Значение морфофизиологических особенностей растений подорожника большого и подорожника приморского для поддержания водно-солевого баланса при засолении
На правах рукописи
Карташов Александр Валерьевич Значение морфофизиологических особенностей растений подорожника большого и подорожника приморского для поддержания водно-солевого баланса при засолении 03.01.05 – физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва.
Научный консультант:
Радюкина Наталия Львовна кандидат биологических наук
Официальные оппоненты:
Балнокин Юрий Владимирович, доктор биологических наук, профессор, Феде ральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии расте ний им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, лаборатория солевого обмена и солеустойчивости, заведующий лабораторией.
Пильщикова Наталия Владимировна, кандидат биологических наук, доцент, Рос сийский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева, кафедра физиологии растений, доцент.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Вологодский государственный педагогический университет, естественно-географический факультет.
Защита состоится «22» января 2013 г. в 11:00 ч. на заседании Совета по защите дис сертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 002.210.01 по специальности 03.01.05 – “Физиология и биохимия рас тений” (Биологические науки) при Федеральном государственном бюджетном учреж дении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской акаде мии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (499) 977-80-18, электронная почта: [email protected];
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук.
Автореферат разослан « 21 » декабря 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Азаркович Марина Ивановна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Глобальные климатические изменения и усиление антропогенной нагрузки делают засоление почв экономической и экологической про блемой многих стран. В условиях высокой потребности в сельскохозяйственной про дукции, снижения качества и доступности плодородных земель, изучение устойчиво сти растений к засолению становится особо важным направлением в современной фи зиологии растений.
Растения – галофиты не обладают значительной биохимической устойчивостью к высоким концентрациям солей, то есть их белки также легко теряют свои свойства при увеличении концентрации NaCl, как и у гликофитов (Osmond, Greenway, 1972;
Greenway, Osmond, 1972;
Richharia et al., 1997). Высокая чувствительность макромо лекул к нарушению ионного состава цитоплазмы клеток, делает противостояние де фициту воды и токсическому действию избытка ионов главными условиями выжива ния любого растения при действии засоления (Chinnusamy, Zhu, 2003). Данные осо бенности определяют важность изучения молекулярных и физиологических механиз мов поддержания водного и ионного гомеостаза в растениях при засолении. Исследо вания в этом направлении установили важность совместимых осмолитов и белков водных каналов растений (аквапоринов) для поддержания осмотического баланса и транспорта воды в клетках (Kuznetsov, Shevyakova, 2010;
Maurel et al., 2008). При изучении процессов поглощения, транспорта и компартментации избыточных ионов были установлены функции транспортных белков, таких как Na+/H+-антипортеры (Shi et al., 2000;
Blumwald et al., 2000), Cl-/H+-антипортеры (Isayenkov et al., 2010;
Mian et al., 2011), Н+-АТФазы (Fuglsang et al., 2011;
Kluge et al., 2003) и др., а также механиз мы их регуляции в растительной клетке (Zhu, 2003;
Janicka-Russak, 2011;
Conde et al., 2011). Исходя из того, что функционирование всех этих механизмов обнаружено как у устойчивых, так и у неустойчивых видов, многие исследователи считают, что ос новное отличие галофитов от остальных растений следует искать именно в принципах регуляции этих защитных механизмов при засолении. Определенные успехи в этом направлении достигнуты благодаря сравнительному изучению контрастных по устой чивости представителей одного семейства, рода или даже вида, что значительно об легчает выявление различий у генетически близких объектов (Inan et al., 2004). В свя зи с этим, продолжается поиск новых модельных объектов, которые позволят более детально раскрыть различия в регуляции адаптационного процесса (Amtmann et al., 2005;
Zhou et al., 2012;
Reginato et al., 2012).
С этой точки зрения, можно считать перспективным изучение растений из рода Plantago, которые существенно различаются по экологической валентности. Значи тельный научный интерес к представителям рода Plantago объясняется большим морфологическим разнообразием этих растений, их экологической «пластичностью» и высокой лекарственной ценностью. Различные виды подорожников используются в качестве модельных объектов для сравнительного анализа особенностей адаптации растений к неблагоприятным условиям внешней среды, в том числе и к засолению (Шипунов, 1998). Наиболее популярными видами для физиологов стали подорожник большой, подорожник средний, подорожник приморский и подорожник толстолист ный (Ahmad et al., 1979;
Konigshofer, 1983;
Pommerrenig et al., 2006;
Nadwodnik, Lohaus, 2008;
Beara et al., 2009;
Reidel et al., 2009;
Sekmen et al., 2007;
Vicente et al., 2004;
Boscaiu et al., 2005;
Gil et al., 2011 и др.). В некоторых исследованиях предста вителей рода Plantago делается вывод о важности механизмов, участвующих в обес печении водного и ионного гомеостаза у галофитных подорожников для их адаптации и выживания в условиях засоления.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении влияния хлоридного засоления на водный и ионный гомеостаз двух видов подорожника: гли кофита – подорожника большого (Plantago major L.) и галофита – подорожника при морского (Plantago maritima L.) и выявлении механизмов, определяющих различие в устойчивости данных видов растений к солевому стрессу.
Задачи исследования:
1. Выявить различия анатомо-морфологического строения растений подорожни ков, важные для поддержания водного и ионного гомеостаза в условиях засоления.
2. Исследовать влияние хлорида натрия в различных концентрациях в питатель ной среде на осмотический потенциал, содержание воды, натрия и калия в листьях исследуемых растений.
3. Изучить динамику показателей водного режима, содержания ионов натрия, хлора и совместимых осмолитов в листьях исследуемых растений при засолении и в последующий восстановительный период.
4. Исследовать влияние засоления на уровень перекисного окисления липидов мембран и антиоксидантной способности экстрактов из листьев подорожников – как показателей антиоксидантного статуса растений.
