как сродством (КД = 0,7 мМ), так и спектральными характеристиками. В присутствии слабых восстановителей гем а32+ образует с цианидом спектрально иной и практически недиссоциирующий (КД 5*10-8 М) аддукт. Обнаружены также два типа комплексов оксидазы ba3 с CO, один из которых, формирующийся в условиях частичного окисления, напоминает прочный цианидный комплекс. Впервые исследована кинетика взаимодействия KCN с восстановленной оксидазой ba3. Обнаружена рН а32+ с цианидом и показано, что зависимость скорости связывания гема связывание лиганда контролируется протонированием гемосопряженной ионизируемой группы белка с рКа около 9. Совокупность полученных данных свидетельствует о значительных различиях между ЦО классов A и B в отношении устройства кислород-редуктазного центра, что дает основания предполагать возможность различий в механизмах транслокации протонов оксидазами разных классов.

Апробация работы. Результаты докладывались на научном семинаре НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского (2010), на 14-й (Москва, 2006) и 16-й (Варшава, 2010) Европейских конференциях по биоэнергетике, XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе статьи в рецензируемых международных журналах.

Диссертация состоит из введения, обзора Структура диссертации.

литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 107 страниц машинописного текста, 3 таблицы и 36 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе исследовали нативный цитохром ba3 из T.thermophilus (Giuffre, 1999), рекомбинантный фермент с гистидиновой «ручкой» и мутантную форму A120T, выделявшиеся по методике (Werner, 2010), а также цитохромоксидазу аа3 из митохондрий сердца быка, выделенную по методу (Fowler, 1962).

Спектры поглощения записывали на спектрофотометрах CaryBio-300 («Varian», США) и SLM-Aminco 2000C (США), спектры КД и МКД – на спектрофотометре «Chiroscan» (Applied Photophysics, Великобритания).

ba Быструю кинетику связывания цианида оксидазой изучали на спектрофотометре быстрого смешивания SX20 (Applied Photophysics, Великобритания).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 1. Общие характеристики оксидазы ba3 из T. thermophilus.

Энзиматическая активность нативного и рекомбинантного ферментов практически не отличается. С искусственными донорами электронов (аскорбат с ТМФД или ДАД, НАДН с ФМС) активность низка (1-6 с-1, 22оС, ионная сила 25 мМ) и увеличивается при добавлении природного донора электронов – цитохрома с552 (~15 с-1 при 220С). Следует помнить, что оптимум работы фермента (~ 500 с-1) достигается при ~ +600C и нулевой ионной силе (Giuffre, 1999). Перенос электронов ферментом, встроенным в липосомы, сопряжен с образованием на мембране и ускоряется разобщителями.

Спектральные свойства. Спектры поглощения окисленной и восстановленной форм цитохрома ba3 заметно отличаются от спектров митохондриальной ЦО (Рис. 1). Это объясняется, в первую очередь, различием типов низкоспинового гема в этих ферментах (b и а, соответственно). В области Соре восстановленный гем b поглощает при 427 нм, гем а – при 444 нм. В видимой области максимумы поглощения гемов b2+ и а32+ еще больше отстоят друг от друга (560 и 604 нм). Высокоспиновый гем а32+ у обеих оксидаз имеет -максимум поглощения при 443-444 нм. Кроме того в спектре ba3 хорошо видна -полоса гема а32+ при 613 нм, тогда как в митохондриальном ферменте -полосу высокоспинового гема (согласно (Vanneste, 1966), при 602 нм) практически невозможно различить на фоне -максимума гема а2+.

Рис. 1. Спектры оптического поглощения оксидаз ba3 и аа3.

А, Б – аэробно окисленные препараты, В, Г – препараты, восстановленные дитионитом.

Глава 2. Особенности взаимодействия цитохромоксидазы ba3 с лигандами.

2.1. Взаимодействие с лигандами окисленной оксидазы ba Взаимодействие оксидазы ba3 с лигандами существенно отличается от связывания лигандов оксидазами класса А. Прежде всего это касается окисленной формы фермента (Таблица 1). Митохондриальная оксидаза аа3 в окисленном состоянии легко взаимодействует с такими низкомолекулярными лигандами гема а33+ как цианид, сульфид, азид, перекись водорода и др. Все эти соединения взаимодействуют с ионом Fe(III) гема а3 по 6-му аксиальному положению и вызывают длинноволновый сдвиг -полосы поглощения фермента.

