Новые промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм
На правах рукописи
КУЛУЕВ БУЛАТ РАЗЯПОВИЧ НОВЫЕ ПРОМОТОРЫ КАУЛИМОВИРУСОВ И КОНСТРУИРОВАНИЕ ИХ ХИМЕРНЫХ ФОРМ 03.00.04 - биохимия 03.00.03 – молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2007
Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН и на кафедре биохимии и биотехнологии Башкирского государственного университета.
Научные руководители Доктор биологических наук, профессор Р.И. Ибрагимов Доктор биологических наук, профессор А.В. Чемерис Официальные оппоненты Доктор биологических наук, профессор А.Ф. Топунов Кандидат биологических наук, доцент Т.В. Маркушева
Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН
Защита диссертации состоится 14 ноября 2007 г. в 16 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу:
450054, г. Уфа, проспект Октября, 71.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.
Автореферат разослан «14» октября 2007 г.
Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, к.б.н. Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. При создании трансгенных растений весьма важным является выбор промотора для обеспечения достаточного уровня экспрессии чужеродного гена. В настоящее время одним из наиболее широко используемых для этих целей служит “сильный” конститутивный 35S промотор, выделенный из вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) из группы каулимовирусов (Odell et al., 1985). Этот промотор имеет в 110 раз большую эффективность (Sanders et al., 1987), чем широко применявшийся ранее, промотор нопалинсинтазы из Т-ДНК агробактерий. Однако для решения некоторых задач по созданию трансгенных растений и обеспечения достаточного уровня экспрессии белковых продуктов, экспрессионной эффективности 35S промотора оказалось недостаточно (Mitsuhara et al., 1996).
При этом во многих бинарных векторах для трансформации растений как селективный, так и маркерный (или целевой) гены находятся под контролем все того же классического 35S промотора, что может отрицательно сказываться на уровне экспрессии, а иногда приводит и к "молчанию" трансгена. В этой связи представляет значительный интерес как обнаружение новых, более эффективных промоторов, так и создание их химерных форм. И поскольку 35S промотор вируса мозаики цветной капусты оказался во многом универсальным, стали осуществляться поиски аналогичных промоторов других каулимовирусов.
Так, были выделены и исследованы промоторы каулимовирусов сои (Glycine max) (Hasegawa et al., 1989), норичника (Scrophularia californica) (Sanger et al., 1990), ночной красавицы (Mirabilis jalapa) (Dey, Maiti, 1999), земляники (F. x ananassa) (Pattanaik et al., 2004), маниока (Manihot sp.) (Samac et al., 2004). Все эти промоторы показали “силу”, сравнимую, а некоторые - превосходящую “силу” промотора вируса мозаики цветной капусты. Из известных ныне промоторов каулимовирусов оставались не исследованными таковые у вирусов мозаики георгина (ВМГ), кольцевой гравировки гвоздики (ВКГГ), желтых листовых завивок цеструма и некоторых других. Помимо поиска новых каулимовирусов, были проведены эксперименты по созданию эффективных промоторных кассет, в состав которых были включены модифицированные и гибридные с другими промоторами формы 35S промотора. Некоторые из полученных конструкций уже нашли применение в генной инженерии растений и показали высокий уровень экспрессии белковых продуктов. Например, 35S промотор с двумя энхансерными доменами показал увеличение экспрессионной активности почти в два раза (Omirulleh et al., 1993);
его гибридная форма с промотором маннопинсинтазы продемонстрировала уровень экспрессии в 3- раз больший в листьях и в 10-15 раз больший в корнях различных трансгенных растений (Comai et al., 1990). Были созданы различные промоторные кассеты на основе промотора и терминатора 35S транскрипта, из которых одна форма показала увеличение уровня экспрессии в 50 раз, по сравнению с 35S промотором (Mitsuhara et al., 1996). Тем не менее, пока нет оснований считать, что самые лучшие промоторы для целей создания трансгенных растений уже найдены или сконструированы.
Одним из путей создания новых эффективных промоторов является метод направленной молекулярной эволюции in vitro. Представляет особый интерес создание химерных форм промоторов методом ДНК шаффлинга – высокоэффективного метода рекомбинации генетического материала последовательностей гомологичных белков или их доменов (Stemmer, 1994), а также промоторных последовательностей (Remans et al., 2005). В качестве родительских последовательностей ДНК здесь предпочтительно использовать эффективные природные промоторы, каковыми являются промоторы каулимовирусов, все исследованные формы которых показали весьма высокий уровень экспрессии белков в трансгенных растениях. При этом могут быть получены конструкции, более эффективные в трансгенных растениях, чем природные формы промоторов каулимовирусов.
Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в выделении и исследовании новых промоторов каулимовирусов и создании их химерных форм методом ДНК шаффлинга.
Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:
1. Выявление филогенетического родства каулимовирусов на основе анализа нуклеотидных последовательностей их геномов, поиск промоторных последовательностей и подбор праймеров для их амплификации;
2. Поиск и отбор инфицированных каулимовирусами растений;
3. Амплификация и клонирование промоторов вируса мозаики георгина (ВМГ) и вируса кольцевой гравировки гвоздики (ВКГГ);
4. Определение нуклеотидной последовательности промоторов ВМГ и ВКГГ и проведение сравнительного анализа с промоторами других каулимовирусов;
5. Клонирование промоторов ВМГ и ВКГГ в бинарных векторах pCambia;
6. Получение химерных форм промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга;
7. Анализ экспрессионной активности генов GUS (-глюкуронидаза) и GFP (зеленый флюресцентный белок) под контролем природных форм промоторов каулимовирусов в протопластах N.tаbacum;
8. Количественный анализ экспрессионной активности промоторов ВМГ и ВКГГ в трансгенных растениях N. tаbacum.
Научная новизна. Впервые амплифицирован и секвенирован участок генома вируса мозаики георгина, содержащий часть межгенного спейсера ( пн), промотор и 7-ю открытую рамку считывания. Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей промоторов ВМГ и ВКГГ с промоторами других каулимовирусов. Показано распространение вируса мозаики георгина на территории г. Уфы и окрестностей. Впервые для получения одноцепочечной ДНК промоторов применена амплификация по типу катящегося кольца с использованием ДНК полимеразы фага рhi 29. Получены химерные последовательности промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга.
Впервые проведен анализ экспрессионной активности промоторов вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики в протопластах и трансгенных растениях табака. Показано, что для проявления экспрессионной активности промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики достаточно последовательности размером 370 пн.
Практическая значимость работы. Промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики могут быть применены при создании трансгенных растений в качестве заменителя классического 35S промотора, так как большое количество его копий в геноме могут быть одной из причин так называемого “молчания” трансгена. Химерные промоторы каулимовирусов могут оказаться более эффективными, чем их природные аналоги и найдут применение при создании трансгенных растений, продуцирующих различные лекарственные или другие физиологически активные вещества и используемых в промышленных масштабах, так как применяемые для тех же целей клетки бактерий не всегда обеспечивают правильное сворачивание рекомбинантных белков. Подобранные праймеры для амплификации промоторов каулимовирусов могут быть использованы для идентификации этих вирусов в инфицированных растениях.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006);
на международной конференции “Генетика в России и мире” (Москва, 2006);
на Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва – Пущино-на-Оке, 2006);
на Четвертом съезде общества биотехнологов России (Пущино, 2006), на Школе семинаре молодых ученых «Биомика – наука ХХI века» (Уфа, 2007).
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 10 печатных работах, а также депонированы в международных банках данных EMBL, GenBank и DDBJ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах, содержит 3 таблицы и 42 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы, включающего 203 источников.
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Агидель 05-04-97914, грантами Программы поддержки ведущих научных школ РФ НШ-2217.2003.4 и НШ-1003.2006.4.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследований были промоторы вируса мозаики цветной капусты, вируса кольцевой гравировки гвоздики и вируса мозаики георгина. В работе использованы следующие методы. ДНК из листьев, пораженных каулимовирусами, выделяли фенольно-детергентным методом (Graham, 1978).
Плазмидную ДНК выделяли методом мягкого лизиса (Clewel, Helinski, 1969) с некоторыми модификациями. При анализе рекомбинантных клонов для определения размера вставки применяли быстрый метод щелочного лизиса бактериальных колоний (Sambrook et al., 1989). Расщепление ДНК проводили в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками. Качество и количество выделенных препаратов определяли аналитическим электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Агарозный гель-электрофорез проводили в приборах модели Sub-Cell GT WIDI MINI (Bio-Rad, США). Элюцию фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили по методу (Sealey, Southern, 1982). ПЦР проводили в амплификаторе производства компании “ДНК-технология” с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus (McPherson et al., 1995).
