Особенности определения и оценка накопления углеводородов в гидробионтах азовского моря
На правах рукописи
Ларин Андрей Александрович ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ОЦЕНКА НАКОПЛЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ В ГИДРОБИОНТАХ АЗОВСКОГО МОРЯ Специальность 03.02.08 – экология (химические наук
и)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Краснодар 2010 г.
Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства» (ФГУП «АзНИИРХ»)
Научный консультант: доктор биологических наук Корпакова Ирина Григорьевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Елецкий Борис Дмитриевич доктор химических наук, профессор Александрова Эльвира Александровна
Ведущая организация: ГУ «Гидрохимический институт» (г. Ростов-на-Дону)
Защита состоится 29 июня 2010 г. в ауд. 231 в 1400 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.101.16 в Кубанском государственном университете по адресу: 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного университета по адресу: 350040, г. Краснодар, ул.
Ставропольская,
Автореферат разослан 27 мая 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент Н.В. Киселева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. К числу приоритетных загрязняющих веществ по критериям экологической опасности (токсичности, генотоксичности, канцерогенности и распространенности, частоте встречаемости), обнаруженных в воде и донных отложениях Азовского моря, относятся нефтепродукты (НП), пестициды, соединения ряда металлов. Наиболее распространенным видом антропогенного воздействия на биоресурсы моря и экосистему в целом является нефтяное загрязнение.
С эколого-токсикологических позиций нефть и нефтепродукты рассматриваются как групповой токсикант неспецифического действия.
Компоненты нефти и нефтепродуктов активно воздействуют в той или иной мере на все группы живых организмов в морской среде, вызывая изменение в структуре сообществ, уменьшение их биомассы и продукции. Известно большое количество работ, описывающих токсическое действие углеводородов (УВ) нефти, распределенных в водной толще, на различные гидробионты. Однако остается невыясненным влияние сорбированных донными отложениями УВ на формирование и развитие донных сообществ.
Донные отложения являются местом обитания бентосных организмов, которые относятся к важнейшим компонентам водной экосистемы, участвующим в круговороте веществ. За счет высокой фильтрационной активности бентосные организмы обладают повышенной способностью к накоплению токсикантов. Ряд авторов отмечают положительную корреляцию между содержанием УВ в бентосных организмах и местах их обитания донных осадках. Поэтому довольно часто предлагается использовать различные бентосные организмы (в частности двустворчатые моллюски) в качестве тест-объектов при мониторинге загрязнения морской среды.
Литературные данные о степени накопления нефтяных компонентов в бентосных организмах весьма отрывочны, а по корреляции между уровнем накопления в моллюсках и загрязнением среды их обитания практически отсутствуют. Нерешенным остается также вопрос корректного аналитического определения углеводородов одновременно во всех элементах водных экосистем - воде, донных отложениях и гидробионтах. Разные методы имеют неодинаковую чувствительность и специфичность к определяемым веществам. При анализе воды, донных отложений и гидробионтов несоответствие результатов, получаемых разными методами, становится более ощутимым.
Диссертационная работа выполнена в рамках государственных контрактов с Госкомитетом РФ по рыболовству и Федерального агентства по рыболовству (Росрыболовство) по ФЦП «Мировой океан» в рамках темы «Комплексные исследования процессов, характеристик и ресурсов Черного и Азовского морей» и госзаказа на выполнение научно-исследовательских работ по направлению «Комплексное изучение водных биологических ресурсов и среды их обитания в промысловых районах Мирового океана в целях рыболовства, сохранения водных биологических ресурсов и среды их обитания».
Цель настоящей работы разработка унифицированного подхода к оценке содержания углеводородов в элементах водных экосистем и исследование зависимости накопления углеводородов в двустворчатых моллюсках Азовского моря от условий их обитания.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- разработать методику определения углеводородов в гидробионтах;
- исследовать уровень накопления углеводородов различных классов в двустворчатых моллюсках Азовского моря и среде их обитания;
- изучить взаимосвязь содержания углеводородов в двустворчатых моллюсках от уровня загрязненности среды их обитания;
- провести моделирование динамики накопления углеводородов различных классов в двустворчатых моллюсках.
Научная новизна.
Изучены особенности анализа и разработана методика определения УВ в гидробионтах с учетом состава и свойств аналита.
По результатам наблюдений, проведенных в 2004-2009 гг., исследована зависимость степени накопления УВ в двустворчатых моллюсках Азовского моря от уровня нефтяного загрязнения среды их обитания.
Личный вклад автора: непосредственное участие автора в 15 морских экспедициях, лабораторных экспериментах, обработке и анализе собранного материала. По результатам исследований автором написаны научно исследовательские отчеты и статьи, в которых проанализированы полученные данные по уровням накопления УВ в моллюсках и среде их обитания. При личном участии автора проведена разработка, усовершенствование и метрологическая аттестация методики определения УВ в гидробионтах.
Практическая значимость.
Разработана и аттестована методика определения УВ в биологических пробах, которая внедрена в АзНИИРХ при проведении экологических исследований.
Результаты исследований используются при проведении анализов гидробионтов в процессе эколого-рыбохозяйственного мониторинга элементов водных экосистем Азово-Черноморского бассейна.
Положения, выносимые на защиту:
1. Экспериментальные и теоретические материалы по особенностям определения углеводородов в гидробионтах.
2. Результаты определения углеводородов в двустворчатых моллюсках Азовского моря в различные сезоны 2004-2009 гг. с использованием предложенной методики.
3. Результаты исследований по установлению взаимосвязи накопления углеводородов в двустворчатых моллюсках и уровнем углеводородного загрязнения среды их обитания.