В то же время в окисленной форме оксидазы ba3 гем a33+ с лигандами практически не реагирует. В некоторых случаях свежевыделенная рекомбинантная оксидаза ba3 была способна связывать цианид, но тот же препарат не реагировал с H2O2. Цитохром ba3 не реагирует с сульфидом и не образует низкоспиновый комплекс гема a33+ при добавлении высоких концентраций азида (100 мM), как это типично для митохондриального фермента. Интересно, что при этом азид вызывает небольшие спектральные изменения, которые в случае митохондриального фермента интерпретируются как взаимодействие лиганда с CuB2+ (Выгодина, 1985).

ЦО аа3 ЦО ba Таблица 1. Взаимодействие H2O2 + – окисленных оксидаз с лигандами * один из препаратов ba3 связывал KCN + – /+* цианид HN3 + –/+** ** наблюдаемые спектральные изменения типичны для связывания азида с CuB H2S + – 2.2. Взаимодействие восстановленной оксидазы ba3 с цианидом Восстановление оксидазы ba3 приводит к появлению способности фермента связывать лиганды гема a3. В присутствии источника электронов цитохром ba3, как и митохондриальная оксидаза аа3 (или бактериальные оксидазы класса А), легко реагирует с СO, NO, KCN, H2O2. При этом существенных различий между поведением нативной и рекомбинантной ЦО ba3 нами обнаружено не было. Наиболее подробно мы исследовали взаимодействие восстановленной оксидазы ba3 с цианидом. Было обнаружено, что в зависимости от условий восстановления, цитохром ba3 образует с цианидом комплексы двух типов, различающиеся прочностью и спектральными свойствами.

2.2.1. Спектральные свойства комплексов восстановленной цитохромоксидазы ba3 с цианидом Один тип комплекса образуется при добавлении цианида к оксидазе ba3 в присутствии слабых восстановителей (ферроцианида, восстановленной формы ДАД, аскорбата + ДАД и др.), а также в присутствии более сильных восстановителей – NADH или даже дитионита, если не принимать специальных мер для соблюдения строго анаэробных условий.

Рис. 2. Cпектры поглощения цианидных комплексов восстановленной ЦО ba3. Абсолютные (А, Б) и разностные (В, Г) спектры поглощения. Образец восстановлен дитионитом в присутствии 3 мкМ ФМС. KCN добавлен в насыщающей концентрации мМ. Сплошные линии – эксперимент в открытой кювете;

пунктир – эксперимент в строго анаэробных условиях (плотно закрытая кювета, продувка аргоном).

В абсолютном спектре поглощения такого комплекса (Рис. 2, сплошные линии) видно исчезновение максимума 613 нм свободного гема а32+ и появление пика при 591 нм, принадлежащего форме а32+-CN. В области Соре наблюдается появление полосы при ~439 нм. Разностный спектр характеризуется узкой интенсивной полосой при 591-592 нм (592-614 = 24, мМ-1см-1, полуширина 12,3 нм), минимумом при 614 нм и увеличением поглощения при 439-440 нм. Подобные изменения характерны для перехода гема а32+ из высокоспинового в низкоспиновое состояние. Величина вызванных цианидом изменений в области Соре и в видимой области практически одинакова. Эти спектральные характеристики согласуются с данными работы (Surerus, 1992). Комплекс гема a32+-CN, полученный в присутствии слабых восстановителей (ферроцианида или ДАД), имеет такие же спектральные свойства, хотя в этом случае гем b и CuA частично или полностью окислены.

Таким образом, спектральные характеристики цианидного комплекса гема а32+ существенно не зависят от степени восстановленности входных редокс центров ЦО ba3.

ba3, восстановленной дитионитом в Добавление цианида к оксидазе присутствии ФМС в плотно закрытой кювете, приводит к образованию комплекса, заметно отличающегося от описанного выше (Рис. 2, пунктир). В видимой области полоса при 592 нм смещается к 589 нм и уменьшается по амплитуде на ~40%. В области Соре полоса цианидного комплекса гема а32+ заметно уширяется, и максимум разностного спектра смещается к 449 нм. Эти спектральные свойства анаэробного комплекса а32+-CN оксидазы ba3 очень близки к характеристикам цианидного комплекса гема а32+ в восстановленной дитионитом митохондриальной оксидазе. Различия между двумя типами цианидных комплексов ba3 наблюдаются также в спектрах КД и МКД (рис. 3).

