Александр валентинович регуляция транспорта митохондрий в клетках млекопитающих
На правах рукописи
УДК 577.3 Кулик Александр Валентинович Регуляция транспорта митохондрий в клетках млекопитающих 03.00.02 - биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Москва 2006
Работа выполнена на кафедре молекулярной биофизики Московского физико технического института (государственного университета) и в группе клеточной биологии Института белка РАН.
Научный консультант:
Кандидат биологических наук Минин Александр Александрович.
Официальные оппоненты: Доктор физико-математических наук Лившиц Михаил Аронович, Институт молекулярной биологии РАН (г.
Москва) Доктор биологических наук Ширинский Владимир Павлович, Российский кардиологический научно производственный комплекс (г. Москва)
Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита диссертации состоится 22 марта 2006 года, в часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при МФТИ по адресу: 141700 Московская обл., г.Долгопрудный, Институтский переулок, д.9, МТФИ
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.
Автореферат разослан: _ _ 2006 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук Брагин В.Е Актуальность проблемы.
Митохондрии играют важную роль в физиологии клетки. Они обеспечивают клетку энергией в форме молекул АТФ, участвуют в регуляции концентрации ионов кальция в цитоплазме, а также являются важнейшим звеном в процессе программируемой клеточной смерти. Распределение митохондрий в клетке тесно связано с жизненной активностью различных ее участков. К примеру, ко локализация некоторых доменов эндоплазматического ретикулума (ЭР) и митохондрий необходима для передачи ионов кальция от ЭР к митохондриям (Rizzuto et al., 1993;
1998;
Csordset al., 1999);
расположение митохондрий вблизи плазматической мембраны позволяет контролировать уровень поступления кальция внутрь клетки (Lawrie et al., 1996;
Hoth et al., 1997;
Montero et al., 2000), а локальные взаимодействия между соседними митохондриями способствуют распространению сигналов между митохондриями в некоторых моделях апоптоза (Pacher and Hajnczky, 2001). Кроме того, почти во всех клетках митохондрии локализуются вблизи мест высокого потребления энергии (Zielinski et al., 1988;
van Blerkom., 1991;
Morris and Hollenbeck 1993;
Chada and Hollenbeck, 2003;
Li et al., 2004). Нарушения транспорта и правильного распределения митохондрий могут приводить к ряду нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера и Хантингтона (Gunawardena and Goldstein, 2001;
Gunawardena et al., 2003;
Hurd and Saxton, 1996), а также латеральный амиотрофический склероз (Collard et. al, 1995). Таким образом, координированный транспорт и распределение митохондрий являются неотъемлемой частью нормального функционирования клетки в целом. Поэтому изучение процессов, лежащих в основе регуляции распределения митохондрий, является важным шагом на пути к пониманию причин нарушения внутриклеточного транспорта этих органелл.
По современным представлениям транспорт митохондрий осуществляется моторными белками, которые используют энергию гидролиза АТФ для движения вдоль филаментов цитоскелета. Было показано, что митохондрии способны перемещаться как вдоль микротрубочек, так и вдоль актиновых микрофиламентов (Morris and Hollenbeck, 1995 Ligon and Steward, 2000), и осуществляется этот процесс при участии таких моторных белков, связанных с микротрубочками, как кинезины и динеины (Tanaka et al., 1998;
Nangaku et al., 1994), и актин-зависимых миозинов. За последнее время накопилось много данных о функциях отдельных моторов. Однако, сведений о молекулярных механизмах их регуляции пока недостаточно.
В отличие от других органелл, большинство митохондрий в клетке неподвижны или малоподвижны, и лишь небольшая их часть двигается относительно быстро (Trinczek et al., 1999;
De Vos et al., 2003). Наличие малоподвижных митохондрий принято связывать с их иммобилизацией вблизи мест активного потребления АТФ или участков, с повышенным содержанием ионов кальция. Вопрос о том, какие именно белки участвуют в непосредственном связывании митохондрий и удерживании их в местах специфической локализации, в настоящее время остается открытым. Тем не менее, в нескольких работах высказывается предположение, что в основе ингибирования движения митохондрий лежит взаимодействие этих органелл с такими элементами цитоскелета, как промежуточные филаменты и актиновые микрофиламенты (Krendel et al., 1998, Wagner et al., 2003, Leterrier et al. 1994, Trinczek et al., 1999). Таким образом, подвижность митохондрий может регулироваться как со стороны моторных белков, участвующих в их транспорте, так и при помощи их взаимодействий с неподвижными структурами цитоскелета. Однако, сигнальные пути, лежащие в основе такой регуляции, в настоящее время остаются малоизученными.
Мы обнаружили, что в клетках CV-1 митохондрии переходят из подвижного состояния в стационарное в ответ на добавление к клеткам одного из основных ростовых факторов, содержащихся в сыворотке, лизофосфатидной кислоты (LPA), которая, как было показано ранее, вызывает такие изменения в клетках, как образование актиновых стресс-фибрилл, созревание фокальных контактов и стабилизацию микротрубочек в направлении движения клетки.