5. Выяснить влияние продолжительного засоления на активности Н+-АТФазы и Na+/H+-антипортера в плазмалемме из корней и листьев подорожников большого и приморского.
Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное сравнительное ис следование действия засоления на растения подорожника большого и подорожника приморского. Дана оценка вклада защитных механизмов в солеустойчивость иссле дуемых растений на уровне их морфологии и физиологии. Получены новые данные о динамике важнейших физиологических процессов, вовлеченных в обеспечение вод но-ионного гомеостаза у подорожников, различающихся устойчивостью к засолению.
В частности, показана способность подорожника приморского противостоять разви тию водного дефицита, а также наличие у этого вида строгого контроля содержания ионов натрия в листьях. Впервые сделаны выводы об отличии восстановительного процесса подорожников. После снятия засоления контрастные по устойчивости подо рожники большой и приморский имели различную динамику маркерных биохимиче ских показателей. Возврат осмотического потенциала клеток, содержания натрия и сорбита к контрольным значениям у листьев подорожника большого проходил мед леннее и не всегда полностью, в отличие от подорожника приморского, который от личался большей регенерационной способностью и быстрее восстанавливался после действия засоления. В работе впервые охарактеризовано влияние засоления на актив ность транспорта H+ и Na+ в плазматических мембранах из листьев и корней иссле дуемых видов подорожника. Показано, что наблюдаемые изменения могут быть ча стью адаптационной стратегии подорожников большого и приморского, заключаю щейся в разной способности к ограничению транспорта ионов Na+ в побеги при дей ствии засоления.
Практическая значимость. Полученные данные о различии защитных меха низмов галофитного и гликофитного видов подорожников в ответ на действие засо ления расширяют представления о процессах адаптации растений к действию небла гоприятных факторов среды. Результаты настоящего исследования могут быть ис пользованы в практике растениеводства, а теоретические обобщения в курсах лекций для студентов биологических специальностей.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на VI Международ ной конференции молодых учёных «Леса Евразии – Венгерский лес» (Венгрия, Шо прон, 2006);
VII Международной конференции молодых учёных «Леса Евразии – Рус ский север» (Петрозаводск, 2007);
VI Съезде ОФР «Современная физиология расте ний: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007 г.);
VII съезде ОФР «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011);
XI Международной конференции молодых учёных «Леса Евразии – Брянский лес» (Брянск, 2011);
Всероссийском симпозиуме «Экология ме гаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии» (Москва, 2011);
X Международной конференции молодых учёных «Леса Евразии – Белорусское по озерье» (Белоруссия, Браслав, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из которых 3 – статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора ли тературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных ре зультатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.
Материалы диссертации изложены на 123 страницах машинописного текста и содер жат 5 таблиц и 33 рисунка. Список цитируемой литературы включает 250 наименова ний, в т.ч. 232 иностранных.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объектов исследований использовали два вида подорожников (семей ство Plantaginaceae Juss.): гликофит подорожник большой (Plantago major L.) и гало фит подорожник приморский (Plantago maritima L.). Подорожник большой – много летнее травянистое растение высотой 15-50 см с широким ареалом обитания. Семена подорожника большого любезно предоставлены Проблемной лабораторией ФГБОУ Брянской государственной инженерно-технологической академии (Россия). Подо рожник приморский – многолетнее травянистое растение, населяет морские берега, солонцы, солончаки. Семена подорожника приморского любезно предоставлены из коллекции Полярно-альпийского ботанического сада-института им. Н.А. Аврорина КНЦ РАН.
Перед посевом семена стерилизовали 5 минут в 13%-ном растворе перекиси во дорода в этаноле и высевали в перлит, увлажненный дистиллированной водой. Начи ная с двух недель, растения выращивали в водной культуре в условиях фитотрона при минеральном питании по Кнопу и с микроэлементами по Хогланду (pН = 6,0) с 12 ча совым световым периодом под люминесцентными лампами Osram Lumilux L36W/ (Osram, Германия) при интенсивности светового потока в диапазоне ФАР 300± мкмоль/м2·с-1 и при температуре воздуха 25±3 C днем и 20±3 С ночью.
Условия проведения опытов. Эксперименты по засолению проводили на 6 недельных растениях. Для этого в питательный раствор вносили NaCl до достижения концентрации 0, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 мМ. Исследование влияния NaCl в различных концентрациях на растения подорожники выращивали в течение трех су ток. Отбор проб листьев растений производили однократно в конце эксперимента.
Изучение динамики физиологических показателей (водный режим, содержание на трия, хлора, совместимых осмолитов, уровень перекисного окисления липидов мем бран и антиоксидантная способность экстрактов растений) проводили при засолении 300 мМ NaCl. Длительность эксперимента составляла шесть суток. Первые трое суток растения выращивались в присутствии 300 мМ NaCl, затем их переносили на нор мальный питательный раствор (без NaCl) и выращивали еще в течение трех суток.
Отбор проб листьев производили каждые 24 часа. Исследование стресс-зависимых изменений активности Н+-АТФаз и Na+/H+ антипортеров мембран плазмалеммы ис пользовали засоление 100 мМ NaCl в течение 7 суток. Отбор проб листьев и корней производили однократно в конце эксперимента. В зависимости от назначения пробы листьев или корней использовали в свежем виде или фиксировали жидким азотом и хранили при температуре -70°С.
Проведение анатомо-морфологических исследований. Определение общей проективной площади листьев с использованием изображений сканированных свежих листьев подорожников выполняли в программе ArcGIS (Esri, США) 10.1. Показатель склерофильности вычисляли как отношение сухой массы листьев одного растения к их общей проективной площади.