4. Материалы по метрологической аттестации методики определения УВ в гидробионтах.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендуемых ВАК Российской Федерации.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007);
II Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием (Краснодар, 2007);
VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «ЭКОАНАЛИТИКА - 2009» (Йошкар-Ола, 2009);
V и VI Международной научно-практической конференции молодых ученых по проблемам водных экосистем «Pontus Euxinus – 2007» и «Pontus Euxinus – 2009» (Севастополь, 2007, 2009).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 132 стр., состоит из введения, пяти глав и выводов, включает 36 рис., 20 табл., список литературы, содержащий 186 источников, в том числе 68 иностранных.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Особенности определения УВ в биологических пробах Большинство известных методик определения УВ в гидробионтах включает 3 стадии анализа: выделение из анализируемых проб, очистку экстрактов от мешающих веществ и количественное определение выделенных УВ. Для выделения УВ из анализируемых проб, как правило, используются различные органические растворители или смеси из двух растворителей.
Наиболее распространенные способы очистки экстрактов включают щелочной гидролиз, который обычно проводится водными или спиртовыми растворами едкого калия или натрия при различных температурах и времени обработки, и последующей экстракции органическими растворителями. Недостатком методик, предусматривающих проведение гидролиза, является необходимость наличия довольно значительной массы исследуемых биологических образцов, что не всегда доступно. К немаловажному фактору, особенно при выполнении рутинных анализов, относится высокая трудоёмкость и существенный расход реактивов. Реже используются методики, основанные на прямой экстракции УВ различными органическими растворителями и последующем отделении от мешающих соединений различными хроматографическими методами – колоночной, тонкослойной, гель-проникающей хроматографией.
Количественное определение выделенных УВ чаще других проводится методами газовой, газожидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Используются также оптические методы – УФ- и флуоресцентной спектрометрии.
Анализ литературных данных позволяет утверждать, что при выполнении рутинных анализов, требующих совмещения корректности результатов с минимизацией трудовых и материальных затрат, наиболее интересны методики определения УВ, основанные на измерении интегральных оптических характеристик. Несмотря на множество существующих в настоящее время методик определения УВ в гидробионтах, эта проблема остается недостаточно решенной. Практически отсутствуют работы, посвященные разработке методик, обеспечивающих одновременно корректный анализ всех элементов водных экосистем - вод, донных отложений и гидробионтов. Разные методы анализа имеют неодинаковую чувствительность и специфичность к определяемым веществам, по-разному проявляется и влияние матрицы на аналитические сигналы определяемых соединений. При анализе проб воды, донных отложений и гидробионтов сложного состава несоответствие результатов, получаемых разными методами, становится наиболее ощутимым.
Анализ литературных и наших экспериментальных данных по степени накопления УВ гидробионтами, опубликованных в период 1990-2009 гг., показал, что содержание алифатических УВ в двустворчатых моллюсках может варьировать от следовых количеств (1.6 мг/кг) до аномально высоких величин – 6800 мг/кг сырой массы. Такой же широкий разброс данных приведен и для полициклических ароматических углеводородов – от 0.01 до 100 мг/кг сырой массы. Максимальное накопление углеводородов в моллюсках отмечается после аварийных ситуаций и в хронически загрязненных районах с высоким уровнем загрязнения. Сведения по составу и содержанию УВ в морских организмах довольно отрывочны, касаются лишь отдельных классов соединений, отдельных акваторий, выполнены авторами с применением различных методов исследования. Противоречивость полученных данных с одной стороны связана со сложностью и зависимостью от многих условий процессов трансформации УВ, а с другой стороны – трудностями методического характера, обусловленными многочисленностью УВ, имеющих различное строение и свойства, которые могли бы быть положены в основу их определения.
Следует также отметить, что моллюски легко аккумулируют, но сравнительно медленно выводят УВ из организма в связи с отсутствием или, по крайней мере, слабым развитием углеводородгидроксилазной детоксицирующей системы. Такая особенность их поведения позволяет рассматривать их как потенциальные тест-объекты для контроля загрязнения водных экосистем. Предпосылкой к этому является широкое распространение моллюсков в морской среде, особенно в прибрежной зоне, легкодоступный пробоотбор, прикрепленный образ жизни и высокая фильтрационная активность, а также низкий процент биотрансформации УВ, приводящий к аккумулированию органических загрязнителей. Однако изучению взаимосвязи между уровнем накопления УВ в моллюсках и содержанием УВ в среде их обитания посвящено недостаточное количество исследований, которые могли бы ответить на вопрос: могут ли моллюски служить индикаторами загрязнения при экологическом мониторинге водных экосистем.
При определении УВ в биологических объектах возникают две основные проблемы, связанные со сложностью и непостоянством их состава, с одной стороны, и наличием липидных фракций – с другой. Из-за сложности и непостоянства состава нефтей и нефтепродуктов, в том числе и их углеводородных фракций, возникает проблема выбора характеристик для количественного определения, как суммарного содержания нефтяных компонентов, так и углеводородов. Вторая проблема связана с тем, что какие бы методики не были взяты для количественного определения УВ, в том числе хроматографические и оптические, одновременно будут регистрироваться и компоненты липидных фракций.
В отличие от других токсикантов (пестициды, ПХБ, тяжелые металлы) нефть и нефтепродукты представляют собой очень сложную смесь углеводородов и их производных, содержащих серу, азот и кислород.
Содержание отдельных компонентов в различных сортах нефти и нефтепродуктов варьирует в очень широких пределах. Попадающие в водную среду нефть и нефтепродукты практически сразу же перестают существовать в исходном состоянии. В результате сложнейших физико-химических и биохимических превращений состав и свойства компонентов нефтяного загрязнения с течением времени существенно изменяются, что создает дополнительные трудности их аналитического определения.
Благодаря липофильным свойствам, УВ в наибольшей степени накапливаются в жизненно важных органах с высоким содержанием липидов, таких как мозг, печень и гонады. При экстракции УВ из анализируемых проб полученный липидный экстракт включает собственно УВ, жиры (триацилглицерины), а также содержащиеся в меньших количествах липиды других классов (фосфолипиды, стероиды, каротиноиды, жирорастворимые витамины и др.).
