Дмитрий николаевич аналоги азотистых оснований как зонды необычных структур днк – рекомбинантного триплекса и параллельного дуплекса
на правах рукописи
УДК 533.9 КАЛЮЖНЫЙ ДМИТРИЙ НИКОЛАЕВИЧ Аналоги азотистых оснований как зонды необычных структур ДНК – рекомбинантного триплекса и параллельного дуплекса 03.00.02. – биофизика автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Москва 2005
Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Научные руководители:
доктор физико-математических наук Анна Кирилловна Щелкина
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук Юрий Петрович Лысов, доктор химических наук, профессор Елизавета Сергеевна Громова.
Ведущая организация:
Институт молекулярной генетики РАН.
Защита состоится 15 декабря 2005 г. в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.
Автореферат разослан «» _ 2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук В.Е. Брагин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Структура ДНК в высокой степени полиморфна. Хорошо изучены двойные спирали A, B, и Z семейства конформаций. Наряду с этими антипараллельными двойными спиралями и классическими тройными спиралями, компьютерным моделированием было предсказано, что ДНК может образовывать двойную спираль с параллельной ориентацией нитей («параллельную» ДНК или пар-ДНК) [Pattabiraman, 1986], а также тройную спираль, в которой параллельно ориентированные нити идентичны[Zhurkin, 1994], [Shchyolkina, 1994]. Такая тройная спираль получила название R-триплекса.
Позднее необычные структуры такого типа были обнаружены с помощью модельных олигонуклеотидов, а также в различных биологических системах. Например, для тринуклеотидных повторов (GAA)(TTC), связанных с нейродегенеративными болезнями человека, методом ЯМР было показано существование параллельного дуплекса в равновесии с каноническим антипараллельным дуплексом [LeProust, 2000]. Возможность образования пар-ДНК в мисматчевых структурах, стабилизированной бороздочными лигандами, была продемонстрирована на модельных олигонуклеотидах [Shchyolkina, 1998]. Структурообразующая роль R триплексов показана в рибосоме [Wimberly, 1999]. Предположена их регуляторная роль в матричных процессах, таких как транскрипция и репликация [Karamychev, 2003]. Показано включение однотяжевого overhang’а в двойную спираль теломерной ДНК на концах хромосом, предполагающее образование R-триплекса (R-формы ДНК) как промежуточной или как равновесной структуры в таком НК-белковом комплексе [Stansel, 2001].
Оптические методы исследования нуклеиновых кислот является косвенными, в отличии от прямых методов, таких как ЯМР и рентгено-структурный анализ (РСА), с помощью которых можно получить полную структуру образца. Однако, даже прямые методы не лишены своих недостатков. Например, с помощью РСА можно получить только статическую картину довольно устойчивых образований в кристаллической упаковке, в условиях, отличных от физиологических. Метод ЯМР применим только для сравнительно больших концентраций исследуемых образцов.
Использование флуоресцирующих аналогов оснований является одним из способов наблюдения за локальной структурой нуклеиновой кислоты. Используя небольшие концентрации образца в физиологических условиях, можно получить сведения о подвижности и локальном окружении отдельного основания в сложных структурах нуклеиновых кислот. Другим положительным фактором такого метода является то, что он применим как для статических структур, так и для переходных образований, возникающих в различных биологических процессах с участием белков. Ранее, флуоресцентные свойства некоторых аналогов оснований в составе В-формы ДНК были хорошо изучены как экспериментально [Rachofsky, 2001], так и теоретически [Jean, 2001].
Исследование свойств необычных конформаций нуклеиновых кислот и их комплексов с белками важно для понимания связи структуры и функции нуклеиновых кислот в клетке. Данная работа направлена на создание метода для применения флуоресцентных аналогов оснований в качестве флуоресцирующего зонда параллельной ДНК и рекомбинантного (R-) триплекса.
Цель работы.
Основной целью настоящей работы была разработка высоко чувствительного флуоресцентного метода наблюдения за образованием и стабильностью необычных структур ДНК, и получение с помощью этого метода новых характеристик этих структур.
Основные задачи исследования.
1. Подобрать флуоресцирующий аналог основания, минимально нарушающий изучаемую структуру ДНК и не уменьшающий ее стабильности.
2. Детально изучить термодинамические свойства и особенности конформаций рекомбинантного триплекса и параллельного дуплекса с нуклеотидными последовательностями, включающими все природные основания.
3. Показать возможность применения данного метода для изучения структурных переходов в ДНК при образовании комплексов с белками.
Научная новизна.
В данной работе впервые было проведено исследование необычных структур ДНК по флуоресценции аналогов оснований. Был проведен поиск таких оснований, которые минимально нарушали структуру ДНК и имели характерные флуоресцентные свойства. Показано, что аналог цитозина – 2-пиримидинон, не нарушая структуры ДНК, значительно уменьшает стабильность как канонического антипараллельного, так и параллельного дуплекса, и дано объяснение этому эффекту.
