Александр сергеевич участие эндогенных протеинкиназ в сезонной регуляции активности са-атразы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц суслика spermophilus undulatus
На правах рукописи
УДК 577.353.2 Кондрашев-Луговский Александр Сергеевич УЧАСТИЕ ЭНДОГЕННЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ В СЕЗОННОЙ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ Са-АТРазы САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ СУСЛИКА Spermophilus undulatus 03.00.04 – Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2009 2 Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Рубцов Александр Михайлович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Архипенко Юрий Владимирович доктор биологических наук, профессор Шенкман Борис Стивович
Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН
Защита диссертации состоится «» _ 200 года в _ на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 в Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу:
119991, Москва, Воробьевы горы, д.1, стр.12, Биологический ф-т.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.
Автореферат разослан «» _ 200_ г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук М. В. Медведева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
.
Актуальность проблемы. Многие живые организмы обладают способностью переживать неблагоприятные изменения во внешней среде за счет изменения интенсивности метаболических процессов. У млекопитающих подобный процесс, называемый гибернацией (зимней спячкой), часто наблюдается в зимний период, когда снижается температура окружающей среды, сокращается продолжительность светового дня и становится недоступной кормовая база. При этом в организме животного-гибернатора происходит ряд биохимических и физиологических перестроек, направленных на резкое снижение энергопотребления. Температура тела может падать до 0°С и даже несколько ниже (Barnes, 1989), скорость метаболизма уменьшается до 1% от нормальных значений (Geiser, Ruf, 1995), причем характерно, что снижению температуры тела животного предшествует снижение скорости метаболизма (Geiser, 1988;
Heldmaier, Ruf, 1992), что свидетельствует о сложной и скоординированной регуляции основных биохимических процессов в организме гибернаторов.
Гибернация не является непрерывным процессом;
в течение спячки периоды полного оцепенения (бауты спячки) продолжительностью 1,5-2 недели сменяются короткими (20- часов) интербаутами, в течение которых животное пробуждается и за короткий срок восстанавливает уровень своего метаболизма до обычных показателей (Lyman, 1982;
Постникова и др., 1997). Во время баутов спячки тело животного остается неподвижным, частота дыхания падает до 1-2 вдохов в минуту, а пульс до 3-5 ударов в минуту. При этом большая часть мышечного аппарата находится в неактивном состоянии (исключение составляют сердечная мышца, диафрагма и межреберные мышцы, осуществляющие дыхательные движения, и мышцы, поддерживающие характерную позу животного). При пробуждении происходит быстрое восстановление сократительной активности сердца и скелетных мышц. Есть данные, что именно мышечная ткань принимает основное участие в теплопродукции при разогревании животного при пробуждении (Lyman, 1982). При этом мышечная ткань зимоспящих животных обладает целым рядом адаптационных особенностей, позволяющих мышцам функционировать в экстремальных условиях и не только обеспечивающих выживание организма в условиях спячки, но и участвующих в начальном этапе теплопродукции при пробуждении. В частности, при гибернации наблюдаются изменения электромеханических свойств скелетных мышц (Kondo, Shibata, 1984), функциональных свойств миозинов (Morano et al., 1992;
Лукоянова и др., 1996, 1997), содержания миоглобина (Постникова и др., 1997), ADP и ATP (El Hachimi et al., 1989), которые приводят к значительному уменьшению сократительной активности мышц.
Очевидно, что изменения метаболизма, происходящие при зимней спячке, должны затрагивать и саркоплазматический ретикулум (СР) – один из ключевых структурных компартментов миоцита, осуществляющий регуляцию мышечного сокращения и 2+ внутриклеточного обмена Са. Действительно, к настоящему времени накоплен ряд данных об изменениях в структуре и функциональной активности СР животных-гибернаторов. У спящих животных микровязкость мембран СР уменьшается, а гидрофобный объем возрастает (Малышева и др., 2001). Это может объясняться накоплением в мембранах полиненасыщенных жирных кислот, что является необходимым условием выживания животных во время зимней спячки (Пантелеев, 1983). Белковый состав мембран СР также претерпевает значительные изменения. В частности, показаны количественные изменения в содержании ряда основных белковых компонентов (Малышева и др., 2001;
Rubtsov, 2001), а также наличие специфических изоформ ряда белков.
Гибернация сопровождается и существенными изменениями в функциональной активности СР. В СР кардиомиоцитов гибернирующих животных возрастает аккумуляция Са2+ (Belke et al., 1987;
Liu et al., 1997), что может быть связано с изменением активности Са АТРазы СР или свойств Са-связывающих белков СР (Milner et al., 1991). Показано, что активность Са-АТРазы СР скелетных мышц суслика Spermophilus undulatus в зимний период составляет не более 50% от активности фермента летнего активного животного, причем уровень активности белка спящего животного резко возрастает при активации эндогенных протеинкиназ СР (Малышева и др., 2001;
Rubtsov, 2001). Однако детали этого регуляторного механизма оставались невыясненными.
Цель работы заключалась в выяснении участия эндогенных протеинкиназ в регуляции активности Са-АТРазы СР скелетных мышц суслика Spermophilus undulatus. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать спектр белков СР, фосфорилируемых эндогенными протеинкиназами, у активных и спящих животных.
2. Оценить вклад различных эндогенных протеинкиназ в фосфорилирование белков СР.
3. Определить возможный механизм регуляции активности Са-АТРазы СР скелетных мышц суслика эндогенными протеинкиназами.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показано, что препараты СР скелетных мышц суслика Spermophilus undulatus содержат эндогенные протеинкиназы, локализованные преимущественно внутри полостей ретикулума. Определен состав белков, фосфорилируемых протеинкиназами в препаратах СР активных и спящих сусликов, а также проведена количественная оценка уровня фосфорилирования различных белков. Показано, что Са-АТРаза не является мишенью протеинкиназ ни в одном из исследованных препаратов.
Выявлен ингибирующий эффект Са2+ на включение фосфата в белки СР. Показано присутствие в СР суслика казеинкиназы II-го типа. Кроме того, впервые установлено, что именно казеинкиназа II принимает участие в регуляции активности Са-АТРазы при гибернации. Впервые определены спектры белков СР активных и спящих сусликов, являющихся мишенями казеинкиназы II. Кроме того, выявлен ряд белков, связывающихся с Са-АТРазой СР. Идентификация этих белков позволила определить список потенциальных белков-регуляторов активности Са-АТРазы, локализованных в непосредственной близости от молекулы фермента и являющихся мишенями казеинкиназы II. На основании полученных данных предложена модель регуляции активности Са-АТРазы СР скелетных мышц суслика Spermophilus undulatus при гибернации.
