Масштабирование процесса микробиологического синтеза рекомбинантных белков (на примере получения рекомбинантного человеческого 2-интерферона)
На правах рукописи
Казеев Илья Владимирович МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ (НА ПРИМЕРЕ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО 2-ИНТЕРФЕРОНА) 05.17.08 Процессы и аппараты химических технологий 03.00.23 Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева.
Научный руководитель Доктор технических наук, профессор Меньшутина Наталья Васильевна Доктор медицинских наук, зам.Генерального директора ОП ЗАО «Биокад» Денисов Лев Александрович Официальные оппоненты Доктор технических наук, профессор, руководитель научно-внедренческой лабораторией «Технология промышленного биосинтеза» ФГУП «ГосНИИсинтезбелок» Винаров Александр Юрьевич Доктор биологических наук, руководитель отдела ОАО «Акрихин» Робакидзе Татьяна Николаевна Ведущая организация Институт биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича
Защита диссертации состоится «19» февраля 2009 г. в 13 часов в Малом актовом зале на заседании диссертационного совета Д 212.204. в РХТУ им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д. 9.
С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.
Автореферат диссертации разослан «19» января 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.204.03 Женса А.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В настоящее время биотехнология всё активнее замещает химическое производство: это получение химических соединений, лекарственных веществ, новых видов топлив, решение экологических проблем.
Биотехнологические процессы составляют 40% химико-фармацевтического производства, и этот процент растёт за счёт создания последнего поколения лекарственных препаратов на основе белков. В связи с этим представляется актуальным развитие и дополнение существующих методик расчёта и масштабирования биохимических реакторов с учётом возможностей нового аналитического оборудования и вычислительных мощностей компьютеров.
В качестве объекта для осуществления масштабного перехода был выбран процесс микробиологического синтеза клетками Escherichia coli белка – человеческого 2-интерферона. Для исследования процесса культивирования, оптимизации параметров ведения процесса и последующего переноса технологии в промышленность был использован системный подход, позволивший связать разработку новой технологии с использованием культуры E.coli SGК25/pIF TREN в различных объёмах и определить пути активного воздействия на процесс с развитием и дополнением методики масштабирования, т.е. определить связи между явлениями, происходящими на разных уровнях иерархии.
Работа выполнена в соответствии с заданием Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 2012 годы», ГК № 02.513.11.3359.
Цель работы развитие и дополнение существующих методик расчёта и масштабирования биореакторов с учётом возможностей более точного измерения таких важных параметров процесса как растворённый кислород и дыхательный коэффициент биореакторов на примере производства рекомбинантного человеческого 2-интерферона микроорганизмами E.coli SGК25/pIF TREN в ходе конститутивного синтеза на сложных многокомпонентных средах.
Для достижения поставленных целей необходимо решить следующие задачи:
Провести системный анализ процесса производства белка бактериальными клетками:
• Изучить особенности и параметры процесса культивирования, влияющие на рост и развитие микроорганизмов E.coli SGК25/pIF TREN на сложной многокомпонентной среде – LB бульон;
• Определить факторы, влияющие на метаболизм клеток и заставляющие их продуцировать рекомбинантный белок 2 интерферон;
Изучить динамику потребления клетками кислорода в ходе периодического культивирования и определить дыхательные коэффициенты исследуемых биореакторов при помощи газового масс спектрометра ProLine 2000®;
На основании выявленных основных факторов, влияющих на процесс, разработать схему масштабного перехода, включающую в себя разного рода модели (статистические, критериальные, детерминированные);
Разработать математическую модель кинетики периодического процесса накопления рекомбинантного белка 2-интерферона бактериальными клетками E.coli SGК25/pIF TREN;
Исследовать гидродинамику в рассматриваемых аппаратах для периодического культивирования микроорганизмов, используя программное обеспечение FLUENT©;
Разработать программное обеспечение и алгоритм для осуществления масштабного перехода процесса биосинтеза рекомбинантного белка 2 интерферона клетками E.coli.
Научная новизна.