Оптимизация условий анализа гидробионтов для оценки накопления УВ При разработке методики определения УВ в качестве добавок использовались УВ, выделенные из льяльной воды методом тонкослойной хроматографии. УВ вносили в мышечную ткань, печень и гонады промысловых рыб Азовского и Черного морей - пиленгаса и акулы-катран и мягкую ткань двустворчатых моллюсков Cerastoderma glaucum. УВ экстрагировали гексаном из гомогенизированных и обезвоженных сульфатом натрия проб. Эффективность выделения УВ контролировали по интенсивности люминесценции при возб = 370 нм, люм = 460 нм и по сумме интенсивностей полос поглощения при 2926 и 2956 см-1 в ИК-области спектра, соответственно на спектрофлуориметре RF-5301PC фирмы Shimadzu (Япония) и ИК-спектрофотометре IR-270 фирмы Hitachi (Япония).
Любой метод регистрации количества УВ будет искажать получаемые результаты из-за соединений, извлеченных из биологических проб вместе с углеводородами. Например, при использовании люминесцентного метода анализа предварительная очистка необходима, чтобы «избавиться» от таких соединений, как жирорастворимые витамины, гормоны, пигменты и т.п., которые из-за структурных особенностей обладают люминесцирующими свойствами. Применение метода ИК-спектроскопии также невозможно без предварительной очистки, так как все органические соединения имеют полосы поглощения валентных колебаний метильных и метиленовых групп, по интенсивности которых определяют количество УВ.
При анализе гидробионтов, важным этапом является процесс извлечения аналита из биологической матрицы, т.к. дальнейшее его определение будет зависеть от полноты экстракции. К наиболее распространенным способам выделения УВ различными растворителями (гексан, хлороформ, этиловый эфир, циклогексан, метиленхлорид или смеси растворителей) относятся: прямая экстракция, ультразвуковая, с применением микроволнового излучения, экстракция в аппарате Сокслета, сверхкритическая флюидная экстракция, жидкостная экстракция под давлением, твердофазная микроэкстракция.
Для разделения выделенных компонентов наиболее часто используется колоночная (КХ) или тонкослойная (ТСХ) хроматография, которой предшествует стадия очистки экстракта. Очистку чаще всего проводят кипячением пробы в спиртовом растворе щелочи с последующим выделением углеводородов и неомыляемых липидов в неполярном растворителе.
Сравнительная оценка ряда предложенных способов щелочного гидролиза, показала, что эта довольно длительная и трудоемкая стадия анализа не всегда приводит к желаемым результатам, особенно при высоком содержании липидов. С другой стороны, как показали наши сравнительные испытания, наиболее предпочтительно применение для прямой экстракции гексана, который в наименьшей степени извлекает мешающие полярные соединения.
Для дальнейшего разделения УВ и отделения их от липидной фракции нами использован метод тонкослойной хроматографии, в тонком слое сорбента граница отделения УВ от липидов достаточно четко определяется визуально под УФ-светом, что позволяет контролировать эффективность очистки экстракта.
В качестве сорбентов для ТСХ-разделения изучались силикагель и оксид алюминия. С активированного оксида алюминия не элюируются жиры, жирные кислоты, жирные спирты и ряд других соединений, что, несомненно, является положительным моментом стадии разделения, однако, при этом одновременно необратимо сорбируются ароматические углеводороды.
Например, с активированного оксида алюминия не элюируется до 30% трехядерных ПАУ и до 100 % - четырех- и пятиядерных ПАУ.
На оксиде алюминия III степени активности при элюировании смесью гексана и четыреххлористого углерода (70:30), липиды образуют размытую хроматографическую зону, перекрывающуюся с зоной УВ. Аналогичная картина наблюдалась и при использовании в качестве подвижной фазы гексана. Двукратное элюирование гексаном также не улучшило разделения. В качестве подвижной фазы кроме гексана использовали ацетонитрил, в котором растворимость липидов существенно меньше, чем в гексане. Однако на оксиде алюминия липиды, как и при других использованных элюентах, в ацетонитриле растягиваются по всему слою сорбента вплоть до зоны УВ. На силикагеле при элюировании смесью гексана с четыреххлористым углеродом липиды и УВ остаются на старте, а при элюировании ацетонитрилом происходит более четкое их отделение от липидов.
При модифицировании поверхности сорбентов возрастает возможность специфического взаимодействия между полярной поверхностью сорбента с полярными и поляризованными группами или участками молекул. На импрегнированных сорбентах возможно также проявление процесса хемосорбции полярных липидов, который приводит к значительному повышению времени удерживания или необратимой сорбции и омылению липидов, что повышает эффективность отделения их от определяемых УВ.
Для импрегнирования силикагеля и оксида алюминия был выбран гидроксид натрия.
Наилучшие результаты были получены при использовании в качестве сорбента – силикагеля, подвижной фазы – ацетонитрила. УВ и липиды разделились на две зоны с четкими границами, имеющие Rf = 0.8 и 0.1. Кроме визуального, полноту разделения липидов и УВ проверяли по наличию полос поглощения различных функциональных групп в инфракрасных спектрах элюатов углеводородной зоны.
В ИК-спектре гексанового экстракта моллюска (C. glaucum) обнаружены полосы поглощения в области =2800-3100 см -1, присущие симметричным и ассиметричным валентным колебаниям групп -СН, -СН2 и СН3 и в области =1550-1750 см -1, характерные для карбонильной группы. В этой же области полоса поглощения при 1650 см -1 может также характеризовать присутствующие в липидах и УВ сопряженные группы – СН2=СН2– с другими виниленовыми и карбонильными группами (рисунок 1-I).
Рисунок 1 – ИК спектр экстракта моллюска (C. glaucum) (I) - (I), элюата после стадии очистки ТСХ (II) и после двух стадий очистки - (III) (II) (III) После хроматографирования экстракта в системе: сорбент – силикагель, импрегнированный гидроксидом натрия, подвижная фаза – ацетонитрил, в ИК-спектре элюата УВ-зоны, помимо полос поглощения метильных и метиленовых групп, наблюдалась полоса при 1740 см -1, интенсивность которой значительно уменьшилась по сравнению с исходной. Однако наличие этой полосы свидетельствует о недостаточной очистке от липидов (рисунок 1 II).