Для подсчета плотности расположения устьиц на листьях растений использо вали метод «мгновенных реплик» эпидермиса, полученных с использованием бес цветного лака на основе полиметилметакрилата. Подсчет количества устьиц проводи ли под световым микроскопом с использованием объект-микрометра.
Для изучения анатомии листьев готовили временные препараты их попереч ных срезов. Препараты исследовали под световым микроскопом Imager D1 (Carl Zeiss, Германия) с цифровой фотонасадкой.
Водопоглощающую способность листьев определяли по приросту массы (в процентах от исходной массы) отделенных листьев растений, помещенных в деиони зованную воду и выдержанных в насыщенной парами воды камере в течение 24 ча сов.
Осмотический потенциал клеточного экссудата определяли на криоскопиче ском осмометре Osmomat 030 (Gonotec, Германия) в соответствии с инструкцией про изводителя. Клеточный экссудат выжимали из размороженных образцов листьев рас тений.
Определение содержания Na, К и Сl в листьях. Анализ содержания натрия и калия в образцах, подготовленных методом мокрого озоления, проводили на атомно адсорбционном спектрофотометре Hitachi 207 (Hitachi, Япония). Содержание ионов хлора определяли в водных экстрактах из листьев потенциометрическим методом на потенциометре Expandable ionAnalyzer EA 940 (Orion Research, США) с использова нием комбинированного хлоридного электрода 96-17-00 (Orion Research, США).
Анализ растворимых углеводов и сахароспиртов в водных экстрактах из ли стьев растений проводили совместно с лабораторией механизмов роста растительных клеток Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН (зав. лаб.-д.б.н., проф.
Горшкова Т.А.). Разделение и идентификацию свободных углеводов и сахароспиртов в препаратах проводили при помощи высокоэффективной анионообменной хромато графии в системе DX-500 (Dionex, США) на колонке CarboPac PA-1, 4х250 мм (Dionex, США) с использованием пульс-амперометрического детектора ED (Dionex, США) (Gurjanov et al., 2007;
Микшина и др., 2009).
Определение содержания сорбита в листьях растений. Анализ сорбита в вод ных, депротеинизированных экстрактах из листьев растений выполняли фермента тивным методом с использованием набора KSORB02/04 (Megazyme, Ирландия) в со ответствии с инструкцией производителя.
Определение содержания свободного пролина в листьях растений проводили по методу Bates с соавт. (Bates et al., 1973).
Оценка содержания МДА в листьях растений. Содержание МДА оценивали спектрофотометрическим методом, основанном на образовании окрашенного ком плекса МДА с тиобарбитуровой кислотой при нагревании (Buege, Aust, 1978).
Активность низкомолекулярных антиоксидантов в этанольных экстрактах из листьев растений оценивали по способности их обезвреживать катион-радикал ABTS•+ (2,2’-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты)) по методу, адаптированному для растительного материала (Re et al., 1999), и выражали в эквива лентном количестве вещества Тролокса – TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity).
Выделение, очистку и исследование мембран плазмалеммы проводили со вместно с лабораторией мембран растительных клеток ИФР РАН (зав. лаб.-д.б.н., Трофимова М.С.). Препараты плазмалеммы получали методом разделения микросо мальных мембран в водной двухфазной полимерной системе (Трофимова и др., 2011).
Определение содержания белка в препаратах мембран. Содержание белка в препаратах определяли по методу Bradford (Bradford, 1976).
Определение АТФазной активности плазмалеммы. Активность Н+-АТФаз оценивали спектрофотометрически при 340 нм по количеству окисленного НАДН в сопряженной АТФ-регенерирующей системе (Palmgren, 1990).
Определение АТФ-зависимой Н+-транслоцирующей активности и оценка скорости Na+/Н+ обмена мембран плазмалеммы. Н+-транслоцирующую активность определяли по скорости генерации рН инвертированными везикулами, который ре гистрировали по изменению оптической плотности среды в присутствии индикатора рН – акридинового оранжевого (Palmgren, 1990). Для оценки скорости Na+/Н+ обме на сравнивали Н+-транслоцируюшую активность везикул при наличии и в отсутствие ионов Na+.
Представленные данные являются результатом трех независимых экспериментов и получены не менее чем в 3-кратной биологической и аналитической повторностях.
Результаты, представляющие собою малые выборочные совокупности, обрабатывали статистически в среде Microsoft Excel 2007 и выражали как среднюю арифметиче скую величину ± основная ошибка средней величины.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анатомо-морфологическая характеристика побегов подорожников Основным физиологическим процессом, при котором растения расходуют воду, является транспирация (Kramer, Boyer, 1995). По этой причине, многие растения га лофиты обладают малой площадью и большой толщиной листьев, что позволяет не только экономить воду, но и запасать ее в тканях. Для количественной оценки разли чий в строении листьев двух видов подорожника была определена общая проективная площадь их листьев и вычислен показатель склерофильности (ПС), позволяющий оценивать толщину листьев растений (табл. 1) и выражающейся как отношение сухой массы листа к площади его поверхности. Суммарная проективная площадь поверхно сти листьев подорожника большого была в 3,5 раза больше, чем таковая у подорож ника приморского. Листья подорожника приморского имели большую сухую массу на единицу проективной площади, что характеризует их как более суккулентные. Ли стья подорожника большого, напротив, отличались меньшим значением ПС, что ука зывало на их большую склерофильность.
Таблица 1 – Общая площадь листьев растений и показатель склерофильности Среднее значение Среднее значение Показатель скле Вид общей проективной сухой массы рофильности, подорожника площади листьев, см листьев, г кг/м П. большой 0,5530 ± 0,0898 171,18 ± 22,250 0,031 ± 0, П. приморский 0,2312 ± 0,0328 48,08 ± 6,550 0,048 ± 0, Для количественной оценки плотности расположения устьиц – важного морфо логического признака, суккулентности или ксероморфности растения - были получе ны и проанализированы реплики эпидермиса поверхностей листьев контрольных рас тений подорожников. У листьев подорожника приморского число устьиц на квадрат ный миллиметр было в 1,6 раза выше, чем у П. большого (табл. 2).