Практическая значимость работы. Проведенные исследования значительно расширяют существующие представления как о возможных способах регуляции активности Са-АТРазы СР скелетных мышц во время гибернации, так и о механизмах регуляции функциональной активности СР в целом. Полученные результаты используются при организации экспериментальной работы студентов и аспирантов кафедры биохимии биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на научных семинарах кафедры биохимии биологического факультета МГУ, IX Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2001), Х-th International Conference on Na,K-ATPase and Related Cation Pumps (Эльсинор, Дания, 2002), III съезде Всероссийского биохимического общества (С.-Петербург, 2003), Международных симпозиумах «Biological Motility: Achievements and Perspectives» (Пущино, 2004, 2006, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международной научной конференции «Молекулярные механизмы адаптации» (Махачкала, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.
Структура и объем диссертации.
Работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 123 страницы машинописного текста, 10 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 240 источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные животные. Взрослых сусликов Spermophilus undulatus отлавливали в Якутии и содержали в виварии Института биофизики клетки РАН (Пущино) в индивидуальных клетках при 20-25°С в условиях естественной длины светового дня и стандартного кормления. В ноябре сусликов помещали в темную комнату и содержали при температуре 2-4С. В течение января–февраля зимние спящие суслики декапитировались в середине баута спячки. Материалы летних активных животных получали в июле–августе.
После декапитации скелетные мышцы задних конечностей освобождали от сухожилий и жира, замораживали в жидком азоте и затем хранили при температуре -70°С до использования (до полугода без потери активности Са-АТРазы СР).
Получение микросомальных препаратов СР. Препараты микросом СР получали из скелетных мышц методом дифференциального центрифугирования (Ритов и др., 1977).
Концентрация белка в препаратах СР определяли по методу Лоури в присутствии 1% дезоксихолата натрия (Lowry et al., 1951), используя в качестве стандарта БСА.
Анализ белкового состава препаратов СР проводили с использованием электрофореза в ПААГ по методу Лэммли (Laemmly, 1970), в присутствии додецилсульфата натрия в пластинах ПААГ толщиной 0,75 мм при силе тока 20 мА в концентрирующем и мА в разделяющем гелях, используя 4%-й концентрирующий и 6–20%-й разделяющий градиентный гели (Shorina et al., 1997). Окраску электрофореграмм проводили Кумасси R- либо серебром по стандартным методикам.
Активность Са-АТРазы определяли методом непрерывной регистрации в системе сопряженных ферментативных реакций (пируваткиназа + лактатдегидрогеназа) (Gould et al., 1987). Активность Са-АТРазы регистрировали на спектрофотометре «Hitachi 200–20» при 37°С по изменению оптической плотности при = 340 нм, происходящей в результате снижения концентрации NADH в системе. Реакцию проводили в среде, содержащей 80 мM KCl, 50 мМ MOPS (рН 7,0), 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ СаСl2, 2 мМ РEP, 2,5 мМ АТР (рН 7,0), 0,3 мг/мл NADH, 5 ед PK, 10 ед LDН (концентрация свободного Са2+ составляла мкМ). Концентрации PK и LDН были подобраны так, что бы они не лимитировали АТРазную реакцию. Реакцию начинали добавлением в пробу объемом 1 мл 10 мкг белка CР. Для определения влияния фосфорилирования белков СР протеинкиназами на активность Са АТРазы препараты СР в течение 2-х мин преинкубировали в среде, содержащей 2 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 1 мМ EGTA, 1 мМ PMSF, 10 мМ имидазол и 2 мМ АТР, рН 7,0 при 37°С.
Концентрация белка СР в пробе составляла 1 мг/мл. Затем из пробы отбирали 10 мкл раствора и вносили в кювету для измерения активности Са-АТРазы.
Фосфорилирование белков СР эндогенными протеинкиназами проводили в среде, содержащей 15 мМ трис-НСl (рН = 7,4), 1 мМ DTT, 5 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 0,1 мМ Na3VO4, 5 мМ NaF, 1 мМ pNPP и 1 мМ PMSF (Hawkins et al., 1994;
Пелози, Донелла-Деана, 2000). Реакцию начинали внесением в среду раствора АТР, содержащего [32Р]АТР в расчете 106 распадов в минуту на пробу. Реакцию проводили при температуре 37°С.
Определение уровня включения фосфата в белки СР в результате протеинкиназной реакции проводили методом отбора проб. Из реакционной среды (см. выше) отбирали по мкл для определения удельной радиоактивности АТР. Аликвоты наносили на бумажные фильтры Whatman 3MM (1515 мм) и высушивали на воздухе. В определенные моменты времени отбирали по 6 мкл среды реакции, наносили на фильтры (1515 мм) и фиксировали 20 мин в 10% растворе ТХУ, содержащем 10 мМ Na2P2O7 и 10 мМ NaH2PO4, затем фильтры отмывали от невключившейся метки в растворе того же состава четыре раза по 20 мин при механическом перемешивании. После отмывки фильтры высушивали, помещали во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-106 и просчитывали в фосфорном канале жидкостного сцинтилляционного счетчика «Rackbeta 2114» (Швеция).
Регистрацию включения меченого фосфата в индивидуальные белки СР проводили методом авторадиографии. После проведения электрофореза окрашенные и высушенные гели помещали в авторадиографическую камеру Sigma с флуоресцентным экраном на рентгеновскую пленку Fuji и экспонировали 5-7 дней при температуре -20°C.
Пленку проявляли проявителем, предназначенным для получения максимально контрастного изображения. Полученные авторадиограммы сканировали с разрешением 600 dpi и анализировали с помощью программы Foretix 1D (Nonlinear Dynamics Ltd). Уровень включения метки в индивидуальные белки СР рассчитывали в условных единицах как отношение интегральной оптической плотности пятна на авторадиограмме к интегральной оптической плотности соответствующей белковой полосы на электрофореграмме.
Очистку Са-АТРазы проводили с помощью аффинной хроматографии на Reactive Red 120-агарозе по методу Coll, Myrphy (1984;
1987).