Цель работы и основные задачи исследования Целью работы было установить механизмы передачи сигнала LPA, контролирующего подвижность митохондрий, и определить участников этой передачи.
Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Среди известных регуляторных белков, осуществляющих передачу сигнала LPA, выявить те из них, которые участвуют в ингибировании движения митохондрий.
2. Выяснить, какие из изменения в структуре цитоскелета, вызываемые LPA, отвечают за ингибирование движения митохондрий.
Научная новизна В результате настоящей работы найден новый механизм регуляции подвижности митохондрий одним из ростовых факторов, лизофосфатидной кислотой (LPA), который заключается в регулируемом переходе их из подвижного состояния в стационарное. Впервые установлено участие малой ГТФазы RhoA и ее белка-мишени mDia1, в передаче сигнала LPA, который приводит к подавлению движения митохондрий.
Продемонстрировано также, что ингибиторное действие белка mDia1 на движение митохондрий строго зависит от его способности стимулировать полимеризацию актина, связывающего митохондрии. Индукция полимеризации актина, другими, не зависимыми от mDia1 способами, включая обработку клеток известным стабилизатором полимерного актина, джасплакинолидом или активацию Arp2/3 комплекса, не влияет на подвижность митохондрий.
Теоретическая и практическая ценность Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию фундаментальных процессов, лежащих в основе внутриклеточной локализации и транспорта митохондрий. Полученные результаты могут быть использованы для разработки методик лечения нейро-дегенеративных заболеваний, связанных с нарушением транспорта и правильного распределения митохондрий. Разработанные методические подходы к наблюдению и анализу движения митохондрий могут быть использованы для изучения внутриклеточного транспорта других органелл.
Апробация работы.
Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на XLIV научной конференции Московского физико-технического института (Долгопрудный, 2001);
на международной конференции «2001 HHMI Meeting of International Research Scholars» (Ванкувер, Канада, 2001);
на международной школе «FEBS practical course on «Visualising Cytoskeleton Dynamics» (Дрезден, Германия, 2004);
и на межлабораторном семинаре Института белка РАН (Москва, 2005).
Структура и объем работы.
Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы.
Диссертация изложена на 82 страницах машинописного текста и содержит таблицы и 15 рисунков.
Методы исследования.
Для экспериментов по изучению движения митохондрий использовалиcь культивируемые клетки линии СV-1-Mito. Линия была получена в ходе селективной трансфекции клеток СV-1 (клетки эпителия почки зелёной мартышки) плазмидой pEYFP-Mito (Clontech), кодирующей восьмую субъединицу человеческой цитохром С оксидазы с присоединенным к ней желтым флуоресцентным белком (EYFP, флуоресценция на длине волны 527 нм). Клетки выращивали на покровных стеклах до плотности 50-70% суб-конфлуентного монослоя.
Трансфекцию культивируемых клеток CV-1 Mito необходимыми плазмидами проводили с помощью липосомного реагента Unifectin M, полученного от А.
Сурового (Институт биоорганической химии, Москва). В опытах для ко-экспрессии в клетке нескольких ДНК-конструкций применяли методику внутриядерных микроинъекций раствора ДНК в культивируемые клетки, которые предварительно рассаживали на разграфленные стекла.
Для микроскопии живых клеток, покровные стекла с клетками монтировали на предметных стеклах, в результате чего получалась герметичная камера, заполненная культуральной средой. Наблюдения проводили при помощи микроскопа Axiophot (Zeiss). Температуру поддерживали постоянной 37оС +/20С с помощью регулируемого воздушного потока (Zeiss Air Stream Incubator).
С помощью 12-битной цифровой CCD камеры 1 MHz MicroMax (Roper Scientific) и программного обеспечения WinView 32 (Princeton Instruments) изображение записывалось, передавалось на компьютер и запоминалось в виде 8 битных файлов с размером картинки 782х582 пикселя. Время экспозиции было равно 1 секунде, пауза между последовательными кадрами - 3 секунды, количество кадров в каждом фильме - от 20 до 50.
Обработка данных. Для определения средней скорости отдельных митохондрий использовали программу ImageJ (Scion). С ее помощью в каждом кадре записанной последовательности определялись координаты каждой митохондрий: геометрического центра (для митохондрий малого размера) или координаты одного из концов митохондрии (для длинных органелл). Затем при помощи программы Excel (Microsoft), определяли расстояния между положениями органелл в соседних кадрах и среднюю скорость движения каждой митохондрии за промежуток времени между кадрами. Таким образом, определяли, как меняется средняя скорость каждой митохондрии в данной клетке от кадра к кадру. В каждом опыте анализировали митохондрии в 5-10 клетках, в каждой клетке 10- митохондрий.