Таблица 2 – Плотность расположения устьиц на листьях подорожников Вид Адаксиальная сторона Абаксиальная сторона подорожника листа, шт/мм2 листа, шт/мм П. большой 135±13,8 133±8, П. приморский 222±32,5 214±27, Анатомическое строение листа подорожника большого (рис. 2А) в целом было типично для травянистых растений. Через лист проходило 7 главных жилок с одним коллатеральным проводящим пучком (рис. 2Б). Листья подорожника приморского ха рактеризовались изолатеральным строением (рис. 2В). Центральное положение в лис те занимала водозапасающая паренхима. Наличие водозапасающих тканей считается признаком суккулентности. Некоторые авторы определяют подорожник приморский как суккулентный эугалофит (Breckle, 2002;
Османова, 2009). Однако суккулентность подорожника приморского может быть связана не столько с приспособлением к засу хе, сколько с необходимостью депонирования избытка солей при засолении. Более того, с учетом плотности расположения устьиц, нельзя говорить о классической сук кулентной организации листа подорожника приморского, т.к. у классических сукку лентов минимальная плотность расположения устьиц составляет 3 – 93 шт./мм2, а у не суккулентных растений – 82 – 222 шт./мм2 (von Willert et al., 1992). Размер проводя щих пучков в листьях подорожника приморского был меньше, чем у подорожника большого, однако общее число самих пучков было выше.
В э А 0,1 мм 0,5 мм гп сп э фп взп Г Б кс пп ф 1 мм ск 0,5 мм кол Рисунок 2 – Анатомическое строение листьев подорожника большого (А-Б) и подо рожника приморского (В-Г): А – фрагмент мезофилла листа, Б – срез через централь ную жилку листа, В – фрагмент мезофилла листа, Г – общий план среза.
взп – водозапасающая паренхима;
гп – губчатая паренхима;
кол – колленхима;
кс – ксилема;
пп - проводящий пучок;
ск – склеренхима;
сп – столбчатая (палисадная) па ренхима;
фп – фотосинтезирующая паренхима;
э – эпидерма;
ф – флоэма.
2. Оценка устойчивости растений подорожников к хлоридному засолению Подорожники различались по степени выраженности реакции на присутствие NaCl в концентрациях от 50 до 500 мМ в питательной среде. Подорожник большой начинал терять тургор при действии 100 мМ NaCl, в отличие от подорожника при морского, у которого визуально наблюдаемая реакция на засоление начиналась при концентрациях NaCl более 200 мМ. Поскольку реакция растений на NaCl связана с нарушением водного баланса и токсическим действием ионов натрия, было важно определить содержание воды, осмотический потенциал и содержание ионов натрия в листьях исследуемых растений при действии NaCl в различной концентрации.
В листьях подорожника большого снижение содержания воды сильно зависело от концентрации NaCl в среде (рис. 3а). В листьях подорожника приморского, имев ших конститутивно бльшую оводненность, потери воды при максимальной концен трации NaCl не превышали 9% от исходного ее содержания и были менее значитель ными, чем у подорожника большого.
Осмотический потенциал клеточного экссудата листьев сильнее понижался у подорожника большого, и при засолении от 200 до 500 мМ NaCl был в 4-5 раз ниже, чем у контрольных растений. Значения осмотического потенциала для подорожника приморского, наоборот, были близки к осмотическому потенциалу питательного рас твора во всех опытных вариантах, и были ниже его, в среднем, на -0,4 МПа (рис. 3б).
(б) (а) NaCl, мМ 100 П. большой 0 50 100 150 200 300 400 П. приморский Содержание воды, % - осм., МПа - - 60 - П. большой - П. приморский 0 50 100 150 200 300 400 500 - питательный раствор NaCl, мМ - Рисунок 3 – Содержание воды (а) и осмотический потенциал (б) в листьях растений на третьи сутки действия NaCl в различных концентрациях.
Значительное снижение осмотического потенциала и увеличивающийся осмоти ческий градиент между растением и средой не приводили к усилению поступления воды в листья подорожника большого. Вместе с этим, способность отделенных ли стьев подорожника большого к поглощению воды не утрачивалась при засолении и была сопоставима с водопоглощающей способностью листьев подорожника примор ского. Можно предполагать, что, вызванное засолением, нарушение поступления во ды в листья подорожника большого связано с повреждением корневой системы.
В листьях растений подорожника большого наблюдалось дозозависимое накопление натрия (рис. 4а). Содержание ионов натрия в листьях подорожника при морского достигало максимума (примерно 4-5 ммоль/г сухой массы) при засолении 50 мМ и слабо изменялось с увеличением концентрации NaCl в среде.
Анализ содержания калия в листьях опытных растений показал, что в подорож нике приморском его уровень при сильном засолении (400 и 500 мМ NaCl) превышал контрольные значения. В листьях подорожника большого содержание калия изменя лось незначительно (рис. 4б).
2, (а) 7 (б) 2, К+, ммоль/г сух. м.
Na+, ммоль/г сух. м.
1, 3 1, 2 П. большой П. большой 0, 1 П. приморский П. приморский 0 0, 0 100 200 300 400 500 0 100 200 300 400 NaCl, мМ NaCl, мМ Рисунок 4 – Влияние различных концентраций NaCl на содержание Na+ (а) и К+ (б) в листьях растений на третьи сутки эксперимента.
Таким образом, различная устойчивость двух видов подорожников к засолению была связана с их разной способностью противостоять развитию водного дефицита, поддерживать осмотический потенциал клеток в и контролировать содержание ионов натрия в клетках.