Определение спектра белков, взаимодействующих с Са-АТРазой, проводили с использованием метода ковалентных сшивок. В качестве сшивающего агента применяли бифункциональный сшивающий агент дитиобиссукцинимидилпропионат (DTSP) (Bateman, Nicholson, 1984).
Идентификация белков методом тандемной масс-спектрометрии, сопряженной с ВЭЖХ с нанопотоками (LC-MS/MS), была проведена Р.Х. Зиганьшиным в лаборатории химии пептидов Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика мембранных препаратов СР, использованных в работе. На первом этапе работы мы проанализировали полученные препараты СР скелетных мышц летних активных и зимних гибернирующих сусликов. Результаты измерения выхода белка показали, что во время спячки общее содержание белка в ткани падает (Таблица 1). Активность Са-АТРазы спящего животного оказалась примерно в 2 раза ниже, чем у летнего, что совпадает с результатами проводимых ранее исследований (Малышева и др., 2001;
Rubtsov, 2001).
Анализ белкового состава препаратов СР показал (рис. 1), что по качественному составу препараты СР активных и спящих животных практически идентичны, тогда как количественный состав белков мембран СР при гибернации претерпевает изменения (Таблица 2). Так, содержание белков с молекулярными массами 24, 31, 44 и 55 кДа в препаратах СР, полученных из зимних спящих животных, в 1,5-2,5 раза выше, чем в препаратах СР активных животных. Вместе с тем, препараты СР активных животных обогащены высокомолекулярными белковыми компонентами. В частности, содержание белков с молекулярными массами 450, 350, 165, 130 и 63 кДа, которые на основании литературных данных мы идентифицировали как Са-канал (рианодиновый рецептор) и его протеолитический фрагмент, богатый гистидином Са-связывающий белок, саркалюменин и кальсеквестрин соответственно, в 2–3 раза выше в препаратах СР из активных животных.
Таблица 1. Выход белка СР из скелетных мышц суслика Spermophilus undulatus и Са-АТРазная активность выделенных препаратов саркоплазматического ретикулума.
Летние активные Зимние гибернирующие (n=8) (n=10) 0,85±0,06** Выход белка, мг/г ткани 1,41±0, Активность Са-АТРазы, мкмоль/мин на 0,77±0,04*** 2,15±0, мг белка СР Удельная активность Са-АТРазы, 1,9±0,15*** 3,83±0, мкмоль/мин на мг белка Са-АТРазы В скобках указано количество использованных для анализа препаратов СР.
Звездочками отмечены параметры, величина которых для СР зимних сусликов достоверно отличается от величины параметра для летних животных.
** p0,05 *** p0, Содержание Са-АТРазы в препаратах СР гибернирующих животных несколько ниже, чем у бодрствующих (Таблица 2). В целом, обнаруженные нами различия в белковом составе мембран СР активных и гибернирующих сусликов хорошо согласуются с известными ранее данными (Малышева и др., 2001;
Rubtsov, 2001). Можно также предположить, что изменение белкового состава мембран СР вносит свой вклад в снижение активности этого фермента при гибернации.
Рис. 1. Элетрофореграма белков СР скелетных мышц сусликов, полученная после прокрашивания геля Кумасси R-250. Дорожка 1 – белки–стандарты;
2 – летний активный суслик;
3 – зимний спящий 97 кДа суслик 66,2 кДа 45 кДа 31 кДа 21,5 кДа 14,4 кДа 1 2 Таблица 2. Содержание основных белковых компонентов мембранных препаратов саркоплазматического ретикулума скелетных мышц активных и гибернирующих сусликов.
Содержание белков выражено в процентах от общего количества белка в каждом из препаратов.
Молекулярная масса, кДа Активные (n=8) Гибернирующие (n=10) 450 1,9±0,3 1,0±0, 205 4,9±0,6 3,5±0, 165 1,7±0,5 0,6±0,3* 130 2,0±0,5 0,8±0,2* 105 56,0±8,0 40,0±5,6** 63 10,3±2,0 3,3±1,2*** 55 5,4±2,2 8,7±2, 44 3,8±1,3 11,3±3,1*** 30 10,5±3,0 18,0±5,2** 24 4,5±1,7 11,6±2,0** В скобках указано количество использованных для анализа препаратов СР.
Звездочками отмечены параметры, величина которых для СР зимних сусликов достоверно отличается от величины параметра для летних животных.
* p0,1 ** p0,05 *** p0, Фосфорилирование белков СР. В предварительных экспериментах нами были подобраны оптимальные условия для фосфорилирования белков СР. Авторадиографическое исследование распределения включенного 32Р между различными белками СР показало, что в исследуемых препаратах метка включается в 10-15 индивидуальных белковых полос (рис. 2), причем одни и те же белки у бодрствующих и спящих животных фосфорилируются неодинаково (Таблица 3).
Рис. 2. Фосфорилирование белков СР скелетных мышц летних активных (А) и зимних гибернирующих (Б) сусликов.
Дорожки 1 и 3 – электрофореграммы белков СР летнего активного (дорожка 1) и зимнего спящего (дорожка 3) сусликов, 105 кДа прокрашенные Кумасси R-250. Дорожки и 4 – авторадиограммы соответствующих 63 кДа дорожек.
55 кДа 44 кДа 30 кДа 1 2 3 Проведенные нами расчеты удельного фосфорилирования различных белковых полос показывают, что количество метки, включаемой в белок у спящих и бодрствующих животных, часто не находится в прямой зависимости от содержания белка в СР. Полученные результаты указывают на то, что фосфорилирование одних и тех же белков резко отличается в зависимости от физиологического состояния животного. В частности, высокий уровень включения фосфата у летних животных наблюдается в полосы с молекулярными массами и 35 кДа.
Таблица 3. Уровень включения фосфата (условные единицы) в белки СР летних активных и зимних гибернирующих сусликов. Фосфорилирование проводилось в среде активации эндогенных протеинкиназ в присутствии АТР.
Молекулярная масса, кДа Активные (n=6) Гибернирующие (n=8) 130 1,6±0,2 2,0±0, 98 1,2±0,2 4,8±0,7*** 70 - 1,7±0, 63 1,8±0,35 2,7±0,7* 55 1,4±0,2 0,8±0,1* 44 0,13±0,1 1,5±0,2*** 35 4,5±0,8 0,4±0,1*** 33 - 0,4±0, 30 0,25±0,1 1,3±0,3*** 17 0,5±0,1 0,4±0,1* В скобках указано количество использованных для анализа препаратов СР.