1. Предложена схема масштабирования процессов культивирования в биохимических реакторах, объединяющая в себе несколько подходов (критериальный, статистический, модельный), и позволяющая использовать возможности аналитического оборудования для точного определения оптимальных параметров ведения процессов;
2. Рассчитаны оптимальные параметры производства рекомбинантного человеческого 2-интерферона на сложных многокомпонентных средах и выявлены основные факторы, определяющие течение процесса;
3. Разработана математическая модель кинетики процесса, позволяющая:
• определять максимальный выход белка при различных режимах работы аппарата;
• уточнять параметры ведения процесса при различных начальных условиях.
4. Для мониторинга и масштабирования процессов, протекающих в биохимическом реакторе при производстве препаратов фармацевтического назначения, было успешно применено инновационное аналитическое оборудование, представляющее собой газовый масс-спектрометр ProLine 2000®.
Практическая ценность.
Разработано программное обеспечение для моделирования периодического процесса производства рекомбинантного человеческого 2 интерферона микроорганизмами E.coli SGК25/pIF TREN. Программное обеспечение позволяет на основе кинетики накопления биомассы и целевого белка определять основные параметры и условия ведения процессов культивирования. Разработанное программное обеспечение может быть адаптировано для моделирования процессов культивирования рекомбинантных штаммов-продуцентов E.coli, протекающих на сложных многокомпонентных средах.
Выявленные закономерности начала синтеза рекомбинантного белка и факторы, влияющие на его скорость, позволили оптимизировать режимы проведения процесса культивирования и добиться стабильных выходных характеристик продукта, что играет важную роль в биофармацевтическом производстве лекарственных препаратов.
Были проведены исследования процесса периодического культивирования штамма E.coli SGК25/pIF TREN в колбах Эрленмейера, подобраны режимы работы 15 литрового аппарата, рассчитаны и опробированы параметры процесса в 70 литровом аппарате и проведены опытные синтезы в 300 литровом аппарате с целью подтверждения полученных результатов.
Используя предложенный масштабный переход, включающий в себя статистический, критериальный и модельный подходы, был осуществлён перенос технологии культивирования с лабораторных установок на промышленные объёмы. При этом удалось оптимизировать основные параметры ведения процесса, которые позволили повысить не только количественные, но и качественные характеристики выходной субстанции, что, в свою очередь, привело к общему увеличению выпускаемой продукции и её качеству. Проведённая оптимизация процесса культивирования позволила увеличить рентабельность производства клеточной биомассы с высоким содержанием белка 2-интерферона на базе предприятия ЗАО «Биокад», Москва. Получаемая субстанция 2-интерферона используется для приготовления лекарственных препаратов, применяемых при комплексной терапии онкологических заболеваний, а также в качестве противовирусного средства «Генферон®».
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на: 28ой Международной выставке-конгрессе по химической технологии, защите окружающей среды и биотехнологии «ACHEMA’06», Франкфурт-на-Майне, 2006 г.;
Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2006;
Международной конференции молодых учёных по химии и химической технологии МКХТ-2007, Москва, 2007;
5-ом Международном Конгрессе «Биотехнология – состояние и перспективы развития», Москва, 2008.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы и приложения. Основной материал изложен на страницах машинописного текста, содержит 60 рисунков, 17 таблиц. Список литературы содержит 160 наименований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении отражена и обоснована актуальность поставленной задачи.
В первой главе рассмотрены основные компоненты, участвующие в процессе культивирования клеток в биохимических реакторах. Дана характеристика бактерий Escherichia coli, используемых в производстве биомедицинских препаратов. Проведён маркетинговый анализ рынков рекомбинантных интерферонов в мире и России. Приведен обзор математических моделей кинетики и гидродинамики процессов периодического культивирования микроорганизмов.
В соответствии с целью работы и на основании результатов анализа литературы была сформулирована задача исследования и намечены этапы ее решения.
Вторая глава посвящена системному анализу процесса микробиологического синтеза белка бактериальными клетками E.coli SGК25/pIF TREN в ходе периодического процесса. Порядок проведения анализа представлен на рисунке 1.