Для клонирования амплификатов промоторов каулимовирусов использовали вектор pKRX. Подготовку и трансформацию компетентных клеток E.coli осуществляли по методу Коэн (Cohen et al., 1972). Секвенирование проводили, на автоматическом секвенаторе «ABI PRISM 310 Genetic Analyzer» (Applied Biosystems, Inc., США). Электрокомпетентные клетки E.coli и A.tumefaciens готовили по методу Ausubel et al. (1987) и Lin (1995). Протопласты трансформировали методом опосредованного полиэтиленгликолем (PEG 4000) эндоцитоза плазмидной ДНК, затем проводили анализ транзиентной экспрессии (Lyznik et al., 1989;
Locatelli et al., 2003). Трансгенные формы табака получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков (Horsch et al., 1985). Промоторы каулимовирусов в одноцепочечной форме были получены с помощью амплификации по типу катящегося кольца с использованием ДНК полимеразы фага phi 29. ДНК шаффлинг проводили по (Stemmer, 1994) с модификациями (Zhao, Arnold, 1997) и (Kikuchi et al., 2000).
Флюориметрическое определение активности GUS в клеточных экстрактах проводили по методу, описанному Jefferson (1987) с модификациями (Зверева, Романов 2000). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ DNASIS (Hitachi Software Engineering Co, Япония) и Lasergene фирмы “DNASTAR, Inc.” (США).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Выяснение филогенетических связей каулимовирусов, поиск промоторных последовательностей, подбор праймеров для их амплификации и поиск инфицированных каулимовирусами растений.
Для проведения экспериментов по направленной молекулярной эволюции необходимым условием является наличие гомологии между in vitro нуклеотидными последовательностями (Stemmer, 1994). Поэтому нами был предварительно осуществлен поиск каулимовирусов, близкородственных к вирусу мозаики цветной капусты. Для определения филогенетических связей каулимовирусов был осуществлен анализ 14-ти полностью секвенированных последовательностей геномов каулимовирусов и частично секвенированной последовательности генома скрытого вируса хрена. Для этого использовали данные из международного банка нуклеотидных последовательностей. Было выяснено, что по гомологии нуклеотидной последовательности геномов наиболее близко к вирусу мозаики цветной капусты стоят скрытый вирус хрена и вирус кольцевой гравировки гвоздики (рис. 1). Другую близкую группу образуют вирус мозаики норичника (ВМН) и вирус мозаики ночной красавицы (ВМНК). Несколько дальше отстоит вирус, окаймляющий жилки земляники (ВОЖЗ). Еще одну группу каулимовирусов, с меньшей гомологией нуклеотидной последовательности с вирусом мозаики цветной капусты образуют каулимовирусы черешни, цеструма, арахиса, маниока и сои (рис. 1).
Рис. 1. Филогенетическое древо сходства основных представителей каулимовирусов, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей геномов. CaMV – ВМЦК;
HRLV – скрытый вирус хрена;
CERV – ВКГГ;
FMV – вирус мозаики норичника (ВМН);
MMV – вирус мозаики ночной красавицы (ВМНК);
SVBV – вирус, окаймляющий жилки земляники (ВОЖЗ);
SbCMV – вирус бледной пятнистости сои;
CesCauliVir – вирус желтых листовых завивок цеструма;
PeanutCSV – вирус бледной полосатости арахиса;
BlueberryRRV – вирус красных кольцевых пятен черешни;
CsVMV – вирус мозаики маниока.
Для проведения дальнейшего анализа и отбора промоторов для ДНК шаффлинга с 35S промотором, были взяты ВКГГ, ВМН и ВОЖЗ, поскольку эти вирусы оказались филогенетически близки к ВМЦК. Нуклеотидные последовательности геномов 4-х штаммов ВМЦК, 2-х штаммов ВКГГ и по одному штамму ВМН, ВОЖЗ, а также ВМНК были выровнены с помощью программы Megalign пакета Lasergene. Используя информацию о расположении промоторов ВМЦК, ВМН и ВМНК в геноме, было оценено примерное местоположение промоторов ВКГГ и ВОЖЗ, затем промоторные участки исследуемых каулимовирусов были выровнены для оценки их гомологии.