Кроме того, два типа комплексов кардинально различаются сродством к лиганду (см. раздел 2.2.3).

Рис. 3. Спектры кругового и магнитного кру гового дихроиз ма двух цианидных комплексов оксидазы ba3.

Условия, как на рис. 2.

2.2.2. Кинетика связывания цианида восстановленным гемом а32+ цитохромоксидазы ba3.

В присутствии различных доноров электронов (ферроцианид, ДАД, НАДН) гем а32+ цитохрома ba3 полностью связывается с цианидом в аэробных условиях уже при микромолярных концентрациях лиганда (Рис. 4). Реакция протекает с кинетикой, близкой к моноэкспоненциальной, скорость ее пропорциональна концентрации KCN и характеризуется константой скорости второго порядка ~ 110 М-1с-1 (панель Б), что близко к константе скорости связывания цианида с восстановленной ЦО митохондрий.

цианидный комплекс, % 100 50 мкМ Б A - kobs, 10 c 10 мкМ - KCN -1 - 2 мкМ kv = M c 0 10 20 30 40 0 5 время, мин [KCN], мкМ Рис. 4. Кинетика связывания цианида ЦО ba3 в присутствии ДАД.

А - кинетика образования цианидного комплекса. Б - зависимость скорости образования цианидного комплекса от концентрации лиганда. Доля фермента, образовавшего цианидный комплекс, определялась cпектрофотометрически по A592-575. В качестве донора электронов использован 2 мМ восстановленный ДАД. Аэробные условия, рН 7,6.

ba3, Образование комплекса цианида с цитохромоксидазой восстановленной дитионитом с ФМС в анаэробных условиях, характеризуется высоким значением Кд ~ 0,7 мМ (см. ниже), поэтому кинетика процесса была исследована при высоких концентрациях лиганда с помощью метода быстрого смешивания. Развитие во времени спектральных изменений в ответ на добавление 20 мМ KCN показано на рис 5А.

A Б 590 - 614 nm - 10 мМ см - A, мМ см - A 590 20 мM - - 0.0 5 c KCN 614 - 3.6 c t= 0 - 240 c 550 575 600 625 0 1 10 20 Длина волны, нм Время, с Рис.5. Кинетика связывания цианида с цитохромоксидазой ba3 в анаэробных условиях. В спектрофотометре быстрого смешивания оксидазу ba3, восстановленную избытком дитионита натрия и 3 мкМ ФМС, смешивали с равным объемом раствора KCN, содержащего дитионит. Конечные концентрации: ba3 - 3,5 мкМ;

KCN -20 мМ.

Исчезновение полосы свободного восстановленного гема а32+ при 614 нм сопровождается появлением максимума цианидного комплекса при 589- нм. Процесс по меньшей мере двухстадиен, как в видимой области (рис. 5) так и в полосе Соре (не показано) и при разложении на 2 экспоненты характеризуется k1 = 3.6 с-1 и k2 = 0.05 с-1 (Рис. 5Б). Величина k1 при 20 мМ цианида соответствует константе скорости второго порядка kon ~ 170 М-1с-1, близкой к таковой в присутствии диаминодурола (рис. 4).

2.2.3. Сродство восстановленного гема а32+ цитохромоксидазы ba3 к цианиду.

Аэробный комплекс. Цианидный комплекс гема a32+, возникающий в аэробных условиях, характеризуется чрезвычайно прочным связыванием лиганда. Как видно из Рис. 4, цитохром ba3 в присутствии ДАД и 50 мкМ цианида через 15-20 минут полностью переходит в связанную форму. В присутствии ферроцианида оксидаза ba3 полностью переходит в цианидный комплекс даже без добавления цианида (Калинович, 2010), извлекая лиганд из гексацианидного комплекса Fe(II). Прямая количественная оценка прочности связывания при таком высоком сродстве (например, путем титрования) осложняется медленностью реакции при низких концентрациях лиганда, в связи с чем были использованы другие подходы. Было найдено, что в соотношении 1:1 оксидаза ba3 полностью экстрагирует цианид из цианидного комплекса метмиоглобина (KД около 1,2 мкМ (Ver Ploeg, 1968)). Эксперименты с использованием в качестве цианидного буфера смеси метмиоглобина с KCN (11:1) показали, что в присутствии 0,1 мкМ свободного цианида гем a32+, при достаточно длительной инкубации, практически полностью переходит в форму цианидного комплекса. Это позволяет оценить верхнюю границу сродства цианида к гему а32+ величиной Кд 10-8 М.