Основной целью экспериментальных исследований являлось изучение особенностей и параметров процесса культивирования, влияющие на рост и развитие микроорганизмов E.coli SGК25/pIF TREN на сложной многокомпонентной среде. Кроме того, на основании литературного обзора было установлено, что в ходе экспериментальных работ необходимо определить влияние на процесс 5 основных факторов: температуры, времени проведения процесса и начала синтеза белка клетками, скорости подачи воздуха в ферментёр, количества оборотов мешалки и концентрации субстрата.
Процесс микробиологического синтеза белка занимает ключевую роль в регламенте производства рекомбинантного человеческого 2-интерферона, разработанного и применяемого на предприятии ЗАО «Биокад» (г. Москва).
Требования к получаемой биомассе достаточно высоки. От общего количества получаемых клеток и синтезированного белка зависят все дальнейшие стадии выделения и очистки рекомбинантного 2-интерферона, накапливаемого в виде тел включения. Выбор периодического ведения процесса обусловлен необходимостью стерильности получаемой клеточной массы.
В качестве биокультуры был использован штамм бактерий Escherichia coli SGК25/pIF TREN. Питательной средой служила многокомпонентная среда LB (пептон (10 г/литр), Fluka,США;
дрожжевой экстракт (5 г/литр), Sigma, США;
NaCl (5 г/литр), Panreac, Испания). На первом этапе исследовался процесс микробиологического синтеза в колбах Эрленмейера на качалке «New Brunswick» G10 при скорости вращения платформы 150 об/мин и температуре 32оС. Изучалось влияние степени аэрации на количественный выход клеток и накопление 2-интерферона внутри клеток.
Оптическую плотность клеток измеряли при помощи спектрофотометра «Shimadzu» при длине волны 540 нм с использованием кювет с расстоянием между стенками 1 см. Уровень накопленного белка измеряли при помощи электрофореза в 12,5% ПААГ. Аэрацию регулировали степенью заполнения колб питательной средой. Результаты исследований, проведенных в качалочных колбах, представлены на рисунке 2.
сравнение кривых роста бактерий процент накопленного белка оптическая плотность, 560 нм %белка в клетках 50 мл 50 мл 20 200 мл 200 мл 400 мл 3 400 мл 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 время, ч время,ч А Б Рис.2. А - кривые роста бактерий в колбах Эрленмейера с различными объёмами пи тательной среды (50, 200, 400 мл);
Б - процент накопленного белка а2-интерферона Выявленные зависимости конечного количества клеток и синтезированного белка от объёма питательной среды, позволили сделать вывод о том, что воздействие растворённого кислорода на физиологическое состояние популяции является действенным методом влияния на выходные характеристики процесса.
Кроме того, можно сделать следующие выводы:
• Микробиологический синтез состоит из двух стадий (до периода 6,5-7, часов наблюдается активный рост клеток, затем – синтез белка). Процесс накопления белка сложный, так как белок накапливается внутри клеток, а не секретируется во внешнюю среду – нельзя измерить «in situ»;
• Длительность процесса составляет 12 – 13 часов, после чего наступает стадия стационара и последующее отмирание популяции.
Оптимальными выходными характеристиками процесса по количеству полученной биомассы и количества синтезированного белка было принято считать результаты, полученные в варианте с объёмом среды 200 мл.
При культивировании в биохимическом реакторе появляется возможность влияния на процесс посредством варьирования оборотов мешалки – N (об/мин) и количества подаваемого воздуха – А (л/лж/мин), тем самым изменяя содержание растворенного кислорода. Была проведена серия экспериментов на лабораторном ферментёре (объём 15 литров). Культивирование в ферментёре осуществляли при температуре 32оС и при значения pH=7,2±0,2, без подачи питательной среды и дополнительной коррекции рН. Для изучения влияния растворенного кислорода было решено разделить процесс на 2 стадии:
1. с момента внесения инокулята в питательную среду до 7 часа;
2. с 7 часа до перехода культуры в состояние стационара (13 час).