Впервые 2-аминопурин (2-АР) применен для изучения параллельной ДНК и рекомбинантного триплекса. Установлено, что 2-АР практически не нарушает структуры и не влияет на стабильность изучаемых необычных структур ДНК.
Описаны флуоресцентные свойства 2-аминопурина, включенного в структуру параллельного дуплекса и рекомбинантного триплекса. С высокой точностью рассчитаны термодинамические параметры образования межмолекулярного параллельного дуплекса и внутримолекулярного R-триплекса. Впервые показано, что образование этих структур можно наблюдать не только по ультрафиолетовому поглощению природных оснований, в которое вносят вклад все природные основания, но и по изменению интенсивности флуоресценции аналога основания при плавлении индивидуального триплета в триплексе или пары оснований в параллельном дуплексе.
Разработанный метод позволил подтвердить структуру водородных связей в АТА триплете, предложенную компьютерным моделированием. Рассчитана термодинамика вклада одной водородной связи в энергетику R-триплекса.
Обнаружена необычно высокая относительная чувствительность стабильности R триплекса к наличию мисматчевых оснований в узнающей третьей цепи. Впервые подтверждено образование неканонической водородной связи между С2H2 аденина в R нити и N7 аденина в дуплексной части и оценена ее энергия. С учетом доказанной структуры АТА триплета был получен необычно стабильный параллельный триплекс, в котором все аденины были заменены на 2,6-диаминопурин.
Впервые наблюдали вытеснение нитей в рекомбинантном триплексе.
Продемонстрирована возможность образования R-триплекса теломерной последовательностью млекопитающих.
Флуоресцентным методом обнаружена точка особой конформации НК на расстоянии примерно 13 нуклеотидов от начала транскрипции в элонгационном комплексе транскрипции Т7РНК-полимеразы, в которой возможно образование нескольких R триплетов оснований.
Научно практическая ценность работы.
Работа имеет выраженную фундаментальную направленность. Практическая ценность работы состоит в разработке нового высокочувствительного флуоресцентного метода детектирования необычных структур ДНК. Показана возможность применения этого метода как к свободной ДНК, так и к ДНК в комплексе с белками. Установлена значимость водородных связей в АТА триплете на стабильность рекомбинантного триплекса.
Апробация работы.
Материалы диссертации изложены на 8и студенческих конференциях и на 3х международных конференциях.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 5 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа состоит из Введения, обзора литературных данных, методического раздела, трех глав содержащих изложение и обсуждение результатов.
Работа изложена на 83 страницах, включает 8 таблиц и 35 иллюстрации.
Библиография включает 90 наименований.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Введение.
Изложена история проблемы, рассмотрена актуальность выбранной темы, сформулирована цель работы и определенны задачи исследования.
Обзор литературных данных.
В данном разделе описаны структурные особенности параллельной ДНК и рекомбинантного триплекса, а так же их биологическая значимость. Описаны методы, применяемые для наблюдения необычных структур.
Также, в разделе обсуждены изученные ранее аналоги природных оснований и их флуоресцентные свойства в канонической структуре ДНК.
В конце раздела определена актуальность и значение настоящей работы в свете изложенных литературных данных.
Материалы и методы.
В разделе описан дизайн олигонуклеотидов, потенциально способных образовывать необычные структуры. Описана процедура получения межмолекулярных дуплексов и внутримолекулярных триплексов. Рассказано о методиках проведения эксперимента.
Приведены теоретические модели изучения плавления межмолекулярных и внутримолекулярных структур. Описана методика проведения квантово механических расчетов.
Глава Детекция образования внутримолекулярного триплекса ДНК по флуоресценции 2-аминопурина, включенного в третью нить.
Для решения поставленной задачи необходимо было подобрать такие аналоги оснований, которые минимально бы искажали структуру ДНК. Для этого проведено компьютерное моделирование возможности образования триплетов оснований, в которых основание в третьей нити было заменено на его флуоресцирующий аналог. В качестве флуоресцирующего аналога аденина использовался 2-АР. На рисунке 1. изображены схемы образования триплетов оснований, полученных с помощью квантово-механических расчетов. При замене аденина на 2-аминопурин происходит не значительное смещение 2-АР относительно природного аденина. При этом так же образуются две водородных связи третьей нити с Уотсон-Криковским дуплексом.
Дальнейшие исследования проводились на модельном олигонуклеотиде (RCW), R потенциально способным образовывать структуру внутримолекулярного параллельного триплекса.
Последовательность олигонуклеотида была W C выбрана таким образом, чтобы трехнитевая структура состояла из 10 триплетов. Для предотвращения обмена нитей, дуплексная Рисунок 1.1 Схема образования часть была усилена двумя GC парами и жестким триплетов оснований при замене природного аденина в третьей GAA линкером, а третья нить присоединена к нити на его флуоресцирующий аналог 2-аминопурин.