Звездочками отмечены параметры, величина которых для СР зимних сусликов достоверно отличается от величины параметра для летних животных.
* p0,1 *** p0, Особый интерес представляют белковые полосы, уровень включения фосфата в которые в препаратах из гибернирующих животных существенно превышает уровень их фосфорилирования у летних животных. Такими белками являются белки с молекулярными массами 98, 44 и 30 кДа. Кроме того, было установлено, что белки с молекулярными массами 70 и 33 кДа фосфорилируются только в препаратах СР зимних спящих животных и не фосфорилируются у летних активных сусликов.
Подобные различия в фосфорилировании разных белков в препаратах СР сусликов, находящихся в различных стадиях физиологической активности, можно объяснить тесной связью уровня фосфорилирования белка и его функциональной активности, значительно различающейся в разные сезоны. Возможно, что эти различия могут быть обусловлены изменением спектра эндогенных протеинкиназ, осуществляющих фосфорилирование, в зависимости от времени года.
С целью исследования протеинкиназ, присутствующих в препаратах СР, мы проводили инкубацию препаратов СР в присутствии активаторов протеинкиназ разных типов. В качестве активаторов мы использовали активаторы протеинкиназы А сАМР ( мкМ), протеинкиназы G сGМР (100 мкМ), а также активаторы Са/СаМ-зависимых протеинкиназ Са2+ (10 мкМ) и кальмодулин (50 мкг/мл) в присутствии Са2+. Кроме того, для определения локализации протеинкиназ и их белков-субстратов мы инкубировали препараты СР в присутствии неионного детергента Тритона Х100 в концентрации 0,5%. Включение фосфата в белки СР в присутствии различных соединений резко различается (Таблица 4). По сравнению с фосфорилированием контрольных препаратов, включение фосфата в препараты СР при инкубации в присутствии сАМР и cGMP было больше только на 5-10% как для бодрствующих, так и для спящих животных. Наиболее эффективными мишенями протеинкиназ, активируемых добавками циклических нуклеотидов, являются белки с молекулярными массами 70 и 130 кДа. Увеличение уровня включения фосфата в эти белки составляет до 30% от контрольного значения. Вместе с тем, удельное фосфорилирование низкомолекулярных компонентов с молекулярными массами 47, 44, 31 и 24 кДа практически не зависит от наличия циклических нуклеотидов в среде (Таблица 4). Увеличение включения под действием cGMP можно объяснить как активацией сGMP-зависимой протеинкиназы, так и тем, что при концентрациях порядка 100 мкМ сGMP может выступать как аналог сАМР, активируя протеинкиназу А (Lincoln et al., 1995). Однако, вероятно, основной вклад в фосфорилирование белков СР вносят не эти протеинкиназы, а представители протеинкиназ других классов.
Обработка препаратов СР неионным детергентом Тритоном X100 привела к резкому увеличению количества включения фосфата в препараты, причем рост включения метки в препараты СР бодрствующих животных составлял 300-350%, а в препараты из спящих животных – 500-600% от исходного уровня. Возможно, это объясняется тем, что при солюбилизации белков становятся доступны участки фосфорилирования, которые ранее были экранированы либо липидами, либо в результате белок-белковых взаимодействий.
Вероятно также, что при солюбилизации СР протеинкиназы, которые локализованы внутри везикул СР, выходят наружу, что позволяет им фосфорилировать белки-мишени, недоступные для них ранее. Об этом говорит высокий уровень фосфорилирования (в отсутствие детергента) люминальных белков СР саркалюменина (130 кДа) и кальсеквестрина (63 кДа);
Таблица 4. Уровень включения фосфата (условные единицы) в белки СР летних активных и зимних гибернирующих сусликов в присутствии активаторов протеинкиназ.
+Тритон кДа Животные Контроль +Са +Са/СаМ +сAMP +cGMP X Летние 2,9±0,4 - - 2,9±0,8 2,8±0,6 3,6±1, Зимние - - - - - Летние 6,5±1,3 - - 6,4±2,6 7,2±2,1 8,6±4, Зимние 1,6±0,3 - - 1,6±0,8 1,5±0,6 2,2±0, Летние 1,6±0,2 0,2±0,05*** 0,2±0,04*** 2,2±0,8 2,3±1,0 2,8±0,5* Зимние 2±0,2 0,2±0,05*** 0,2±0,05*** 2,5±1,0 2,6±0,8 5±1,5** Летние 1,2±0,2 - - 1,2±0,5 1,3±0,4 16±4,6*** Зимние 4,8±0,7 - - 4,7±1,4 4,9±1,1 22±6,8*** Летние - - - - - Зимние 1,7±0,3 - - 2,1±0,2 2,2±0,8 2,8±1, Летние 1,8±0,35 1,6±0,4 1,5±0,5 1,9±0,5 1,8±0,7 2,3±0, Зимние 2,7±0,7 2,6±0,8 2,6±1,0 2,8±1,1 2,7±1,0 3,8±1, Летние 1,4±0,2 0,6±0,1** 0,5±0,08** 1,4±0,4 1,4±0,4 2±0, Зимние 0,8±0,1 0,3±0,05** 0,2±0,03** 0,8±0,1 0,7±0,1 1±0, Летние 0,13±0,1 0,1±0,03 0,1±0,02 0,13±0,04 0,12±0,03 0,2±0, Зимние 1,5±0,2 0,1±0,02* 0,1±0,03* 1,4±0,3 1,4±0,4 2,9±0, Летние 4,5±0,8 - - 4,5±1,1 4,4±1,2 5±2, Зимние 0,4±0,1 - - 0,4±0,1 0,4±0,05 0,9±0,3* Летние - - - - - Зимние 0,4±0,15 - - 0,4±0,1 0,3±0,05 0,4±0, Летние 0,25±0,1 - - 0,25±0,05 0,3±0,06 0,3±0, Зимние 1,3±0,3 - - 1,3±0,3 1,4±0,2 1,8±0, Летние 0,5±0,1 - - 0,5±0,1 0,5±0,1 0,6±0, Зимние 0,4±0,1 - - 0,4±0,05 0,4±0,1 0,5±0, Звездочками отмечены параметры, величина которых достоверно отличается от значений в контроле.