Была выбрана следующая стратегия варьирования параметров культивирования: на первой стадии увеличение числа оборотов мешалки и количества подаваемого воздуха проходило ступенчато (каждый час) таким образом, чтобы к моменту времени равном 7 часам достичь оптимального значения растворенного кислорода в питательной среде. На второй стадии – поддерживать заданные значения на достигнутом уровне.
На рисунке 3 представлена схема проведения экспериментов в ферментере.
Приведён пример электрофореграммы, получаемой при анализе проб, отбираемых в ходе микробиологического синтеза.
Рис.3. Схема проведения культивирования в аппа рате объёмом 15 литров фирмы Electrolux® 1-вспомогательные шту церы;
2 - корпус ферментё ра;
3 - стерильная пита тельная среда (LB);
4 – ру башка ферментёра;
5 – дат чик температуры охлаж дающей воды;
6 - датчик температуры внутри фер ментёра;
7 – устройство для регулирования оборо тов мешалки;
8 - барботёр;
9 - мешалка;
10 – датчик давления в аппарате;
11 - регулируемые клапаны;
12 - спектрофотометр SHIMADZU® Для того чтобы оценить влияние содержания компонентов питательной среды на рост клеток, был проведён аминокислотный анализ LB-бульона. Для этого в ходе периодического культивировании отбирались пробы с последующим определением концентрации компонентов субстрата в ИБФМ РАН (г.Пущино). Отмечено, что в ходе роста клетки используют в качестве источника углерода и энергии свободные аминокислоты, входящие в состав питательной среды. Кроме того, результаты исследования позволили сделать следующий вывод: состав питательной среды остается практически постоянным по аминокислотному составу и не ограничивает рост бактерий.
Ниже представлены результаты экспериментов в биохимическом реакторе объёмом 15 литров по выявлению взаимного влияния факторов (оборотов мешалки и аэрации) на выходные характеристики процесса. При исследовании влияния аэрации на синтез клеток и накопления белка фиксировались обороты мешалки на постоянном уровне и менялась только скорость подачи воздуха (л/лж/мин) (рисунок 4), для исследования влияния скорости перемешивания (об/мин) – наоборот (рисунок 5).
влияние аэрации на синтез клеток влияние аэрации на синтез белка 40, 7, 35, о т ч с а п о н с ь 5 0н ю 6, пи екя л т от, 6 м 30, елка в клетках 5, кривая роста А = белок А= 25, кривая роста А = 4,0 белок А= кривая роста А = 20, белок А= кривая роста А = белок А= 3, кривая роста А = %б 15, белок А= 2, 10, 1,0 5, 0, 0, 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 время, ч врем ч я, А Б Рис.4. Исследование влияния скорости подачи воздуха (л/лж/мин) на синтез белка клетками при фиксированном числе оборотов мешалки (А – кривые роста клеток;
Б – содержа-ние белка а2-интерферона в клетках) влияние оборотов мешалки на синтез клеток влияние оборотов мешалки на синтез белка 35, 7, 30, 6, оптическая плотность, 25, %белка в клетках 5, белок W= кривая роста W=50 20, белок W= 4, кривая роста W= белок W= кривая роста W=200 15,0 белок W= 3, кривая роста W= белок W= кривая роста W=400 10, 2, 5, 1, 0, 0, 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 время, ч время, ч Б А Рис.5. Исследование влияния количества оборотов мешалки (об/мин) на синтез белка клетка-ми при фиксированной скорости подачи воздуха (А – кривые роста клеток;
Б – содер-жание белка а2-интерферона в клетках) В ходе экспериментов проводилось измерение текущей концентрации кислорода посредством датчика. Было отмечена разница в концентрации растворенного кислорода в зависимости от параметров ведения процесса. На основании проделанных экспериментов в аппарате объёмом 15 литров были сделаны следующие выводы:
• Синтез белка клетками является сложным. Процесс культивирования является альтернативным: возможен высокий выход по клеткам с малым содержанием белка и наоборот – высокие показатели по белку, но малое количество клеток;
• На течение синтеза не оказывает влияние изменение состава питательной среды. Рассматриваемый процесс не является лимитированным по содержанию необходимых для роста бактерий веществ;
• Одним из эффективных способов повышения выходных параметров является воздействие на физиологию клеток путем выбора оптимальных характеристик ведения процесса: количества растворенного кислорода в питательной среде (количества подаваемого воздуха и скорости оборотов мешалки).