Для анализа подвижности митохондрий и доли неподвижных митохондрий, учитывали движения всех митохондрий в плоской части клеток, которые были видны в поле микроскопа в течение съемки. Значение относительной подвижности митохондрий в клетке, определяли как отношение числа перемещений митохондрий со скоростью больше 0.2 мкм/с к общему числу всех зарегистрированных перемещений митохондрий в данной клетке. Долю неподвижных митохондрий определяли как отношение числа митохондрий, которые в течение всего времени наблюдения не меняли своего положения или двигались со скоростью меньше 0. мкм/с, к общему числу митохондрий в данной клетке. Долю времени в движении определяли как отношение числа кадров, в которых митохондрия двигалась со скоростью больше 0.2 мкм/с, к общему числу кадров, в которых наблюдали данную митохондрию. Для подсчета среднего значения данного параметра учитывались данные только для подвижных митохондрий. Для определения средней скорости движения подвижных митохондрий, учитывали только те кадры, в которых митохондрия двигалась со скоростью больше 0.2 мкм/с.
Для каждого опыта получали распределение соответствующих характеристик движения митохондрий (относительной подвижности митохондрий;
доли подвижных митохондрий;
доли времени в движении;
средней скорости), полученных в разных клетках. С помощью программы «Statistica for Windows» (StatSoft) распределения проверяли на нормальность по тесту Колмогорова Смирнова и вычисляли среднее значение и стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий использовали t-тест для независимых величин.
Результаты исследования и их обсуждение.
Наблюдение митохондрий в живых клетках и определение их подвижности.
Поведение митохондрий на периферии клеток характеризуется двумя различными состояниями: стационарным и подвижным. Стационарные митохондрии закреплены на элементах цитоскелета, а подвижные – перемещаются вдоль микротрубочек с помощью моторных белков. Чтобы исследовать механизмы переключения между двумя состояниями митохондрий, мы использовали систему наблюдения за индивидуальными митохондриями в живых клетках. Для этого была получена клеточная линия, в которой все митохондрии были помечены желтым флуоресцентным белком (ЕYFP). На рис. 1 представлена типичная картина распределения митохондрий в клетках CV-1 Mitо, полученная при помощи цифровой камеры.
Рис. 1. Движение митохондрий в клетках CV-1 Mitо. (А) Первый из последовательности кадров, полученных при помощи флуоресцентной микроскопии. (Б) Движения митохондрий в участке, выделенном в рис. 1А. (В) Траектории перемещений митохондрий из рис. 1Б за 3 мин. Масштаб 10 мкм.
Видно, что митохондрии в этих клетках имеют удлиненную форму и располагаются радиально. На рис.1 Б показано, как меняется положение митохондрий в выделенном на рис. 1 А участке в серии кадров. На рис.1 В представлены траектории их движения за 3 минуты с разрешением 4 секунды.
Видно, что движение митохондрий представляло собой перемещения в направлении края клетки или к центру, которые прерывались частыми остановками.
Многие органеллы не перемещались на значительные расстояния, а находились в относительном покое на протяжении всего времени наблюдения.
Чтобы выяснить, какой вклад в транспорт митохондрий в нашей системе вносят микротрубочки, мы проанализировали движение митохондрий в клетках, обработанных нокодазолом и не содержащих микротрубочек. Движение митохондрий в отсутствие микротрубочек представляло собой случайные хаотические перемещения на небольшие расстояния. Все перемещения происходили со скоростями меньше 0.2 мкм/с. Из чего следует, что быстрое движение митохондрий возможно только в присутствии микротрубочек, и это движение характеризуется скоростями 0.2 мкм/с и выше.
Для удобства анализа движения митохондрий мы в дальнейшем считали митохондрии подвижными, если скорость их движения превышала 0.2 мкм/с;
митохондрии, которые двигались с меньшими скоростями или были неподвижными в течение времени съемки, мы считали стационарными. В качестве основного параметра была выбрана относительная подвижность митохондрий, которая представляет собой долю перемещений митохондрий со скоростью больше 0. мкм/с среди всех зарегистрированных перемещений. Этот параметр показывает, какая часть наблюдаемых митохондрий (в среднем) в каждый момент времени находится в подвижном состоянии. Анализ движения митохондрий в 50 клетках линии CV-1 Mito показал, что среднее значение относительной подвижности митохондрий составляет 7% (таблица 1).
Подвижность митохондрий находится под контролем внешних факторов.
Чтобы выяснить, как подвижность митохондрий зависит от условий культивирования клеток, мы поместили клетки в бессывороточную среду.
Оказалось, что подвижность митохондрий значительно снижается, если клетки инкубировать в отсутствие сыворотки (таблица 1). Такой эффект был обратимым:
подвижность митохондрий восстанавливалась при добавлении в среду сыворотки.