Для предварительной очистки экстракта до разделения методом ТСХ использовали оксид алюминия, импрегнированный щелочью. В зависимости от количества и состава липидов дополнительная очистка уменьшила количество липидов в исходной пробе на 90-95 %. Предварительная очистка экстракта в статических условиях на импрегнированном оксиде алюминия и последующее разделение в тонком слое импрегнированного силикагеля позволила полностью отделить УВ от соэкстрагируемых липидов. Это подтверждает спектр элюата в инфракрасной области, который не имеет заметного поглощения при 1750 см -1 (рисунок 1-III).
Удаление липидов из экстракта происходит не только за счет адсорбционных процессов на развитой поверхности сорбента, но и процесса щелочного гидролиза омыляемых липидов на поверхности сорбента.
Использование в качестве элюента ацетонитрила также способствует улучшению разделения УВ и липидов за счет их разной растворимости в этом растворителе.
Определение количества выделенных УВ можно проводить по интенсивности поглощения в ИК-области или по интенсивности люминесценции полиаренов, входящих в состав УВ. После двукратной очистки экстракта происходит практически полное отделение УВ от полярных фракций липидов. Однако в зоне УВ находятся не только УВ, полученные извне, но и собственные УВ гидробионтов. Например, в составе УВ, выделенных из C. glaucum, при высоких концентрациях обнаружены полиолефин - С21Н32 (НЕН) и углеводород ряда гопана, которые будут существенно завышать результаты, получаемые методом ИК спектрофотометрии (рис. 2).
Рисунок 2 – Хроматограмма УВ, выделенных из моллюска C. glaucum С учетом этих особенностей и в связи с тем, что в составе биогенных УВ люминесцирующие ПАУ практически отсутствуют, для определения УВ предпочтительнее использовать метод флуоресцентной спектрофотометрии. В качестве стандарта для градуировки флуориметра использовали УВ, выделенные из льяльной воды, которая является наиболее распространенным источником нефтяного загрязнения водных объектов. Интенсивность люминесценции этих УВ занимает промежуточное положение между наиболее различающихся по этому показателю УВ, что уменьшает ошибку за счет несоответствия состава стандарта составу определяемых веществ (рис. 3).
Рисунок 3 – Интенсивность люминесценции Зависимость интенсивности люминесценции от концентрации УВ, выделенных из различных нефтяных образцов 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0. С,мг/мл Мазу т Сарат.нефть Льяльн.в оды Грозн.нефть Д из.топлив о На основании проведенных исследований разработана схема определения УВ в гидробионтах, включающая следующие стадии анализа (рис. 4):
Рисунок 4 – Схема анализа гидробионтов на содержание УВ Методика выполнения измерений массовой доли УВ в пробах гидробионтов пресных и морских водных объектов люминесцентным методом зарегистрирована в Федеральном реестре методик выполнения измерений, применяемых в сферах распространения государственного метрологического контроля и надзора, под шифром ФР 1.31.2009.06562.
Оценка накопления углеводородов моллюсками Азовского моря Исследования по уровню накопления УВ в моллюсках Азовского моря и нефтяного загрязнения среды их обитания выполнены по материалам, собранным в Азовском море во время экспедиций комплексного экологического мониторинга, которые проводились с 2004 по 2009 гг. в различные вегетационные периоды (весной, летом и осенью). Наблюдения проводили на 76 стандартных станциях (рис. 5).
Содержание токсикантов определяли в мягкой ткани M. lineatus, C. glaucum и M. galloprovincialis, створках их раковин, а также интегральных пробах. Было проанализировано более 270 проб моллюсков, выполнено элементоопределений.
Рисунок 5 – Карта-схема стандартных станций комплексного экологического мониторинга в Азовском море Содержание УВ в интегральных пробах наиболее часто встречающихся в Азовском море моллюсков менялось в пределах – от 3 до 33 мг/кг сырой массы (табл. 1). Наиболее высокие концентрации УВ обнаружены в пробах M. lineatus и C. glaucum.
Таблица 1 – Концентрации УВ в интегральных пробах моллюсков, мг/кг сырой массы Mytilus Mytilaster lineatus Cerastoderma glaucum galloprovincialis Год Диапазон Средняя Диапазон Средняя Диапазон Средняя 2004 9 – 10 10 10 – 12 11 – – 2005 3 – 14 8 3 – 11 5 3 – 23 2006 11 – 18 15 9 – 19 13 12 – 33 2007 3 – 21 5 9 – 11 10 3 – 7 2008 3 – 24 9 3 – 19 11 3 – 9 2009 3 – 24 15 10 - 18 15 6–7 Сезонная динамика накопления УВ в гидробионтах характеризовалась более высокими значениями в весенний – наиболее холодный период, в этот период увеличивается содержание липидов в организме моллюсков, что приводит к увеличению накопления гидрофобных загрязнителей, к которым относятся УВ всех классов (табл. 2). При этом со снижением температуры уменьшается и интенсивность биологической и химической деградации УВ.
Таблица 2 – Концентрации УВ в интегральных пробах моллюсков в различные сезоны 2004-2009 гг., мг/кг сырой массы Вид Весна Лето Осень моллюсков Диапазон Средняя Диапазон Средняя Диапазон Средняя M. lineatus 3 - 24 10 3 - 18 8 3 - 10 M. galloprovincialis 3 - 19 10 3 - 11 6 3 - 10 C. glaucum 3 - 33 15 3 - 9 6 3 - 5 В мягкой ткани C. glaucum и M.galloprovincialis, отобранных в 2007 2009 гг., степень накопления УВ в среднем была выше в 1.5–2.5 раза, чем в створках раковин (табл. 3).