Исходя из полученных результатов, для изучения динамики показателей водного режима, содержания натрия, хлора и совместимых осмолитов в листьях исследуемых растений было выбрано воздействие 300 мМ NaCl в питательном растворе в течение трех суток. Для сравнительного исследования динамики восстановительных процес сов у растений, после засоления их переносили питательную среду контрольного со става и выращивали в течение еще трех суток.
Динамика содержания воды, осмотического потенциала, содержания на трия и хлора в листьях исследуемых растений при засолении 300 мМ NaCl и в восстановительный период Содержание воды в листьях подорожника большого заметно уменьшалась при действии 300 мМ NaCl. В листьях подорожника приморского, наоборот, колебания содержания воды были минимальны и не превышали 1,8% к третьим суткам опыта (рис. 5а). Осмотический потенциал в листьях подорожника большого на третьи сутки эксперимента был ниже, чем у подорожника приморского в 1,4 раза.
(б) (а) Содержание воды, % от сыр. веса Время, ч 0 24 48 72 96 120 Содержание воды, % - осм., мПа - 82 П. большой, контроль - П. большой, 300 мМ П. приморский, контроль 0 24 48 72 96 120 П. приморский, 300 мМ Время, ч - Рисунок 5 – Содержание воды (а) и динамика осмотического потенциала (б) в листьях растений при засолении и в восстановительный период. Затемненая область графика соответствует периоду засоления.
Принимая во внимание тот факт, что в питательной среде осмотический потенциал был равен примерно -1,4 мПа, то столь значительное снижение его в листьях подорожника большого может рассматриваться не как осмотическая регуляция, а как неспособнось к поддержанию водного баланса в условиях засоления.
(а) (б) 300 П. большой, контроль П. приморский, контроль П. большой, 300 мМ 250 Na+, мкмоль/г св. м.
Cl-, мкмоль/г св. м.
П. приморский, 300 мМ 200 150 100 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 Время, ч Время, ч Рисунок 6 – Динамика содержания натрия (а) и хлора (б) в листьях растений при засолении и в восстановительный период. Затемненая область графика соответствует периоду засоления.
Как видно из рисунка 6, содержание ионов натрия и хлора в течение всего экс перимента у подорожника большого был выше, чем у подорожника приморского.
Расчет средней концентрации натрия в клетках листьев подорожника большого на третьи сутки эксперимента показал, что она должна была приближаться к 270 мМ, против 170 мМ в листьях подорожника приморского. Быстрое и значительное накоп ление натрия и хлора в листьях подорожника – гликофита могло быть еще одной при чиной существенного снижения осмотического потенциала в клетках.
В большей степени уровень осмотического потенциала был зависим от содержа ния ионов натрия у подорожника большого (r = -0,96 при p = 0,01) и в меньшей сте пени у подорожника приморского (r = -0,86 при p = 0,05).
Таким образом, можно предполагать, что подорожник большой был неспособен поддерживать низкое содержание натрия и хлора в клетках, что может свидетельст вовать о низкой эффективности барьерных систем клеток корня и механизмов актив ного транспорта этих ионов против их электрохимических градиентов.
Анализ динамики изученных параметров на этапе восстановления показал, что восстановление у подорожника большого проходило медленнее. Малая скорость снижения содержания натрия, а также отсутствие снижения содержания хлора в ли стьях подорожника большого после снятия засоления, возможно, были причинами сохранения более низких значений осмотического потенциала у восстанавливающих ся растений. Растения подорожника приморского, напротив, восстанавливали осмотический потенциал до контрольных значений за 72 часа.
Динамика содержания совместимых осмолитов в листьях исследуемых рас тений при засолении 300 мМ NaCl и в период восстановления Одновременно с повышением содержания ионов и их компартментацией в ва куоли растения защищают цитоплазму клеток от потерь воды за счет синтеза совмес тимых осмолитов (Tuteja, 2009).
Проведенный нами анализ содержания растворимых углеводов и сахароспиртов в экстрактах из корней и листьев подорожников методом ВЭЖХ показал, что концен трация сорбита в листьях подорожника большого и подорожника приморского сопос тавима с концентрацией важнейших углеводов растений – глюкозы и сахарозы, что подтверждается литературными данными (Ahmad, Larhner, 1979;
Nadwodnik, Lohaus, 2008). Поэтому нами было изучено влияние засоления на содержание сорбита, а так же на содержание пролина – распространенного осмотически активного и стресс протекторного метаболита - в листьях подорожников.
В листьях обоих исследованных растений происходило увеличение содержания сорбита через 48 ч после засоления (рис. 7а). Однако в дальнейшем, увеличение со держания сорбита было характерно только для листьев менее устойчивого подорожника большого. У подорожника приморского содержание сорбита после часов снижалось.
(б) (а) 35 П. большой, контроль 0, П. приморский, контр.
пролин, мкмоль/г сух. м.
0,6 П. большой, 300 мМ сорбит, ммоль/г сух. м.
П. приморский, 300 мМ 0, 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 Время, ч Время, ч Рисунок 7 – Динамика содержания сорбита (а) и пролина (б) в листьях растений при засолении и в восстановительный период. Затемненная область графика соответствует периоду засоления.
Полученные данные свидетельствуют о сходной NaCl-индуцированной стиму ляции синтеза сорбита у обоих растений. Различие содержания сорбита при засоле нии и в восстановительный период у исследуемых растений, возможно, связано с раз ным осмотическим потенциалом в листьях подорожников. Более низкий осмотиче ский потенциал в листьях подорожника большого из-за обезвоживания и сохраняю щегося высокого содержания натрия, мог быть причиной поддержания синтеза сор бита на значительном уровне даже после перенесении этого растения в контрольные условия.
Анализ содержания пролина (рис. 7б) выявил значительно меньший, в сравнении с сорбитом, уровень его в листьях у обоих видов контрольных и опытных растений (примерно в 30-60 раз). Количество пролина существенно повышалось при засолении только в листьях подорожника большого, что, возможно, связано не столько с осмо регуляторной, сколько с его антиоксидантной и белок-стабилизирующей ролью.
Антиоксидантный статус растений при засолении (300 мМ NaCl в течение трех суток) и при последующем восстановлении Одним из последствий действия засоления на растения является окислительный стресс, связанный с нарушениями структуры мембран, процессов фотосинтеза и ды хания (Shao et al., 2008;
Gill, Tuteja, 2010;
Suzuki et al., 2012). Для оценки степени окислительных повреждений была изучена динамика содержания МДА в листьях двух видов подорожников. В ходе эксперимента уровень МДА у обоих видов мало различался и достигал максимума на третьи сутки засоления (рис. 8а). Таким образом, изменение содержания МДА в листьях указывает на развитие окислительного стресса у обоих видов растений при засолении, независимо от их устойчивости к засолению.
0, (б) TEAC, ммоль тролокса/г сух.м.
(а) 0, МДА, мкмоль/г св.м.
0, 0, 0, 0, 0,01 0,00 0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 Время, ч Время, ч Рисунок 8 – Влияние 300 мМ NaCl в питательной среде на содержание МДА в листь ях растений (а) и на антиоксидантную емкость этанольных экстрактов из листьев по дорожников (б). Затемненная область графика соответствует периоду засоления Рост МДА, наблюдавшийся к концу восстановительного периода, мог свиде тельствовать о повторном развитии окислительного стресса, который вероятно возникал вследствие гипоосмотического шока из-за резкого снижения осмотического потенциала в среде (Cazale et al., 1998;
Hernandez, Almansa, 2002;
Liu et al., 2012).
В литературе представлено значительное число доказательств высокой антиок сидантной активности экстрактов листьев различных видов подорожника (Samuelsen, 2000;
Glvez et al., 2005;
Pogacnik, Ulrih, 2011;
Amakura, 2012 и др.), но мало сведений о возможном участии низкомолекулярных антиоксидантов в защитном ответе подо рожников на стресс.
Для оценки активности низкомолекулярных антиоксидантов использовали метод определения тролокс-эквивалента антиоксидантной способности экстрактов из листь ев растений, который позволил оценить суммарное содержание ABTS•- активных низкомолекулярных гидрофильных и липофильных антиоксидантов, включая флаво ноиды, фенилпропаноиды, каротиноиды и др. Антиоксидантная емкость в листьях подорожника приморского в условиях засоления увеличивалась значительнее, чем у подорожника большого, и оставалась на высоком уровне до конца эксперимента (рис.
8б). Подорожник приморский проявлял большую способность к повышению содер жания низкомолекулярных антиоксидантов в условиях засоления, чем его родствен ник-гликофит. Возможно, эта способность данного галофита к лучшему обезврежи ванию свободных радикалов является одной из причин большей солеустойчивости подорожника приморского.
Влияние засоления на активности Н+-АТФазы и Na+/H+ антипортера в плазмалемме из корней и листьев подорожников Известно, что важную роль в поддержании водно-солевого баланса клеток рас тений при засолении играют Н+-АТФазы, необходимые для вторично энергизованного транспорта ионов и метаболитов через клеточные мембраны.
Факт того, что содержание натрия в листьях опытных растений подорожника приморского, в отличие от подорожника большого, не зависело от степени засоления (рис. 4а), и определялось лишь наличием или отсутствием NaCl в питательной среде, может объясняться различиями в регуляции процессов активного транспорта ионов H+ и Na+ у этих растений. С целью проверки справедливости данной гипотезы нами были проведены исследования стресс-индуцированных изменений каталитической и транспортной активностей H+-АТФазы, а также активности Na+/H+ антипортера в плазмалемме, выделенной из корней и листьев исследуемых растений.
Поскольку для выполнения поставленной задачи необходимо было смоделиро вать «насыщение» листьев растений ионами натрия, длительность эксперимента была увеличена до 7 суток, а уровень засоления снижен до 100 мМ NaCl. Такая схема экс перимента, с одной стороны, не приводила к гибели менее устойчивого подорожника большого, а, с другой стороны гарантировала стабилизацию уровня ионов Na+ в ли стьях обоих растений (эффект «насыщения»).
АТФазная активность плазмалеммы, выделенной из корней и листьев контроль ных растений, имела близкие значения, в то время как действие 100 мМ NaCl приво дило к увеличению активности данного фермента в 1,7 и 2,3 раза в листьях подорож ника большого и подорожника приморского соответственно, а также к слабому сни жению активности в корнях. Важно было понять, сопровождается ли обнаруженное нами увеличение АТФзной активности под действием засоления соответствующей стимуляцией АТФ-зависимой Н+-транслоцирующей активности выделенных везику лярных мембран. Как показано на рисунке 9, активация этого процесса действительно наблюдалась, но только для плазмалеммы, выделенной из листьев растений.
0,7 П. большой 0,70 П. приморский корни Активность, ОЕ/(мг белка*мин) листья 0,6 0, Рисунок 9 – Влияние засоления 100 мМ 0,5 0, на Н+ NaCl 0,4 0, транслоцирующую ак тивность мембран из 0,3 0, корней и листьев рас 0,2 0, тений подорожника большого приморского 0,1 0, на 7 сутки.
0,0 0, контроль 100 mM NaCl контроль 100 mM NaCl Отмеченное выше стимулирующее действие засоления на транспортную ак тивность H+-АТФазы плазмалеммы подорожников может активировать вторично энергизуемые процессы транспорта, в том числе транспорт Na+ через Na+/Н+ анти порт.
0,20 0, П. большой Рисунок 10 – Влияние П. приморский Активность, ОЕ/(мг белка*мин) засоления 100 мМ 0,15 0,15 корни на скорость NaCl Na+/Н+ обмена в пре листья паратах плазмалеммы 0,10 0, из корней и листьев растений подорожника 0,05 0, большого и примор ского на 7 сутки.
0, 0, контроль 100 mM NaCl контроль 100 mM NaCl -0, Как следует из данных, представленных на рисунке 10, в мембранах из корней подорожника большого не наблюдалось каких-либо существенных изменений в ско ростях Na+/Н+ обмена по сравнению с контролем. Напротив, в мембранах из корней подорожника приморского, в условиях засоления, скорость Na+/Н+ обмена снижалась в несколько раз. Вместе с тем в мембранах, выделенных из листьев опытных растений обоих видов, наблюдалась существенная стимуляция процесса Na+/Н+ обмена по сравнению с контролем.
Скорость Na+/Н+ обмена может в определенной степени характеризовать спо собность клеток корня или листа к активному, опосредованному протонным градиен том, выведению натрия в апопласт. Поэтому, изменение активности этого вида транс порта в паренхиме ксилемы корня, позволяет снижать содержание Na+ в ксилеме и, следовательно, темпы его поступления в надземные органы.
Таким образом, можно предположить, что, наблюдаемое при засолении сниже ние скорости Na+/Н+ обмена в плазмалемме, выделенной из корней подорожника приморского, позволяло в условиях целого растения ограничивать поступление ионов натрия в ксилему и надземные органы и стабилизировать тем самым уровень натрия в листьях независимо от интенсивности засоления. Наблюдавшаяся в условиях засоле ния стимуляция Н+-транслоцирующей и Na+/Н+ обменной активности плазмалеммы листьев, возможно, позволяла растениям усиливать энергозависимый транспорт ио нов Na+ из клеток листа, а также, возможно, интенсифицировать загрузку флоэмы фо тоассимилятами.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Адаптация растений к действию засоления должна заключаться в восстановле нии водного режима клеток и ионного баланса их цитоплазмы, направленном как на уменьшение степени взаимодействия ионов солей с чувствительными компонентами клетки, так и на нормализацию минерального питания. Одним из способов защиты у растений-галофитов может быть наличие специализированных морфологических и анатомических приспособлений.
Полученные данные о различиях строения контрастных по устойчивости к засо лению подорожника большого и подорожника приморского показывают значение анатомо-морфологических особенностей для процесса адаптации этих растений к за солению. Подорожник приморский характеризовался меньшей площадью листьев (в 3,5 меньше, чем у подорожника большого), что характерно также для некоторых дру гих засухо- и солеустойчивых представителей рода Plantago (Vicente et al., 2004;
Bos caiu et al., 2005;
Koyro, 2006;
Rahimi et al., 2006;
Afsharmanesh et al., 2010). Таким об разом, форма листовой пластинки подорожников в значительной степени зависит от экологической принадлежности вида и, несомненно, влияет на водный режим расте ния. В отличие от подорожника большого листья подорожника приморского характе ризовались изолатеральным строением, характерным для многих суккулентов (Fisher et al., 1997), и обладали хорошо развитой водозапасающей тканью, которая занимала большой объем листа. При этом, водозапасающая паренхима листьев подорожника приморского может быть предназначена не столько для приспособления к засухе, сколько для депонирования избытка солей. Таким образом, полученные данные срав нительного анатомо-морфологического исследования растений свидетельствуют о наличии ряда особенностей в строении подорожника приморского, которые имеют значение для сохранения водного баланса при засолении.
Сравнительный анализ действия различных концентраций NaCl на растения по дорожника большого и подорожника приморского позволил выявить четкие границы адаптационных возможностей данных растений к засолению. Для подорожника большого токсическим было воздействие хлорида натрия в концентрации выше мМ, в то время как подорожник приморский не имел признаков повреждения при вы ращивании на растворе с концентрацией до 200 мМ NaCl.
При засолении, в условиях физиологической засухи, растения способны регулировать осмотический потенциал и сохранять его в физиологически допустимых пределах, что может рассматриваться, как один из адаптационных механизмов.
Исследованые растения различались по способности противостоять развитию водного дефицита. Содержание воды в листьях подорожника приморского, в отличие от подо рожника большого, изменялось в узких пределах, а осмотический потенциал клеток не опускался ниже 0,4 МПа относительно осмотического потенциала среды, что со храняло возможность поступления воды в растение. У подорожника большого при действии засоления значительное снижение осмотического потенциала клеточного экссудата листьев не приводило к усилению транспорта воды в направлении дейст вующего осмотического градиента, возможно из-за повреждения корневой системы.
Важной особенностью и, возможно, центральным звеном в солеустойчивости подорожника приморского была способность к контролю накопления натрия в листь ях. У исследуемого галофита содержание натрия поддерживалось на постоянном уровне (в пределах 5 ммоль/г сухой массы), даже при значительных уровнях засоле ния, что отличало его от подорожника большого.
Значительная роль в стабилизации содержания натрия в листьях подорожника приморского могла принадлежать механизмам активного транспорта ионов через мембраны клеток. Для предотвращения поступления ионов натрия в листья, подо рожнику-галофиту необходимо было ограничивать их загрузку в ксилему на уровне клеток ксилемной паренхимы. Как показали исследования на инвертированных вези кулах мембран выделенных из корней и листьев подорожника, этот механизм дейст вительно функционировал. Везикулы плазмалеммы, выделенные из корня подорож ника приморского, подвергавшегося засолению, характеризовались сильно снижен ной скоростью Na+/Н+ обмена по сравнению с везикулами, выделенными из корней контрольных растений. В то время как для везикул из корней растений подорожника большого в условиях засоления таких изменений отмечено не было. Вместе с этим, в листьях обоих растений при действии засоления происходило усиление как протон транслоцирующей, так и Na+/Н+ обменной активности мембран. Исходя из получен ных нами данных, можно предположить, что наблюдаемое при засолении снижение скорости Na+/Н+ обмена в плазмалемме, выделенной из корней, позволяло в условиях целого растения подорожника приморского ограничивать поступление ионов натрия в ксилему и надземные органы.