В исследованном диапазоне условий связывание цианида с гемом а32+ является практически необратимым. Наблюдать сколь-либо заметную диссоциацию комплекса не удается. На Рис. 6 показаны результаты эксперимента, в котором к полностью сформированному комплексу ba32+–CN добавили избыток кобаламина (III), являющегося эффективной ловушкой для цианида (КД ~ 10-12 М (Broderick, 2006)). Распада цианидного комплекса цитохрома ba3 не происходит даже за 6 суток, за исключением примерно 10% диссоциирующего с koff ~ 5,6•10-6 с-1. Для комплекса, небольшой части комплекса, подвергающейся диссоциации, соотношение koff /kon дает верхний предел KД 5•10-8 M, что согласуется с данными равновесных экспериментов с использованием цианидного комплекса метмиоглобина. В контрольном эксперименте добавление в тех же условиях кобаламина к цианидному комплексу метмиоглобина вызывает распад комплекса с koff 1,3•10-4 с-1 (Рис.

6Б), что хорошо соответствует литературным данным (Brancaccio, 1994).

цианидный комплекс, % цианидный комплекс, % A Б 100 метмиоглобин оксидаза 50 ba 0 100 200 0 50 100 150 Время, ч Время, мин Рис. 6. Диссоциация аэробного цианидного комплекса восстановленной оксидазы ba3.

А – распад цианидного комплекса оксидазы ba3 (4,7 мкМ) в присутствии кобаламина ( мкМ). 15 мкМ KCN, рН 7,6, в качестве восстановителя использован 50 мкМ НАДН.

Б – контрольный эксперимент: диссоциация цианидного комплекса метмиоглобина (8, мкМ). рН 7,0, остальные условия, как на панели А.

Анаэробный комплекс. Комплекс, образующийся при добавлении KCN к оксидазе ba3, восстановленной дитионитом с ФМС в анаэробных условиях (плотно закрытая кювета, в раствор KCN добавлен дитионит) характеризуется низким сродством к цианиду. Связывание лиганда в этом случае легко обратимо и титруется с Кд = 0,7 мМ. (Рис. 7). Эта величина близка к Кд цианидного комплекса восстановленной митохондриальной ЦО, определенной нами в тех же условиях (Кд около 0,4 мМ).

Рис. 7. Связывание цианида с полностью восстановленными формами цитохромоксидаз ba3 и аа типа.

Титрование цианидом цитохромов ba3 и аа3 в присутствии 25 мМ дитионита натрия и 3 мкМ ФМС, рН 7,6. Продувка аргоном, плотно закрытая кювета, KCN добавлялся из анаэробного исходного раствора.

Таким образом, цианидные комплексы, образующиеся при различном способе восстановления биядерного центра ЦО ba3, по меньшей мере на порядков различаются между собой по прочности. Было найдено, что анаэробный комплекс при открывании кюветы и перемешивании легко переходит в форму с высоким сродством, несмотря на избыток в среде дитионита. Обратного превращения предобразованного прочного комплекса в форму с низким сродством и максимумом при 589 нм не удается добиться даже при длительной инкубации с избытком дитионита и ФМС в плотно закрытой кювете.

2.3. Два типа комплексов восстановленной цитохромоксидазы ba3 с окисью углерода.

Б ba 3 + CO A ba 3 + CO - - 15 мМ см 100 мМ см - - 525 550 575 600 400 425 450 Длина волны, нм Длина волны, нм Рис. 8. Абсолютные спектры поглощения комплекса восстановленной ЦО ba3 с окисью углерода, полученные через 1 мин после продувки CO (1) и через 24 дня инкубации на воздухе (2). 1,4 мкМ ЦО ba3 восстановлена 20 мМ дитионитом натрия с 3 мкМ ФМС.

Подобно результатам с цианидом, нами было обнаружено также два разных комплекса оксидазы ba3 с СО (рис. 8). Один из них образуется при взаимодействии полностью восстановленного фермента с избытком CO и аналогичен описанному в литературе (рис. 8, кривые 1). При длительной инкубации на воздухе этот спектр комплекса претерпевает значительные изменения и через несколько дней становится практически не отличим от спектра прочного цианидного комплекса» (рис. 8, кривые 2). Далее комплекс остается стабильным в течение всего срока наблюдения (до месяца), не считая постепенного окисления гема b. Спектры КД и МКД подтверждают сходство аэробных комплексов гема а32+ в оксидазе ba3 с цианидом и CO.