Таблица 3 – Концентрации УВ в мягкой ткани и створках моллюсков, мг/кг сырой массы Cerastoderma glaucum Mytilus galloprovincialis Год Мягкая ткань Створки раковин Мягкая ткань Створки раковин Диапазон Средняя Диапазон Средняя Диапазон Средняя Диапазон Средняя 2007 3 – 17 6 3 – 7 3 3 – 14 8 3 – 7 2008 3 – 21 9 3 – 12 6 3 – 23 13 3 – 14 2009 7 - 35 19 3 – 11 7 10 - 26 20 3 – 14 В составе УВ, обнаруженных в исследованных моллюсках, были идентифицированы полициклические ароматические углеводороды (ПАУ):
флуорен, фенантрен, антрацен, флуорантен, пирен, трифенилен, хризен, бенз(b)флуорантен, бенз(k)флуорантен бенз(е)пирен, бенз(а)пирен, дибенз(а,h)антрацен, бенз(g,h,i)перилен, суммарные концентрации которых менялись в диапазоне - от 0.01 до 8.4 нг/г сырой массы.
Среди идентифицированных ПАУ в более высоких концентрациях, как правило, обнаруживались фенантрен и флуорантен. Массовые доли каждого из них в общем содержании ПАУ составляли более 30%. По частоте встречаемости в исследуемых моллюсках среди идентифицированных ПАУ преобладали флуорантен, хризен, фенантрен и пирен. Хризен был обнаружен в 83.6%, флуорантен – в 82.2 %, фенантрен – в 80.8 %, бенз(b)флуорантен в 46.6 % и пирен – в 43.8 % проанализированных проб.
Исследование зависимости накопления УВ в моллюсках от уровня нефтяного загрязнения среды их обитания Накопление углеводородов в моллюсках от содержания нефтепродуктов в среде их обитания (выборки составили 40-50 измерений) оценивали по коэффициентам ранговой корреляции Спирмена (табл. 4). Наибольший статистически достоверный коэффициент отмечен для интегральных проб Cerastoderma glaucum.
Таблица 4 – Корреляционная связь между накоплением УВ в моллюсках и содержанием НП в донных отложениях и придонном слое воды Коэффициент корреляции rs Донные Вид Вид пробы Придонный слой отложения/ воды/ моллюски моллюски Mytilaster lineatus Интегральная -0.20 -0. Интегральная 0.13 0. Mytilus galloprovincialis Мягкая ткань 0.05 0. Створки 0.48 0. Интегральная 0. 0. Cerastoderma glaucum Мягкая ткань -0.39 0. Створки -0.29 0. Отсутствие четкой корреляции в моллюсках может быть связано с особенностью их питания, выражающейся в образовании псевдофекалий и процессами биоконцентрирования вторичного загрязнения. При условии одинаковой степени загрязненности донных отложений все эти физиологические особенности моллюсков дифференцируют количество поллютантов, поступающих в их организм. Слабая корреляционная связь между накоплением УВ в моллюсках и содержанием НП в донных отложениях может быть также обусловлена и незначительной десорбцией НП в придонный слой воды, фильтруемый бентосными организмами.
Поскольку двустворчатые моллюски обитают на разных субстратах, был проведен расчет корреляционной зависимости с учетом гранулометрического состава донных отложений (табл. 5).
Таблица 5 – Корреляционная связь между концентрациями УВ в моллюсках и содержанием НП в донных отложениях различного гранулометрического состава Коэффициент Вид моллюсков Тип пробы Тип донных отложений корреляции rs песчано-ракушечный 0. интегральная Mytilus илы алеврито-пелитовые -0. galloprovincialis песчано-ракушечный 0. мягкая ткань илы алеврито-пелитовые 0. песчано-ракушечный 0. интегральная Cerastoderma илы алеврито-пелитовые 0. glaucum песчано-ракушечный 0. мягкая ткань илы алеврито-пелитовые -0. песчано-ракушечный -0. Mytilaster lineatus интегральная илы алеврито-пелитовые -0. При дифференциации полученных данных с учетом типа грунта коэффициенты корреляции также остались на низком уровне. Наибольшие статистически достоверные коэффициенты корреляции (-0.51 и 0.45) получены для мягкой ткани C. glaucum, отобранных на алеврито-пелитовых илах и песчано-ракушечных донных отложениях.
В связи с многочисленностью факторов, влияющих в натурных условиях на накопление и выведение УВ моллюсками (фаза репродуктивного цикла, температура, перемещение донных осадков и т.д.), для выяснения причин отсутствия корреляции между накоплением УВ в тканях моллюсков и содержанием НП в донных отложениях, нами проводились экспериментальные исследования, включающие изучение динамики изменения состава нефтяного загрязнения в системе вода - донные отложения и степени накопления УВ в тканях моллюсков, находящихся в контакте с донными отложениями различной степени загрязненности.
Содержание нефтяных компонентов в донных отложениях может быть выше, чем в воде в сотни, тысячи и даже десятки тысяч раз. Поэтому на границе раздела водной толщи и осадков происходят наиболее интенсивные процессы накопления компонентов нефти в бентосных организмах и донных видах рыб, их превращения и разложения, которые, в конечном счете, определяют биологические последствия нефтяного загрязнения моря.
Информация о влиянии нефтяного загрязнения донных осадков на бентосную и бентосоядную фауну весьма ограничена, в отличие от изучения влияния на них водорастворимых фракций нефти.
Изучение трансформации первоначального состава нефтяного загрязнения в системе вода – донные отложения проводилось на образце сырой нефти из перевалочной базы «Шесхарис», расположенной в Новороссийской бухте. Нефть вносили в донные отложения различного гранулометрического состава: ил;
песок;
смесь песка и ракуши (80:20);
смесь песка, ракуши и ила (40:40:20). В зависимости от типа донных осадков, концентрации нефти, вносимые в донные отложения, составляли 0.2, 0.5, 0.8, 1.0 и 5.0 г/кг соответственно. Такие концентрации характерны для уровня нефтяного загрязнения донных отложений Азовского моря. В качестве контрольного образца использовались донные отложения, содержащие 0. г/кг, что соответствует минимальному количеству НП, обнаруживаемому в осадках моря. Загрязненный грунт помещали в аквариумы вместимостью 20 л и 100 л и заливали морской водой. Через различные промежутки времени ( часа, 3 суток, 7 суток, 14 суток) отбирали пробы воды и донных отложений, в которых определяли качественный и количественный состав присутствующих в них НП. Оценивали также количество НП, которое сорбировалось на стенках аквариумов в вышеуказанные промежутки времени. Содержание НП, растворенных в воде и сорбированных на стенках аквариумов, постепенно увеличивалось с 0.5 до 2.4 % (в аквариумах с илами) от общего суммарного содержания и с 0.3 до 5.7 % (в аквариумах с песком). Основная масса нефти через 14 суток после начала эксперимента оставалась в сорбированном донными отложениями состоянии (94.3–97.6 %).
Изменение качественного состава НП в процессе миграции сказывалось на соотношениях отдельных групповых компонентов - парафиновых, нафтеновых и ароматических углеводородов, смол и асфальтенов, а также индивидуальных соединений этих групп. Независимо от типа осадков в воде с течением времени отмечено незначительное изменение соотношения между углеводородной фракцией и смолистыми веществами в сторону уменьшения смолистых веществ, в донных отложениях, напротив, наблюдалось увеличение доли смолистых веществ. Отмеченная тенденция может быть связана не только с процессами их деградации, но и с их накоплением в верхнем анализируемом слое осадков илистой фракции в процессе взмучивания и последующего осаждения.
Динамику изменения соотношения между парафино-нафтеновыми, ароматическими (включая одно- и двухядерные) и полициклическими (трехядерные и выше) ароматическими углеводородами оценивали по оптическим характеристикам – поглощению в инфракрасной () и ультрафиолетовой (D) областях спектра и интенсивности люминесценции (I).
Показатели D/Е, I/E и I/D характеризуют соотношения ароматических и парафино-нафтеновых углеводородов - D/Е, полициклических ароматических и парафино-нафтеновых углеводородов - I/E, полициклических ароматических и ароматических углеводородов - I/D (табл. 6). Изменения значений D/Е, I/E и I/D, полученных на разных этапах эксперимента, показали уменьшение к концу опыта доли ароматических, в том числе полициклических, углеводородов по сравнению с парафино-нафтеновыми углеводородами. При этом в ароматической фракции более высокая устойчивость отмечена для полициклических углеводородов независимо от типа грунта (отношение I/D с течением времени увеличилось). Полученные данные свидетельствуют о том, что во время эксперимента трансформация компонентов нефти, сорбированных донными отложениями, происходила в результате как химического, так и биологического окисления. При этом интенсивность процессов химического окисления была выше, так как доля ароматических углеводородов, обладающих более высокой реакционной способностью по сравнению с парафиновыми углеводородами, к концу опыта уменьшилась.
Отсутствие накопления ароматических углеводородов, которое обычно наблюдается в природных условиях, в проведенных экспериментах может быть обусловлено несколькими факторами: кратковременностью опытов ( дней), недостатком нефтеокисляющей микрофлоры и интенсивными процессами автоокисления. Суммарное же содержание ПАУ в ароматической фракции, к концу эксперимента увеличилось: в опытах с илом в 1.9 раза, в опытах с песком – в 2.8 раза (табл. 6).
Таблица 6 – Изменение оптических характеристик углеводородов в донных отложениях различного гранулометрического состава Ил Песок Время отбора проб D/Е I/D I/E D/Е I/D I/E 9.6 1.110 11.010 2.9 2.110 12. 2 2 3 часа 7.7 1.2102 9.7102 2.4 4.0102 9. 3-и сутки 4.5 1.5102 8.7102 1.9 4.1102 4. 7-е сутки 4.2 2.1102 6.3102 0.8 5.9102 4. 14-е сутки В составе алифатических углеводородов за время проведения экспериментов обнаружены следующие изменения: доля парафиновых углеводородов С15-С24 к концу эксперимента уменьшилась, а С25-С34, напротив, увеличилась;
содержание разветвленных н-алканов, нафтеновых и ароматических углеводородов к концу опыта увеличилось;
содержание неразделенных соединений («горб» на хроматограмме), представленных конденсированными гетероциклическими соединениями за время эксперимента практически не изменилось.
Таким образом, распределение нефти и нефтепродуктов по различным формам миграции в момент поступления и с течением времени сопровождается существенным изменением их исходного химического состава.
Исследования по степени накопления и выведения нефтяных компонентов двустворчатыми моллюсками проводились в условиях экспериментально воссозданного современного уровня загрязнения Азовского моря.
Объектом исследования служили двустворчатые моллюски Mytilus galloprovincialis, которые активно участвуют в процессе фильтрации придонной воды и контактируют с загрязненным грунтом. В эксперименте использовали донные отложения, содержащие главным образом тяжелые фракции глубоко трансформированных углеводородов в концентрациях 0. г/кг и 1.0 г/кг сухой массы. В качестве контроля использовались донные отложения, содержащие 0.03 г/кг. При этом гранулометрический состав используемых в эксперименте осадков относился к одному типу и был представлен ракушей, песком и илом (40:40:20). Эксперимент проводили в течение 5 суток. Концентрации НП в воде, отобранной из разных аквариумов, к концу эксперимента уменьшились. Уменьшение концентраций НП связано с осаждением взвешенных мелкодисперсных частиц, действием нефтеокисляющих бактерий, процессами автоокисления, однако основную роль в очищении воды сыграли помещенные в аквариумы мидии.
Физиологические особенности мидий таковы, что в процессе фильтрации мидии не пропускают через пищеварительную систему крупные минеральные и другие частицы (в частности, взвешенные в толще воды донные отложения), а, обволакивая, тут же сбрасывают их в виде псевдофекалий, тогда как почти все мелкодисперсные и растворимые компоненты проходят «переработку» в организме. Также мидии поступают и с избытком корма. В течение эксперимента вокруг мидий появлялись «кучки» взвешенных частиц, которые мидии отфильтровывали при всасывании воды.
Максимальное накопление УВ (парафиновых, нафтеновых, ароматических) в мягкой ткани мидий было отмечено на третьи сутки эксперимента. К концу эксперимента концентрации суммы УВ в мидиях или остались на уровне, обнаруженном на 3-и сутки, или уменьшились (рис. 6).
Рисунок 6 – Накопление УВ в мягкой ткани M. galloprovincialis в аквариумах с донными мг/кг отложениями различной степени загрязненности:
1 – контроль (0.03 г/кг), 2 – 0.50 г/кг;
3 – 1.00 г/кг сухой массы 0 1 2 3 4 5 сутки В течение всего эксперимента в тканях мидий отмечено постоянное увеличение суммарного содержания индивидуальных ПАУ (рис. 7).
нг/г Рисунок 7 – Накопление ПАУ (нг/г сырой массы) в мягкой ткани мидий, находящихся в аквариумах с донными отложениями, содержащими НП в концентрации 1.0 г/кг сухой массы 0 1 2 3 4 сутки Проводились также исследования степени накопления углеводородов в тканях гидробионтов с более загрязненными донными отложениями (до г/кг) и в более длительной экспозиции – 21 сутки. Высокий уровень загрязнения моделировался внесением в донные отложения свежего мазута. В качестве объекта исследований, как и в 5-суточном эксперименте, использовались двустворчатые моллюски M. galloprovincialis длиной 3-4 см, выращенных на коллекторах в условно чистом районе вблизи м. Б. Утриш. В каждом аквариуме экспонировалось по 14 мидий, помещенных на твердый субстрат. В течение эксперимента изменение концентраций НП в донных отложениях не имело четкой направленности. В воде, в отличие от донных осадков, на протяжении всей экспозиции отмечено постепенное уменьшение концентраций УВ. При этом в эксперименте с наиболее загрязненными донными отложениями отмечено и более резкое снижение концентраций УВ в воде. В контрольном аквариуме концентрация УВ в воде за время эксперимента практически не изменилась.
Уменьшение концентраций УВ в воде аквариумов может быть связано, как с очищающей ролью мидий, так и с осаждением взвешенных мелкодисперсных коллоидных частиц, которые вследствие высокой сорбционной способности содержат большие количества УВ. Осаждение взвеси подтверждается увеличением концентраций УВ в створках моллюсков, связанного с физической адсорбцией мелкодисперсных частиц створками раковин M. galloprovincialis в течение эксперимента.
В опытах с донными отложениями, содержащими более низкие концентрации НП (0.03 и 0.60 г/кг), максимальное содержание УВ в мидиях отмечено на 7-и сутки и в течение дальнейшей экспозиции содержание УВ изменялось незначительно. В аквариумах с более высоким содержанием нефтепродуктов накопление УВ в моллюсках имело волнообразный характер (рис. 8).
1 2 мг/кг мг/кг 2 0 3 6 9 12 15 18 0 3 6 9 12 15 18 сутки сутки Рисунок 8 – Накопление УВ в мягкой ткани M.galloprovincialis в аквариумах с донными отложениями различной степени загрязненности:
(1) – контроль (0.03 г/кг);
(2) – 0.6 г/кг;
(3) – 2.5 г/кг;
(4) – 5.0 г/кг сухой массы Особенность накопления УВ в мягкой ткани моллюсков связана с тем, что, захватывая минеральные и органические частицы, находящиеся во взвешенном состоянии или перешедшие в осадок, моллюски током воды транспортируют их в мантийную полость, где и происходит сортировка преимущественно по размерности частиц, а не по пищевой ценности.
Высокое накопление УВ в моллюсках, помещенных в аквариумы с наиболее загрязненными донными отложениями (2.5 и 5.0 г/кг сухого грунта), может быть обусловлено тем, что в пищеварительный тракт моллюсков попала также пелитовая часть ила с адсорбированными нефтяными компонентами.
В отличие от сложной динамики накопления УВ в мидиях независимо от длительности эксперимента, накопление ПАУ было постоянным в течение всей экспозиции (рис. 9).
6. нг/г Рисунок 9 – Накопление ПАУ 5 (нг/г) в мягкой ткани мидий, находящихся в аквариумах с донными отложениями 1. 2 1. 0.2 0.2 различной степени 0. загрязненности 0 3 сутки 0.6 г/кг 5.0 г/кг Сложный характер динамики накопления УВ в моллюсках может быть связан с тем, что в стрессовых ситуациях (в данном случае высокое загрязнение) на фоне низкой фильтрационной активности происходит периодическая мобилизация адаптационных сил организма. Это приводит к кратковременному ускорению физиологических процессов очистки организма и сбросу в виде фекалий и псевдофекалий, попавших в организм аккумулированных токсикантов. Этот фактор может являться одной из причин отсутствия корреляции между степенью накопления УВ в тканях моллюсков и содержанием нефтепродуктов в донных отложениях, обнаруженное во время натурных наблюдений и экспериментов в лабораторных условиях. Поэтому использование двустворчатых моллюсков в качестве тест-объектов при мониторинге нефтяного загрязнения водных объектов только по накоплению токсикантов может привести к ошибочным выводам. В то же время можно предположить, что степень накопления ПАУ в моллюсках может быть использована в качестве критерия при оценке загрязнения водных объектов полиаренами, но это требует дальнейшего изучения. Вероятно, более результативным будет интегрированный подход, основанный на одновременном определении аккумулированных токсикантов и биохимических параметров исследуемых гидробионтов.