ВЫВОДЫ 1. В поддержании водного гомеостаза растений подорожника приморского значи тельный вклад вносило анатомо-морфологическое строение листьев, имеющих мень шую, в сравнении с подорожником большим, транспирационную поверхность, выра женный суккулентный характер внутренней организации и наличие водозапасающих тканей.
2. Основными отличиями подорожника большого от подорожника приморского в ре акции их на засоление были более выраженный водный дефицит, и малоэффективный контроль накопления ионов натрия и хлора в листьях растений.
3. Стимуляция накопления совместимых осмолитов сорбита и пролина имела боль шее значение в защитном ответе менее устойчивого к засолению подорожника боль шого, который сильнее испытывал водный дефицит.
4. Подорожник большой и подорожник приморский испытывали окислительный стресс при засолении, однако, подорожник приморский был способен к более эффек тивному обезвреживанию свободных радикалов, что является одной из причин его большей солеустойчивости.
5. Подорожник приморский обладал более высоким регенерационным потенциалом по сравнению с подорожником большим, что проявлялось в большей степени восста новления исследованных параметров (содержание воды, осмотический потенциал, содержание ионов натрия и хлора в листьях) при перенесении растений из засоления в контрольные условия.
6. В листьях растений обоих видов подорожников, наблюдаемая при засолении ин дукция АТФазной активности плазмалеммы, вероятно, была причиной усиления АТФ-зависимого транспорта, что может рассматриваться как стресс-зависимая регу ляция вторично-энергизованного транспорта.
7. В отличие от подорожника большого, подорожник приморский, был способен при засолении ограничивать поступление ионов натрия в ксилему и надземные органы за счет уменьшения скорости Na+/Н+ обмена в плазмалемме клеток корня.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Иванов Ю.В., Карташов А.В., Радюкина Н.Л., Шевякова Н.И. (2006) Функцио нирование NaCl- индуцированной защитной системы в растениях галофитного и гли кофитного типов. В сб.: Пущинская школа-конференция молодых учёных, Пущино, с.
75-76.
2. Иванов Ю.В., Карташов А.В., Радюкина Н.Л., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В.
(2006) Действие различных концентраций NaCl на дикорастущие травянистые расте ния средней полосы России. В сб.: Международная конференция молодых учёных «Леса Евразии – Венгерский лес», Шопрон, с. 67-68.
3. Карташов А.В., Иванов Ю.В., Пашковский П.П., Радюкина Н.Л., Кузнецов Вл.В. (2007) Исследование ранней индукции защитных систем растений подорожника большого (Plantago major L.) под действием NaCl. В сб.:VI Съезд Общества физиоло гов растений России, Сыктывкар, с. 176-177.
4. Карташов А.В., Иванов Ю.В., Радюкина Н.Л. (2007) Системы стресс толерантности подорожника большого. В сб.: Международная конференция молодых учёных «Леса Евразии – Русский север», Петрозаводск, с. 100-101.
5. Радюкина Н.Л., Карташов А.В., Иванов Ю.В., Шевякова Н.И., Кузнецов В.В.
(2007) Сравнительный анализ функционирования защитных систем у представителей галофитной и гликофитной флоры в условиях засоления. Физиология растений, 54, 902-912.
6. Radukina N.L., Ivanov Y.V., Kartashov A.V., Kuznetsov Vl.V. (2007) The Free Po lyamines in Glycophyte Plantago major and Halophyte Thellungiella halophila under Salt Stress. In: Book of Abstr., International Symposium “Plant Growth Substances: Intracellu lar Hormonal Signaling and Applying In Agriculture”, Kyiv, P109.
7. Карташов А.В., Радюкина Н.Л., Иванов Ю.В., Пашковский П.П., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. (2008) Роль систем антиоксидантной защиты при адаптации дикорастущих видов растений к солевому стрессу. Физиология растений, 55, 516-522.
8. Mapelli S., Brambilla I. M., Radyukina N. L., Ivanov Yu. V., Kartashov A. V., Reg giani R., Kuznetsov Vl. V. (2008) Free and bound polyamines changes in different plants as a consequence of UV-B light irradiation. Gen. Appl. Plant Physiology, 34, 55-66.
9. Радюкина Н.Л., Мапелли С., Иванов Ю.В., Карташов А.В., Брамбилла И., Кузнецов В.В. (2009) Гомеостаз полиаминов и антиоксидантные системы корней и листьев Plantago major L. при солевом стрессе. Физиология растений, 56, 359-368.
Карташов А.В. Иванов Ю.В., Пашковский П.П., Радюкина Н.Л. (2011) Со 10.
леустойчивость как критерий оценки перспективности использования растений для городского озеленения. В сб.: «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии» и Школа для молодых ученых по экологической физиоло гии растений. Материалы докладов, Москва, с. 70.
Карташов А.В., Иванов Ю.В. (2011) Постстрессовое состояние выявляет раз 11.
нонаправленную продолжительную активацию защитной системы дикорастущих тра вянистых растений. В сб.: VII Съезд Общества физиологов растений России «Физио логия растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехноло гий» Материалы докладов Часть I., Нижний Новгород, c. 317 – 318.
Карташов А.В., Радюкина Н.Л. (2011) Исследование солевого стресса у подо 12.
рожника большого и подорожника приморского – представителей «контрастных» экологических групп. В сб.: Международная конференция молодых учёных «Леса Ев разии» (тезисы докладов), Брянск, с. 145.