Иван валерьевич изучение нового семейства генов su(mg) у drosophila melanogaster.
На правах рукописи
УДК 575.22:595.773.4 КРИВЕГА ИВАН ВАЛЕРЬЕВИЧ Изучение нового семейства генов su(mg) у Drosophila melanogaster.
03.00.26 – молекулярная генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2007
Работа выполнена в группе «Молекулярной генетики дрозофилы» Института биологии гена РАН.
Научный консультант:
кандидат биологических наук Головнин Антон Клеменсович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Глазков Михаил Васильевич кандидат биологических наук Краснов Алексей Николаевич
Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.
Защита диссертации состоится _ 2007 года, в _ часов на заседании Диссертационного совета _ при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва., ул Вавилова, д.34/5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке. Института молекулярной биологии им.
В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д.32.
Автореферат разослан: 2007 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета, канд. фарм. наук Грабовская Л.С.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Экспрессия гена регулируется при помощи различных цис- и транс-регуляторных элементов. К цис-регуляторным элементам относятся последовательности ДНК, непосредственно прилежащие к генам, так называемые промоторы, и дистально расположенные энхансеры и сайленсеры. Большинство энхансеров не обладает специфичностью по отношению к промоторам, следовательно должна существовать система, ограничивающая активность энхансера только «правильным» промотором. Предполагается, что в функционировании данной системы значительную роль могут играть инсуляторы. Инсулятор представляет собой последовательность ДНК, которая, находясь между энхансером и промотором, ограничивает их взаимодействие. Таким образом, инсуляторы выполняют важную функцию регуляции транскрипции, определяя какой энхансер должен активировать данный промотор.
На настоящий момент механизм действия инсуляторов полностью не изучен.
Существует несколько моделей их функционирования, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки, но практически все они предполагают связь работы инсулятора с ядерной периферией и белками ядерного матрикса. К сожалению, до сих пор не выявлены конкретные белки, входящие в эти ядерные структуры и одновременно влияющие на работу инсулятора. Это направление исследований представляет большой интерес, так как рассматривает инсуляцию как составную часть глобального процесса регуляции транскрипциии в ядре в целом. Выяснение функциональных связей между процессом инсуляции и белками ядерного матрикса позволит понять роль инсуляторов в образовании различных областей ядра: с повышенной и пониженной активностью транскрипции.
В представленной работе было продолжено изучение широко известного Su(Hw) зависимого инсулятора, впервые обнаруженного в последовательности ретротранспозона МДГ4 у Drosophila melanogaster. Известно, что инсулятор Su(Hw) способен блокировать более 30 известных энхансеров, работающих в разных тканях и на разных этапах развития.
Белковый комплекс инсулятора Su(Hw) состоит из трех известных на данный момент белков: связывающегося с ДНК белка Su(Hw), белка Mod(mdg4) и недавно открытого белка CP190. Мутация в гене mod(mdg4) нарушает связывание кодируемого им белка Mod(mdg4)67.2 с инсуляторным комплексом. Отсутствие белка Mod(mdg4)67.2 приводит к нарушению инсуляции в различных модельных системах. Недавно в нашей лаборатории была обнаружена группа генов su(mg) (suppressor of mod(mdg4)), мутации в которых приводили к восстановлению Su(Hw)-зависимой инсуляции даже при отсутствии белка Mod(mdg4)67.2. Один из клонированных генов группы su(mg) кодирует белок EAST, который, как предполагается, является компонентом ядерного матрикса. Изучение свойств и функций этого белка позволит более детально понять связь между инсуляцией, ядерным матриксом и транскрипцией.
Цель и задачи исследования Основной целью данной работы является изучение структуры и функций гена из семейства su(mg), который кодирует белок EAST.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Изучить генетические взаимодействия между геном east и генами, кодирующими белки, входящие в состав инсуляторного комплекса Su(Hw).
2. Найти в составе ретортранспозона МДГ4 последовательность, отвечающую за проявление эффектов гена east.
3. Доказать существование молекулярных взаимодействий между белками EAST, CP60 и белками инсуляторного комплекса.
Научная новизна и практическая ценность работы. В представленной работе впервые было продемонстрировано непосредственное участие в составе инсуляторного комплекса белка CP60, который считается компонентом ядерного матрикса. Впервые было показано прямое взаимодействие белков СP60 и EAST, при этом белок EAST является также одним из возможных компонентов ядерного матрикса.
Также было показано, что для проявления эффектов гена east в изучаемой модельной системе, необходимы последовательности инсулятора Su(Hw) и длинного концевого повтора из ретротранспозона МДГ4.
Полученные генетические данные позволяют выдвинуть гипотезу о том, что белок EAST является компонентом неизвестной ранее системы репрессии генов, находящихся в эухроматиновых районах генома.
Таким образом, в представленной работе впервые было показано наличие функциональных и физических взаимодействий между белками инсуляторного комплекса и белками, предположительно входящими в состав ядерного матрикса, - EAST и СP60.
Полученные в данной работе результаты позволяют лучше понять организацию транскрипции в ядре в целом и выявить области ядра с разным уровнем генной активности, что может быть полезно для создания стабильно экспрессирующих продуцентов.
Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции "Nuclear Structure & Dynamics" (Монпелье, Франция, 2007) и на 10-ой школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2006).
Публикации По теме диссертации опубликованы две научные статьи и тезисы, представленные на двух конференциях.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на _ страницах, включает _таблиц и 25 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 250 источников.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Изучение влияния гена east на функционирование инсулятора в системе аллеля y Ранее были обнаружены две слабые мутации в гене east, относящемся к семейству генов su(mg): eastP1 и eastP2 (Bezborodova et al., 1997). Эти мутации вызваны встраиванием Р-элемента в промоторную область гена и приводят к незначительному снижению уровня экспрессии.
Для изучения того, как ген east влияет на функционирование Su(Hw) инсулятора, были получены две линии Drosophila melanogaster. В линии y eastP1 w, где гены yellow и white были полностью инактивированы, концентрация белка EAST снижалась благодаря наличию мутации. В другой линии yw;
Р{east+;
w}/CyO;
P{east+;
w}/TM6,Tb, где гены yellow и white также были инактивированы, концентрация белка EAST значительно возрастала из-за присутствия конструкции, содержащей геномную последовательность гена east.