Этот результат свидетельствует о наличии в сыворотке веществ, способных регулировать внутриклеточную подвижность митохондрий.
Таблица 1.
Относительная подвижность митохондрий, % * Контроль 7 +/- Клетки с разобранными микротрубочками В безсывороточной среде 1.6 +/- 0. *Данные представлены в виде M ± SD.
Для того чтобы определить, какой из сывороточных факторов отвечает за регуляцию подвижности митохондрий, мы измеряли относительную подвижность митохондрий в клетках при добавлении в среду различных факторов, содержащихся в сыворотке. Несмотря на то, что ни одно из проверенных нами веществ не повышало подвижности митохондрий в такой же степени, как сыворотка, мы обнаружили, что лизофосфатидная кислота (LPA), один из основных компонентов сыворотки, оказывает противоположный эффект: добавление LPA приводило к значительному снижению подвижности митохондрий. Митохондрии переставали двигаться уже через несколько минут после добавления в среду LPA. Спустя 40- минут, подвижность митохондрий восстанавливалась до контрольного значения.
Анализ движения митохондрий в таких клетках показал, что лишь очень не большая их часть перемещается на значительные расстояния.
Рис. 2. LPA ингибирует подвижность митохондрий. (А, В) Первый кадр из последовательности микрофотографий флуоресцентно меченых митохондрий в клетках линии CV-1 Mita;
(Б, Г) представлены траекто рии движения за минуты всех митохондрий в тех же самых клетках. (А, Б) – контрольная клетка;
(В, Г) – клетка, обработанная 5 мкМ LPA в течение 5 минут.
Масштаб 10 мкм.
На рис. 2 Г показаны траектории митохондрий в присутствии LPA. Видно, что они очень короткие, и большинство органелл практически не изменяли своего положения за время съемки. Результаты количественного анализа, приведенные на рис. 3, показывают, что LPA подавляет движение митохондрий, уменьшая среднее значение относительной подвижности митохондрий более чем в пять раз (P 0.05).
Лизофосфатидная кислота ингибирует подвижность митохондрий через белок RhoA.
Лизофосфатидная кислота представляет собой фосфолипид, обладающий активностью ростовых факторов в нормальных и опухолевых клеточных культурах.
Связываясь с LPA-рецепторами на поверхности клетки, LPA запускает несколько сигнальных каскадов, вызывающих различные клеточные изменения. Один из наиболее изученных каскадов, активируемых LPA, включает активацию малой ГТФ-азы RhoA (Ridley and Hall, 1992;
Cook et al., 1998). Мы предположили, что этот белок может быть также вовлечен и в регуляцию подвижности митохондрий. Чтобы проверить данное предположение, мы экспрессировали в клетках конститутивно активный мутант белка RhoA, EGFP-RhoA-(Q63L) (плазмида любезно предоставлена Др. Клаусом Ханом (Scripps Research Institute, Сан Диего, США).
Анализ движения митохондрий в таких клетках показал, что, как и при добавлении LPA, относительная подвижность митохондрий в данных клетках сильно уменьшается (рис. 3).
Рис. 3 Количественный анализ подвижности митохондрий в клетках, обработанных LPA, и в клетках, экспрессирующих EGFP-RhoA-(Q63L). n- число клеток, в которых была посчитана относительная подвижность митохондрий;
в скобках указано суммарное число проанализированных митохондрий;
в каждом опыте посчитаны клетки из 3 независимых экспериментов. Данные представлены в виде M ± SD.
Чтобы выяснить, какую роль играет эндогенный белок RhoA в регуляции распределения и подвижности митохондрий, мы инъецировали в клетки С трансферазу, бактериальный фермент, который АДФ-рибозилирует и тем самым инактивирует белок RhoA (Paterson et al., 1990;
Ridley and Hall, 1992). Такое воздействие приводило к тому, что закрепленное состояние митохондрий на периферии клетки нарушалось, и почти все они оказывались в околоядерной области. Таким образом, наши результаты показывают, что белок RhoA участвует в регуляции подвижности и распределения митохондрий.
Белок RhoA регулирует распределение митохондрий, действуя через свои белки-мишени.
Поскольку активация RhoA оказалась необходимым и достаточным условием для заякоривания митохондрий на периферии, мы решили проверить, участвуют ли, активируемые им белки, mDia1 и Rho киназа, в регуляции подвижности митохондрий.
Рис. 4 Экспрессия мутантных конструкций Rho киназы изменяет актиновый цитоскелет. Микрофотографии клеток CV-1, экспрессирующих конститутивно активный (А, Б, В) или доминантно негативный (Г, Д, Е) мутанты Rho киназы. Клетки зафиксированы 4% параформальдегидом. Трансфецированные клетки отмечены на рисунке стрелками. (А, Г) – фазовый контраст;
(Б, Д) уровень экспрессии мутантных конструкций, выявлянный антителами против с Myc и FITC-мечеными вторыми антителами;
(В, Е) - полимерный актин, выявленный TRITC – фаллоидином. Масштаб 10 мкм.