Триплет, имеющий все природные 9 основания изображен полупрозрачным.
дуплексной части более гибким TTTT линкером. В качестве контроля был взят олигонуклеотид (KCW) с негомологичной третьей нитью, не образующий структуры параллельного триплекса. Для изучения свойств аналогов оснований в структуре одно из природных оснований было заменено на его аналог. Схемы этих олигонуклеотидов изображены на рисунке 1.2. В качестве контролей использовали шпилечные 5’-GTAGACTGAG T T R2APCW 5-GTaGACTGAG T T RCW G CGCATCTGACTC T G CGCATCTGACTC T T T A A A GCGTAGACTGAG-3’ A GCGTAGACTGAG-3’ K CW 5-GTTaGACTGC T T 2AP G CGCATCTGACTC-5’ CW A G CGCATCTGACTC T A GCGTAGACTGAG-3’ T A A GCGTAGACTGAG-3’ T R2APC 5’-GTaGACTGAG T T 3’-CATCTGACTC T 2AP R 5’-GTaGACTGAG Рисунок 1.2 Модельные олигонуклеотиды.
структуры CW и RC, образующие внутримолекулярный дуплекс, и одну нить R. В контрольных олигонуклиатидах одно природное основание также было заменено на его аналог.
В качестве аналога аденина в структуре параллельного триплекса был изучен 2-АР.
На рисунке 1.3 приведены кривые плавления, полученные по изменению поглощения 2AP в длине волны 260нм. Для триплексной структуры R CW плавление имеет двухступенчатый характер, что свидетельствует о том, что третья нить плавится при более низких температурах, чем дуплексная часть триплекса.
Методом УФ плавления было показано, что модифицированный триплекс с 2-АР по стабильности не уступает триплексу с природными основаниями. При плавлении олигонуклеотида KCW, который не образует триплексной структуры, плавление третьей нити не наблюдалось. С помощью кривых УФ плавления были определены термодинамические параметры выплавления третьей нити из триплексной структуры (таблица 1.1). Следует отметить, что при плавлении третьей нити величина гиперхромизма невелика, поэтому ошибка определения термодинамических параметров оказалась довольно большой.
Флуоресценция 2-АР чувствительна к его локальному окружению. При возбуждении в длине волны =310 нм наблюдалась флуоресценция с максимумом около 370 нм.
При низкой температуре, когда предположительно все олигонуклеотиды образуют совершенные структуры, интенсивность (и квантовый выход) флуоресценции 2-АР в 0. 0. 0. Рисунок 1.3 кривые плавления 0. 0. по поглощению в УФ.
2AP-CW триплекс 0. СW дуплекс 0. 0. 0. 0. 0.205 0. 0 20 40 60 Температура а б Рисунок 1.4 Температурная зависимость интенсивности флуоресценции 2-АР в разных структурах ДНК.
Х 2-АР в отдельной нити 2-АР в дуплексе а) 2-АР в третьей нити триплекса R2АРCW, б) 2-АР в контрольном K2АРCW отдельной R нити оказалась наибольшей, в дуплексной части в три раза меньше, чем в отдельной нити, а в третьей нити триплекса в 1.5 раза меньше. Такую величину интенсивности флуоресценции можно объяснить разным стекингом аналога основания в различных структурах и, как следствие, различной доступностью растворителю.
Была изучена температурная зависимость интенсивности флуоресценции 2-АР в этих трех структурах. Эта зависимость представлена на рисунке 1.4. При увеличении температуры флуоресценция 2-АР в отдельной нити экспоненциально падала. Это говорит о том, что квантовый выход флуоресценции 2-АР сильно зависит от температуры на данном интервале температур, и при увеличении столкновений с молекулами растворителя флуоресценция тушится. Флуоресценция 2-АР в третьей Таблица 1.1 Термодинамические параметры образования триплексной структуры.
Интенсивность УФ поглощение флуоресценции H, кДж·моль-1 -99±3 -102± Тпл, °С 21±1 23± нити триплекса при повышении температуры до 30°С увеличивается, затем уменьшается также, как в отдельной нити. Флуоресценция 2-АР в дуплексе практически не меняется в этом диапазоне температур.
Такой характер температурной зависимости флуоресценции можно объяснить тем, что стекинг взаимодействия 2-АР, включенного в третью нить триплекса, при повышении температуры ослабляются, и при 30°С его окружение становится практически таким же, как и в отдельной нити. Таким образом, мы наблюдаем плавление единичного триплета оснований по изменению флуоресценции. Применив модель плавления внутримолекулярной структуры для описания плавления этого единичного триплета в структуре триплекса, мы определили термодинамические параметры этого перехода, которые представленны в таблице 1.1. Оказалось, что термодинамические характеристики плавления единичного триплета совпадают с характеристикми плавления триплекса, определенными по УФ поглощению в 260 нм.