* p0,1 ** p0,05 *** p0, можно полагать, что и остальные фосфорилируемые в отсутствие Тритона Х100 белки (55, 44, 33 и 31 кДа) также локализованы внутри полостей ретикулума. Фосфорилируемый в присутствии Тритона Х100 белок с молекулярной массой 98 кДа, скорее всего, является фосфорилазой, которая может связываться с мембранами СР (Han et al., 1992). Увеличение уровня фосфорилирования люминальных белков СР в присутствии Тритона Х100 может быть связано с увеличением их доступности для протеинкиназ, например, в результате разрушения детергентом олигомерных комплексов этих белков (Szegedi et al., 1999).
Необходимо отметить, что в присутствии Тритона Х100, как и в его отсутствие, не наблюдается фосфорилирования Са-АТРазы СР (Таблица 4).
Инкубация препаратов СР в присутствии ионов Са2+ приводит к снижению уровня включения метки до 10-15% от исходного уровня. Преинкубация в присутствии Са2+ и кальмодулина также приводила к значительному ингибированию включения фосфата в препараты СР (до 15-17% от исходного уровня). При этом наблюдалось снижение уровня включения P практически во все фосфорилируемые белки препаратов СР как летних активных, так и зимних гибернирующих сусликов (Таблица. 4). Практически без изменений остается только уровень фосфорилирования кальсеквестрина (63 кДа). По-видимому, в препаратах СР скелетных мышц сусликов Са/кальмодулин-зависимая протеинкиназа отсутствует. Более того, эндогенная протеинкиназная активность этих препаратов ингибируется Са2+. Можно также предположить, что Са2+ активирует присутствующие в СР эндогенные протеинфосфатазы (Cohen P, 1989). Однако проведенные нами исследования Са2+ показали, что добавление микромолярных концентраций к предварительно фосфорилированным препаратам СР в наших условиях приводило к незначительному (не более 15 % от первоначального уровня фосфорилирования) снижению уровня включения 32Р в белки ретикулума. Столь сильный ингибирующий эффект Са2+ может быть связан либо с тем, что связывание ионов Са2+ белками-мишенями протеинкиназ может приводить к конформационным перестройкам, блокирующим участки фосфорилирования этих белков, либо с тем, что Са2+ ингибирует эндогенные протеинкиназы в СР скелетных мышц сусликов.
Определение локализации протеинкиназ. Для определения локализации протеинкиназ мы проводили анализ фосфорилирования экзогенно добавленного субстрата казеина, а также исследовали влияние на уровень фосфорилирования непроникающего через мембрану ингибитора протеинкиназ гепарина. В низких концентрациях (10 мкМ) гепарин ингибирует, преимущественно, казеинкиназу II-го типа, а в более высоких (100 мкМ) неспецифически ингибирует большинство протеинкиназ (Mitev et al., 1994). Было обнаружено, что добавление гепарина к препаратам СР в обеих концентрациях практически не влияет на уровень фосфорилирования белков СР (рис. 3), что подтверждает наше заключение о локализации протеинкиназ преимущественно внутри полостей СР. В присутствии Тритона Х100, который резко увеличивает уровень фосфорилирования белков СР, гепарин эффективно ингибировал фосфорилирование: в присутствии 10 мкМ гепарина уровень фосфорилирования снижался до значений, наблюдаемых в отсутствие Тритона Х 100, а в присутствии 100 мкМ ингибитора включение метки снижалось еще примерно в раза (рис. 3). Это говорит о том, что эндогенные протеинкиназы преимущественно локализованы внутри везикул СР, причем значительная часть эндогенной протеинкиназной активности, по-видимому, приходится на долю казеинкиназы II-го типа.
Включение фосфата вбелки СР, %% к контролю 600 Летние активные(n=5) Зимние гибернирующие (n=7) Контроль + 10 мкМ + 100 мкМ + Tритон X100 + Tритон X100 + Тритон X гепарин гепарин + 10 мкМ + 100 мкМ гепарин гепарин Рис. 3. Влияние гепарина на включение фосфата в препараты СР скелетных мышц суслика. Уровень фосфорилирования нормировался к контролю для каждой группы.
160 Летние активные (n=6) Зимние гибернирующие (n=7) Включение фосфата в белки СР, %% к контролю Контроль + казеин + казеин + 10 мкМ + казеин + 100 мкМ гепарин гепарин Рис. 4. Фосфорилирование экзогенно добавленного казеина протеинкиназами препаратов СР скелетных мышц сусликов и влияние гепарина на фосфорилирование. Уровень фосфорилирования нормировался к контролю для каждой группы.
Анализ фосфорилирования экзогенно добавленного казеина показал, что он слабо фосфорилируется эндогенными протеинкиназами СР, а внесение в инкубационную среду гепарина не оказывает существенного влияния на уровень фосфорилирования (рис. 4).
Незначительное (около 30% от исходного уровня) фосфорилирование экзогенного казеина может быть связано с активностью протеинкиназ, заякоренных на наружной поверхности мембран везикул СР.
В присутствии тритона Х100 экзогенно добавленный казеин становится доступным субстратом для эндогенных протеинкиназ СР (рис. 5). Увеличение включения метки в этих условиях составило 200-300% (от исходного уровня фосфорилирования). Добавление гепарина существенно снижало уровень включения метки в препараты.
900 Летние активные (n=5) 800 Зимние гибернирующие (n=7) Включение фосфата в белки СР, %% к контролю Контроль + Тритон X100 + казеин + Тритон X100 + Тритон X100+ Тритон X + казеин + казеин + 10 + казеин + мкМ гепарин мкМ гепарин Рис. 5. Фосфорилирование экзогенно добавленного казеина протеинкиназами препаратов СР скелетных мышц сусликов в присутствии Tритона X100 и влияние гепарина на фосфорилирование.
Уровень фосфорилирования нормировался к контролю для каждой группы.
Влияние фосфорилирования на активность Са-АТРазы. Отличительной чертой казеинкиназы II-го типа является возможность использовать в качестве донора фосфата при фосфорилировании не только АТР, но и GTP. Поэтому для определения роли казеинкиназы II в регуляции активности Са-АТРазы были проведены эксперименты по определению влияния GTP-зависимого фосфорилирования на активность Са-АТРазы. В качестве контроля было исследовано влияние АТР-зависимого фосфорилирования на активность Са-АТРазы, а также влияние на активность Са-АТРазы присутствия в среде активации эндогенных протеинкиназ специфического ингибитора казеинкиназы II-го типа 5,6-дихлор-1-бета-D рибофуранозилбензимидазола (DRB) (Zandomeni et al., 1984).