Чтобы изменить активность Rho киназы мы экспрессировали в клетках ее конститутивно активный (ROCK-CAT) и доминантно негативный (ROCK-RB/PH) мутанты (плазмиды любезно предоставлены Др. Козо Каибучи (Nagoya University, Нагоя, Япония). Как и следовало ожидать, экспрессия ROCK-CAT индуцировала в клетках образование развитых стресс-фибрилл (рис. 4 В), а экспрессия ROCK RB/PH - приводила к их полному исчезновению (рис. 4 Е). При этом картина распределения и подвижность митохондрий в клетках, экспрессирующих данные мутанты, не отличались от таковых в контрольных клетках (таблица 2). То есть ингибирование движения митохондрий, вызываемое LPA через белок RhoA, происходит без участия Rho киназы.
Таблица 2.
Относительная подвижность Число клеток Опыт митохондрий, % (митохондрий) Контроль 7 +/- 3 11 (340) LPA 1.2 +/- 0.5 9 (310) RhoA-QL 2.1 +/- 1.1 5 (100) ROCK-CAT 6 +/- 4 6 (185) ROCK-RB/PH 6 +/- 4 7 (207) 0.5 +/- 0.3 10 (303) mDia1(N3) 0.6 +/- 0.4 10 (290) mDia1(N3) + С 0.5 +/- 0.4 8 (212) ROCK-RB/PH + mDia1(N3) Данные представлены в виде M ± SD.
Поскольку оказалось, что Rho киназа непосредственно не участвует в регуляции движения митохондрий, мы решили изучить роль в этом процессе другого возможного участника – белка mDia1. Для этого мы трансфецировали клетки плазмидой, кодирующей конститутивно активный мутант белка mDia1, содержащий домены, отвечающие за полимеризацию актина, но с удаленным RhoА-ГТФ-связывающим регуляторным доменом (плазмида любезно предоставлена др. Шу Нарумией (Kyoto University, Киото, Япония). Оказалось, что при экспрессии EGFP-mDia1(N3) быстрое движение митохондрий полностью подавлялось.
Относительная подвижность митохондрий была почти в десять раз меньше, чем в контроле, и составляла менее 1% (таблица 2).
Рис. 5 Экспрессия конститутивно активного мутанта белка mDia1 изменяет картину распределения митохондрий в клетках CV-1 Mita. Микрофотография клеток линии CV-1 Mita, трансфицированных конструкцией EGFP-mDia1(N3) и зафиксированных 4% параформальдегидом. А – фазовый контраст. Б – флуоресценция на длине волны 510 – 560 нм. Масштаб 10 мкм.
Помимо того, что в клетках, экспрессирующих конститутивно активный мутант белка mDia1, все митохондрии были неподвижными, сами клетки изменяли свою форму, становились сильно вытянутыми (рис. 5 А). Митохондрии в таких клетках выстраивались вдоль длинной оси клетки (рис. 5 Б).
Поскольку инактивация белка RhoA С3-трансферазой приводила к нарушению закрепления митохондрий на периферии клетки, важно было выяснить, будет ли она изменять локализацию и подвижность митохондрий в клетках, экспрессирующих активный мутант белка mDia1. Анализ движения митохондрий показал, что инъекция С3-трансферазы в клекти, экспрессирующие mDia1(N3), не вызывала увеличения подвижности митохондрий (таблица 2).
Рис. 6 Инактивация белка RhoA не нарушает заякоривания митохондрий, индуцированного экспрессией конститутивно активного мутанта белка mDia1.
Микрофотографии клеток CV-1 Mito, экспрессирующих конститутивно активный мутант белка mDia1, и инъецированных раствором С3 трансферазы. Фотография сделана спустя 2 часа после инъекции. А – фазовый контраст. Б – флуоресценция на длине волны 510 – 560 нм. Масштаб 10 мкм.
Кроме того, в таких клетках не изменялось характерное распределение и форма митохондрий (рис. 6), свидетельствуя о том, что роль белка RhoA в регуляции этих процессов сводится к активации белка mDia1.
Цитоскелетные структуры, участвующие в заякоривании митохондрий.
Изменение формы клеток, в результате экспрессии активного мутанта белка mDia1, было описано ранее в работе из лаборатории Ш. Нарумии на клетках другого типа (Ishizaki et al., 2001). Экспрессия EGFP-mDia1(N3) в клетках Hela также вызывала их удлинение. Такая вытянутая форма клеток была следствием перестроек цитоскелета: актиновые филаменты в них имели вид параллельных пучков и вместе с системой микротрубочек располагались вдоль главной оси клетки. Мы исследовали цитоскелетные структуры в трансфицированных клетках нашей линии CV-1 Mito. На рис. 7 видно, что подобная реорганизация микротрубочек и актиновых филаментов происходила и в них.