Оказалось, что уровень гомологии промоторов каулимовирусов почти совпадает с уровнем гомологии последовательности геномов, и в построенном филогенетическом древе каулимовирусы образовали те же филогенетически связанные группы. Вирус мозаики георгина также является одним из представителей каулимовирусов. По данным GenBank геном данного вируса секвенирован лишь частично, тем не менее по анализу известных последовательностей было выявлено, что этот вирус имеет большее филогенетическое родство с ВМН и ВМНК. Исходя из полученных нами данных, были подобраны праймеры для амплификации промоторов ВМН, ВОЖЗ, ВМГ и ВКГГ и был осуществлен поиск инфицированных каулимовирусами растений в Уфимском регионе. В результате из перечисленных вирусов в г. Уфе был обнаружен лишь вирус мозаики георгина (ВМГ).
2. Амплификация и клонирование промотора вируса мозаики георгина. Промотор ВМГ и его фланкирующие участки по данным GenBank не секвенированы, и это не позволяло подобрать удобные праймеры для амплификации полногеномного промотора. Было решено амплифицировать более протяженный участок нуклеотидной последовательности, включающий промоторную область. При подборе праймеров использовались лишь известные последовательности генома ВМГ и подбирались участки, наиболее близко прилегающие к промотору. Наиболее подходящей оказалась следующая пара праймеров:
5-CAGTGACTCATCCTCCAATA-3, 5-AATATCTACTGACATTTCTT-3.
Размер амплифицируемого участка составил приблизительно 1290 пн (рис. 2).
Рис. 2. Электрофореграмма амплификата участка генома ВМГ, размером около 1290 пн, из образцов ДНК инфицированного георгина.
Маркером служит ДНК фага, расщепленная эндонуклеазой рестрикции BstEII.
Проведенный анализ нуклеотидной последовательности позволил оценить расположение и подобрать праймеры для амплификации самого промотора, размер которого, судя по гомологии с родственными каулимовирусами, не должен превышать 400 пн. В итоге был амплифицирован промоторный участок генома вируса мозаики георгина размером 442 пн, который был клонирован в фагмидном векторе pKRX.
3. Амплификация и клонирование промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики. Растения, листья которых по морфологическим признакам инфицированы вирусом кольцевой гравировки гвоздики, были получены из Института вирусологии, микробиологии и биологической безопасности (г. Брауншвейг, Германия). В GenBank опубликована последовательность генома вируса кольцевой гравировки гвоздики. Для оценки расположения промотора провели выравнивание генома ВКГГ с геномами 4-х штаммов ВМЦК. Далее, учитывая выравнивание промоторных последовательностей наиболее близкородственных каулимовирусов, осуществили подбор праймеров для амплификации промотора ВКГГ, при этом отдавали преимущество более консервативным участкам. Было подобрано 3 праймера:
CERVFltF1 5'–ATTAAAAGAACAATGGCAAG–3', CERVFltF2 5'–AGAAGATTTAATGGCAATCC–3', CERVFltR 5'–AGGACTTAGGCTCAACACAT–3'.
При амплификации с праймерами CERVFltF1 и CERVFltR размер ампликона должен составить 651 пн, а с праймерами CERVFltF2 и CERVFltR - 501 пн. Из 4-х образцов ДНК, выделенных из листьев гвоздичных, нам удалось амплифицировать ДНК размерами около 500 пн и 650 пн (рис. 3), что подтвердило наличие ВКГГ в листьях гвоздичных. Далее оба фрагмента ДНК, отличающиеся лишь расположением праймеров, были клонированы в фагмидном векторe pKRX.
Рис. 3. Результаты амплификации промоторного участка генома ВКГГ размером 501 пн из различных инфицированных представителей гвоздичных (г.
Брауншвейг, Германия). Маркер - pBluescript II SK+, расщепленная эндонуклеазой рестрикции HpaII;
1 - Lychnis (смолка обыкновенная или клейкая);
2, 3 - Dianthus caryophyllus (гвоздика садовая);
4 - Dianthus barbatus (гвоздика турецкая);
5 представитель семейства гвоздичных, видовая принадлежность которого не определена.
4. Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности промотора вируса мозаики георгина. Участок генома ВМГ размером 1290 пн был секвенирован с применением “прямого” и “обратного” праймеров.