Третья глава посвящена разработке методики масштабного перехода от лабораторных реакторов (15 литров) к аппаратам полупромышленных (70 литров) и промышленных (300 литров) объёмов. Анализ экспериментальных данных и проведённый литературный обзор позволили разработать следующую методику масштабирования – рисунок 6.
Первым шагом в масштабном переходе является статистическая обработка результатов, полученных в ходе исследования в биохимическом реакторе объёмом 15 литров.
С тати сти ческая об работка результатов, п олучен н ы х О пределение в 15 л ф ерм ентёре. ды хательного Р езультат: п олучен и е оп ти м альн ы х зн ачен и й к о э ф ф и ц и е н т а (R Q ) к о л и ч е с т в а о б о р о т о в м е ш а л к и N opt (о б /м и н ), и с к о р о с т и п о д а ч и в о з д у х а A opt (л /л ж / м и н ) О пределение коэф ф ициента м ассопередачи по кислороду (К La ) О пределение оптим альны х реж им ов работы 70 л аппарата N opt (о б /м и н );
A opt (л /л ж /м и н ) О пределение оптим альны х реж им ов работы 300 л аппарата N opt (о б /м и н ) ;
A opt (л /л ж /м и н ) М ОДЕЛИ РО ВАН ИЕ ГИДРОДИНАМ ИКИ М ОДЕЛЬ М аксим альная К ритерии КИНЕТИКИ скорость си н теза оп ти м и зац и и ц елевого белка ПРОЦЕССА Рис.6. Алгоритм масштабного перехода На основе пассивного эксперимента была составлена трехуровневая матрица для двух факторов. За параметр оптимизации было выбрано количество синтезируемого белка в клетках, которое рассчитывалось как произведение массы полученных клеток на процент экспрессии целевого белка.
С учетом рассчитанных коэффициентов уравнение регрессии выглядит следующим образом:
% P = 4, 413 + 0, 288 N + 1,133 A 0, 501 N 2 0, 088 A 2 0, 200 NA (1) где N – число оборотов мешалки (об/мин), A – аэрация (л/лж/мин).
На рисунке 7 представлен результат статистической обработки данных с 15 литрового ферментера. Следует отметить, что рассчитанные значения параметров ведения процесса являются оптимальными для 7 часа синтеза (начало второй стадии), и их следует фиксировать на оставшийся период культивирования.
Рис. 7. Поверхность отклика выходного параметра Оптимальные значения в фер ментере с рабочим объемом 15 литров, которые необ ходимо фиксировать после часов и поддерживать на заданном уровне:
Nopt= 200 об/мин;
Аopt = 0,83 л/лж/мин.
При расчете коэффициента массопередачи кислорода (kLa) были рассмотрены известные зависимости [Кафаров и др., 1979]. При подстановке экспериментальных значений в расчётные формулы были вычислены коэффициенты массопередачи для рассматриваемого процесса. Оценив полученные значения kLa, была выбрана следующая зависимость, которая наиболее точно описывает рассматриваемый синтез:
kLa = 0, 06 (N /V ) (2) 0,8 где (N/V) – удельная мощность.
Исходя из рассчитанных оптимальных значений скоростей мешалки и аэрации, было определено значение коэффициента массопередачи кислорода для этих условий для аппарата объёмом 15 литров на момент времени равном часам kL a = 198ч 1.