Рис. 7 Экспрессия конститутивно активного мутанта белка mDia1 изменяет организацию микротрубочек и актиновых филаментов в клетках CV-1 Mita.
Микрофотографии клеток линии CV-1 Mita, трансфицированных конструкцией EGFP-mDia1(N3) и зафиксированных 4% параформальдегидом. Микротрубочки выявлены антителами против Glu-тубулина и FITC-мечеными вторыми антителами (А), а полимерный актин TRITC-фаллоидином (Б). Масштаб 10 мкм.
Поскольку неподвижные митохондрии в клетках, экспрессирующих активный мутант белка mDia1, располагались вдоль параллельных пучков актиновых филаментов и микротрубочек, мы предположили, что ингибирование движения митохондрий возникает из-за их взаимодействия с актиновыми филаментами, которое препятствует быстрому движению этих органелл вдоль микротрубочек.
Чтобы выяснить, участвует ли полимерный актин (F- актин) в ингибировании движения митохондрий, мы обрабатывали клетки веществами, которые его разрушают (латранкулин В и цитохалазин D), и анализировали в них движение митохондрий. На рис.8 представлены результаты анализа подвижности митохондрий в клетках, обработанных латранкулином Б. Видно, что относительная подвижность митохондрий в отсутствие полимерного актина значительно выше (P 0.01). Разборка актина цитохалазином D, также приводила к увеличению подвижности митохондрий в клетках, экспрессирующих mDia1(N3) (данные не приведены).
Рис. 8. Деполимеризация F-актина латранкулином В приводит к увеличению подвижности митохондрий. Количественный анализ движения митохондрий в контрольных клетках и клетках, экспрессирующих конститутивно активный мутант белка mDia1 (EGFP-mDia1(N3), обработанных 0.2 - 0.4 мкМ латранкулина Б в течение 20 мин. Для определения относительной подвижности митохондрий в каждом опыте было проанализировано минимум 10 клеток ( независимых эксперимента). Данные представлены в виде M ± SD.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что активация белка mDia1 ингибирует движение митохондрий за счет увеличения содержания F актина в клетках. Чтобы узнать, происходит ли ингибирование подвижности митохондрий актиновыми филаментами в контрольных клетках, мы проанализировали движение митохондрий в клетках CV 1 Mito при разборке в них F-актина. Как и в опытах с клетками, экспрессирующими mDia1(N3), деполимеризацию актиновых филаментов в контрольных клетках осуществляли латранкулином B. Оказалось, что в этом случае относительная подвижность митохондрий возрастает вдвое (рис. 8). То есть, F-актин в клетках препятствует движению митохондрий.
Полимеризация актина, стимулируемая независимыми от mDia1 способами, не приводит к заякориванию митохондрий.
Увеличение содержания F-актина в клетках могло препятствовать движению митохондрий, во-первых, в результате простого увеличения вязкости цитоплазмы;
во-вторых, причиной такого замедления могли быть специфические взаимодействия митохондрий и микрофиламентов, например, при участии моторных белков, связанных с актиновыми микрофиламентами, или других белков на поверхности митохондрий, способных связываться с F-актином. Чтобы проверить предположение, о том, что митохондрии тормозятся вследствие увеличения плотности актинового геля, мы использовали несколько способов повышения содержания полимерного актина в клетках.
Рис. 9. Экспрессия WA и джасплакинолид увеличивают содержание F актина в клетках. Микрофотографии клеток линии CV-1 Mita, экспрессирующих конститутивно активный мутант белка N-WASP (A), или обработанных 0.2 мкМ джасплакинолида в течение 30 мин. Клетки зафиксированы 4% параформальдегидом. Полимерный актин выявлен TRITC-фаллоидином. Клетка, экспрессирующая EGFP-WA, отмечена на рисунке стрелкой. Масштаб 10мкм.
Во-первых, мы увеличивали уровень содержания F-актина, добавляя в среду к клеткам джасплакинолид, пептид, выделенный из морской губки Jaspis johnstoni, который стабилизирует фибриллярный актин и стимулирует его полимеризацию (Bubb et al., 1994). Во-вторых, мы стимулировали полимеризацию актина, путем активации эндогенного Arp2/3 комплекса, который, как было показано ранее, стимулирует полимеризацию новых актиновых филаментов (Pollard et al., 2000;
Evangelista et al., 2003). Для этого мы экспрессировали С-концевой домен WA белка N-WASP (Wiskott -Aldrich Syndrome Protein) (плазмида любезно предоставлена Др.
Михаэлем Уэем (Cancer Research UK, Лондон, Великобритания), который действует как конститутивно активный стимулятор Arp2/3 комплекса (Yamaguchi et al., 2000;
Moreau et al., 2000;
Harlander et al., 2003).