Как видно из рис. 6, активность Са-АТРазы в СР летних животных в два раза превосходит активность фермента спящих сусликов. Инкубация препаратов СР в среде активации эндогенных протеинкиназ в присутствии АТР приводит к значительному росту активности белка у зимних животных и практически не сказывается на активности Са АТРазы летних сусликов. Аналогичная картина наблюдается и в присутствии в среде активации эндогенных протеинкиназ GTP. Активность Са-АТРазы СР у активных животных не изменяется, но у спящих животных возрастает до уровня, сопоставимого с уровнем активности Са-АТРазы бодрствующих сусликов, что хорошо согласуется с ранее полученными данными (Малышева и др., 2001). Присутствие в среде активации эндогенных 4, Летние активые (n=6) Зимние гибернирующие (n=6) 3, Активность Са-АТРазы, пмоль/мин на мг белка 2, 1, 0, 1 2 3 4 Рис. 6. Влияние преинкубации СР скелетных мышц в среде активации эндогенных протеинкиназ на активность Са-АТРазы скелетных мышц сусликов. 1 – активность Са-АТРазы без преинкубации, 2 – преинкубация в присутствии АТР, 3 – преинкубация в присутствии ATP и DRB, 4 – преинкубация в присутствии GTP, 5 – преинкубация в присутствии GTP и DRB.
протеинкиназ DRB полностью подавляло эффект активации Са-АТРазы в препаратах СР, выделенных из гибернирующих животных и не оказывало влияния на активность Са-АТРазы активных сусликов вне зависимости от того, какой нуклеозидтрифосфат использовался в качестве донора фосфата. Таким образом, полученные нами результаты позволяют заключить, что регуляция активности Са-АТРазы СР скелетных мышц у гибернирующего суслика S. undulatus осуществляется путем фосфорилирования регуляторного белка (либо белков) казеинкиназой II.
Определение роли казеинкиназы II в фосфорилировании белков СР. При АТР зависимом фосфорилировании включение фосфата в белки СР имеет место в препаратах СР обоих типов, причем уровень фосфорилирования летних препаратов несколько выше, чем зимних, что согласуется с ранее проведенными экспериментами (рис. 7).
Летние активые (n=5) Зимние гибернирующие (n=6) Включение фосфата, пмоль/мг белка СР 1 2 3 Рис. 7. Включение фосфата в белки СР скелетных мышц летних активных и зимних гибернирующих сусликов. 1 – фосфорилирование в среде активации эндогенных протеинкиназ в присутствии в качестве донора фосфата АТР, 2 – в присутствии GTP, 3 – в присутствии АТР и DRB, 4 – в присутствии GTP и DRB.
При использовании в качестве донора фосфата GTP включение фосфата так же имело место как в препаратах СР активных животных, так и спящих, причем уровень фосфорилирования практически не отличался у животных с разной степенью физиологической активности. Возможно, причиной этого может являться то, что изменения белкового состава препаратов СР при переходе от бодрствования к зимней спячке в большей степени носят не качественный, а количественный характер. При этом содержание части белков не подвержено сезонным изменениям. Возможно, именно к этой группе белков могут относиться и регуляторные белки Са-АТРазы, предположительно фосфорилируемые казеинкиназой II. Вместе с тем, уровень суммарного фосфорилирования белков СР при использовании в качестве донора фосфата GTP был примерно в полтора раза ниже уровня АТР-зависимого фосфорилирования, что свидетельствует о присутствии в полостях СР помимо казеинкиназы II других протеинкиназ.
Введение в среду фосфорилирования ингибитора казеинкиназы II DRB привело к снижению АТР-зависимого фосфорилирования препаратов СР как активных, так и гибернирующих животных примерно на 35%. GTP-зависимое фосфорилирование в присутствии DRB ингибировалось на 80 %. Возможно, это можно объяснить тем, что часть белков, фосфорилируемых казеинкиназой II, является также мишенями протеинкиназ других типов.
Таблица 5. Уровень включения фосфата (условные единицы) в белки СР летних активных и зимних гибернирующих сусликов. Фосфорилирование проводилось в среде активации эндогенных протеинкиназ в присутствии GTP.
Контроль + DRB кДа Летние активные Зимние Летние активные Зимние гибернирующие гибернирующие 98 2,0±0,1 8,0±1,2 1,0±0,2* 2,3±1,2** 63 2,5±0,8 3,0±0,5 1,0±0,2** 1,2±0,5** 55 - 4,0±1,2 - 1,2±0,6* 44 0,8±0,2 1,1±0,4 0,4±0,1* 0,3±0,1** 30 0,15±0,08 4,0±0,8 0,04±0,02*** 0,8±0,2*** 17 0,5±0,1 0,3±0,1 0,2±0,1* 0,15±0,05* Звездочками отмечены параметры, величина которых достоверно отличается от контрольных значений. *p0,1 ** p0,05 *** p0, Авторадиографическое исследование с использованием в качестве донора фосфата [32Р]GТР показало, что казеинкиназа II фосфорилирует в препаратах СР не менее семи индивидуальных белковых полос, причем уровень включения фосфата в эти белки существенно различается в зависимости от степени физиологической активности животного (Таблица 5). Практически все белки лучше фосфорилируются в препаратах СР спящих сусликов. Видимо, это объясняется тем, что при гибернации эти белки находятся в дефосфорилированном состоянии. Вместе с тем, ранее описанный опыт с GTP-зависимой активацией Са-АТРазы спящих сусликов позволяет предположить, что именно фосфорилирование казеинкиназой II какого-либо белка-регулятора Са-АТРазы может обратимо влиять на уровень ее активности.
Выявление белков, взаимодействующих с Са-АТРазой. Препараты СР были обработаны бифункциональным сшивающим агентом DTSP, после чего очищены путем аффинной хроматографии. После элюции и разрушения сшивающего агента оказалось, что Са-АТРаза СР скелетных мышц активных сусликов связывается с белками с молекулярными массами 63, 55, 44, 35 и 30 кДа, а у спящих животных – 63 и 55 кДа (рис. 8). Учитывая данные экспериментов по определению белков-мишеней казеинкиназы II, можно предположить, что белками, способными регулировать активность Са-АТРазы СР скелетных мышц животных-гибернаторов, могут являться белки с молекулярными массами 63, 55, 44 и 30 кДа, которые являются мишенями казеинкиназы II и способны связываться с молекулой Са-АТРазы.