Следующим шагом масштабного перехода, следуя алгоритму, представленному на рисунке 6, стало определение оптимальных значений числа оборотов мешалки и скорости подачи воздуха для реакторов объёмом 70 л и 300 л, при условии их геометрического подобия. Кроме того, необходимо соблюсти при расчётах гидродинамическое и массообменное подобие. Подобие гидродинамической обстановки будет показано в главе 4 при использовании компьютерного моделирования гидродинамики. При массообменном подобии аппаратов значение коэффициента массопередачи кислорода «газовая фаза – жидкость» должно поддерживаться, что было использовано в последующих расчётах. Масштабный переход был осуществлён при вышеперечисленных условиях с использованием следующих формул:
(3) N 0 = N p n3 d м где N0–мощность, расходуемая на перемешивание жидкости в аппарате;
Np-число мощности, n–количество оборотов мешалки, d–диаметр мешалки, - вязкость.
При масштабировании соблюдалось условие:
N 01 N (4) = V p1 V p где N01, N02 – расходы мощности на перемешивание, Vр1, Vр2 – объёмы реакторов.
Из критериального соотношения (4) были определены оптимальные значения скорости вращения мешалки для аппаратов объёмом 70 литров и литров, которые необходимо фиксировать на 7 час культивирования и поддерживать эти значения до завершения процесса. Используя формулу для расчёта числа аэрации (5), был рассчитан необходимый расход воздуха:
Q (5) Na = D 2 ап n d м где Q – расход воздуха, Dап - диаметр аппарата, n – частота вращения мешалки, dм – диаметр мешалки.
Результаты вычислений расхода воздуха и скорости вращения мешалки в рассматриваемых аппаратах представлены в виде таблицы 1.
Таблица Рассчитанные значения расхода воздуха и скорости вращения мешалки Параметр процесса Аппарат Аппарат Аппарат 15 литров 70 литров 300 литров Кол-во оборотов мешалки, об/мин 200 151 Кол-во подаваемого воздуха, л//мин 10 39 Полученные значения kLa для 70 и 300 литровых аппаратов совпадали со значением kLa, полученного для биореактора объёмом 15 литров с точностью до 7%.
Правильность результатов предположений и представленных расчётов была подтверждена использованием газового масс-спектрометра ProLine 2000®. При помощи данного прибора были получены профили «дыхательных коэффициентов» - RQ для аппаратов объёмом 15 литров и аппарата объёмом 300 литров. Результаты данного эксперимента, а также формула для расчета представлены на рисунке 8.
ФОРМУЛА РАСЧЁТА КОЭФФИЦИЕНТА RQ GCO2 выд = С(%)CO2 выд выд - С(%)CO2 вх вх GO2 выд = С(%)O2вх вх - С(%)O2выдвыд С(%)CO2 выд выд - С(%)CO вх RQ = С(%)O2вх вх -С(%)O2выдвыд А Б Рис. 8. Данные, полученные при использовании газового масс-спектрометра (А – профиль «дыхательного коэффициента» RQ, Б – формулы для расчётов) Из представленных на рисунке 8 результатов экспериментов видно практическое совпадение профилей «дыхательных коэффициентов» для реакторов с разными объёмами.
Четвёртая глава посвящена моделированию гидродинамики в исследуемых биохимических реакторах и разработке математической модели кинетики процесса.
Моделирование гидродинамики было осуществлено при помощи программного пакета Fluent 6.1. Задача моделирования сводилась к определению основных параметров процесса, влияющих на гидродинамическую обстановку внутри реакторов (таких как плотность жидкости, распределение клеток в объёме аппарата, число оборотов мешалки, подача воздуха), и выбору из имеющегося перечня пакета Fluent уравнений, описывающих процесс.
Картина биохимического реактора объёмом 300 литров представлена на рисунке 9.
Б А Рис. 9. А – Биохимический реактор (объём 300 литров):1-привод мешалки, 2-патрубок выходящего воздуха, 3- корпус аппарата, 4- мешалка, 5-барботёр, 6 – вспомо гательные штуцеры;
Б – геометрия виртуального аппарата, созданная при помощи программного пакета Fluent 6. В результате расчёта уравнений модели, описывающих гидродинамику сплошной фазы с диспергированной фазой, и графической визуализации рассчитанных значений были получены следующие профили распределения частиц в объёме исследуемых аппаратов, которые представлены на рисунке 10.
А Б Рис. 10. А - профиль распределения клеток в аппарате объёмом 15 литров в началь ный момент времени при внесении инокулята в питательную среду;
Б – рас пределение клеток по объёму аппарата спустя 5 секунд пребывания в аппарате.
Таким образом, проведённые расчёты профилей скоростей в исследуемых реакторах различного объёма подтвердили подобие гидродинамической обстановки при определенных в 3 главе скоростей вращения мешалки и подачи воздуха. Кроме того, результаты расчётов позволяют подтвердить возможность использования положений идеального смешения при последующем моделировании кинетики процесса.
При рассмотрении процессов аэробного биосинтеза на удельную скорость роста клеток влияет как концентрация углеродного субстрата, так и количество растворённого кислорода, что в общем случае может быть представлено как:
µ = ( µs ;
µ ) (6) где µ - общая удельная скорость роста клеток;
µ s - удельная скорость роста клеток, зависящая от субстрата;
µ - удельная скорость роста клеток, зависящая от содержания растворенного кислорода в питательной среде.
В данной работе рассмотрен вариант, когда скорость роста клеток не лимитируется концентрацией углеродного субстрата (он находится в избытке) и, следовательно, удельная скорость роста клеток будет определяться, в основном, содержанием в среде растворенного кислорода.
CL µ = µmax (7) K C + CL 1 + Р K iC где µmax – удельная максимальная скорость роста микроорганизмов, ч-1;
СL–текущая концентрация растворенного кислорода, г/л;
КС и KiC – кинетические константы, г/л;
Р – концентрация белка в клетках, г/л.
Модель кинетики процесса была сформирована исходя из условий идеального смешения в биохимическом реакторе и состоит из дифференциальных уравнений, учитывающих изменение концентрации биомассы, концентрации растворенного кислорода в питательной среде и продукта синтеза (белка 2-интерферона) во времени. Система уравнений представлена следующим образом:
dX dt = µ X dС = K L a ( С * С L ) qС X (8) dt 0, если 0 t 7, dP dt = q X K ip X 2, если t (KP X ) P max где Kр, Kip – кинетические константы, г/л;
qC - скорость потребления кислорода клетками, л/ч;
qРmax – удельная максимальная скорость образования продукта, г/ч;
Х – концентрация биомассы, г/л;
С* - равновесная концентрация кислорода при парциальном давлении, г/л.
Скорость потребления кислорода клетками представлена зависимостью:
µX qC = (9) Y XC где YXC – расходный коэффициент, г/г.
С помощью разработанного программного обеспечения в Mathcad 7. была проведена идентификация параметров математической модели и найдены значения кинетических констант и коэффициентов. В качестве начальных условий послужили начальные концентрации биомассы и субстрата в периодическом процессе, протекающем при температуре 32°С: X= 2,010-3 г/л, С* = 7,510-3 г/л, P = 0 г/л. Результаты математического моделирования представлены на рисунке 11:
Рис. 11 Сравнение результатов, полученных при решении мате матической модели и экспери ментальных данных при пери одическом культивировании штамма E.coli – продуцента человеческого рекомбинантного 2-интерферона: 1 – кривая роста клеток;
2 – кривая растворенного кислорода;
3 – концентрация накопленного белка клетками.
Точками обозначены эксперимен тальные данные, прямыми – данные, полученные в ходе решения математической модели.
Решение уравнений модели подтвердило правильность определения коэффициента kLa (полученного с использованием статистического подхода), позволило уточнить начальную концентрацию посевного материала, а также получить спектр кривых, отражающих ход процесса в зависимости от параметров ведения культивирования.