В качестве модельной системы для изучения участия белка EAST в инсуляции была использован аллель у2. Мутация у2 вызвана встраиванием ретротранспозона МДГ4 между энхансерами, отвечающими за экспрессию гена yellow в теле и крыльях, и промотором этого гена. В результате мухи имеют желтые тело и крылья, так как входящий в состав МДГ4 инсулятор Su(Hw) блокирует взаимодействие между энхансерами и промотором гена. Однако экспрессия гена yellow в щетинках не нарушена, поскольку соответствующий энхансер находится в интроне гена и не блокирован инсулятром. Поэтому у мух фенотипа у2 щетинки полностью окрашены.
Скрещивание линии у2 с линией y eastP1 w не влияет на экспрессию гена yellow.
Однако при введении одной или двух дополнительных копий гена east в линию у наблюдается почти полная репрессия гена yellow в щетинках. Эффект гиперэкспрессии гена east не проявляется на диком аллеле y+. Таким образом последовательность ретротранспозона МДГ4 необходима для проявления эффектов гена east.
Мутация mod(mdg4)u1 нарушает связывание белка Mod(mdg4)67.2, одного из компонентов инсуляторного комплекса, с инсулятором Su(Hw). В линии у2;
mod(mdg4)u1/ mod(mdg4)u1 наблюдается почти полная репрессия гена yellow в щетинках мух и частичное снятие инсуляции в абдоминальных сегментах брюшка (Georgiev and Kozycina, 1996).
Дестабилизация инсуляторного комплекса на фоне мутации mod(mdg4)u1 превращает аллель у2 в чувствительную тест-систему, позволяющую генетическими методами обнаруживать белки, влияющие на работу инсулятора Su(Hw).
Комбинация мутации eastP1 и mod(mdg4)u1 на фоне аллеля y2 приводит к восстановлению экспрессии гена yellow в щетинках и абдоминальных сегментах брюшка.
Гиперэкспрессия гена east, совмещенная с мутацией mod(mdg4)u1, на фоне аллеля y приводит к почти полной репрессии гена yellow – абдоминальные сегменты брюшка и щетинки не окрашены. Для подтверждения функциональности линии yw;
Р{east+;
w}/CyO;
P{east+;
w}/TM6,Tb был проведен эксперимент по «спасению фенотипа». Одновременное сочетание мутации eastP1 и гиперэкспрессии гена east в линии y2;
mod(mdg4)u1/mod(mdg4)u приводило к репрессии гена yellow в щетинках и вариабельной окраске брюшка. Таким образом, мутация eastP1 и гиперэкспрессия гена east компенсируют эффект друг друга, что говорит о функциональности линии yw;
Р{east+;
w}/CyO;
P{east+;
w}/TM6,Tb.
2. Определение последовательности, ответственной за проявление EAST-зависимой репрессии Чтобы выяснить, будет ли увеличение количества последовательностей ретротранспозона МДГ4 в предпромоторной области гена yellow приводить к усилению EAST-зависимой репрессии, в следующей серии экспериментов были использованы описанные ранее производные аллелеля у2, названные yTD (Melnikova and Georgiev, 2002).
Данные аллели несут терминальные обрывы хромосомы непосредственно в зоне энхансеров, контролирующих экспрессию гена yellow в теле и крыльях, дистальнее ретротранспозона МДГ4. Увеличение концентрации белка EAST не влияет на экспрессию аллеля yTD, который содержит только одну копию ретротранспозона МДГ4. При увеличении количества копий МДГ4 в аллелях yTD эффект действия лишних копий гена east на экспрессию yellow в щетинках становился все сильнее. В линиях, содержащих копии ретротранспозона МДГ4, наблюдалась частичная репрессия, то есть только часть щетинок не была окрашена. Тогда как в линиях, содержащих 4-5 копий ретротранспозона МДГ4, экспрессия гена yellow в щетинках была полностью подавлена – все щетинки у мух были неокрашены и, кроме того, наблюдалась слабая репрессия в теле и крыльях (табл.1).
Название аллеля Степень пигментации Степень пигментации Степень пигментации кутикулярных структур кутикулярных структур кутикулярных структур при при нормальном уровне при введении 1 копии введении 2 копий трансгена экспресси гена east трансгена Р{east+;
w} Р{east+;
w} Т/A/Кр Щ Т/A/Кр Щ Т/A/Кр Щ y2 2/2/2 5 2/2/2 ev 2/2/2 yTD (1 копия 2/2/2 5 2/2/2 5 2/2/2 МДГ4) yTD (2 копии 4/4/4 5 4/4/4 wv 4/4/4 mv МДГ4) yTD (4-5 копий 4/5/5 5 4/5/5 ev 3/5/4 МДГ4) Таблица 1. Анализ влияния гиперэкспрессии гена east на yTD аллели. В аллелях yTD в скобках указано количество копий МДГ4 в изучаемой линии. Обозначения: Т-тело, А-абдоминальные сегменты. Кр-крылья, Щ-щетинки.
Пигментация щетинок: 1-все щетинки неокрашены, ev-большая часть щетинок не окрашена, mv-количество окрашенных и неокрашенных щетинок примерно одинаково, wv-бошьшая часть щетинок окрашена, 5- все щетинки окрашены.
Пигментации тела, крыльев и абдоминальных сегментов оценивалась согласно работе Gause et al., 1998, где 1-нет окраски, 5-окраска как у дикого типа.
Данные результаты позволяют предположить, что в теломерных районах влияние гиперэкспрессии гена east на экспрессию гена yellow частично подавлено. Возможно теломерный белковый комплекс нейтрализует действие белка EAST. Возрастание количества копий ретротранспозона МДГ4 в линиях, несущих аллель yTD, приводит к увеличению расстояния между теломерным комплексом и промотором гена yellow и усилению репрессии. Поэтому yTD линии, содержащие несколько копий ретротранспозона МДГ4, наиболее чувствительны к изменению концентрации белка EAST.