Таким образом, триплет с 2-АР плавится одновременно с остальными триплетами из природных оснований, то есть механизм плавления третьей нити в триплексной структуре является квазикооперативным.
Для определения доступности растворителю основания в разных структурах был проведен эксперимент по тушению флуоресценции 2-АР йодистым калием (KI).
Квантовый выход флуоресценции 2-АР в триплексной структуре оказался ниже, чем в отдельной нити, что свидетельствует о том, что в этой структуре 2-АР частично защищен от растворителя. С другой стороны, как и ожидалось, 2-АР в триплексной структуре более доступен растворителю, чем в структуре дуплекса. Большая доступность оснований третьей нити растворителю является характерной чертой структуры рекомбинантного триплекса.
На основании проведенного комплекса экспериментов следует вывод, аналог аденина 2-АР является структурным зондом образования параллельного триплекса.
Глава Изучение особенностей структуры рекомбинатного триплекса с помощью нового флуоресцентного метода.
Влияние количества водородных связей в триплетах на общую стабильность триплексной структуры.
Для изменения количества водородных связей между третьей нитью триплекса и дуплексной частью было проведено замещение природных оснований на их аналоги.
При этом аналоги подбирали таким образом, чтобы количество возможных водородных связей менялось, не нарушая общую структуру триплекса.
На рисунке 2.1 изображены схемы образования триплетов оснований с заменой природных оснований на их аналоги. В качестве аналогов оснований выбраны 7 деазааденин и 2,6-диаминопурин. Видно, что замена аденина в дуплексной части триплекса на 7-деазааденин в случае 2-АР в третьей нити ведет к потере одной водородной связи между третьей нитью и дуплексной частью. В случае аденина в третьей нити, происходит потеря неканонической водородной связи между N аденина W нити и С2Н2 группой аденина R нити. Замена всех аденинов на 2,6 диаминопурин ведет к образованию дополнительной водородной связи. В случае 2-АР в третьей нити сохраняет количество водородных связей между R нитью и дуплексом.
Для изучения стабильности триплексов с модифицированными триплетами синтезировали олигонуклеотиды, имеющие один, два или три модифицированных триплета оснований. Синтезированные олигонуклеотиды представлены на рис 2.2.
Относительно ранее изученного R2-APCW, олигонуклеотид T-266 имеет две дополнительные связи, а в олигонуклеотидах T-1-7 и T-123-7 на одну и три A 2-AP T T 7-dA 7-dA 2-AP A T A T A 2-AP DAP T DAP DAP T Рисунок 2.1 Схемы образования триплетов оснований с модифицированными основаниями водородных связей меньше, соответственно. У олигонуклеотида T-23-7 отсутствуют две неканонических водородные связи между третьей нитью триплекса и дуплексной частью.
T-1-7 5-GTaGACTGAG T T T-23-7 5’-GTaGACTGAG T T G CGCATCTGACTC T G CGCATCTGACTC T T T A A A GCGT7GACTGAG-3’ A GCGTAG7CTG7G-3’ T-266 5-GTaGDCTGDG T T T-123-7 5-GTaGaCTGaG T T G CGCATCTGACTC T G CGCATCTGACTC T T T A A A GCGTDGDCTGDG-3’ A GCGT7G7CTG7G-3’ Рисунок 2.2. Схемы олигонуклеотидов образующие рекомбинантный триплекс с модифицированными триплетами оснований.
а – 2-аминопурин 7 – 7-деазааденин D – 2,6-диаминопурин По температурной зависимости интенсивности репортерного основания 2-АР в структуре каждого триплекса были определены термодинамические параметры их образования. Оказалось, что энергетические параметры сильно зависят от количества водородных связей. На рисунке 2.3 представлена зависимость энтальпии (а) и свободной энергии (б) образования триплексов от количества водородных связей. Из этой зависимости был определен средний вклад одной водородной связи между третьей нитью и дуплексной частью в общую стабильность триплекса.
Установлено, что потеря одной канонической водородной связи ведет к уменьшению энтальпии образования триплексной структуры в среднем на 18 кДж/моль. Удаление неканонической водородной связи вызывает меньшее падение энтальпии образования триплекса на 12.5 кДж/моль. Несомненно, что в эту величину вносит вклад и изменение энергии стекинг взаимодействия оснований вследствие локальных конформационных изменений структуры триплекса под действием потери водородной связи между основанием третьей нити и дуплексом. Важно, что потеря 4 5 водородных связей при всего только двух мисметчевых основаниях в третьей нити ведет к полной потере узнавания этой нитью 10-п.о. дуплекса. Такая сильная зависимость общей стабильности триплексной структуры от количества водородных связей является характерным свойством рекомбинантных триплексов. Это свойство H, кДж/моль o G(0 C), кДж/моль 140 T-266 T- 2AP R CW 100 2AP R CW T-23-7 T-23- T-1- T-1- 40 T-123-7 T-123- 20 -3 -2 -1 0 1 2 -3 -2 -1 0 1 (числа водородных связей (числа водородных связей 2AP 2AP относительно R CW) относительно R CW) Рисунок 2.3. Зависимость энергетических параметров образования триплекса от количества водородных связей.