Сравнительный анализ показал, что была клонирована последовательность, включающая часть гена 6, промотор, большой межгенный спейсер и 7-ю открытую рамку считывания вируса мозаики георгина. Нуклеотидная последовательность большого межгенного спейсера размером 678 пн был зарегистрирован в GenBank (accession number EF463101). Промотор ВМГ частично оказался гомологичным промоторам других каулимовирусов:
гомология с промотором вируса мозаики норичника составила 60%, а с промотором вируса мозаики ночной красавицы – 63%. Сравнительный анализ регуляторных областей промоторов ВМГ, вирусов мозаики норичника и ночной красавицы показал следующее: ССАСТ-бокс у вируса норичника имеет каноническую последовательность, у ВМГ она представлена последовательностью ССААТ, у вируса ночной красавицы – GCAAC. У вирусов норичника и ночной красавицы 1-й TGACG мотив представлен последовательностью TGACG, а у ВМГ тимин заменен на аденин;
2-й TGACG мотив у всех трех видов представлен последовательностью TGACG. ТАТА бокс у всех трех видов представляет собой консенсусную последовательность ТАТАТАА.
Нуклеотидная последовательность промотора ВМГ размером 442 пн была зарегистрирована в GenBank (accession number EF513491). Кроме часто исследуемых регуляторных участков, у промоторов ВМГ, ВМН и ВМНК была выявлена еще одна консенсусная последовательность. Оказалось, что у всех этих трех каулимовирусов в сайте инициации транскрипции имеется каноническая последовательность GATCA(A)TCGAAA (рис. 4).
Рис. 4. Консенсусная последовательность ДНК, расположеная за ТАТА боксом и совпадающая с 3' концом -18 +1 домена промоторов ВМГ и ВМНК.
5. Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики. Клонированные в pKRX фрагменты генома ВКГГ размером 501 и 651 пн были секвенированы и последовательность промоторного участка размером 455 пн была зарегистрирована в GenBank (accession number EF513492). Поиск сходных последовательностей в базе данных генов c помощью программы “Megablast” (доступной на вебсайте NCBI) показал 95%-ную гомологию секвенированного нами промотора с промоторным участком изолята вируса ВКГГ из Нидерландов (accession number NC 003498). Выравнивание секвенированного нами промотора ВКГГ с последовательностью промотора индийского изолята ВКГГ (accession number AJ853858) c помощью программы “Megalign” показало уровень гомологии 96%. Уровень гомологии промоторов ВКГГ и ВМЦК составил 48%. Сравнительный анализ последовательностей промоторов вируса мозаики цветной капусты и вируса кольцевой гравировки гвоздики показал, что ССАСТ-бокс у промотора ВКГГ отличается от такового промотора ВМЦК и представлен последовательностью СТАСТ;
ТАТА-бокс представлен у ВКГГ последовательностью ТАТАТААAGG и у ВМЦК последовательностью ТАТАТАAGGA. 1-й TGACG мотив – у ВМЦК представлен канонической последовательностью TGACG, у ВКГГ последовательностью AGACG, 2-й TGACG мотив у обоих видов представлен последовательностью TGACG.
ССАСТ и TGACG боксы у промотора ВМЦК имеют один общий нуклеотид Т (Sanger et al., 1990), при этом в отличие от ВМГ, до ССАСТ бокса в геноме у ВМЦК не было обнаружено схожих последовательностей. Следует отметить, что после второго TGACG мотива у ВМЦК есть еще одна последовательность ССАСТ, что также совпадает с данными литературы о наличии повторов этих последовательностей (Sanger et al., 1990).
6. Конструирование химерных форм промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга. Промоторы ВМЦК (510 пн), ВКГГ (501 пн) и ВМГ (442 пн) были вырезаны из фагмидного вектора pKRX по сайту рестрикции BssHI. После этапов самолигирования, очистки и осаждения, проводили наработку одноцепочечных последовательностей при помощи амплификации по типу катящегося кольца с использованием ДНК-полимеразы фага рhi29. Для затравки использовали праймеры Т3, Т7 и праймеры, подобранные к самим промоторам. При использовании Т7 праймера образуется плюс-цепь, а при использовании Т3 праймера минус-цепь (рис. 5).
Рис. 5. Общая схема получения одноцепочечной ДНК при помощи ДНК полимеразы фага рhi29.
Одноцепочечные формы промоторов ВМЦК, ВКГГ и ВМГ были использованы нами в качестве исходного материала при проведении ДНК шаффлинга. Для удобства промоторы в одноцепочечной форме были обозначены нами в соответствии с названием вируса и праймера, с которого данную цепь ДНК нарабатывали (форвард – F, реверс – R): 35SF, 35SR, CERVF, CERVR, DMVF, DMVR. Для проведения ДНК шаффлинга, использовали все комбинаций разных цепей ДНК этих промоторов: 35SF+CERVR (смесь 1), CERVF+35SR (смесь 2), 35SF+DMVR (смесь 3), DMVF+35SR (смесь 4), CERVF+DMVR (смесь 5), DMVF+CERVR (смесь 6).