В обоих случаях уровень полимерного актина в клетках существенно возрастал (рис. 9). Однако, ни обработка клеток джасплакинолидом, ни экспрессия в них WA не уменьшали относительную подвижность митохондрий (рис. 10).
Рис. 10 Индукция F-актина, вызываемая только конститутивно активным мутантом белка mDia1, приводит к снижению подвижности митохондрий.
Количественный анализ движения митохондрий в клетках экспрессирующих:
конститутивно активный мутант белка mDia1 (EGFP-mDia1, (N3);
конститутивно активный мутант белка Cdc42 (EGFP-Cdc42 (Q61L);
конститутивно активный мутант белка Rac1 (EGFP-Rac1 (Q61L);
конститутивно активный мутант белка N-WASP (EGFP-WA) и в клетках, обработанных джасплакинолидом. В каждом опыте было проанализировано по клеток (3 независимых эксперимента). Данные представлены в виде M ± SD.
Различие в относительной подвижности митохондрий в клетках, экспрессирующих EGFP-mDia1(N3), со всеми остальными представленными опытами достоверно с P 0.01.
Мы также проверили, как влияет на подвижность митохондрий экспрессия двух других белков, участвующих в регуляции актинового цитоскелета, малых ГТФаз Rac1 и Cdc42. Конститутивно активные мутанты этих белков активировали полимеризацию актина и образование ламеллиподий и филоподий, соответственно, как было показано ранее (Ridley et al., 1992). Однако, митохондрии в клетках, экспрессирующих Rac1-(Q61L) и Cdc42-(Q61L), были даже более подвижны, чем в контроле (рис. 10).
Таблица 3.
Латранкулин mDia1N + Контроль WA mDia1N В Латранкулин В Доля 65% ± неподвижных 67% ± 20%** 45% ± 27%** 99% ± 1%*** 45% ± 21%*** 14% митохондрий* Доля времени в движении 10% ± 4% 16% ± 7% --- 12% ± 2% 8% ± 3% отдельных митохондрий* Средняя скорость 0.28 ± во время 0.29 ± 0.01 0.32 ± 0.01 --- 0.33 ± 0. 0. движения, мкм/с* Число клеток 15 (410) 13 (388) 10 (250) 9 (303) 10 (280) (митохондрий) * Определение этих характеристик движения митохондрий приведено в части «Методы исследования» данного реферата. Данные представлены в виде M ± SD.
** Различие достоверно с P 0.05.
*** Различие достоверно с P 0.01.
Таким образом, наши данные свидетельствуют в пользу того, что активация mDia1, а не других стимулирующих полимеризацию актина белков, способствует закреплению митохондрий на периферии клеток. Поэтому, предположение о том, что причиной снижения подвижности митохондрий является увеличение вязкости цитоплазмы вследствие повышенного содержания F-актина, скорее всего не верно.
В пользу специфических взаимодействий между митохондриями и F-актином, говорит тот факт, что при разборке F-актина средняя скорость движения митохондрий практически не меняется (таблица 3). В то же время значительно уменьшается доля стационарных митохондрий, то есть тех митохондрий, которые были неподвижными в течение всего времени наблюдения (таблица 3).
Заключение.
Имеющиеся к настоящему времени данные указывают на то, что распределение митохондрий может контролироваться на уровне регуляции активности моторных белков (Morris and Hollenbeck, 1995;
De Vos et al., 2000;
De Vos et al., 2003), а также на уровне регуляции переключения между подвижным состоянием и стационарным состоянием (Morris and Hollenbeck, 1993;
Leterrier et al., 1994;
Wagner et al., 2003;
Chada and Hollenbeck, 2003;
Chada and Hollenbeck, 2004).
В настоящей работе мы показали, что переход митохондрий из подвижного состояния в стационарное регулируется ростовым фактором LPA. Было показано, что за передачу сигнала от рецептора LPA отвечает регуляторный каскад, включающий малую ГТФ-азу RhoA и активируемый ею белок mDia1. Последний относится к семейству форминов и в активированном состоянии стимулирует образование F-актина, который специфически взаимодействует с митохондриями и ингибирует их движение по микротрубочкам.
LPA, связываясь с рецепторами на поверхности клеток запускает ряд сигнальных каскадов, вызывающих, в том числе, образование актиновых стресс фибрилл и их сокращение (Ridley and Hall, 1992;
Hall, 1994). В наших опытах неподвижные, вследствие действия LPA, митохондрии локализовались в области новообразованных стресс-фибрилл. Можно предположить, что близость митохондрий к сократительным пучкам выгодна клетке, поскольку образование пучков F-актина и миозин-зависимое сокращение требуют интенсивного расхода энергии в виде АТФ. Таким образом, перераспределение митохондрий может объясняться локальным изменением в потребности АТФ, что было показано ранее в работах из лаборатории П. Холленбека (Morris and Hollenbeck, 1993). Известно, что в клетках разных типов митохондрии, находящиеся на периферии и взаимодействующие с цитоскелетом, имеют более высокий трансмембранный потенциал, чем те, которые локализуются в околоядерной области (Collins et al., 2002). А в культивируемых нейронах митохондрии с высоким трансмембранным потенциалом (высокоэнергизованные митохондрии) локализуются в основном в дендритах, а не в аксоне, и подвижность их в дендритах также существенно меньше (Overly et al. 1996). Можно предположить, что существует связь между подвижным состоянием митохондрий и их трансмембранным потенциалом.
Наши результаты отчетливо свидетельствуют в пользу того, что основную роль в удерживании митохондрий в неподвижном состоянии играют актиновые микрофиламенты. Разборка F-актина при добавлении латранкулина В приводила к повышению подвижности митохондрий в клетках. Интересно, что митохондрии переходили в стационарное состояние только при увеличении содержания F-актина, образующегося вследствие активации белка mDia1. Подавление подвижности митохондрий не наблюдалось при активации других белков, стимулирующих полимеризацию актина (N-WASP, Cdc42, Rac1), а также при стабилизации полимерного актина джасплакинолидом. Эти результаты исключают предположение о том, что ингибирование подвижности митохондрий является следствием возросшей вязкости цитоплазмы, вызванной избыточным содержанием актиновых филаментов.
В пользу специфических взаимодействий между митохондриями и F-актином, говорит тот факт, что при разборке F-актина средняя скорость движения митохондрий практически не меняется (таблица 3). В то же время значительно уменьшается доля стационарных митохондрий, то есть тех митохондрий, которые остаются неподвижными в течение всего времени наблюдения.
Регуляция распределения митохондрий другим ростовым фактором была показана ранее (Chada and Hollenbeck, 2003). Локальная стимуляция аксона NGF (нервным ростовым фактором) приводила к тому, что митохондрии скапливались в местах стимуляции и переставали двигаться. Этот процесс зависел от активности фосфоинозитол- 3-киназы (PI-3-киназы), одного из компонентов сигнальной цепи, запускаемой активацией NGF рецепторов. Ингибирование PI -3-киназы полностью подавляло эффект иммобилизации митохондрий, вызванный NGF. Неподвижное состояние большинства митохондрий также нарушалось после деполимеризации F актина латранкулином В, свидетельствуя о том, что, как и в нашем случае с LPA, полимерный актин необходим для удерживания митохондрий в стационарном состоянии. Поскольку PI-3-киназа способна активировать малые ГТФазы Rac1 и RhoA (Arrieumerlou et al., 1998;
Reif et al., 1996), можно предположить, что NGF активирует PI-3-киназу, которая затем активирует малую ГТФазу RhoA, а белок RhoA, в свою очередь, стимулирует mDia1-зависимую полимеризацию актиновых микрофиламентов, препятствующих транспорту митохондрий.
Выводы 1. Найден новый регулятор подвижности митохондрий - лизофосфатидная кислота (LPA), который ингибирует их движение по микротрубочкам.
2. Выявлено участие регуляторных белков, малой ГТФазы RhoA и ее белка мишени mDia1, в передаче сигнала LPA, который приводит к подавлению движения митохондрий.
3. Показано, что ингибиторное действие белка mDia1 на движение митохондрий строго зависит от его способности стимулировать полимеризацию актина, связывающего митохондрии.
4. Движение митохондрий ингибируется при их взаимодействии с полимерным актином, который образуется только под действием mDia1, а не других индукторов.
Список опубликованных статей по теме диссертации 1. А.В. Кулик, Ф.К. Гиоева, А.А. Минин. Видеомикроскопическое исследование движения митохондрий // Онтогенез. 2002. Т. 33. №5. С. 366-373.
2. А.А. Минин и А.В. Кулик. Внутриклеточный транспорт. Принципы регуляции // Успехи биологической химии. 2004. Т. 44. С. 171-208.
3. О.Е. Некрасова, Ан.А. Минин, А.В. Кулик, А.А. Минин Регуляция фибронектином формы и внутриклеточного распределения митохондрий. // Биологические мембраны. 2005. Т. 22. № 1. С. 58-65.
4. А.В. Кулик, О.Е. Некрасова, А.А. Минин. Фибриллярный актин регулирует подвижность митохондрий. // Биологические мембраны. 2006. Т. 23. № 1. С. 52-59.
Работа выполнена при поддержке Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF, грант RB1-2506-PU-03 A. A. M.) и программой Президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология”.
Кулик Александр Валентинович РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСПОРТА МИТОХОНДРИЙ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Подписано в печать 30.01.06. Формат 60 84 1/16. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 1,0. Уч.- изд. л. 1,0. Тираж 70 экз. Заказ № ф Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский физико-технический институт (государственный университет) Отдел автоматизированных систем “ФИЗТЕХ-ПОЛИГРАФ” 141700, Моск. обл., г. Долгопрудный, Институтский пер.,