ВЫВОДЫ 1. Разработана методика определения суммарного содержания углеводородов в гидробионтах, включающая две стадии очистки экстракта на оксиде алюминия и силикагеле, импрегнированных гидроксидом натрия, обеспечивающих эффективное удаление липидных фракций и определение УВ. Показано, что с учетом специфики анализируемого объекта, наиболее достоверные результаты получены при детектировании аналитического сигнала по интенсивности люминесценции.
2. Проведена метрологическая аттестация разработанной методики.
Погрешность определения УВ в диапазоне от 3 до 10 мг/кг составляет 42 %, свыше 10 до 38 мг/кг – 20 %, свыше 38 до 100 мг/кг сырой массы – 14 %.
Методика зарегистрирована в Федеральном реестре методик выполнения измерений, применяемых в сфере распространения государственного метрологического контроля и надзора, под шифром ФР.1.31.2009.06562.
3. Изучено накопление углеводородов различных классов в двустворчатых моллюсках Азовского моря и среде их обитания, отобранных в различные сезоны 2004-2009 гг., установлено, что уровень накопления менялся в пределах 3 – 35 мг/кг и не зависел от вида моллюсков, при этом содержание УВ в мягкой ткани исследованных моллюсков было в 2-3 раза выше, чем в створках раковин. Степень накопления УВ в моллюсках характеризуется более высокими значениями в весенний период.
4. В исследованных образцах моллюсков идентифицированы ПАУ, преимущественно фенантрен и флуорантен, массовые доли которых составляли от общего содержания полиароматических углеводородов более 60%. По частоте встречаемости в исследуемых моллюсках преобладали хризен, флуорантен, фенантрен, которые были обнаружены в более 80 % проанализированных проб. Суммарные концентрации индивидуальных ПАУ находились в диапазоне 0.01-8.4 нг/г сырой массы.
5. Проведены исследования зависимости степени накопления УВ в образцах моллюсков Азовского моря от их содержания в донных отложениях и придонном горизонте водной толщи. Отмечены низкие коэффициенты корреляции, не наблюдается зависимости между накоплением УВ в моллюсках и уровнем загрязненности различных типов донных осадков.
Наиболее статистически достоверные коэффициенты корреляции получены для мягких тканей C. glaucum, отобранных на песчано-ракушечных грунтах и алеврито-пелитовых илах, соответственно 0.45 и 0.51.
6. Исследования по степени трансформации состава нефтяных компонентов в системе вода – донные отложения показали, что независимо от типа осадков в воде с течением времени отмечено незначительное изменение соотношения между углеводородной фракцией и смолистыми веществами в сторону уменьшения последних. В донных отложениях, наблюдается увеличение доли смолистых веществ. Отмеченная тенденция может быть связана не только с процессами деградации УВ, но и с накоплением их в верхнем анализируемом слое осадков илистой фракции в процессе взмучивания и последующего осаждения.
7. Уровни накопления УВ в тканях M. galloprovincialis, находящихся в контакте с донными отложениями различной степени загрязненности (от 0. до 5.0 г/кг сухой массы), определялись динамикой накопления и последующего выведения УВ, которая не имела четкой направленности.
Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:
Павленко Л.Ф., Кленкин А.А., Анохина Н.С., Скрыпник Г.В., 1.
Ларин А.А. Новый подход к определению нефтяных углеводородов в биологических образцах / Тез. докл. XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии: М.: Граница, 2007. – т. 4. – С. 196.
Ларин А.А. Влияние нефтяного загрязнения на биохимические 2.
показатели Mytilus Galloprovicialis // Мат-лы межд. научн. конф. – Саранск:
Изд-во МГУ, 2007. – С. 100–101.
Ларин А.А. Накопление нефтяных углеводородов в бентосе Азовского 3.
моря / Тезисы V Международной научно-практической конференции молодых ученых по проблемам водных экосистем «Pontus Euxinus – 2007» (24– сентября 2007 г.) – Севастополь: ЭКОСИ-Гидрофизика, 2007. – С. 49-50.
Кленкин А.А., Скрыпник Г.В., Ларин А.А. Подготовка проб воды и 4.
донных отложений для определения следовых количеств полициклических ароматических углеводородов / Тез. докл. II Всерос. конф. по аналит. химии с международным участием. - Краснодар, октябрь 2007 г.- С. 349.
Павленко Л.Ф., Корпакова И.Г., Скрыпник Г.В., Ларин А.А.
5.
Характеристика загрязнения акваторий Керченского пролива и прилежащих участков Азовского и Черного морей / В кн. «Керченская авария: последствия для водных экосистем». – Ростов н/Д: ФГУП АзНИИРХ, 2008. – С. 58-105.
Ларин А.А., Павленко Л.Ф., Корпакова И.Г. Накопление загрязняющих 6.
веществ в моллюсках из юго-восточного района Азовского моря. // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. – М., 2009. - №1 – С. 45-48.
Ларин А.А., Анохина Н.С. Зависимость накопления нефтяных 7.
компонентов в моллюсках от загрязненности среды их обитания / Тезисы VI Международной научно-практической конференции молодых ученых по проблемам водных экосистем «Pontus Euxinus – 2009» (21–24 сентября г.) – Севастополь: ЭКОСИ-Гидрофизика, 2009. – С. 66-67.
Ларин А.А., Павленко Л.Ф., Корпакова И.Г., Темердашев З.А.
8.
Определение «углеводородного индекса» в биологических пробах методом тонкослойной хроматографии и инфракрасной и люминесцентной спектроскопии // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. – М., 2009. - №7 – С. 58- Ларин А.А., Корпакова И.Г. К вопросу о возможности использования 9.
моллюсков в качестве тест-объектов при мониторинге нефтяного загрязнения // VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «ЭКОАНАЛИТИКА - 2009», Йошкар-Ола, 21-27 июня 2009. – С. 127.
МВИ массовой доли нефтяных углеводородов в пробах гидробионтов 10.
пресных и морских водных объектах. Люминесцентный метод.
ФР.1.31.2009.