Полученные результаты подтверждают вывод о том, что для проявления эффекта y гена east в системе аллеля необходимо присутствие последовательности ретротранспозона МДГ4. Исходя из генетических взаимодействий, можно предположить, что белок EAST действует как репрессор на экспрессию аллеля y2.
Для выявления последовательности МДГ4, необходимой для EAST-зависимой репрессии, были использованы описанные ранее частичные или полные ревертанты аллеля у2 (Georgiev et al., 1990) (рис.1).
Рисунок 1. Схематичное изображение аллелей гена yellow, в которых присутствуют различные последовательности ретротранспозона МДГ4. Обозначения: стрелка - направление транскрипции гена yellow;
белые горизонтальные прямоугольники - экзоны гена;
серые овалы - энхансеры, контролирующие экспрессию гена yellow в теле (Т), крыльях (К) и щетинках (Щ);
черный овал - инсулятор Su(Hw);
отрезки - размер делеций в аллелях y+1MC и y+2MC.
В полном ревертанте y+1MC, вследствие делеции в ретротранспозоне МДГ4, остается только один из его длинных концевых повторов (ДКП). Повышение концентрации белка EAST не влияло на экспрессию аллеля y+1MC (табл.2). Поэтому можно предположить, что для EAST-зависимой репрессии необходимо более одной последовательности ДКП. В частичном рервертанте yPR2 мобильный элемент hobo встроился в последовательности инсулятора Su(Hw), что привело к его частичной инактивации, при этом другие последовательности МДГ4 остались неизмененными (рис.1) (Geyer et al., 1988).
Совмещение аллеля yPR2 c двумя дополнительными копиями гена east привело к полной инактивации гена yellow в щетинках и восстановлению репрессии в теле и крыльях (табл.2). Таким образом, увеличение концентрации белка EAST влияет на экспрессию гена yellow во всех кутикулярных структурах. В полном ревертанте y+2MC встраивание мобильного элемента jockey в последовательность МДГ4 привело к полной делеции последовательностей инсулятора, в то же время другие последовательности МДГ4 были сохранены (рис.1). Увеличение концентрации белка EAST приводило к полной репрессии гена yellow в щетинках и слабой репрессии в теле и крыльях (табл.2). Исходя из структуры использованных аллелей можно предположить, что за эффект репрессии отвечают первые 500 нуклеотидов последовательности длинного концевого повтора (ДКП) МДГ4, оставшаяся в аллеле y+2MC (координаты согласно Marlor et al., 1986).
Название аллеля Степень пигментации Степень пигментации Степень пигментации кутикулярных структур кутикулярных структур кутикулярных структур при нормальном уровне при введении 1 копии при введении 2 копий экспресси гена east трансгена Р{east;
w} трансгена Р{east;
w} Т/A/Кр Щ Т/A/Кр Щ Т/A/Кр Щ y2 2/2/2 5 2/2/2 ev 2/2/2 +1MC y 2/2/2 5 2/2/2 5 2/2/2 yPR2 3/3/3 5 3/3/3 ev 2/2/2 y+2MC 5/5/5 5 5/5/5 ev 5/5/5 Таблица 2. Анализ влияния гиперэкспрессии гена east на ревертанты аллеля у2. Обозначения так же, как в таблице 1.
Согласно изложенным выше данным, гиперэкспрессия гена east, совмещенная с мутацией mod(mdg4)u1 приводит к почти полной репрессии гена yellow в аллеле y2.
Следовательно, наблюдаемый эффект зависит от присутствия белка Mod(mdg4)67.2, участвующего в формировании инсуляторного комплекса Su(Hw). Ранее было показано, что мутация mod(mdg4)u1 никак не влияла на экспрессию y+2MC аллеля, что говорит о взаимодействии белка Mod(mdg4)67.2 только с последовательностью инсулятора в составе МДГ4 (Georgiev and Corces, 1995). Таким образом, белок EAST оказывает влияние на функционирование инсулятора при помощи двух последовательностей: инсулятора Su(Hw) и длинного концевого повтора (ДКП).
Для изучения влияния инсулятора Su(Hw) и ДКП на проявление EAST-зависимой репрессии была создана генетическая конструкция P{ДКП-Su;
w+}. В состав данной конструкции входили инсулятор Su(Hw), содержащий 12 сайтов связывания для белка Su(Hw), и ДКП, содержащий первые 500 нуклеотидов (Marlor et al., 1986). Данные последовательности были встроенные между энхансерами, контролирующими экспрессию гена yellow в теле и крыльях, и промотором гена yellow (рис.2).
Рисунок 2. Схематичное изображение генетической конструкции P{ДКП-Su;
w+}. Обозначения:
серные круги - энхансеры гена yellow, черный овал - последовательность инсулятора Su(Hw) (Su), белый овал - последовательность длинного концевого повтора (ДКП), горизонтальные прямоугольники - последовательности генов yellow и white, горизонтальные стрелки - направление транскрипции этих генов, черные вертикальные стрелки - сайты узнавания для FLP-рекомбиназы, белые вертикальные стрелки - сайты узнавания для CRE-рекомбиназы.
Данная генетическая конструкция была встроена в 17 различных районов генома Drosophila melanogaster. Все трансгенные линии имели максимально окрашенные щетинки. Удаление последовательности ДКП никак не влияло на экспрессию гена yellow в щетинках. Введение гиперэкспрессии гена east приводило к подавлению экспрессии гена yellow в щетинках в половине трансгенных линиях (таб. 3), данный эффект зависел от наличия последовательности ДКП. Введение мутации mod(mdg4)u1 приводило к подавлению экспрессии гена yellow в щетинках во всех трансгенных линиях. Репрессия ослаблялась при удалении последовательности ДКП.
Введение мутации mod(mdg4)u1 одновременно с гиперэкспрессией гена east в трансгенные линии усиливало репрессионный эффект даже в отсутствие последовательности ДКП. Полученные данные говорят о том, что последовательность ДКП необходима для проявления EAST-зависимой репрессии и усиления эффекта мутации mod(mdg4)u1. При этом на фоне мутации mod(mdg4)u1 гиперэкспрессия гена east в отсутствие ДКП может оказывать репрессионный эффект через последовательность инсулятора Su(Hw).