Низкотемпературные спектры ЭПР показали, что в аэробном комплексе с CO «невидимая медь» CuB находится в окисленном состоянии.

Глава 3. Гемосопряженные ионизируемые группы цитохромоксидазы ba3.

В главе описаны результаты исследования pH-зависимости свойств гемовых центров фермента.

pH –зависимость спектров поглощения. pH-зависимость спектральных свойств гемопротеидов обычно отражает кислотно-основную ионизацию групп в ближайшем окружении гемов, ионизация тех же групп влияет, как правило, на способность гемов к редокс-зависимому протонированию. Найдено, что влияние pH на спектральные свойства оксидаз аа3 и ba3 резко отличается. В случае оксидазы аа3 при защелачивании возникает асимметричный разностный спектр, свидетельствующий о длинноволновом сдвиге полосы Соре, и увеличивается поглощение при 606 нм (не показано), что согласуется с данными литературы и связано с изменением спектральных характеристик высокоспинового гема а3 (Parul, 2005) – возможно образованием перекисного комплекса. Совершенно другой характер имеют спектральные изменения окисленной ЦО ba3 –типа. Защелачивание выывает симметричный разностный спектр, примерно, той же амплитуды, что в случае оксидазы aa3, но указывающий на сдвиге полосы Соре в коротковолновую область.

pH-зависимость связывания цианида. Было найдено, что в оксидазе ba скорость связывания восстановленного гема а3 с цианидом замедляется при защелачивании. Типичные результаты представлены на рис. 9.

цианидный комплекс, % Б A pH:

7, 3, lg kon 50 50 M 7, KCN 8, 25 9, 9, 0 7 8 9 0 5 10 pH В рем я, м ин Рис. 9. рН-зависимость скорости связывания цианида с цитохромом ba3 в присутствии диаминодурола. (А) – Кинетика связывания 50 мкМ цианида с цитохромом ba3 при различных значениях рН. 0,9 мкМ ЦО ba3 восстановлена 1 мМ ДАД. По оси ординат отложена доля фермента, связанного с цианидом, определявшаяся спектрофотометрически по A592-575. (Б) – рН-зависимость скорости образования комплекса.

Через экспериментальные точки проведены теоретические кривые, соответствующие следующим случаям: 1 – протонированный фермент (pKа = 9,3) связывает протонированный лиганд HCN;

2 – протонированный фермент (pKа = 8,75) связывает как HCN, так и CN-.;

3 – протонированный фермент c pK 7 связывает анионную форму лиганда CN–;

4 – Протонированный лиганд (HCN) связывается с ba3, независимо от ионизации фермента.

При постоянной концентрации лиганда скорость реакции замедляется в шесть раз при защелачивании среды от рН 7,4 до рН 9,5. Наблюдаемое замедление реакции нельзя объяснить простой ионизацией HCN (pK=9,2) и избирательным взаимодействием фермента с анионом CN- (кривая 3 на рис.

9Б), так что эффект связан с ионизацией группы (групп) фермента. Хорошее соответствие экспериментальным данным дают две простейшие модели:

взаимодействие протонированной формы фермента (pKа = 9.3) с протонированной формой лиганда (HCN) (кривая 1), либо реакция протонированной формы фермента с pK 8.75 как с HCN, так и с CN- (кривая 2).

Как можно видеть из рис. 9Б, чтобы достоверно различить эти два варианта, необходимы эксперименты в сильно щелочной области при pH ~10 и выше.

Глава 4. Свойства мутантной формы оксидазы ba3 с заменой A120T в кислородном канале Вопрос о том, как лиганды попадают в активный центр оксидаз, практически не исследован. Затруднения в связывании лигандов с окисленной формой оксидазы ba3, описанные в Главе 2, могли бы объясняться проникновением лигандов в кислород-редуктазный центр фермента через кислородный канал, который открывается только при восстановлении биядерного центра. В связи с этим представлялось интересным исследовать влияние аминокислотных замен в кислородном канале на свойства фермента, включая взаимодействие оксидазы ba3 с лигандами. Подобные работы в литературе отсутствуют. В качестве первого этапа исследований нами в совместной работе с лабораторией Б.Людвига в Биоцентре Университета им.