На основании разработанной модели и предложений по масштабированию процесса были осуществлены экспериментальные серии культивирования штамма-продуцента в 300-литровом аппарате. Результаты экспериментов показали, что составленная математическая модель и расчеты полностью удовлетворяют процессу микробиологического синтеза рекомбинантного белка в клетках Escherichia coli на сложнокомпонентных средах.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ 1. Предложена схема и алгоритм масштабирования процессов культивирования в биохимических реакторах, объединяющая в себе несколько подходов (критериальный, статистический, модельный), и позволяющая использовать возможности нового аналитического оборудования для контроля за биотехнологическими процессами в режиме он-лайн с возможностью более точного определения таких важных характеристик процесса как количество потребляемого кислорода клетками и дыхательного коэффициета биореакторов.
2. Оптимизированы основные параметры микробиологического синтеза штамма E.coli, продуцирующего рекомбинантный человеческий 2 интерферон, при росте на сложных многокомпонентных средах, и выявлены основные факторы, определяющие течение процесса.
3. По предложенной методике масштабирования осуществлен масштабный перенос технологии культивирования процесса биосинтеза рекомбинантного белка 2-интерферона клетками E.coli.
4. Благодаря использованному в работе газовому масс-спектрометру ProLine 2000 для анализа отходящей смеси газов из биохимического реактора, был определён дыхательный коэффициент. Полученные результаты подтвердили справедливость предположений и рассчитанных значений при масштабировании процесса.
5. Разработана математическая модель кинетики процесса микробиологического синтеза и программное обеспечение, позволяющие определять максимальный выход белка при различных режимах работы аппарата и уточнять параметры ведения культивирования при различных начальных условиях.
6. Для анализа гидродинамики в биохимическом реакторе был использован программный пакет Fluent, позволяющий оценить гидродинамическую обстановку в аппаратах объёмами 15, 70 и 300 литров.
Экспериментальные и аналитические исследования процесса синтеза белка в биохимических реакторах проводились на базе ЗАО «Биокад» (г.Москва) под руководством к.т.н. Чугунова А.М. и к.б.н. Гончаровой О.В. Аналитические исследования состава сложнокомпонентной среды проводились в ИБФМ РАН (г.Пущино)
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. I. Kazeev., L. Denisov, E. Guseva, N. Menshutina. Investigation and Optimization of Recombinant Proteins Production. // 28th International Exhibition-Congress on Chemical Engineering, Environmental Protection and Biotechnology (ACHEMA-2006): proceeding of congress. – Frankfurt am Main, Germany, 2006.– Т.XXII.– P. 234-238.
2. Зеркаев А.И., Гузев О.Ю., Казеев И.В. Инновационная технология атмосферной сублимационной сушки с активной гидродинамикой для получения фармацевтических порошков с заданной наноструктурой.
Индустрия наносистем и материалы // Всероссийская конференция инновационных проектов аспирантов и студентов: материалы конференции.
– М.: МИЭТ, 2006. – 244 с.
3. Шейченко О.П., Шейченко В.И., Толкачев О.Н., Бочаров Е.В., Казеев И.В., Быков В.А. Применение разностных электронных спектров поглощения в анализе комплексного препарата Фитомикс-40 // Всероссийская научно практическая. конференция "Отечественные противоопухолевые препараты". Российский биотерапевтический журнал. – М. 2006. - Том 5, № 1. – 32 с.
4. Казеев И.В., Воронова Н.И., Гусева Е.В., Меньшутина Н.В. Изучение кинетики синтеза рекомбинантного 2-интерферона в клетках Escherichia coli // Международный конгресс молодых учёных по химии и химической технологии «МКХТ-2007»: матер. конф. - М.:РХТУ им Д.И. Менделеева, 2007. – Т.XXI, №1. – С. 52-57.
5. Казеев И.В., Меньшутина Н.В., Ефанов Ю.Г., Морозов Д.В. Применение газового масс-спектрометра для контроля за процессом культивирования микроорганизмов в биореакторе // Журнал «Химическая промышленность сегодня». – 2008 – №4. – С. 31-35.
6. Казеев И.В., Чугунов А.М., Морозов Д.В. Применение газового масс спектрометра как обязательного элемента при внедрении на предприятии стандартов PAT // Международный конгресс «Биотехнология – состояние и перспективы развития»: матер. конф. – М. 2008. – Т.II, №1. – С. 66-69.