В соответствии с данными по гомологии промоторов каулимовирусов, были смешаны разные цепи ДНК промоторов ВМЦК и ВКГГ, обработаны ДНКазой I, при этом были получены фрагменты ДНК размерами около 50 - 300 пн. Далее был проведен первый раунд амплификации без добавления праймеров, при котором происходит постепенное увеличение размеров восстанавливаемых фрагментов и образование их пула. В ходе первого раунда ДНК шаффлинга генерируется бибилиотека рекомбинантов, несущих точки состыковки – кроссоверы, где происходит перестановка отдельных частей матрицы с одной родительской последовательности на другую. Затем был проведен 2-й раунд амплификации с использованием специально подобранных праймеров, фланкирующих исходные гены. В результате при смешивании (+)-цепи промотора ВМЦК с (-)-цепью промотора ВКГГ (1 смесь) и двух раундов ПЦР, получили амплификат размером больше 500 пн (рис. 6). С помощью электрофоретического анализа был показан неоднородный состав амплификата, содержащий ДНК различного размера.
Благодаря тому, что при втором раунде ПЦР использовали “форвард” праймер промотора ВМЦК и “реверс” праймер промотора ВКГГ, в качестве конечных продуктов реакции нарабатываются лишь химерные молекулы ДНК. Для контроля использовали смесь промоторов ВМЦК и ВКГГ в двуцепочечной форме и использовали эту матрицу во втором раунде ПЦР, при этом наработка продукта, как и ожидалось, не происходила. При смешивании (+)-цепи промотора ВКГГ и (-)-цепи промотора ВМЦК (смесь 2) получили однородный амплификат размером около 500 пн (рис 6). При использовании форвард праймера промотора ВКГГ и реверс праймера ВМЦК, амплификация смеси промоторов в двуцепочечной форме также не проходит (минус-контроль).
Рис. 6. Электрофореграмма амплификатов после проведения двух раундов ПЦР ДНК шаффлинга промоторов ВМЦК и ВКГГ.
1 – результат ДНК шаффлинга смеси 1 ((+) цепь промотора ВМЦК и (-) цепь промотора ВКГГ);
2 – “минус” контроль для смеси 1 (ПЦР анализ смеси промоторов ВМЦК и ВКГГ в двуцепочечной форме при помощи форвард праймера промотора ВМЦК и реверс праймера ВКГГ);
3 - результат ДНК шаффлинга смеси 2 ((+) цепь промотора ВКГГ и (-) цепь промотора ВМЦК);
4 - “минус” контроль для смеси 2 (ПЦР анализ смеси промоторов ВМЦК и ВКГГ в двуцепочечной форме при помощи форвард праймера промотора ВКГГ и реверс праймера ВМЦК).
Полученные амплификаты были клонированы в плазмиде pKRX, белые колонии пересеяли, выделили плазмиды и провели ПЦР анализ. Как и ожидалось, были получены амплификаты различного размера (рис. 7), все они были приблизительно равны или больше по размеру, чем промоторы ВМЦК и ВКГГ.
Рис. 7. Электрофореграмма ПЦР анализа клонов, полученных при клонировании амплификата из смеси 1 после ДНК шаффлинга в фагмидный вектор pKRX. С 1 по 7 - номера анализируемых клонов;
8 – амплификат промотора ВКГГ размером 501 пн (маркер).
Последовательности промоторов первых двух клонов были секвенированы. Анализ секвенированной последовательности показал, что оба клона содержат химерные формы промоторов ВМЦК и ВКГГ. Размер промотора первого клона составил 905 пн (рис. 8). В начале располагается полноразмерный промотор ВМЦК (510 пн), затем 5'-конец промотора ВКГГ размером 253 пн, далее часть фагмидного вектора pKRX размером 75 пн (область полилинкера) и в конце находится 3'-конец промотора ВКГГ размером 67 пн. Размер промотора второго клона составил 715 пн где последовательно расположены 5'-конец промотора ВМЦК размером 214 пн и полноразмерный промотор ВКГГ (501 пн) (рис. 8).
Рис. 8. Расположение составных частей в химерных промоторах 1 го и 2 го клонов.
В итоге было получено около 30-ти клонов, промоторы некоторых из них были секвенированы и оказались химерными, при этом были использованы все возможные комбинации промоторов каулимовирусов (смеси 1 – 6) (рис. 9).
Рис. 9. Электрофореграмма ПЦР анализа клонов, полученных при клонировании амплификата из смеси 4 (DMVF+35SR) в фагмидный вектор pKRX после ДНК шаффлинга. 1 – амплификат промотора ВМЦК (маркер – пн);
2 – промотор ВМГ (маркер – 442 пн);
3 – 25 – номера анализируемых клонов.
Было выбрано три химерных промотора для клонирования в бинарный вектор pCambia 1304, с целью проведения анализа их экспрессионной активности в клетках E.coli и A.tumefaciens.
7. Анализ экспрессионной активности генов GUS и GFP под управлением химерных и природных форм промоторов каулимовирусов в клетках E.coli, A.tumefaciens и N.tаbacum. Промоторы ВКГГ (501 пн и 370 пн), ВМГ (442 пн) и три химерных промотора были клонированы в вектор pCambia 1304, где они могли управлять экспрессией генов GUS и GFP одновременно.
Полученными ДНК-конструкциями трансформировали компетентные клетки E.coli и A.tumefaciens и анализировали экспрессию гена GUS при помощи субстрата x-gluc. Все анализируемые промоторные последовательности показали примерно одинаковую, визуально детектируемую, активность как в клетках E.coli, так и в клетках A.tumefaciens.
Конструкции вектора pCambia 1304 с промоторами ВКГГ (501 и 370 пн) и ВМГ (442 пн) были использованы для трансформации протопластов табака и анализа транзиентной экспрессии репортерных генов GUS и GFP в растительных клетках. С помощью данного метода мы показали, что амплифицированные нами промоторные последовательности ВМГ и ВКГГ являются достаточными для проявления транзиентной экспрессии генов GUS и GFP в растительных клетках (рис. 10).
Рис. 10. a) Транзиентная экспрессия гена GUS под управлением промотора ВКГГ размером 501 пн в протопластах табака (трансформированный протопласт окрашивается в синий цвет и на рисунке выглядит более темным);
б) Транзиентная экспрессия гена GFP под управлением промотора ВМГ в протопластах табака (трансформированные протопласты светятся ярким зеленым цветом и на рисунке выглядят более светлыми).
Промоторные последовательности ВКГГ размерами 501 и 370 пн показали приблизительно одинаковый уровень экспрессионной активности в протопластах табака. Промотор ВКГГ размером 501 пн и промотор ВМГ размером 442 пн были клонированы в векторы pCambia 1281Z и pCambia 1291Z. Затем при помощи данных конструкций были получены трансгенные растения табака, которые после проведения гистохимического анализа с помощью субстрата x-gluc (рис. 11), были отобраны для количественного определения активности GUS в клеточных экстрактах.
Рис. 11. Гистохимический анализ экспрессии гена GUS в трансгенном по промотору ВМГ табаке. Экспрессия гена GUS детектируется визуально окрашиванием растительной ткани в синий цвет (на черно-белом изображении выделяется потемнением).
Для каждого промотора были отобраны по четыре разных трансгенных растения, из которых были выделены белки и проверена активность глюкуронидазы с помощью субстрата 4-MUG (4-метилумбеллиферил--D глюкуронид) и продукта реакции 4-MU (4-метилумбеллиферон), способной к флюоресценции. Измерения флюоресценции проводили на спектрофлюориметре после 30 мин работы фермента. Концентрацию 4-MU определяли по калибровочной кривой, которую построили заранее. Результаты измерения активностей промоторов были выражены в pmol 4-MU мин-1мг-1 белка.
Для разных трансгенных растений активность гена GUS различалась, но в среднем для 35S промотора мы получили 482.6 pmol 4-MU мин-1мг-1 белка, для промотора ВМГ: 480.1 pmol 4-MU мин-1мг-1 белка, а для промотора ВКГГ: 442. pmol 4-MU мин-1мг-1 белка (табл. 1).