Обобщая полученные результаты, можно сделать вывод, что белок EAST связан с белковыми комплексами, собирающимися на последовательностях инсулятора Su(Hw) и ДКП из ретронтранспозона МДГ4.
Генотип исследуемых линии P{ДКП_SU;
w} P{ДКП_SU ;
w} 1 ev mv wv 5 1 ev mv wv +/+ 0 0 0 0 17 0 0 0 0 mod(mdg4)u1/ mod(mdg4)u1 15 1 0 1 0 7 2 4 1 Р{east+;
w} 3 1 3 2 8 0 0 0 5 Р{east+;
w};
mod(mdg4)u1/ mod(mdg4)u1 16 1 1 0 0 14 1 2 0 Таблица 3. Анализ влияния гиперэкспрессии гена east на генетическую конструкцию P{ДКП-Su;
w+}.
Обозначения: - вырезание последовательности ДКП из конструкции. Окраска щетинок оценивалась так же, как и в таблице 1. Цифрами в таблице указано количество линий с соответствующей окраской щетинок.
3. Участие белков CP60 и EAST в функционировании инсулятора Su(Hw) Полученные результаты позволяют предположить, что белок EAST регулирует активность инсулятора Su(Hw) в составе ретротранспозона МДГ4. Так как белок EAST в нормальных условиях не взаимодействует с хроматином (Wasser and Chia, 2007), должен существовать другой белок или белковый комплекс, обеспечивающий функциональную связь белка EAST с инсулятором Su(Hw).
Один из предполагаемых компонентов ядерного матрикса, белок CP60, колокализуется в ядре с белком EAST в межхромосомном пространстве и его локализация зависит от уровня экспрессии гена east (Wasser and Chia, 2000). Кроме того, было показано, что белок СР60 колокализуется в ядре с белком CP190, компонентом инсулятора Su(Hw) (Kellogg et al. 1995 Whitfield et al. 1995). Данные факты позволяют сделать предположение, что белок CP60 может выступать в роли посредника между белком EAST и инсуляторным комплексом.
3.1 Взаимодействие белка CP60 с инсулятором Su(Hw) in vitro. Используя библиотеку кДНК, созданную при помощи обратной транскрипции на РНК, выделенной из линии Oregon, была получена последовательность ДНК, кодирующая белок СР60.
Анализ взаимодействия белка CP60 с компонентами инсуляторного комплекса проводили с помощью дрожжевой двугибридной системы. Было показано, что белок СР напрямую взаимодействует с белком CP190, но не взаимодействует с другими известными компонентами инсулятора Su(Hw): белками Su(Hw) и Mod(mdg4)67.2.
Белок СP60 на N-конце содержит домен, который относится к семейству MADF.
Данные домены обеспечивают взаимодействие белков с ДНК (Cutler et al., 1998). Для того чтобы выяснить, способен ли белок CP60 взаимодействовать с ДНК in vitro, был использован метод задержки в геле комплекса ДНК-белок (EMSA). В качестве тестируемых инсуляторов, были взяты следующие последовательности: инсулятор Su(Hw) из ретротранспозона МДГ4 и эндогенный инсулятор из локуса 1А2, содержащий два сайта связывания для белка Su(Hw). Белок CP60 взаимодействует с этими последовательностями и не взаимодействует с кодирующей белок последовательностью из гена mod(mdg4), (рис.3).
Рисунок 3. Задержка в геле комплексов различных последовательностей ДНК с белком CP60. А.
Задержка в геле белка СP60 c последовательностью инсулятора Su(Hw) из ретротранспозона МДГ4. Б.
Задержка в геле белка СP60 c последовательностью инсулятора Su(Hw) из локуса 1А2. Обозначения: МДГ4 последовательность инсулятора Su(Hw) из ретротранспозона МДГ4;
CDM - последовательность ДНК из кодирующей белок части гена mod(mdg4);
polydIdC - количество микрограмм неспецифического конкурента polydIdC, добавленного в реакционную смесь;
CP60His - белок СP60 c пришитыми к нему шестью гистидинами на С-конце аминокислотной последовательности;
&His; - антитела, узнающие последовательность шести гистидинов;
+ и – - наличие или отсутствие данных компонентов в реакционной смеси, соответственно.
При помощи упоминавшейся выше библиотеки кДНК, выделенной из линии Drosophila melanogaster Оregon, была получена последовательность, кодирующая белок EAST. Для того, чтобы доказать прямое взаимодействие между белками CP60 и EAST, были созданы конструкции для дрожжевой двугибридной системы. В результате было показано, что белок EAST способен взаимодействовать с белком CP60 своим C-концевым доменом. Таким образом, белок EAST может влиять на функционирование инсулятора Su(Hw) при помощи белка CP60.
3.2 Взаимодействие белка СP60 и инсулятора Su(Hw) in vivo в клетках линии S2.
Для изучения свойств белка CP60 были созданы конструкции, позволяющие экспрессировать данный белок с пришитым к нему FLAG-эпитопом в культуре клеток S и имагинальных дисках личинок Drosophila melanogaster.
С помощью метода X-ChIP на клетках линии S2 было проверено взаимодействие белка CP60-FLAG с инсуляторами, которые были использованы в предыдущем эксперименте и в исследованиях Parnell et al., 2006. В качестве контроля использовалось взаимодействие белка Mod(mdg4)67.2 –FLAG с этими же инсуляторами. Согласно полученным данным, белок CP60 взаимодействует с последовательностями эндогенных инсуляторов, инсулятором из ретротранспозона МДГ4 in vivo и не взаимодействует с последовательностями из кодирующими белок части генов actin и ras (рис.4).