Гете (Франкфурт) был получен и исследован мутант A120T с заменой одной из гидрофобных аминокислот в кислородном канале на более гидрофильный аналог с близкими размерами бокового заместителя.

Между свойствами мутантой формы и ферментом дикого типа были найдены некоторые различия. Активность солюбилизированной мутантной ЦО ba3 составляет 50-60 % от активности фермента из штамма дикого типа. Кроме того, имеются различия в спектрах поглощения: в окисленной оксидазе A120T наблюдается небольшой максимум при 582 нм, который растет при восстановлении. При этом поглощение свободного восстановленного гема а уменьшается как в области Соре (443 нм), так и в видимой области (613 нм) на 30-50 %, что коррелирует со сниженной активностью мутанта.

Было исследовано взаимодействие мутантной ЦО ba3 A120T с цианидом и СО, но больших различий обнаружено не было. В частности, мутация не влияет на степень фотодиссоциации CO после вспышки лазера и кинетику последующей темновой рекомбинации СО. Для формы A120T не удалось получить анаэробный цианидный комплекс с низким сродством, однако сколь существенно это обстоятельство пока сказать трудно.

ОБСУЖДЕНИЕ Результаты работы свидетельствуют, что между свойствами центра восстановления кислорода в оксидазе ba3 (оксидаза класса B) и в митохондриальной оксидазе аа3 (оксидаза класса А) имеются существенные различия. Эти различия ярко проявляются в реакционной способности кислород-редуктазного центра по отношению к лигандам гема а3. Оксидазы класса А в окисленном состоянии легко взаимодействуют с низкомолекулярными лигандами гема а3 – цианидом, перекисью водорода, азидом, сульфидом, тогда как окисленная оксидаза ba3 либо вообще не реагирует с этими лигандами, либо взаимодействует необычно.

Восстановление оксидазы ba3 сопровождается появлением способности связывать лиганды гема а32+ так же легко, как и в оксидазах класса А.

Возникает предположение, что окисление оксидазы ba3 сопровождается изменениями в активном центре, закрывающими доступ лигандов к гему а3.

В одном из препаратов оксидазы ba3 нам удалось наблюдать способность к связыванию цианида с окисленной формой фермента с образованием а33+–CN.

обычного комплекса Но тот же препарат по-прежнему не взаимодействовал с H2O2, сульфидом и не давал низкоспинового комплекса с азидом. Интересно отметить, что из перечисленных соединений HCN имеет минимальный размер. Представляется вероятным, что проникновение низкомолекулярных лигандов в активный центр, как и проникновение естественного субстрата – кислорода, осуществляется через «кислородный канал», хорошо различимый в трехмерной структуре оксидазы ba3. Можно предположить, что этот канал при окислении ЦО закрывается или сужается, так что лишь имеющий минимальные размеры цианид в некоторых препаратах способен проникать через возникающий барьер. При восстановлении фермента канал открывается, и биядерный центр становится доступен для O2, CO и других лигандов.

Редокс-зависимое стерическое перекрывание кислородного канала могло бы оптимизировать работу фермента в условиях низких концентраций кислорода, например, предотвращая заполнение канала в бездействующем окисленном ферменте кластерами молекул воды, которые будут препятствовать быстрой диффузии кислорода к восстановленному гему а3 после прихода в биядерный центр электронов.

С целью проверки такой возможности была начата работа по мутагенезу остатков в кислородном канале цитохромоксидазы ba3. На сегодня нами получен только один мутант такого рода с заменой А120Т во входе в кислородный канал, и эта замена не повлияла существенно на скорость связывания лигандов с биядерным центром. Следует отметить, что кислородный канал в оксидазе ba3 имеет Y-образную разветвленную форму с двумя выходами вглубь мембраны. Возможно, для выявления заметных эффектов необходимо произвести замены в обоих выходах канала.

Взаимодействие с лигандами восстановленного гема а 3.

Восстановленная оксидаза ba3 легко взаимодействует с лигандами гема а32+:

СО, NO, цианидом. Однако и тут наблюдаются существенные отличия от оксидаз класса A. В частности, гем а32+ оксидазы ba3 образует два типа комплексов с KCN и CO. Сопоставление с литературными данными позволяет предложить следующую интерпретацию наших результатов.

В присутствии сильного восстановителя (дитионита) в анаэробных условиях образуется цианидный комплекс фермента, в котором все 4 редокс центра восстановлены: CuA1+, b2+, a32+, CuB1+. Этот комплекс с максимумом поглощения при 589 нм и с низким сродством к цианиду (КД=0.7 мМ) похож на цианидный аддукт восстановленной митохондриальной оксидазы. Важно отметить, что при близкой форме спектра его молярная интенсивность в оксидазе ba3 всегда на 30-40% ниже, чем в случае митохондриального фермента. По-видимому, в оксидазе типа ba3 связанный в кислород редуктазном центре цианид способен присоединяться как к гему a32+, так и к CuB, подобно тому, как это было ранее показано в отношении CO методом ИК [a32+–CN CuB+ a32+ NC–CuB+]. Между спектроскопии (Koutsoupakis, 2002):

этими двумя формами устанавливается равновесие ~2:1, что близко к константе равновесия, наблюдаемой для комплекса ba3 с CO. В восстановленной же митохондриальной оксидазе и других оксидазах класса A весь связанный в активном центре HCN находится на геме а32+, и, соответственно, молярная интенсивность полосы поглощения комплекса выше, чем у оксидазы ba3.

Цианидный комплекс, образующийся в аэробных условиях, характеризуется максимумом поглощения при 592 нм и почти в два раза более высоким коэффициентом молярной экстинкции, а также очень высоким сродством лиганда к гему a32+. Сопоставление с литературными данными позволяет заключить, что в этом комплексе CuB окислена, что и объясняет прочность связывания лиганда. Представляются вероятными две структуры цианидного комплекса частично восстановленной оксидазы типа ba3.

В работе (Surerus, 1992) предполагалось, на основании данных ENDOR спектроскопии, что в аэробном комплексе оксидазы ba3 c ферментом связываются 2 молекулы цианида, образуя продукт а32+-СN/CuB2+-CN. Прочное связывание лиганда с окисленной медью могло бы «запирать» в активном a32+.

центре лиганд, сидящий на геме Альтернативная возможность заключается в связывании одной молекулы лиганда, которая образует мостик между восстановленным гемом a3 и окисленной CuB: a32+–CN–CuB2+. Подобный тип связи аналогичен прочному связыванию цианида в активном центре оксидаз класса А: a33+–CN–CuB2+ (либо a33+–CN–CuB+).

В полностью восстановленном цианидном комплексе ba3 CuB по всей видимости сохраняет аутоксидабельность, поэтому даже кратковременный контакт комплекса со следами кислорода приводит к окислению CuB и образованию стабильного цианидного комплекса с участием CuB2+;

в таком комплексе даже столь сильный восстановитель как дитионит не всегда может обеспечить переход CuB в восстановленное состояние. Аналогичная ситуация наблюдается в отношении цианидного комплекса полностью восстановленной митохондриальной ЦО. Этот комплекс также неустойчив, но в этом случае ключевую роль играет аутоксидабельность не только CuB, но и гема a3, и при малейшем контакте с кислородом, даже в присутствии избытка дитионита, фермент практически необратимо переходит в прочный цианидный мостиковый комплекс а33+ –СN –CuB2+ (либо а33+ –СN –CuB+) Возможно, что образование прочного аэробного комплекса оксидазы ba с CO также обусловлено окислением CuB, которое «запирает» CO, связанный с a32+ гемом в активном центре. Такой эффект может объясняться необходимостью восстановленной формы CuB, как промежуточного центра посадки CO на пути его выхода из фермента в процессе фотодиссоциации, либо тем, что окисление CuB и является фактором, который индуцирует обсуждавшиеся выше конформационные изменения, ведущие к стерическому перекрыванию доступа лигандов в кислород-редуктазный центр окисленного фермента.

Гемосопряженные группы. Выявление гемосопряженных групп в дыхательных оксидазах важно, поскольку такие группы являются наиболее вероятными участниками редокс-зависимой транслокации протонов. Наши опыты показывают, что в окружении кислород-редуктазного центра цитохромоксидазы ba3 имеются гемосопряженные ионизируемые группы, влияющие на спектральные свойства фермента и на его реакционную способность по отношению к лигандам. Эти группы проявляют себя существенно иным образом, чем в оксидазах класса А, что является еще одним аргументом в пользу возможности разных протондвижущих механизмов в оксидазах разных классов.