может играть важную роль в биологических процессах, в которых дуплекс ДНК узнается гомологичной нитью с последующим обменом нитями.
Было продемонстрировано образование R-триплекса различными последовательностями оснований. Исследована термодинамика образования R триплекса с теломерной последовательностью млекопитающих. Для изучения термодинамики использовали олигонуклеотиды, способные сворачиваться в триплексы R-типа, моделирующие участок D-петли внутри предполагаемой t-петли, образуемой концами теломер млекопитающих. На рисунке 2.4 схематично представлены изучаемые триплексы Tel-G и Tel-G-12.
T T Tel-G Tel-G12 5-GGTTaGGGTTAG 5- GGTTaGGG T T T T G G CCAATCCC CCAATCCCAATC T T A A A GGTTAGGG-3’ GGTTAGGGTTAG-3’ A Рисунок 2.4 Схемы олигонуклеотидов образующие триплексы с теломерной последовательностью млекопитающих В таблице 2.1 представлены термодинамические параметры образования триплексов с теломерной последовательностью. Энергия образования Tel-G-12 меньше, чем R2APCW. Это можно интерпретировать или как особую невыгодность некоторых стэкинг контактов в триплексе, или как следствие возможного изменения конформации триплекса или его дуплексной части в случае наличия G –кластеров.
Таблица 2.1. Термодинамические параметры образования 2AP*T:A триплета в триплексах с теломерной последовательностью млекопитающих.
H, олигонуклеотид Tпл, °C КДж·моль- Tel-G 8±2 -84± Tel-G-12 9±1 -71± R2apCW 21±1 -99± Глава 2-аминопурин как зонд конформаций трехтяжевого комплекса ДНК·ДНК·РНК при элонгации Т7 РНК полимеразы in vitro.
В данной части работы был исследован остановленный элонгационный комплекс Т РНКП на матрице длиной 61 п.о. и РНК-продуктом длиной 21 п.о., причем в одно из различных положений нетранскрибируемой ДНК (нтДНК) был включен флуоресцирующий аналог аденина 2-аминопурин (2-АР). Описанный ранее метод детекции конформации ДНК (ss, ds или триплекс), основанный на чувствительности флуоресценции 2-АР к окружению, позволил установить участие нтДНК в той или иной структуре.
В качестве матрицы для работы полимеразы использовались дуплексы длиной 61 пар оснований, схематично изображенные на рисунке 3.1. Дуплексы имели участок посадки полимеразы с характерной последовательностью. Далее следовала последовательность элонгации, состоящая только из пуриновых оснований. В каждой нт нити только один аденин заменен на 2-АР. Затем следовал участок остановки транскрипции. Таким образом, промотор для работы полимеразы имел только один флуоресцирующий аналог основания. Полимераза садилась на матрицу, и при добавлении пуриновых трифосфатов начинался синтез РНК. Полимераза останавливалась, как только доходила до участка остановки, так как в раствор не добавляли пиримидиновые трифосфаты. В экспериментах run-off при добавлении пиримидиновых трифосфатов продолжалось движение полимеразы по матрице, и, дойдя до конца, она сползала с дуплекса и садилась на него снова, повторяя заново цикл синтеза РНК. Таким образом, в растворе получалось большое количество ds ds ds ds ds + ds+ Рисунок 3.1 Матрица элонгации транскрипции Т7РНК полимеразы.
Участок посадки Т7РНКп и инициации транскрипции Участок остановки элонгации Участок элонгации транскрипции положение 2-АР в нтДНК Синтезированная РНК однонитевой РНК. На рисунке 3.2 показано, что полимераза действительно работала вышеописанным образом. На рисунке представлен 16% ПААГ, прокрашенный SybrGold, остановленного элонгационного комплекса в растворе без пиримидиновых трифосфатов (стоп) и не остановленного (run off) в растворе содержащем все трифосфаты. Видно, что при неостановленной транскрипции нарабатывается большое количество РНК длиной около оснований. При остановленной ds8 ds8 ds13 ds ds стоп runoff стоп runoff транскрипции количество свободной РНК меньше, и большая часть РНК участвует в 61по нк-белковом комплексе.
Было проведено исследование интенсивности флуоресценции 2-АР на 21нт различных расстояниях от места остановки РНК Т7РНКП, с целью определить, в каком состоянии находится нетранскрибируемая Рисунок 3.2. Проверка работы остановленного комплекса нить ДНК матрицы. Так как некоторые.элонгации Т7РНКП Интенсивность флуоресценции Положение 2-АР относительно места остановки транскрипции Рисунок 3.3. Зависимость интенсивности флуоресценции 2-АР от положения флуоресцирующего основания относительно места остановки элонгации транскрипции аминокислоты в составе фермента имеют собственную флуоресценцию в области флуоресценции 2-АР, для определения интенсивности флуоресценции аналога основания из общей флуоресценции вычиталась собственная флуоресценции фермента. Таким образом были получены результаты, представленные на рисунке 3.3.
Увеличенная интенсивность флуоресценции свидетельствует о нарушении стекинга 2 АР.
Получены следующие результаты и сделаны основные выводы о трехтяжевом комплексе НК. Положение (+5) является контролем дуплексной структуры. Фермент не доходит до этого положения и никак не влияет на структуру ДНК в этой области.
Далее положение (-4) - нетранскрибируемая нить находится все еще под ферментом, по всей видимости, он вызывает тушение 2-АР. В положении (-8) флуоресценция 2 АР возрастает до уровня флуоресценции в однонитевой ДНК. В этом положении нетранскрибируемая нить находится далеко от фермента и транскрибируемой нити, следовательно, транскрибируемая нить образует гетеродуплекс с синтезированной нитью РНК. Следующее положение (-13) является особой точкой, где синтезированная нить РНК находится достаточно близко к двум нитям ДНК, и, возможно, образуется триплексная структура, в которой нетранскрибируемая нить ДНК является третьей нитью триплекса. Полученые результаты этому не противоречат. Далее происходит обмен нитями. Не транскрибируемая нить ДНК обменивается с нитью РНК и образуется ДНК*ДНК дуплекс. В положениях (-18) и ( 22) интенсивность флуоресценции 2-АР находится на уровне дуплексной структуры, что говорит о том, что на таком расстоянии от места остановки транскрипции нить РНК Транскрибируемая нить 18 + 22 Нетранскрибируемая нить Рисунок 3.4. Схема остановленного комплекса элонгации Т7РНКп.
РНК находится достаточно далеко, и не препятствует образованию дуплекса из двух нитей ДНК. Схема этого комплекса изображена на рисунке 3. Глава Исследование свойств флуоресцирующих оснований, включенных в параллельный дуплекс.
Для изучения свойств параллельных дуплексов при помощи флуоресцирующих аналогов оснований был проведен поиск таких оснований, которые бы минимально искажали изучаемую структуру. При помощи квантово-механических расчетов было показано, что стехиометрически наилучшими аналогами оснований являются аналог аденина 2-АР и аналог цитозина 2-пиримидинон (Р). На рисунке 4.1 изображены схемы образования нуклеотидных пар с аналогами оснований. При замене аденина на 2-АР предположительно не должна меняться структура образуемого дуплекса, и также образуются две водородные связи между основаниями. Замена цитозина на Р должна приводить к потере Н-связи и дестабилизации антипараллельного дуплекса, но не влиять на структуру параллельного. При образовании параллельной пары Р с гуанином, структура пары изоморфна паре с природными основаниями GC, и количество водородных связей не меняется.
Для изучения влияния замещения природных оснований на их флуоресцирующие аналоги синтезировали нуклеотидные последовательности, потенциально способные образовывать параллельный дуплекс. В качестве контроля синтезировались оли параллельный антипараллельный Т Т 2-АР 2-АР Т Т А А P P G G C C G G Рисунок 4.1 Схемы образования пар в параллельном и антипараллельном дуплексах с модифицированными основаниями ps-N1 5’-ATCCCTATAG-3’ aps-N1 5’-ATCCCTATAG-3’ 5’-TAGGGATATC-3’ 3’-TAGGGATATC-5’ ps-P1 5’-ATCPCTATAG-3 aps-P1 5’-ATCPCTATAG-3’ 5’-TAGGGATATC-3 3’-TAGGGATATC-5’ ps-2AP 5’-ATCCCTaTAG-3’ aps-2AP 5’-ATCCCTaTAG-3’ 5’-TAGGGATATC-3’ 3’-TAGGGATATC-5’ Рисунок 4.2 Олигонуклеотиды, образующие параллельные и антипараллельные дуплексы с модифицированными основаниями гонуклеотиды, образующие канонические дуплексы с антипараллельной направленностью нитей. В исследуемых дуплексных структурах только одно основание было заменено на его флуоресцирующий аналог. На рисунке 4. представлены исследованные нуклеотидные последовательности.
Было проведено исследование влияния на общую стабильность дуплекса замещения природного основания в нем на флуоресцирующий аналог. Методом УФ плавления показано, что стабильность как параллельного, так и антипараллельного дуплексов меняется незначительно при замещении одного аденина на 2-АР. По кривым УФ плавления были рассчитаны термодинамические параметры образования параллельных и антипараллельных дуплексов, которые представлены в таблице 4.1.
Таблица 4.1. Термодинамические параметры образования дуплексов с замещением аденина на 2-АР, концентрация нитей 4µМ в буфере 1М LiCL и 10мМ трис-HCl pH 7. H, Tпл, °C кДж·моль- aps-N1 44.0±0.1 -255± aps-2AP 41.1±0.1 -264± ps-N1 27.5±0.1 -161± ps-2AP 28.6±0.1 -165± Для дуплексов, в которых один цитозин был заменен на Р, также исследована стабильность методом УФ плавления. Оказалось, что замена природного цитозина на Р ведет к дестабилизации как антипараллельного, так и параллельного дуплекса.
Термодинамические параметры образования таких дуплексов представлены в таблице4.2. При такой сильной дестабилизации возникает вопрос о сохранении структуры параллельного дуплекса в присутствие Р.
Методом кругового дихроизма установлено, что при замещении цитозина на Р сохраняется структура параллельного дуплекса. Об этом свидетельствовало характерное плечо в 290нм, которое соответствует образованию параллельной GC пары.
По собственной флуоресценции Р показано, что этот аналог основания образует стекинг с соседними основаниями. Фланкирующие гуанины вызывают сильное тушение флуоресценции Р как в антипараллельном, так и в параллельном дуплексах.
Из расчетов методами молекулярной механики установлено, что наибольшую дестабилизацию в структуру дуплексов вносят невыгодные электростатические взаимодействия, вызванные измененным распределением заряда в Таблица 4.2. Термодинамические параметры образования дуплексов с замещением цитозна на 2-пиримидинон концентрация нитей 1µМ в буфере 0.5М LiCL и 10мМ трис HCl pH 7. H, Tпл, °C кДж·моль- aps-N1 39.7±0.1 -273± aps-P1 23,8±0.5 -187± ps-N1 24,5±0.6 -176± ps-P1 13,2±0.9 -127± модифицированном основании.
Для дуплексов с аденином, замещенным на 2-АР, проведено исследование флуоресцентных свойств аналога основания. При возбуждении в =310нм 2-АР имеет флуоресценцию в области 370нм. Была исследована температурная зависимость интенсивности флуоресценции 2-АР, включенного в разные структуры дуплексов (рисунок 4.3). При низкой температуре интенсивность флуоресценции 2-АР в параллельном дуплексе немного выше чем в антипараллельном, что свидетельствует об уменьшенном стэкинге 2-АР с соседними основаниями, и о большей доступности растворителю. При высокой температуре, когда структуры дуплексов уже расплавлены, интенсивность флуоресценции становится одинаковой в обоих типах дуплексов.
Интенсивность флуоресценции Интенсивность флуоресценции, ое 4 увеличивается при уменьшении стэкинга 2-АР с соседними основаниями. Таким 3 образом, можно наблюдать плавление 2 10 одной пары в структурах дуплекса. При помощи математической модели 1 плавления из кривых плавления по флуоресценции были определены 0 10 20 30 40 50 60 о Температура, С термодинамические параметры Рисунок 4.3 Температурная плавления одной пары оснований. зависимость интенсивности флуоресценции 2-АР в разных Полученные результаты представлены в структурах ДНК.
Х 2-АР в отдельной нити таблице 4.3.
2-АР в параллельном дуплексе Оказалось, что термодинамика образования одной пары, наблюдаемая по флуоресценции 2-АР, практически не отличается от термодинамики образования дуплекса, наблюдаемое по УФ плавлению.
Таким образом, показано, что как параллельный, так и антипараллельный дуплексы плавятся по механизму “все-или-ничего”.
Для сравнения доступности 2-АР растворителю в структурах разных дуплексов, был проведен эксперимент по тушению флуоресценции йодистым калием (KI). Было установлено, что 2-АР в структуре параллельного дуплекса более доступен растворителю, чем в структуре антипараллельного. Это согласуется с теоретической молекулярной моделью параллельного дуплекса.
Таблица 4.3. Термодинамические параметры образования дуплексов полученые по температурной зависимости интенсивности флуоресценции концентрация нитей 2µМ в буфере 0.5М LiCL и 10мМ трис-HCl pH 7. H, Tпл, °C кДж·моль- aps-2AP 38.6±0.2 -279± ps-2AP 27.3±0.4 -167± На основании полученных результатов, можно сказать, что флуоресцирующий аналог аденина 2-АР можно использовать в качестве структурного зонда для наблюдения образования параллельного дуплекса ДНК. С помощью этого зонда были выявлены характерные конформационные особенности параллельного дуплекса.
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Разработан новый флуоресцентный метод для наблюдения образования рекомбинантного триплекса и параллельного дуплекса.
2. С высокой точностью определены термодинамические параметры образования R триплекса случайной последовательностью оснований. С помощью введения флуоресцирующего зонда в одну из нитей трехтяжевого комплекса ДНК доказано образование равновесного R-триплекса без обмена гомологичных нитей, а также впервые детектирован обмен гомологичных нитей в R-триплексе.
3. Изучена зависимость стабильности рекомбинантного триплекса от количества водородных связей третьей нити с дуплексом и определен средний вклад водородной связи в энергию образования R-триплекса. Подтверждена схема водородных связей в триплете R-триплекса и экспериментально выявлена неканоническая водородная CH—N связь.
4. Продемонстрирована возможность образования R-триплекса теломерной последовательностью млекопитающих, и получены его термодинамические характеристики.
5. Показано, что флуоресценция 2-АР может применяться в остановленном комплексе элонгации Т7 РНКП для изучения конформаций трехтяжевого комплекса нуклеиновых кислот.
6. С помощью флуоресцентных характеристик аналога цитозина 2-пиримидинона и аналога аденина 2-АР, введенных в антипараллельный и параллельный дуплексы ДНК, исследованы конформационные различия этих структур. Показано, что основания в параллельной ДНК более доступны молекулам растворителя и лигандам.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Anna K. Shchyolkina, Dmitry N. Kaluzhny, Olga F. Borisova, Quentin Hanley, Andrew Clayton, Donna J. Jovin, Thomas M. Jovin. ”2-aminopurine as a Probe for Parallel or Anti parallel Orientation of Strands in DNA Duplex // Journal of Biomolecular Structure and Dynamics 2001,v.18, p.941-942.
2. Dmitry N. Kaluzhny, Olga F. Borisova, Robert L. Jernigan, Victor B. Zhurkin, Anna K.
Shchyolkina. Formation of Intramolecular DNA Triplex Monitored by Fluorescence of 2 aminopurine Incorporated in the Third Strand // Journal of Biomolecular Structure and Dy namics 2001, v.18, p.942-943.
3. D.N. Kaluzhny, S.N. Mikhailov, E.V. Efimtseva, O.F. Borisova, A.K. Shchy-olkina and T.M. Jovin. Fluorescent 2-pyrimidinone nucleoside in parallel-stranded DNA // Nucleo sides, Nucleotides and Nucleic Acids.,2003, May-Aug, 22(5-8):1499-503.
4. Shchyolkina AK, Kaluzhny DN, Borisova OF, Hawkins ME, Jernigan RL, Jovin TM, Arndt-Jovin DJ, Zhurkin VB. Formation of the parallel recombina-tion type triplex by hu man thelomeric sequences. // Journal of Biomolecular Structure and Dynamics 2003, v.20, p.868-869.
5. Shchyolkina AK, Kaluzhny DN, Borisova OF, Hawkins ME, Jernigan RL, Jovin TM, Arndt-Jovin DJ, Zhurkin VB. Formation of an intramolecular triple-stranded DNA structure monitored by fluorescence of 2-aminopurine or 6-methylisoxanthopterin // Nucleic Acids Research. 2004, Jan 22;
32(2), p.432-40.
6. Д.Н. Калюжный, О.Ф. Борисова, Р.Л. Джерниган, В.Б. Журкин, А.К. Щелкина.
Детекция образования внутримолекулярного триплекса ДНК по флуоресценции 2 аминопурина, включенного в третью нить // XIV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 11-15 февраля 2002, стр.49-50.
7. D.N. Kaluzhny, S.N. Mikhailov, O.F. Borisova, V.L. Florentiev, A.K. Shchyolkina, Jovin TM. Cytosine analogue 2-pyrimidinone in parallel-stranded DNA // XV International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. September 11-14, 2002, Leuven, Belgium, Program and Abstracts p. 296.
8. Shchyolkina A.K., Kaluzhny D.N., Borisova O.F., Arndt-Jovin D.J., Jovin T.M., Jernigan R.L., Zhurkin V.B. Direct detection of R-triplexes formation by human telomere sequences using 2-aminopurine fluorescence // XV International Round Table on Nucleo sides, Nucleotides and Nucleic Acids. September 11-14, 2002, Leuven, Belgium, Program and Abstracts p. 288.
9. Д.Н. Калюжный, О.Ф. Борисова, R. Jernigan, V.B.Zhurkin, А.К. Щелкина. 2 аминопурин как флуоресцентный детектор структуры рекомбинантного триплекса ДНК // Вторая ежегодная молодежная конференция ИБХФ-вузы ”БИОХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА”, Москва, 13-14 июня 2002г, c. 29-30.
10. Калюжный Д.Н., Борисова О.Ф., Хокинс М.Е., Джерниган Р.Л., Джновин Т.М., Арндт-Джовин Д.Дж., Журкин В.Б. Щелкина А.К. Образование внутримолекуляроного триплекса ДНК, наблюдаемое по флуоресценции 2 аминопурина и 6MI-птеридина включенных в третью нить. // 8-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых 17-21 мая 2004г. сборник тезисов с 13.