CP 60 Mod(mdg4)67. % от количества ДН К в изнача льном экстракте 3. 0. % количества ДНК в изнача льном э кстракте 0. 3. 0. 2. 0. 2.00 Ab+ Ab+ 0. Ab Ab 0.40 1. 0. 1. 0. 0. 0. 0. RAS gypsy 1A2 24D 62D 87E 50A 1A1 1A6 66E Act RAS gypsy 1A2 24D 62D 87E 50A 1A1 1A6 66E Act 1- 1- Рисунок 4. Результаты хроматиниммунопреципитация белков CP60-FLAG и Mod(mdg4)67.2-FLAG в клетках линии S2. Показан усредненный результат трех экспериментов. Результаты представлены в виде процентов от количества ДНК в изначальном клеточном экстракте. Белым цветом показаны результаты, получившиеся с антителами к эпитопу FLAG. Серым цветом указаны результаты, получившиеся с неспецифическими антителами. Обозначения: gypsy1-3 – последовательность инсулятора Su(Hw) из МДГ4;
1А2, 24D, 62D, 87E, 50A, 66E – последовательности эндогенных инсуляторов из соответствующих локусов (Parnell et al., 2006;
Golovnin et al., 2003);
1A1, 1A6 – последовательности ДНК, не содержащие сайты связывания для белка Su(Hw);
RAS - последовательность из гена ras, кодирующая белок;
Act - последовательность из гена actin, кодирующая белок.
Чтобы подтвердить вхождение белка СP60 в состав инсуляторного комплекса, был проведен эксперимент по коиммунопреципитации белка CP60-FLAG и белка Mod(mdg4)67.2, входящего в состав инсулятора Su(Hw). Положительным контролем служила коиммунопреципитация белков Su(Hw)-FLAG и Mod(mdg4)67.2. Было установлено, что белки CP60-FLAG и Mod(mdg4)67.2 могут входить в состав одного комплекса, что подтверждает участие белка CP60 в формировании инсуляторного комплекса Su(Hw) (рис.5).
Рисунок 5. Результат коиммунопреципитации белков СР60FLAG и Mod(mdg4)67.2 (A) и белков Su(Hw)FLAG и Mod(mdg4)67.2 (Б). Обозначения: InPut – дорожка геля, на которую был нанесен клеточный экстракт, +Ab – дорожка с элюцией фракции ядреного экстракта, связавшегося с атителами к эпитопу FLAG,Out+ – дорожка с ядерным экстрактом, не связавшимся с антителами к эпитопу FLAG;
-Ab – дорожка с элюцией фракции ядерного экстракта, связавшегося с неспецифическими антителами;
Out- – дорожка с ядерным экстрактом, не связавшимся с неспецифическими антителами;
Mark – дорожка с маркером молекулярной массой белков (изображена полоса соответствующая размеру 100 кДа).
3.3 Изучение свойств белка СP60 in vivo в клетках Drosophila melanogaster.
Участие белка CP60 в составе инсуляторного комплекса было также проверено с помощью окрашивания политенных хромосом клеток слюнных желез Drosophila melanogaster. В результате было установлено, что многие сайты связывания для белков CP60-FLAG и Mod(mdg4)67.2 колокализуются на политенных хромосомах. Однако иногда встречаются локусы, где белок CP60-FLAG находится в районах, не содержащих белки Mod(mdg4)67.2, и наоборот, локусы, содержащие сайты связывания только для белка Mod(mdg4)67. (цветные фотография представлена в тексте диссертации). Таким образом, при помощи иммунного окрашивания политенных хромосом слюнных желез Drosophila melanogaster было показано, что белок СР60 ассоциирован с большинством сайтов связывания для белка Mod(mdg4)67.2 (цветные фотография представлена в тексте диссертации).
В ядре клетки инсуляторные белки Su(Hw), Mod(mdg4)67.2 и СР190 образуют большие комплексы, названные «инсуляторными тельцами» (Gerasimova et al. 2000;
Pai et al. 2004). Предполагается, что «инсуляторные тельца» представляют собой совокупность инсуляторных комлексов, связанных с ДНК. Таким образом, участвующие в инсуляции белки должны колокализоваться в «инсуляторных тельцах» или влиять на их формирование. Поэтому была проверена локализация белка CP60-FLAG в клетках линии S2 и в клетках имагинальных дисков личинки Drosophila melanogaster. В результате было выяснено, что белок CP60FLAG в значительной степени, но не полностью, колокализуется с белком Mod(mdg4)67.2, который был использован в качестве маркера «инсуляторных телец» (цветные фотография представлена в тексте диссертации).
Описанные выше результаты подтверждают участие белка СP60 в функционировании инсулятора Su(Hw).
Исходя из полученных результатов, можно предположить, что изменение экспрессии генов east и cp60 будет влиять на формирование белками Su(Hw) и Mod(mdg4)67. «инсуляторых телец» в ядрах клеток имагинальных дисков личинки Drosophila melanogaster. Увеличение (дополнительная копия трансгена, кодирующего белок СР60 FLAG) или уменьшение (введение мутации в гене cp60 - cp60D1/+ в гетерозиготе) уровня экспрессии гена ср60 не влияло на распределение белков Su(Hw) и Mod(mdg4)67.2 в ядрах клеток имагинальных дисков. Однако увеличение уровня экспрессии гена east (две копии конструкции P{east+;
w+}) приводило к резкому снижению количества «инсуляторных телец» и перемещению оставшихся к ядерной оболочке. В то же время, частичная P инактивация гена east в мухах, несущих мутацию east, никак не влияла на распределение белков Su(Hw) и Mod(mdg4)67.2 в ядрах клеток имагинальных дисков. Данные результаты указывают на взаимосвязь уровня экспрессии гена east с формированием и распределением «инсуляторных телец», образованных белками инсуляторного комплекса (цветные фотография представлена в тексте диссертации).
3.4 Функциональное взаимодействие между белками СР60 и EAST и белками инсуляторного комплекса. Для изучения функционального взаимодействия между белками инсуляторного комплекса и белками СР60 и EAST был проведен ряд генетических скрещиваний между линиями мух, несущими мутации или дополнительные копии исследуемых генов. В качестве модельной системы использовался аллель y2.
Прежде всего, было проанализировано взаимодействие гена east с геном ср190, кодирующим один из белковых компонентов инсуляторного комплекса (Pai et al., 2004).
Мутация в гене ср190 - ср3 связана с нарушением рамки считывания, в результате получается укороченный нефункциональный белок. Одна или две дополнительные копии гена east приводят к почти полному подавлению экспрессии гена yellow в щетинках мух, а дополнительное введение мутации ср3 в гетерозиготе усиливает наблюдаемую репрессионную активность. При совместной гиперэкспрессии генов ср190 и east наблюдался обратный эффект: полное восстановление транскрипции гена yellow в щетинках.