Рис. 8. Фракции препаратов СР скелетных мышц летних активных (А) и зимних гибернирующих (Б) сусликов, обработанные бифункциональным сшивающим агентом DTSP, элюируемые с колонки с Reactiv RED-120 агарозой.
105 кДа Дорожки 1 и 4 – электрофореграммы препаратов СР сусликов. Дорожки 2 и 5 – 63 кДа 55 кДа фракции, элюируемые с колонки 44 кДа имидо-АТР, дорожки 3 и 6 – те же фракции после обработки разрушающим 30 кДа сшивку агентом (-меркаптоэтанолом) 1 2 3 4 5 Идентификация белков, взаимодействующих с Са-АТРазой и являющихся мишенями казеинкиназы II показала, что в интересующих нас белковых полосах присутствуют белки, ассоциированные с внешней поверхностью мембраны СР (44 кДа, креатинкиназа), и люминальные белки СР (63 и 55 кДа), которые представляли для нас основной интерес. Белок с молекулярной массой 30 кДа идентифицировать пока не удалось.
Белок с молекулярной массой 63 кДа был идентифицирован как кальсеквестрин. Этот белок играет роль главного внутриретикулярного Са-буфера, а также участвует в регуляции Са-каналов СР, входя в состав олигомерного белкового комплекса вместе с другими белками (джанктин, триадин) (Yano, Zarain-Herzberg, 1994;
Zhang et al., 1997;
Gyrke et al., 2004).
Роль кальсеквестрина в регуляции активности Са-АТРазы пока не была показана.
Поскольку аминокислотная последовательность кальсеквестрина суслика пока неизвестна, мы проанализировали ряд известных последовательностей кальсеквестрина млекопитающих на консервативность первичной структуры и на наличие потенциальных участков фосфорилирования казеинкиназой II. Мы сравнивали аминокислотные последовательности мышечных изоформ кальсеквестрина мыши, человека, быка и кролика (tr|Q6P3C3|Q6P3C3_MOUSE;
tr|B2R863|B2R863_HUMAN;
tr|Q05JF3|Q05JF3_BOVIN;
sp|P07221|CASQ1_RABIT). Анализ показал, что все четыре проанализированные последовательности являются высококонсервативными: существенные различия в первичной последовательности наблюдаются только в N-концевом фрагменте и в длине поли-Asp фрагмента на С-конце молекул. Замены в средней части молекул носят консервативный характер. Это позволяет предположить, что и кальсеквестрин суслика имеет сходное строение.
Мы проанализировали эти четыре белка на наличие потенциальных участков фосфорилирования казеинкиназой II. Анализ показал, что все исследованные белки имеют в своем составе 5 остатков серина и 3 остатка треонина, являющихся потенциальными мишенями казеинкиназы II, причем все эти остатки консервативны для всех проанализированных последовательностей и находятся в высококонсервативной средней части молекулы белка. В литературе есть данные о том, что кальсеквестрин является мишенью казеинкиназы II в скелетных мышцах кролика и сердце собаки (Cala, Jones, 1991).
Таким образом, мы вправе предположить, что и кальсеквестрин в полостях СР суслика также может фосфорилироваться казеинкиназой II.
При анализе полосы с молекулярной массой 55 кДа были получены пептиды, идентифицированные как фрагменты молекулы белка саркалюменина. Саркалюменин представляет собой один из основных Са-связывающих белков СР, существующий в виде двух изоформ с молекулярными массами 55 и 130 кДа, которые являются, по-видимому, результатом альтернативного сплайсинга одного гена и локализованы в ретикулуме в области продолговатых трубочек, которые являются также и местом локализации Са-АТРазы.
Нами были проанализированы первичные последовательности «коротких» и «длинных» изоформ саркалюменина из кролика, мыши и человека. (sp|P13666 2|SRCA_RABIT/sp|P13666|SRCA_RABIT;
sp|Q7TQ48-2|SRCA_MOUSE/ tr|A6H5Y7|A6H5Y7_ MOUSE;
sp|Q86TD4-2|SRCA_HUMAN/sp|Q86TD4|SRCA_HUMAN). Анализ аминокислотных последовательностей показал, что все изоформы имеют небольшой консервативный домен на N-конце молекулы (около 22 а.к.о.), и большой высококонсервативный С-концевой домен.
Между этими доменами находится обширная видоспецифичная вариабельная область, присутствующая только в «длинных» изоформах белков.
Поиск аминокислотных остатков, являющихся потенциальными мишенями казеинкиназы II показал, что в консервативных доменах, общих для «коротких» и «длинных» изоформ саркалюменина, находятся высококонсервативные остатки серина (2 остатка) и треонина (3 остатка), которые могут фосфорилироваться казеинкиназой II. Вместе с тем, большое количество остатков, с большой вероятностью фосфорилируемых казеинкиназой II находится также и в вариабельной области «длинных» изоформ белков.
Таким образом, мы можем предположить, что в СР суслика содержится 2 изоформы саркалюменина, отличающиеся по молекулярной массе и способности связывать Са2+.
Вместе с тем, учитывая высокую гомологию в консервативных доменах изоформ 2 из разных объектов, мы вправе допустить, что изоформа 2 саркалюменина скелетных мышц суслика имеет участки фосфорилирования казеинкиназой II.
Необходимо отметить, что возможность фосфорилирования сердечной изоформы саркалюменина эндогенной казеинкиназой II была показана ранее, причем это является одним из путей регуляции активности Са-канала сердечной мышцы (Hadad et al., 1999).
Кроме того, известно, что казеинкиназа II способна фосфорилировать саркалюменин в СР скелетных мышц кролика (Shoshan-Barmatz et al., 1996).
Обращает на себя внимание и тот факт, что у гибернирующего суслика содержание белка с молекулярной массой 130 кДа снижается, а белка 55 кДа увеличивается (рис. 1, Таблица 2). Возможно, это свидетельствует о зависимости синтеза различных изоформ от физиологического состояния животного.
Таким образом, полученные нами данные позволяют предполагать, что наиболее реальными кандидатами на роль эндогенных регуляторов активности Са-АТРазы СР скелетных мышц при гибернации являются кальсеквестрин и саркалюменин. Оба эти белка присутствуют в СР, связываются с Са-АТРазой и содержат остатками Ser и Thr, являющимися потенциальными мишенями для фосфорилирования казеинкиназой II-го типа. Кроме того, показано, что известные в настоящее время регуляторные свойства этих белков обусловлены их фосфорилированием или дефосфорилированием протеинкиназами или протеинфосфатазами.
Исхода из полученных нами данных, можно предположить, что возможная схема регуляции активности Са-АТРазы животных-гибернаторов имеет следующий вид:
регуляторный белок в дефосфорилированном состоянии связан с молекулой Са-АТРазы и ингибирует ее активность, вероятно, за счет стерических ограничений конформационной подвижности люминального домена Са-АТРазы. При фосфорилировании связь регуляторного белка и молекулы АТРазы не нарушается, однако конформация белка претерпевает изменения, при которых он теряет способность ингибировать Са-АТРазу.
Выводы:
1. В препаратах саркоплазматического ретикулума скелетных мышц суслика присутствует эндогенная протеинкиназная активность. Фосфорилирование белков ретикулума эндогенными протеинкиназами приводит к активации Са-АТРазы в ретикулуме гибернирующего суслика.
2. Эндогенные протеинкиназы локализованы преимущественно внутри полостей ретикулума. Около 50% протеинкиназной активности приходится на долю казеинкиназы II. Са-АТРаза не является субстратом эндогенных протеинкиназ ретикулума.
3. Фосфорилирование белков ретикулума казеинкиназой II приводит к активации Са АТРазы саркоплазматического ретикулума гибернирующего суслика.
4. Белки с молекулярными массам 63, 55, 44 и 30 кДа, являющиеся субстратами казеинкиназы II, сшиваются с Са-АТРазой в присутствии бифункционального сшивающего агента дитиобиссукцинимидилпропионата.
5. Наиболее вероятными белками, фосфорилирование которых казеинкиназой II может участвовать в сезонной регуляции активности Са-АТРазы, являются кальсеквестрин и саркалюменин.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Кондрашев-Луговский А.С., Малышева А.Н., Лопина О.Д., Рубцов А.М. Роль фосфорилирования белков мембран саркоплазматического ретикулума скелетных мышц суслика Spermophilus undulatus эндогенными протеинкиназами в регуляции активности Са АТРазы. В сб. «III съезд биохимического общества» (С.-Петербург, 26 июня – 1 июля года) Тезисы научных докладов // С.-Петербург, 2002. –С.82- 2. Kondrashev-Lugovskii A.S., Malysheva A.N., Storey K.B., Lopina O.D., Rubtsov A.M.
Seasonal changes of Ca-ATPase activity in skeletal muscle sarcoplasmic reticulum of the ground squirrel Spermophilus undulatus. In «Na,K-ATPase and related cation pumps. Structure, function and regulatory mechanisms» (Elsinor, Denmark, 8-14 august 2002). Ann. N.Y. Acad. Sci, April 2003, 986, S.550- 3. Malysheva A.N., Kondrashev-Lugovskii A.S., Lopina O.D., Rubtsov A.M.. Seasonal changes of protein phosphorylation in skeletal muscle sarcoplasmic reticulum of the ground squirrel Spermophilus undulatus by endogenous protein kinases. In. International symposium «Biological motility» (Pushchino, 2004) // S. 4. Кондрашев-Луговский А.С., Малышева А.Н., Стори К.Б., Лопина О.Д., Рубцов А.М..
Фосфорилирование белков саркоплазматического ретикулума скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus эндогенными протеинкиназами // Биологические мембраны, 2004. Т.21(6).-С.466- 5. Kondrashev-Lugowsky A.S., Lopina O.D., Rubtsov A.M.. Protein phosphorylation as a way of the regulation of Ca-ATPase activity in skeletal muscle sarcoplasmic reticulum of hibernator, the ground squirrel Spermophilus undulatus. В сб. «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» сборник материалов юбилейной конференции, посвященной 70-летию основоположника российской школы биоэнергетики академика Владимира Петровича Скулачева (Москва, 21-23 февраля 2005 года) // Москва, МГУ, 2005. –С. 6. Kondrashev-Lugovskii A.S., Shcheglova M.V., Lopina O.D., Rubtsov A.M..
Phosphorylation and proteinprotein interactions in the regulation of sarcoplasmic reticulum Ca ATPase activation in hibernating animals. In. International symposium «Biological motility» (Pushchino, 2006) // S.48- 7. Рубцов А.М., Лопина О.Д., Лерхендорф А.Ю., Кондрашев-Луговский А.С. Сезонные изменения в мембранах саркоплазматического ретикулума скелетных мышц гибернирующих млекопитающих. В сб. XX съезд физиологического общества имени И.П.Павлова (Москва, 4 8 июня 2007 года). Тезисы докладов // Москва, 2007. –С. 8. Kondrashev-Lugowsky A.S., Lopina O.D., Rubtsov A.M.. The role of protein kinases in the regulation of activity of Ca-ATPase of sarcoplasmic reticulum of skeletal muscles of typical hibernator Spermophilus undulatus. International symposium «Biological motility. Achievements and perspectives» (Pushchino, 2008) // S.156- 9. Кондрашев-Луговский А.С., Лопина О.Д., Рубцов А.М. Роль протеинкиназ в регуляции активности Са-АТРазы саркоплазматического ретикулума (СР) скелетных мышц животных-гибернаторов. В сб. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая 2008 года) // Новосибирск, 2008.-С. 10. Рубцов А.М., Лопина О.Д., Басевич Е.В., Кондрашев-Луговский А.С. Сезонные изменения активности мембранных ион-транспортирующих АТРаз в скелетных мышцах и почках гибернатора, суслика Spermophilus undulatus. В сб. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая 2008 года) // Новосибирск, 2008.-С. 11. Кондрашев-Луговский А.С., Лопина О.Д., Гончарона Н.Ю., Рубцов А.М. Регуляция активности Са-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц гибернирующего суслика Spermophilus undulatus эндогенными протеинкиназами. В сб. Международная научная конференция «Молекулярные механизмы адаптации» (Махачкала, 30-31 октября 2008 года). Сборник статей // Махачкала, 2008.-С.41-