В частности обнаружен противоположный характер рН-зависимых изменений в спектре поглощения окисленных ферментов из митохондрий и T.thermophilus. Возможной причиной может быть присутствие различных лигандов в биядерных центрах окисленных ферментов разных классов. На рентгеновских структурах видно, что в каталитическом центре окисленной оксидазы аа3 присутствуют два атома кислорода, тогда как у оксидазы ba3 – один.

К сожалению, в этой работе мы не успели снять подробную pH зависимость и определить pK группы, ответственной за спектральный сдвиг окисленного фермента. В случае восстановленного фермента был определен pK~9.0 группы, контролирующей скорость присоединения цианида к гему a3.

ВЫВОДЫ 1. Охарактеризованы свойства нативной и рекомбинантной форм цитохромоксидазы ba3 из бактерии Thermus thermophilus с помощью спектроскопии поглощения, кругового дихроизма и магнитного кругового дихроизма.

2. Связывание лигандов с кислород-редуктазным центром цитохромоксидазы ba3 из T. thermophilus (ЦО класса B) существенно отличается от реакции с цитохромоксидазой аа3 митохондрий (ЦО класса А).

3. Восстановленная форма цитохромокcидазы ba3 легко связывает типичные лиганды гемового железа, но в окисленной форме взаимодействие фермента с лигандами затруднено, тогда как оксидазы класса А взаимодействуют с лигандами как в восстановленной, так и окисленной формах.

4. В отличие от митохондриальной оксидазы, оксидаза ba3 образует два цианидных комплекса гема а32+, различающиеся сродством к лиганду и спектральными свойствами:

в присутствии дитионита в строго анаэробных условиях формируется комплекс гема a32+ c низким сродством к цианиду (КД ~ 0,7 мМ), похожий на a цианидный комплекс восстановленного гема цитохромоксидазы митохондрий (KД ~ 0,4 мМ);

в присутствии слабых восстановителей образуется цианидный комплекс гема а32+ с необычайно высоким сродством (КД 5•10-8 М), не имеющий аналогов среди известных оксидаз.

5. Сопоставление результатов с литературными данными показывает, что в строго анаэробных условиях образуется непрочный комплекс полностью восстановленного фермента: [a32+–CN CuB+ a32+ CN–CuB+], тогда как при неполном восстановлении возникает прочный аддукт, имеющий структуру [a32+–CN–CuB2+] либо [a32+–CN/ CuB2+–СN].

6. Кинетика связывания цианида с восстановленным гемом a3 в оксидазе ba3 характеризуется константой скорости второго порядка ~102 M-1c-1, независимо от типа комплекса.

a 7. Скорость связывания цианида с восстановленным гемом контролируется ионизируемой группой фермента с pK ~ 9.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А. Калинович, Н. Ацаркина, Т.В. Выгодина, Т. Сулиман, А.А.

Константинов. Особенности связывания цианида с цитохромоксидазой типа ba из термофильной бактерии Thermus thermophilus. Биохимия, 2010. 75(3): С. 419 430.

2. A. Dyuba, A.Arutyunyan, T. Vygodina, N. Azarkina, A. Kalinovich, Y.

Sharonov, A. Konstantinov. Circular dichroism spectra of cytochrome с oxidase.

Metallomics, 2011. 2(1): C. 1- 3. A. Kalinovich, N. Azarkina, A.A. Konstantinov. Cyanide binding to cytochrome ba3 is controlled by intraprotein protonation. Abstr. 14-th European bioenergetics conference (Moscow), Biochim. et Biophys. Acta, 2006, V. 14, P. 183-4.

4. А.В. Калинович. Взаимодействие гем-медных терминальных оксидаз группы В с цианидом. XIV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». Москва, 2007, с. 10.

5. А.В. Калинович, Н.В. Ацаркина, А.А. Константинов. Особенности взаимодействия с цианидом терминальных оксидаз типа В. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, с. 320.

6. A.V. Kalinovich, N.V. Azarkina, T.V. Vygodina, T. Soulimane and A.A.

Konstantinov. Pecularities of cyanide binding to ba3-type cytochrome oxidase from a thermophilic bacterium Thermus thermophilus. Abstr. 16-th European bioenergetics conference (Warsaw, Poland), 2010, Biochim. Biophys. Acta, V.1797, S.1, P.96.