Затем для выявления взаимодействий между белками СР60 и EAST были проведены скрещивания, приводящие к совмещению дополнительной копии гена east и мутации в гене cp60 - cp601. Было установлено, что мутация cp601 усиливает репрессионный эффект east, что говорит о наличии взаимодействия между этими генами.
Мутации в генах ср190 (ср3), ср60 (cp601) и east (eastP1) влияли на выживаемость мух. Совмещение мутаций ср3 и eastP1 приводило к значительному снижению выживаемости мух. Совмещение мутаций в генах cp601 и eastP1, напротив, увеличивало выживаемость мух. Эти данные говорят о совместном влиянии изучаемых генов на развитие организма.
Для изучения взаимодействий между генами cp60, east и mod(mdg4) была создана генетическая конструкция P{E-Su;
w+}. Данная конструкция содержала ген yellow и инсулятор Su(Hw), встроенный между энхансерами, контролирующими экспрессию в теле и крыльях и промотором гена yellow (рис.6).
Рисунок 6. Схематичное изображение генетической конструкции P{E-Su;
w+}. Обозначения такие же, как на рисунке 2.
Данная генетическая конструкция была встроена в 15 различных районов генома Drosophila melanogaster. В 9 из 15 полученных линий инсулятор частично или полностью в щетинках на фоне мутации mod(mdg4)u1.
репрессировал экспрессию гена yellow Репрессия зависела от присутствия последовательности инсулятора Su(Hw). В трансгенных линиях eastP1;
mod(mdg4)u1/mod(mdg4)u1 уровень экспрессии гена yellow в щетинках частично восстанавливался. Гиперэкспрессия гена east, напротив, усиливала репрессионный эффект мутации mod(mdg4)u1, но только в линиях, где наблюдалась частичная репрессия в щетинках (табл.4). Данные результаты аналогичны полученным в системе аллеля y2.
Генотип исследуемых линий Окраска щетинок 5 var 1 N/T +/+ 15 0 0 0/ mod(mdg4)u1/mod(mdg4)u1 6 7 2 9/ P(w+;
east+);
mod(mdg4)u1/mod(mdg4)u1 5 1 9 10/ eastP1;
mod(mdg4)u1/mod(mdg4)u1 12 3 0 3/ cp601 ;
mod(mdg4)u1/mod(mdg4)u1 6 2 7 9/ Таблица 4. Анализ влияния генов east, cp60 на генетическую конструкцию P{E-Su;
w+}. Обозначения:
N – количество линий, изменивших свой фенотип по сравнению с исходной конструкцией;
Т – общее число линий;
Var – часть щетинок мух неокрашена. Пигментация щетинок определялась так же, как в таблице 1. В таблице отражено количество линий, имеющих тот или иной фенотип щетинок.
Мутация в гене cp60 (cp601) на фоне мутации mod(mdg4)u1 усиливала репрессию, вызванную инсулятором Su(Hw) (табл.4). Данные результаты говорят о совместном действии белков CP60 и Mod(mdg4)67.2 направленном на предотвращение репрессии, вызванной белком EAST (табл.4).
Однако в 6 из 15 полученных линий мутация mod(mdg4)u1 не вызывала репрессию гена yellow. Сочетание мутации mod(mdg4)u1 с гиперэкспрессией гена east также не подавляло транскрипцию гена yellow в этих линиях.
Полученные результаты подтверждают наличие функционального взаимодействия между белками СР60, EAST и белками инсуляторного комплекса. Также можно сделать вывод, что репрессионный эффект белка EAST зависит от положения инсулятора в геноме.
4. Влияние белка EAST на функционирование инсулятора в системах, отличных от аллеля y Генный комплекс achaete-scute (AS-комплекс) расположен рядом с геном yellow, на экспрессию которого влияет изменение концентрации белка EAST. Гены achaete и scute отвечают за развитие щетинок у дрозофилы. Точная работа этих генов регулируется большим количеством специфичных энхенсеров (Modolell and Campuzano, 1998). Мутация scD1 вызвана встраиванием ретротранспозона МДГ4 между геном scute и частью его энхансеров, вследствие чего активность этих энхансеров блокируется инсулятором Su(Hw) (рис.7).
Рисунок 7. Схематичное изображение аллелей генного комплекса achaete-scute, использованных в работе. Обозначения: координаты в AS-комплексе указаны в тысячах пар нуклеотидов, инсулятор Su(Hw) обозначен серым овалом, горизонтальные стрелки над осью координат указывают направление транскрипции и положение соответствующих генов, делеции в аллелях sc2 и sc5 показаны горизонтальными прямоугольниками под осью координат, ориентация Р-элементов указана стрелками внутри обозначающих их прямоугольников.
Мутации scms1 и scms2 вызваны встраиванием химерного элемента, содержащего ген yellow и инсулятор Su(Hw) из локуса 1А2, окруженные Р-элементами, в регуляторную область AS-комплекса. Увеличение концентрации белка EAST при скрещивании всех вышеперечисленных аллелей с линией yw;
Р{east+;
w}/CyO;
P{east+;
w}/TM6,Tb не влияло на их фенотипическое проявление. Таким образом, можно сделать вывод, что белок EAST не влияет на экспрессию генного комплекса achaete-scute.
Ранее были описаны различные мутации в гене cut, вызванные встраиванием ретротранспозона МДГ4 (Jack et al., 1991). Мутация ct6 вызвана встраиванием МДГ4 между промотором и энхансером гена cut, которые разделены 70 тысячами пар нуклеотидов.
Инсулятор Su(Hw), входящий в состав ретротранспозона МДГ4, приводит к полной изоляции энхансера, который регулирует экспрессию гена cut в крыльях. Частичная делеция последовательностей инсулятора в мутации ctpN приводит к неполному восстановлению активности энхансера гена cut. Кроме того, были описаны две мутации, вызванные либо полной (ct2S), либо частичной (ctpN2S) делецией энхансера гена cut (Mogila et al., 1992) (рис.8).