Таблица Результаты флюориметрического анализа экспрессионной активности гена GUS под управлением промоторов ВМЦК, ВКГГ и ВМГ в трансгенных растениях табака Трансгенное 35S промотор Промотор ВМГ Промотор ВКГГ растение 1 859.0 606.5 367. 2 151.7 427.3 437. 3 612.0 532.8 453. 4 307.6 353.7 510. Ср. значение 482.6±106.4 480.1±37.7 442.1±19. По данным таблицы можно сделать вывод о том, что 35S промотор и промоторы вирусов мозаики георгина и кольцевой гравировки гвоздики одинаковы по экспрессионной активности. Полученные нами результаты в целом совпадают с данными по промоторам уже исследованных каулимовирусов. Следует отметить, что один и тот же промотор в разных трансгенных растениях проявляет различный уровень транскрипционной активности. Вариабельность экспрессии репортерного гена GUS в различных трансгенных растениях одного вида видимо возникают из-за различного их расположения в геноме и из-за общих физиологических и генетических различий между разными растениями выборки.
ВЫВОДЫ 1. Клонированы и секвенированы промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики. Уровень гомологии этих промоторов с промоторами других каулимовирусов составил приблизительно 50-60%.
Наиболее близким к промотору вируса мозаики георгина оказался промотор вируса мозаики ночной красавицы, а к промотору вируса кольцевой гравировки гвоздики – 35S промотор вируса мозаики цветной капусты.
2. Сравнительный анализ канонических регуляторных последовательностей промоторов каулимовирусов показал, помимо типичных повторяющихся последовательностей ССАСТ, TGACG и ТАТА, наличие других консервативных участков, функция которых не определена.
3. На основе одноцепочечных ДНК-матриц промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга созданы химерные формы промоторов вирусов мозаики цветной капусты, кольцевой гравировки гвоздики и мозаики георгина в различных комбинациях.
4. Промоторы вируса кольцевой гравировки гвоздики и вируса мозаики георгина проявляют транскрипционную активность в протопластах и трансгенных растениях табака N.tabacum. Для проявления экспрессионной активности для промотора ВКГГ достаточно последовательности размером 370 пн.
5. Количественный анализ активности исследуемых промоторов в трансгенных растениях табака при помощи субстрата 4-MUG показал, что 35S промотор и промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики проявляют одинаковый уровень экспрессионной активности.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Кулуев Б.Р. Растительные параретровирусы // www.ofap.ru/portal/ejurnal /2006/kupi_08-2006.pdf. 2005. (Электронный учебник, зарегистрированный в отраслевом фонде алгоритмов и программ Государственного координационного центра информационных технологий).
2. Кулуев Б.Р. Поиск новых промоторов каулимовирусов и конструирование их химерных форм // Материалы XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов”. Том IV М.: Изд-во МГУ, 2006. С. 22-23.
3. Кулуев Б.Р., Чемерис А.В. Промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм методом ДНК шаффлинга // Материалы международной конференции “Генетика в России и мире”, посвященной 40 летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Москва, 2006. С.
105.
4. Кулуев Б.Р., Чемерис А.В. Cравнительный анализ последовательностей полногеномных промоторов вируса мозаики цветной капусты и вируса кольцевой гравировки гвоздики // Материалы Российской школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна. Москва–Пущино-на-Оке, 2006. С. 39.
5. Кулуев Б.Р., Чемерис А.В. Секвенирование полногеномного промотора вируса мозаики георгина и анализ регуляторных областей // Материалы Российской школы–конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100–летию со дня рождения С.И. Алиханяна.
Москва–Пущино-на-Оке, 2006. С. 5.
6. Кулуев Б.Р. Конструирование химерных форм полногеномных промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга // Материалы Четвертого съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова.
Пущино, 2006. С. 126-127.
7. Кулуев Б.Р., Чемерис А.В., Ибрагимов Р.И. Поиск каулимовирусов на территории Республики Башкортостан и исследование их полногеномных промоторов // Вестник Башкирского университета, 2007. №2. С. 24-26.
8. Кулуев Б.Р. Создание трансгенных растений с увеличенными и уменьшенными органами // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико химической биологии и биотехнологии. Уфа, 2007. С. 71-73.
9. Кулуев Б.Р. Родственные классическому 35S промотору промоторы других каулимовирусов // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико химической биологии и биотехнологии. Уфа, 2007. С. 73-75.
10. Кулуев Б.Р., Чемерис А.В. Амплификация и клонирование промоторов вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики // Генетика, 2007. Т. 43, №11. В печати.
Кулуев Булат Разяпович Новые промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм Специальность 03.00.04 - биохимия 03.00.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Лицензия № 0177 от 10.06.96 г.
Подписано в печать Отпечатано на ризографе.
Формат 60х84 1/16. Усл.-печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1, Тираж 100 экз. Заказ № 313.
450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет РОСЗДРАВА»