Рисунок 8. Схематичное изображение аллелей гена cut, использованных в работе. Обозначения:
горизонтальная стрелка - направление транскрипции гена cut;
серый овал - энхансеры гена cut;
черный ctpN, ct2S, ctpN2S;
овал - инсулятор Su(Hw);
отрезки - размер делеций в аллелях серый треугольник - ретротранспозон МДГ4;
белые прямоугольники - длинные концевые повторы (ДКП);
стрелки внутри прямоугольников - направление транскрипции;
70 т.п.н. - расстояние между ретротранспозоном МДГ4 и промотором гена cut. На фотографиях представлены фенотипы аллелей, использованных в работе.
Увеличение концентрации белка EAST при скрещивании мух линии yw;
Р{east+;
w}/CyO;
P{east+;
w}/TM6,Tb с мухами, несущими различные аллели гена cut, приводило к значительному усилению проявления мутантного фенотипа только тех аллелей, в которых энхансер гена cut был частично инактивирован (ctpN, ctpN2S). В то же время, увеличение концентрации белка EAST не влияло на ct6 и ct2S мутации, в которых энхансер был полностью инактивирован. Мутации eastP1 и eastP2 также супрессировали мутантное проявление только тех аллелей гена cut, в которых энхансер сохранял частичную активность. Таким образом, белок EAST регулирует активность гена cut вне зависимости от присутствия МДГ4. Возможно белок ЕAST взаимодействует с белковыми комплексами, непосредственно участвующими в регуляции экспрессии этого гена.
5. Изучение влияния гена east на функционирование различных репрессионных белковых комплексов Так как белок EAST проявляет свойства репрессора гена yellow, была осуществлена попытка выяснить, участвует ли он в работе известных репрессионых белковых комплексов у Drosophila melanogaster. Наиболее изучен репрессионный комплекс, формируемый на последовательности PRE (Polycomb responsible element) (Chan et al., 1994). Для исследования роли белка EAST в активности белков группы Polycomb (Pc-белки) была создана конструкция PRE(S)YW, в которой PRE из локуса Ubx, размером 660 пар нуклеотидов, был вставлен в регуляторную область гена yellow (рис.9). Ген white, определяющий пигментацию глаз у дрозофилы, использовался в этой конструкции как дополнительный маркерный ген. Кроме того, PRE был отделен от промотора гена yellow инсулятором Su(Hw).
Рисунок 9. Схематичное изображение конструкции PRE(S)YW. Обозначения: серый прямоугольник - PRE-элемент. Остальные обозначения такие же, как на рисунке 2.
В результате трансформации эмбрионов дрозофилы было получено 11 линий, в которых инсулятор защищал промоторы генов yellow и white от PRE-зависимой репрессии.
При делеции инсулятора в большинстве трансгенных линий PRE индуцировал репрессию.
Однако увеличение или уменьшение концентрации белка EAST не оказывало значительного влияния на PRE-зависимую репрессию генов yellow и white. Таким образом, белок EAST не участвует в Рс-зависимой репрессии (табл. 5).
Трансгенная Окраска глаз у мух Число линий с новым линия фенотипом/ Общее число линий Кр Кор- Кор т. Ор т.Ж Ж св.Ж Б Кр Ор PRE(S)YW 0 0 0 0 3 2 3 3 0 0/ eastP1 0 0 0 0 3 2 4 2 0 1/ PRE()YW 0 0 0 0 1 1 2 4 3 7/ eastP1 0 0 0 0 1 2 1 4 3 8/ Таблица 5. Анализ влияния мутации в гене east на Pc-зависимую репрессию в модельной системе гена white. В левой колонке приведено название использованной в работе конструкции. Обозначения: S - присутствие в линии инсулятора Su(Hw), - вырезание Su(Hw) инсулятора из конструкции, eastP1 - введение в обозначенные выше линии мутации в гене east. Окраска глаз у мух обозначена с помощью следующих сокращений: Кр-красная, Кор-Кр-коричнево-красная, Кор-коричневая, т.Ор-темно оранжевая, Ор-оранжевая, т.Ж-темно-желтая, Ж-желтая, св.Ж-светло-желтая, Б-белая. Цифрами в таблице указано количество линий с соответствующей окраской глаз.
Затем было исследовано влияние мутации в гене east на экспрессию гена white в составе описанных ранее трансгенных конструкций, встроенных в гетерохроматиновые районы теломер второй и третьей хромосом (линии: 39C-5 (2L), 39C-27 (2R), 39C-31 (3R), 39C-51 (3R)) или в 4 хромосому (линии:118E-10 (102A), 39C-34 (102A), 118E-3 (102A), 39C-12 (102B), 39C-52 (102B-C), 118E-19 (102D-E)) (Sun et al., 2000;
Cryderman et al., 1999).
Известно, что гетерохроматиновые районы генома способны репрессировать транскрипцию встроенного в них трансгена. Ранее было показано, что экспрессия трансгена, встроившегося в теломер-ассоциированные повторы (TAS), подавляется. Во всех использованных линиях окраска глаз у мух была мозаичной – красные пятна и точки различной интенсивности на светло-оранжевом фоне, что свидетельствует о выраженной репрессии гена white. Мутация eastP1 не оказывала значительного влияния на эксперссию гена white во всех трансгенных линиях.
Таким образом, белок EAST не участвует в репрессии, вызываемой белками группы Polycomb или прителомерным гетерохроматином Drosophila melanogaster.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Изучение влияния гена east на функционирование инсулятора в системе аллеля y Согласно полученным в представленной работе результатам, ген east оказывает влияние на функционирование инсулятора Su(Hw) в модельной системе гена yellow.
Гиперэкспрессия гена east приводит к подавлению транскрипции гена yellow в щетинках.
Мутация eastP1 восстанавливает функционирование инсулятора на фоне мутации в гене mod(mdg4), кодирующем один из компонентов инсуляторного комплекса Su(Hw). Также ген east генетически взаимодействует с геном ср190, который кодирует еще один белок, входящий в состав инсулятора Su(Hw). Две дополнительные копии гена east приводят к подавлению экспрессии гена yellow, а дополнительное введение мутации ср3 в гетерозиготе усиливает наблюдаемую репрессионную активность. При совместной гиперэкспрессии генов ср190 и east наблюдался обратный эффект: полное восстановление транскрипции гена yellow.
Анализ различных ревертантов аллеля у2 и генетических конструкций P{ДКП Su;
w+} и P{E-Su;
w+}, позволил установить последовательности, ответственные за проявление EAST-зависимой репрессии. Этими последовательностями оказались инсулятор Su(Hw) и длинный концевой повтор из ретротранспозона МДГ4.
Ранее было показано, что отличные от инсулятора последовательности МДГ определяют положение этого мобильного элемента на периферии ядра (Xu et al., 2004).
Также ранее было показано, что длинные концевые повторы ретротранспозона Idefix и его 5’-нетранслируемая область влияют на эффект инсуляции и положение генетической конструкции в ядре (Brasset et al., 2007). Исходя из этих данных, можно предположить, что влияние белка EAST на транскрипцию гена yellow связано с положением этого гена в ядре, которое зависит от присутствия последовательностей длинных концевых повторов ретротранспозона МДГ4. Возможно, присутствие последовательностей МДГ4 в аллельных вариантах гена yellow способствует контакту между регуляторными последовательностями этого гена и белковыми факторами, аккумулированными на ядерной оболочке и оказывающими репрессирующее влияние на ген. При этом увеличение концентрации белка EAST приводит к активизации репрессионного комплекса.
2. Исследование молекулярных взаимодействий между белками EAST, CP60 и белками инсуляторного комплекса Ранее было показано, что белок CP60 колокализуется в ядре с белком EAST в межхромосомном пространстве и его локализация зависит от уровня экспрессии гена east (Wasser and Chia, 2000). Кроме того, было показано, что белок СР60 колокализуется в ядре с белком CP190, компонентом инсулятора Su(Hw) (Kellogg et al. 1995 Whitfield et al. 1995).
При помощи молекулярных исследований, проведенных в данной работе, было показано присутствие белка CP60 в инсуляторном комплексе Su(Hw). Белок CP60 связывается с последовательностью ДНК инсулятора Su(Hw) и взаимодействует с белком CP190. Также белок CP60 коиммунопреципитируется с белком Mod(mdg4)67.2, являющимся компонентом инсуляторного комплекса Su(Hw). Так как было показано наличие прямого взаимодействия между белками CP60 и EAST, можно утверждать, что белок EAST оказывает свое влияние на функционирование инсулятора Su(Hw) при помощи белка CP60.
Исходя из взаимодействий между генами east, cp60, mod(mdg4) и cp190, можно выдвинуть гипотезу о существовании на последовательности инсулятора Su(Hw) группы белков (СР60, СР190 и Mod(mdg4)67.2), в функции которых входит блокирование репрессионной активности белка EAST.
3. Влияние белка EAST на функционирование различных репрессионных комплексов Согласно полученным в данной работе результатам, белок EAST не влияет на репрессию генов, вызванную белками группы Polycomb или прителомерным гетерохроматином. Ранее было показано, что при гиперэкспрессии гена east изменяется компактизация и распределение хромосом в ядре (Wasser and Chia, 2000). При этом внехромосомные структуры занимают больший объем ядра, чем обычно. Можно предположить, что такое перераспределение хромосом делает регуляторные системы активно экспрессирующихся генов более доступными для влияния репрессионных компонентов ядерного матрикса. Полученные результаты позволяют предположить, что белок EAST не является компонентом каких-либо репрессионных комплексов, но при этом выступает как часть глобальной системы белков ядерного матрикса, который обеспечивает правильную временную и тканеспецифичную экспрессию всех генов.
ВЫВОДЫ 1. С помощью различных генетических модельных систем, как нативных, так и искусственно созданных, была показана функциональная взаимосвязь между инсуляторными и репрессионными свойствами инсулятора Su(Hw) и уровнем экспрессии генов east и cp60. Также было показано, что изменение уровня экспрессии генов, кодирующих входящие в инсуляторный комплекс белки, в сочетании с мутациями в генах east и ср60, также меняло свойства инсулятора.
2. Установлено, что для проявления эффектов, связанных с экспрессией гена east, необходимы последовательности инсулятора Su(Hw) и длинного концевого повтора из ретротранспозона МДГ4.
3. Показано прямое взаимодействие между белком СР60 и белком СР190, компонентом инсуляторного комплекса, а также взаимодействие между белком СР60 и белком EAST, предполагаемым компонентом ядерного матрикса. Способность белка СР связываться с последовательностью инсулятора Su(Hw) и коиммунопреципитация белка СР60 с основным компонентом инсулятора Su(Hw) – белком Mod(mdg4)67. подтверждает, что белок СР60 также является компонентом инсуляторного комплекса.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Л.С. Мельникова, И.В.Кривега, П.Г. Георгиев, А.К. Головнин А.К. Белок ядерного матрикса EAST участвует в регуляции транскрипции гена yellow у Drosophila melanogaster. ДАН, 2007, 415(5): 1-4.
2. Л.С. Мельникова, И.В.Кривега, П. Г. Георгиев, А.К. Головнин. Белок ядерного матрикса EAST влияет на транскрипцию генов Drosophila melanogaster независимо от присутствия последовательностей ретротранспозона МДГ4. Генетика. 2007, 43(10): 1-5.
3. И.В. Кривега, Л.С. Мельникова, А.К. Головнин, П.Г. Георгиев. Выявление нового гена супррессора mod(mdg4) и изучение его свойств. Тезисы 10 Пущинской школы конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" с. 25. Пущино, 17-21 апреля 2006г.
4. И.В. Кривега, М.В. Костюченко, Е.В. Кравченко, А.К. Головнин, П.Г. Георгиев.
Создание новой модельной системы для изучения роли белков Mod(mdg4) и супрессоров mod(mdg4) в процессе инсуляции. Тезисы 10 Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" с. 26. Пущино, 17-21 апреля 2006г.
5. A. Golovnin, L. Melnikova, I. Krivega, M. Kostuchenko, I. Volkov, P. Georgiev. The nucleoskeletal proteins EAST and CP60 modulate activity of the gypsy insulator in Drosophila melanogaster. "Nuclear Structure & Dynamics", Montpellier, France, 1-5 September, 2007: