Интенсификация биотехнологии культивирования хлореллы с использованием наночастиц железа и оценка эффективности применения ее в бройлерном производстве и перепеловодстве
На правах рукописи
МАЧНЕВА НАДЕЖДА ЛЕОНИДОВНА ИНТЕНСИФИКАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ХЛОРЕЛЛЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОЧАСТИЦ ЖЕЛЕЗА И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЕЕ В БРОЙЛЕРНОМ ПРОИЗВОДСТВЕ И ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Ульяновск – 2013 1
Работа выполнена на кафедре биотехнологии, биохимии и биофизики Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский государственный аграрный университет» Научный руководитель ПЛУТАХИН ГЕННАДИЙ АНДРЕЕВИЧ кандидат биологических наук, доцент
Официальные оппоненты: РОМАНОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйст венная академия имени П. А. Столыпина» БОГДАНОВ НИКОЛАЙ ИВАНОВИЧ кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, директор ЧП «Научно исследовательский институт Альгобиотехнологии» Ведущая организация ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный университет»
Защита состоится «24» мая 2013 года в «15» часов на заседании диссерта ционного совета Д 220.065.01 при ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» по адресу: 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1, тел. 8 (8422) 44-30-58;
e-mail:
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Ульяновская го сударственная сельскохозяйственная академия имени П. А. Столыпина», а с авто рефератом в сети Интернет на официальном сайте Министерства образования и науки РФ www.vak.ed.gov.ru
Автореферат диссертации разослан «22» апреля 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Пыхтина Лидия Андреевна 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Стратегия развития высоких технологий, принятая в РФ открывает перспективы развития сельскохозяйственного производства, разработки эффективных технологий охраны окружающей среды, создания экологически чис тых производств, приборов, оборудования, компьютерной техники, пищевых про дуктов, биологически активных веществ, пищевых добавок и многого другого.
Характерной чертой ХХI столетия является развитие нанотехнологий. Нанотехно логии базируются на использовании структуры веществ, обладающих полезными функциями и имеющими размеры от одного до ста нанометров. Уникальность нанома териалов связана с их высокой химической и биологической активностью, способно стью проникать через биологические барьеры. Они способны изменять свойства биоло гических объектов, что открывает широкие области их применения и использования в медицине и сельском хозяйстве при разработке новых биотехнологических препаратов.
Одно из перспективных направлений – это использование наноматериалов для получе ния нетрадиционных кормовых добавок (Л. В. Коваленко, 2006;
Ю. Н. Иванычева, 2012).
К числу живых кормовых добавок, используемых для обогащения кормов, отно сится хлорелла. Хлорелла – микроскопическая одноклеточная зелёная водоросль из класса протококковых, в ее составе более 650-ти веществ, среди которых незаменимые аминокислоты, жиры, витамины, макро- и микроэлементы в легкоусваиваемом виде (М. Я. Сальникова, 1977). В своих исследованиях для культивирования и наращивания биомассы мы использовали наиболее перспективный планктонный штамм микроводо росли Chlorella vulgaris ИФР № С-111 (Н. И. Богданов, 1977), обладающий высокой продуктивностью и отвечающий требованиям промышленного культивирования.
Высокая потребность сельскохозяйственного производства РФ в кормовых до бавках, обогащающих рационы, актуализирует поиск новых технологических реше ний для ускоренного наращивания биомассы хлореллы, повышения ее ценности и про дуктивности. Основная роль в решении этой проблемы принадлежит фотосинтезу, ин тенсивность которого определяет урожайность культуры. Железо играет важную роль в биосинтезе хлорофилла. В фотосинтетические электрон-транспортные цепи хлорел лы входят ферменты, содержащие железо: цитохромы, ферредоксин, железосерные центры. Железо в хлоропластах связано с хлорофилл-белковым комплексом. Хлоро филл образует с солями железа комплексные химические соединения различных ти пов и участвует в биосинтезе хлорофилла на этапах: конденсации сукцинил-КоА и глицина с образованием -аминолевулиновой кислоты (ДАЛ);
в реакции окисли тельного декарбоксилирования копропорфириногена в протопорфирин;
на этапе превращения протохлорофилла в хлорофилл. Активация транспорта железа в клетку способствует интенсификации синтеза железосодержащих ферментов стимулируя фо тосинтетическую активность хлореллы (А. Б. Рубин, 1987). Это положение стало рабо чей гипотезой нашей работы и обоснованием для использования в культуральной среде наночастиц железа.
Продукт культивирования – биомасса хлореллы использовалась нами в корм лении птицы в качестве ценной кормовой добавки богатой белками, витаминами, макро- и микроэлементами, а также другими биологически активными веществами (Н. К. Капустин, 1984;
Н. И. Богданов, 2001). В современных условиях ведения про мышленного птицеводства необходимо применение широкого ряда профилактиче ских мероприятий, которые могли бы гарантировать снижение заболеваний птицы, а также улучшение зоотехнических показателей отрасли (А. И. Петенко и др., 2006).
Кормовые рационы наиболее эффективны при дополнении их биотехнологическими и иными кормовыми добавками, биостимуляторами отечественного и иностранного производства (В. Е. Подольников, 1999;
Н. П. Дудина, 2011).
Диссертационная работа входит в план НИР ФГОУ ВПО «Кубанский государст венный аграрный университет» на 2011-2015 гг. по теме «Разработка и научное обос нование способов получения и использования экологически безопасных функцио нальных кормовых и пищевых концентратов и добавок на основе ресурсосберегаю щих биотехнологий: высококалорийные концентраты и добавки;
микробиологиче ские добавки и биопрепараты» (№ госрегистрации 010201153631).
Цель исследования: Используя наночастицы железа разработать оптимизиро ванную культуральную среду для ускоренного наращивания биомассы Chlorella vul garis ИФР № С-111, исследовать влияние хлореллы, выращенной на модифициро ванной культуральной среде на продуктивность, обмен веществ и энергии, морфо логические и биохимические показатели крови перепелов и цыплят-бройлеров.
Задачи исследования:
ввести в состав культуральной среды для выращивания хлореллы наночасти цы железа;
оценить влияние наночастиц восстановленного железа и его оксида на скорость роста хлореллы;
исследовать фотосинтетическую активность хлореллы в среде с наночасти цами железа разной концентрации по замедленной флуоресценции хлорофилла;
оценить переваримость хлореллы в желудочно-кишечном тракте птицы;
изучить влияния суспензии хлореллы на рост и развитие перепелов, цыплят бройлеров и выход готовой продукции;
охарактеризовать морфологические и биохимические показатели крови и пе чени перепелов и цыплят-бройлеров, потреблявших хлореллу;
рассчитать экономическую эффективность применения хлореллы в рационах сельскохозяйственной птицы.
Научная новизна. Использованы возможности современной нанотехнологии в приготовлении высокоценных кормовых добавок для птицеводства с использовани ем наночастиц железа.
Установлено, что введение в культуральную среду для выращивания хлорел лы наночастиц восстановленного железа увеличивает скорость ее роста в 2,5 раза за счет активизации фотосинтетических процессов.
Комплексными исследованиями показано, что хлорелла штамма ИФР № С-111, выращенная в присутствии наночастиц железа, активизирует физиологические и биохимические процессы в организме птицы.
Установлена высокая эффективность использования в рационах перепелов и цыплят-бройлеров суспензии хлореллы в концентрации (1–3) 10 6 клеток/мл при постоянном выпаивании.
Практическая значимость работы. Добавление наночастиц восстановленного железа в культуральную среду активирует фотосинтетическую активность хлореллы и ускоряет наращивание биомассы микроводоросли, существенно удешевляя техно логический продукт.
Использование суспензии хлореллы штамма ИФР № С-111, выращенного в присутствии наночастиц восстановленного железа, в хозяйствах по разведению пти цы в бройлерном производстве и перепеловодстве обеспечивает: повышения ее про дуктивности, сохранности и увеличивает выхода готовой продукции.
Основные положения, выносимые на защиту:
интенсификация фотосинтетических процессов при культивировании хло реллы штамма ИФР № С-111 в среде, модифицированной наночастицами восста новленного железа, приводит к значительному повышению скорости размноже ния культуры;
введение наночастиц восстановленного железа оптимизирует культуральную среду хлореллы штамма ИФР №С-111, ускоряя фотосинтетические процессы в 2,5 раза;
использование суспензии хлореллы в рационах перепелов и цыплят-бройлеров увеличивает живую массы птицы, сохранность поголовья и снижает потребление корма;
положительное влияние на организм птицы биотехнологической кормовой добавки суспензии хлореллы, выращенной на культуральной среде, модифициро ванной восстановленным наножелезом, подтверждается морфо-биохимическими показателями крови и ее сыворотки, а также биохимическими и гистологическими исследованиями печени;
увеличение рентабельности производства обеспечивается включением в рацион перепелов и цыплят-бройлеров суспензии хлореллы в качестве кормовой добавки.
Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались на Второй Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспе чение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2008);
36-й научной конференции студентов и молодых ученых вузов Южного федерального округа, посвященной 40-летнему юбилею Кубанского ГУФКСТ (Краснодар, 2009);
Третьей Всероссий ской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агро промышленного комплекса» (Краснодар, 2009);
Международной научно-практической конференции «Функциональные продукты питания: ресурсосберегающие технологии переработки сельскохозяйственного сырья, гигиенические аспекты и безопасность» (Краснодар, 2009);
Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011);
International Conference «Physiology and Biotechnology of Microalgae» (Moscow, 2012).
Публикации. По материалам проведенных исследований опубликовано 11 на учных работ, в том числе 4 в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литера туры, материалов и методов исследований, результатов исследований, заключения, выводов, предложений производству, списка литературы и приложений. Работа из ложена на 125 страницах машинописного текста, включает 3 приложения, 42 табли цы и 17 рисунков. Библиографический список состоит из 181 источника, в том числе 12 иностранных авторов.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Работа проводилась с 2008 по 2013 год на кафедре биотехнологии, биохимии и биофизики факультета перерабатывающих технологий Кубанского государственно го аграрного университета, в Краснодарском научно-исследовательском ветеринар ном институте Россельхозакадемии, в СПК «Колос» Новопокровского района Крас нодарского края. Объектом исследования являлась суспензия хлореллы, выращен ная на различных культуральных средах и оценка ее влияния в рационах перепелов и цыплят-бройлеров. При культивировании суспензии хлореллы были использованы наночастицы железа нулевой валентности, полученные методом водородного восста новления при температуре 350 … 420 °С (М. Г. Барышев, Н. С. Васильев, 2010). Посред ством электронного микроскопа с полевой эмиссией JSM 7500F были получены фото графии восстановленного нанопорошка железа, средний размер которых составил 80 нм.
Нанодисперсный порошок оксида железа имел размеры 30…80 нм и был получен с по мощью плазменного метода (М. П. Кульзенева, 2010).
Оценку физиологического состояние водоросли проводили по параметрам замедленной флуоресценции (ЗФ) хлорофилла Фо, Фм, В/Н на флуориметре «Фо тон-10» в 9-ти повторах (Ю.С. Григорьев, 2004), где Фо – интенсивность быстрой флуоресценции, Фм – максимальная интенсивность ЗФ, В/Н отражает интенсив ность фотосинтетических процессов, протекающих одновременно на световой и на темновой стадиях – чем выше значение В/Н, тем активнее протекает фотосинтез.
Оценку концентрации клеток хлореллы и наночастиц железа во всех эксперимен тах проводили по величине оптической плотности измерителем ИПС-03 в пеницилли новых флаконах, длина волны измеряющего света 560 нм. Перевод оптической плот ности суспензии хлореллы в концентрацию, выражаемую в клетках на кубический сан тиметр, проводился согласно полученной нами формуле: N = kD где N – количество клеток, k – коэффициент пропорциональности (1134000), D – оптическая плотность.
Лабораторные эксперименты по подбору оптимальной питательной среды для культивирования хлореллы проходили в два этапа, на которых изучали влияние пи тательных сред на скорость наращивания биомассы микроводоросли. I этап – а) сре да Н. И. Богданова;
б) среда на основе комплексного удобрения «Кемира Люкс» (0,05…2 г/л);
в) среда из композиций минерального комплекса «Кристалин» (0,1;
0,2 и 0,3 г/л) и карбамида (1,2;
1,35 и 1,5 г/л);
г) среда с добавлением концентрированного кукурузного экстракта (0,25…1 г/л);
II этап – д) питательная среда, модифицированная наночастицами восстановленного железа (0,00625…0,1 г/л).
На первом этапе эксперимента проводили подбор оптимальной питательной сре ды для культивирования микроводоросли на лабораторных качалках в конических колбах. Контрольной питательной средой была среда Тамия. Каждая колба содержала 150 мл тестируемой среды и 15 мл маточной культуры хлореллы. В результате старто вая концентрация хлореллы составляла (32,4…34,3) 10 4 клеток/мл. Условия культи вирования: 5 суток при температура 28…30 °С и круглосуточной освещенность 4700 люкс. Определение концентрации клеток проводили в первые и пятые сутки.
На втором этапе эксперимента выбранную оптимальную питательную среду модифицировали наночастицами нейтрального железа или его оксида. Культивиро вание хлореллы проводили в культиваторе КВМ-05 в течение 48-ми часов в опти мальной питательной среде, с добавлением к ней наночастиц железа в концентраци ях (0,00625…0,1 г/л), проводили согласно методике (Ю. С. Григорьев, 2007). Коли чество и качество клеток хлореллы определяли в камере Горяева в проходящем све те и методом люминесцентной микроскопии микроскопе фирмы «Carl ZEISS» мо дель AXIO Imager. A1.
При проведении научного опыта на перепелах (II группа) и производственного испытания (II и III группы) культивирование суспензии хлореллы проводили на моди фицированной нейтральным наножелезом оптимальной культуральной среде в стек лянных аквариумах. Оптимальной концентрации суспензия достигала по истечении двух суток. Для проведения научных опытов на перепелах (III и IV группы) и цып лятах-бройлерах суспензию хлореллы выращивали в прозрачном стеклянном фер ментере объемом 100 литров в культуральнойой среде Н. И. Богданова.
Условия культивирования в обоих случаях были идентичны лабораторным экс периментам. Суспензию перемешивали постоянным барботированием нестерильным воздухом при помощи воздушного компрессора производительностью 13…15 л/мин.
Баллонный СО2 подавали в дневное время суток через вход компрессора. Через пять дней культивирования суспензия достигала оптимальной плотности, из ферментера отбирали необходимое количество культуры и замещали его объем свежеприготов ленной культуральной средой.
В ходе исследований было проведено 2 научных опыта и производственное ис пытание. Исследования проводились на перепелах японской породы (Coturnix japon ica) и цыплятах-бройлерах кросса «Росс-308». Всего в опытах было использовано 1050 перепелов и 90 цыплят-бройлеров.
Целью первого научного опыта было определение влияния суспензии хлорел лы, выращенной как на оптимальной культуральной среде, так и на модифициро ванной среде с добавлением восстановленного наножелеза, на рост, развитие и мяс ную продуктивность перепелов. Опыт проводили в виварии в течение 49 дней. По принципу групп аналогов нами было сформировано 5 групп по 60 голов (таблица 1).
1. Схема первого научного опыта на перепелах Количество Группа Условия кормления и поения голов Основной рацион (ОР) + водопроводная вода I-контроль ОР + суспензия хлореллы с концентрацией (2–3) 10 6клеток/1 мл, выращенная на культуральнойой среде с добавлением наночастиц II-опытная восстановленного железа ОР + суспензия хлореллы с концентрацией (1–1,5) 10 6клеток/1 мл III-опытная ОР + суспензия хлореллы с концентрацией (2–3) 10 6клеток/1 мл IV-опытная ОР + 20 % витамина А суточной нормы V-опытная Содержались перепела в клеточных батареях. Кормушка крепилась к передней стенке клетки, а поилка – к боковой. Кормление птицы осуществлялось вручную. Тех нологические параметры содержания птицы (влажность воздуха, температура, осве щенность и др.) поддерживались автоматически и соответствовали требованиям, предъявляемым к их выращиванию. Схемы скармливания комбикормов обеспечивали нормальный рост и развитие молодняка в соответствии с принятыми планами роста и нормами кормления (А. П. Калашников и др., 1985, 2003;
П. И Викторов, и др., 1993;
В. И. Фисинин, И. А Егоров, 1992, 2000). Птица всех групп получала основной рацион, энергетическая и питательная ценность которого соответствовала общепринятым нор мам, рекомендованным ВНИИТИП.
Целью второго научного опыта было определение влияния суспензии хлорел лы на рост, развитие и мясную продуктивность цыплят-бройлеров. Опыт на цыпля тах-бройлерах проводили в виварии на протяжении 42 дней в типовых клеточных ба тареях КБУ-3 по санитарно-зоотехническим условиям, согласно рекомендациям (В. И.
Фисинин, 1989). Из суточных цыплят было сформировано 3 группы по 30 голов в каж дой (таблица 2). Каждый цыпленок был индивидуально взвешен, далее взвешивание проводилось еженедельно в течение всего опыта. Птица всех групп получала основной рацион, энергетическая и культуральная ценность соответствовала общепринятым нормам, рекомендованным ВНИТИП.
2. Схема второго научного опыта на цыплятах-бройлерах Количество Группа Условия кормления и поения голов Основной рацион (ОР) + витаминно-аминокислотный препарат I-контроль «Чиктоник» (1 мл/1 л воды) ОР + суспензия хлореллы с концентрацией (2–3) 10 6 клеток/1 мл II-опытная ОР + суспензия хлореллы с концентрацией (1–1,5) 10 6 клеток/1 мл III-опытная При культивировании на модифицированной восстановленным наножелезом среде, рост микроводоросли был интенсивнее по сравнению с другими опытными средами. Поэтому было проведено производственное испытание выращенной куль туры на рост и развитие перепелов. Производственную апробацию по влиянию сус пензии хлореллы на перепелов проводили в СПК «Колос» Краснодарского края. Бы ло сформировано 3 группы по 250 голов в каждой. Содержание перепелов было идентичным первому научному опыту. Биотехнологическую кормовую добавку суспензии хлореллы культивировали на культуральной среде с добавлением наноча стиц восстановленного железа (таблица 3). Для выпаивания перепелам III группы готовую суспензию хлореллы разводили водопроводной водой до концентрации (1–1,5) 10 6клеток/1 мл.
3. Схема производственного испытания на перепелах Количество Группа Условия кормления и поения голов Основной рацион (ОР) + водопроводная вода I-контроль ОР + суспензия хлореллы с концентрацией (2–3) 10 6клеток/1 мл, выращенная на культуральной среде с добавлением наночастиц восста II-опытная новленного железа ОР + суспензия хлореллы с концентрацией (1–1,5) 10 6клеток/1 мл, выращенная на культуральной среде с добавлением наночастиц восста III-опытная новленного железа В процессе проведения научных опытов и производственного испытания учи тывались основные группы показателей: клинико-физиологические, зоотехнические и физиологические. Определение учитываемых показателей проводили согласно действующим методикам и нормативным документам.
При контрольном убое перепелов и цыплят-бройлеров, который проходил в со ответствии с методикой проведения научных и производственных исследований по кормлению сельскохозяйственной птицы (Ш. А. Имангулов, 2004), проводили отбор крови (в специальные пробирки с антикоагулянтом) для изучения ее морфологиче ского состава, а также биохимических показателей ее сыворотки.
Морфологические показатели крови птицы определяли на анализаторе Medonic CA 620. Сыворотку крови исследовали на полуавтоматическом анализаторе Stat fax 1904® Plus и спектрофотометре Unico 2800 UK/VIS. Содержание в печени перепелов и цыплят-бройлеров каротиноидов, витаминов А, В2 и Е определяли согласно методике А. А. Покровского (1969). При гистологических исследованиях фиксированные в 10%-ом растворе нейтрального формалина срезы печени окрашивали по Романовскому-Гимзе.
Потребление кормов контролировали путем ежедневного группового учета. За каждый возрастной период и за весь опыт в целом определяли среднесуточный при рост и интенсивность роста (И. И. Шмальгаузен, 1935).
Для определения переваримости и усвояемости питательных веществ как перепе лами, так и цыплятами-бройлерами с 36 по 42 сутки проводился балансовый опыт (ба ланс азота, кальция и фосфора) (Ш. А. Имангулов, 2004). Отбор образцов для анализа проводили по методике (Б. Д. Кальницкий, Н. Г. Григорьев, 1977). Химический анализ кормов и продуктов обмена проводили по общепринятым методикам согласно ГОСТ, а также руководствуясь «Методы исследования кормов, органов и тканей животных» (П. Т. Лебедев, А. Т. Усович, 1965).
Для оценки переваримости хлореллы в ЖКТ птицы от каждой опытной группы в стерильные пузырьки с 9-ю мл физиологического раствора добавляли по 1-му г поме та, взбалтывали, давали отстаяться в течение 10 мин. Полученную взвесь разводили дополнительно в 2, 4 и 6 раз и высевали по 0,1 мл на чашки Петри с агаризованной средой Тамия. Контролем служила хлорелла концентрации 1…1,5 млн. клеток/мл.
За сутки до убоя аналогично определяли наличие хлореллы в содержимом мышечного желудка, кишечника и слепых отростков. Культивирование проводи ли при комнатной температуре и постоянном освещении белыми люминесцент ными лампами в течение 14-ти суток. Оценку количества выросших колоний про водили путем визуального просмотра чашек на инвертированном микроскопе фирмы «Carl ZEISS» модель AXIO Observer. A1.
Для изучения влияния суспензии хлореллы на вкусовые качества тушек цып лят-бройлеров и перепелов проводили качественную оценку мяса при помощи орга нолептических методов (Ш. А. Имангулов, 2004).
Расчет экономической эффективности использования суспензии хлореллы в рационах птицы проводили согласно методике ВАСХНИЛ (1980). С этой целью рассчитывали стоимость комбикормов, затраты корма в абсолютном и стоимост ном выражении, себестоимость единицы продукции, стоимость ее в реализацион ных ценах, а также прибыль или убыток.
Все полученные результаты обрабатывали биометрическими методами матема тической статистики (Б. А. Доспехов, 1979). Статистически достоверными считали различия при Р 0,05.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛИ ХЛОРЕЛЛЫ В настоящее время в России получены высокопродуктивные штаммы микроводо росли планктонного типа, не требующие перемешивания культуральной среды, в кото рой растет хлорелла – Chlorella vulgaris ИФР № С-111 и Chlorella vulgaris BIN (Н. И. Богданов, 2007). Однако условия выращивания культуры продолжают оптими зироваться. Для наращивания биомассы хлореллы необходимо соблюдение не толь ко температурного и светового режимов, но и правильный подбор культуральной среды, в которой большое значение уделяется азотному и фосфорному питанию.
В качестве контрольной культуральной среды мы использовали среду Тамия, от носительно которой сравнивали следующие среды: а) среда Н. И. Богданова;
б) среда на основе комплексного удобрения «Кемира Люкс» (0,05…2 г/л);
в) среда из компо зиций минерального комплекса «Кристалин» (0,1;
0,2 и 0,3 г/л) и карбамида (1,2;
1, и 1,5 г/л);
г) среда с добавлением концентрированного кукурузного экстракта (0,25…1 г/л);
д) питательная среда, модифицированная наночастицами восстановлен ного железа (0,00625…0,1 г/л). Результаты по оценке фотосинтетических процессов, происходящих в клетке, представлены значениями параметров В/Н (таблица 4).
4. Концентрация клеток Chlorella vulgaris ИФР № С-111 и отношение В/Н при культивировании на разных средах Концентрация хлореллы Отношение В/Н хлореллы (104 клеток/мл) Культуральная среда на начало на начало 5-е сутки 5-е сутки опыта опыта 100 % Тамия (контроль) 32,4±1,5 106,8±3,8 6,84±0,13 7,18±0, 100 % среда Н. И. Богданова 34,2±1,4 168,7±7,0* 6,82±0,15 9,83±0,35* «Кемира Люкс», 1 г/л 33,9±1,4 153,0±5,5* 6,85±0,21 8,72±0,29* «Кристалин» (0,2 г/л) + карбамид 1,5 г/л 32,8±1,3 115,3±4,3 6,84±0,18 7,43±0, Кукурузный экстракт 34,3±1,5 52,3±2,7 6,79±0,16 5,64±0, Модифицированная культуральная среда 33,6±1,2 170,3±8,7* 6,83±0,18 9,87±0,41* (0,025 г/л) Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) На 5-е сутки культивирования концентрация хлореллы на среде Н. И. Богданова превышала значение контроля на 58,0 %. При выращивании на рас творе «Кемира Люкс» наилучший результат был получен при концентрации 1 г/л (выше контроля на 43 %). При смешивании карбамида и «Кристалин» в концентра циях 1,5 г/л и 0,2 г/л, соответственно, превышение контроля составляло 8 %. При иных комбинациях количество хлореллы было ниже. Выращивание хлореллы на культуральной среде с кукурузным экстрактом показало, что при всех использован ных концентрациюях содержание клеток ниже контроля более чем в два раза. В свя зи с этим в таблице 4 конечный результат представлен на 3-и сутки с начала экспе римента. Оптимальная концентрация хлореллы на модифицированной наножелезом среде показана в таблице по истечении двух суток.
На начало опыта параметр В/Н хлореллы на всех исследуемых культуральных средах был на одном уровне. На 5-е сутки эксперимента наилучший значение было отмечено при культивировании хлореллы на среде Н. И. Богданова и превышало кон троль на 37,0 %. При выращивании хлореллы на культуральной среде с добавлением кукурузного экстракта отношение В/Н было минимальным и снижено по отношению к контролю на 21,5 %.
Таким образом, конечные концентрации хлореллы и значения параметра фото синтетической активности В/Н свидетельствуют о том, что наиболее подходящей культуральной средой (из тестируемых) для культивирования хлореллы является сре да, разработанная Н. И. Богдановым. Поэтому эта среда была выбрана для проведения опыта по влиянию наночастиц железа на скорость роста хлореллы.
3.2 ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ ЖЕЛЕЗА НА ИНТЕНСИВНОСТЬ РОСТА КЛЕТОК ХЛОРЕЛЛЫ Скорость транспорта ионов Fe3+ в клетку микроорганизмов определяют сидеро форы - низкомолекулярные вещества, связывающие ионы и переносящие их через мембрану (M. M. Babikin et al., 2012). Активация переноса железа может интенсифици ровать синтез железосодержащих ферментов и в связи с этим фотосинтетическую ак тивность хлореллы (А. Б. Рубин, 1987). Таким альтернативным путем транспорта желе за внутрь клетки может быть перенос его через мембрану в форме наночастиц. Низкая токсичность металлов в ультрадисперсной форме, пролонгированность действия на биосистемы являются предпосылками для использования их в качестве биостимулято ров роста (М. Е. Дорогов, 2008;
Л. В. Потапова, 2008).
В связи с этим нами было исследовано влияние наночастиц железа двух форм:
нулевой валентности и оксида железа на скорость роста хлореллы. Оба порошка были черного цвета. Посредством электронного микроскопа с полевой эмиссией JSM 7500F были получены фотографии нанопорошка восстановленного железа, средний размер которых составил 80 нм. Нанодисперсный порошок оксида железа имел раз меры 30…80 нм (М. П. Кульзенева, 2010).
Для проведения опыта был использован культиватор КВМ-05 и гостированная методика определения токсичности вод (Ю. С. Григорьев, 2004).
Суспензии наночастиц железа были окрашены, и при их добавлении в культу ральную среду хлореллы происходило увеличение оптической плотности. Естествен но, это необходимо было учитывать при определении концентрации клеток использо ванным нами методом.
Для надежного тестирования была выбрана максимальная концентрация нано железа, равная по оптической плотности поглощению света клетками хлореллы в момент начала эксперимента (0,1 о.е.).
Так как наночастицы в водных растворах способны к химическим превращени ям, их оптические характеристики должны изменяться. Из этого следует, что необ ходимо корректировать изменения в оптической плотности суспензии хлореллы с наночастицами. Для этого провели эксперимент, в котором во флакончиках культи ватора в течение 24 часов были только суспензии наночастиц.
Образцы, содержавшие наночастицы восстановленного железа, через 24 часа ста новились прозрачными и их оптическая плотность даже при максимальной концентра ции была близка к нулю. По-видимому, железо претерпевало химические превращения и переходило в формы, оптически прозрачные при длине волны измеряющего света.
При культивировании наночастицами оксида железа в тех же условиях через 24 часа оптическая плотность составила 0,021 о.е. По-видимому, это форма железа была более ус тойчивой к условиям окружающей среды. Таким образом, при добавлении к культураль ной среде культивирования микроводоросли восстановленного железа получаемая опти ческая плотность через сутки будет отражать только концентрацию клеток.
При проведении исследования максимальной была концентрация как восста новленного железа, так и его оксида 0,1 г/л. Далее ее уменьшали последовательным разведением в 2 раза до величины 0,00625 г/л.
Оптическая плотность суспензии хлореллы при культивировании на культураль ной среде с добавлением наночастиц оксида железа представлена на рисунке 1. До бавление наночастиц оксида железа в минимальной концентрации 0,0625 г/л приве ло к снижению оптической плотности суспензии по отношению к контролю на 23,5 %. При максимальном содержании наножелеза (0,1 г/л) концентрация суспен зии была в 2 раза снижена по отношению к контролю.
0, Концентрация хлореллы, о.е.
0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 0,00625 0,0125 0,025 0,05 0, Концентрация, г/л Рисунок 1 – Зависимость оптической плотности хлореллы от концентрации наночастиц оксида железа через 24 часа культивирования (среднее трех опытов) Таким образом, при всех концентрациях наночастиц оксида железа происходи ло ингибирование роста одноклеточной водоросли.
При культивировании в течение 24 часов хлореллы в присутствии наночастиц восстановленного железа концентрация хлореллы возрастала даже при минималь ном содержании добавки (рисунок 2).
Зависимость носила монотонный характер и при максимальной концентрации железа 0,1 г/л плотность хлореллы превышала контроль на 70 %. Через 48 часов кон центрация микроводоросли в опытных образцах при минимальном содержании нано частиц в два раза превышала контроль и уже при двукратной концентрации начинала выходить на стационарный уровень (рисунок 2). При содержании наночастиц 0,1 г/л плотность выросшей хлореллы была в 2,5 раза выше относительно контроля. В пре делах использованных нами концентраций наночастиц железа ингибирования роста хлореллы не наблюдали. Представленные результаты свидетельствуют об интенси фикации фотосинтеза в микроводоросли. Доказательством этому стали полученные параметры ЗФ суспензии хлореллы и индукционные кривые.
0,250 1, Концентрация хлореллы, о.е.
1, 0, 1, 0,150 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,000 0, 0,0 0,00625 0,0125 0,025 0,05 0, Концентрация, г/л 24 час 48 час Рисунок 2 – Зависимость оптической плотности хлореллы от концентрации наночастиц вос становленного железа через 24 и 48 часов культивирования (среднее трех опытов) На рисунке 3 представлены отношения уровня ЗФ при насыщающем освещении к уровню при низком (В/Н), отражающие интенсивность фотосинтетических процес сов - чем выше значение В/Н, тем активнее фотосинтез.
В/Н, о.е.
0 0,00625 0,0125 0,025 0,05 0, Концентрация, г/л В/Н 24 час. В/Н 48 час.
Рисунок 3 – Зависимость отношения В/Н хлореллы от концентрации наночастиц восста новленного железа через 24 и 48 часов культивирования (среднее трех опытов), Таким образом, фотосинтез в первые сутки культивирования значительно ак тивнее протекал в присутствии наночастиц железа. Через 48 часов при низких кон центрациях наночастиц отношение В/Н еще достаточно велико. С дальнейшим рос том концентрации значение параметра уменьшалось. Исходя из значений В/Н и оп тических плотностей оптимальной можно считать концентрацию наночастиц в на чальный момент выращивания хлореллы 0,025 г/л.
Полученные данные подтверждаются также индукционными кривыми замед ленной флуоресценции хлореллы (рисунок 4).
Все индукционные кривые имеют примерно одинаковую форму. В контроль ном образце максимальный уровень ЗФ составляет 1300 о.е. при значении В/Н 3,9.
При концентрации наножелеза 0,025 г/л интенсивность ЗФ максимальна – 3100 о.е., в то время как отношение В/Н - 7,34. Максимальное же содержание наножелеза привело к уменьшениям уровня ЗФ и В/Н (2600 о.е. и 6,21).
Интенсивность ЗФ, о.е.
0,025 г/л 0,1 г/л 0 г/л 0 6,25 12,5 18,75 25 31, Время, с Рисунок 4 – Индукционные кривые ЗФ хлореллы от концентрации наночастиц восстанов ленного железа на 48 часов от начала опыта Таким образом, проведенные исследования позволяют сказать о том, что сниже ние уровня ЗФ и значения В/Н отражает снижение фотосинтетических процессов, связанных с обеднением состава культуральной среды и исчерпанием ресурсов самих фотосинтезирующих клеток в результате интенсификации процессов размножения.
Микроскопия в светлом поле (рисунок 5) и люминесцентная микроскопия (рису нок 6), проведенные через 48 часов культивирования, показала идентичность морфо логических характеристик хлореллы при всех концентрациях наночастиц.
Контроль Концентрация наночастиц железа 0,1 г/л Рисунок 5 – Микроскопия хлореллы в светлом поле (400х) Контроль Концентрация наночастиц железа 0,1 г/л Рисунок 6 – Люминесцентная микроскопия хлореллы (400х) Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что восстановленное на ножелезо является эффективным стимулятором фотосинтетических процессов у мик роводорослей.
Исходя из результатов экспериментов по подбору оптимальной культутральной среды для выращивания хлореллы мы выбрали среду Н. И. Богданова, и модифици ровали ее добавлением в начальный момент культивирования наночастиц восстанов ленного железа.
3.3 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ СУСПЕНЗИИ ХЛОРЕЛЛЫ В РАЦИОНАХ ПЕРЕПЕЛОВ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ МЕТАБОЛИЗМА И ПОВЫШЕНИЯ МЯСНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ 3.3.1 РОСТ И РАЗВИТИЕ ПЕРЕПЕЛОВ Для проведения первого научного опыта на перепелах было сформировано групп по 60 голов в каждой. Перепела всех групп получали стандартный комбикорм.
Птицу I группы (контроль) поили водопроводной водой;
II опытную группу – суспен зией хлореллы с концентрацией (2–3) 10 6клеток/1 мл, выращенную на культураль ной среде с добавлением наночастиц восстановленного железа;
III опытную группу – суспензией хлореллы с концентрацией (1–1,5) 10 6клеток/1 мл;
IV опытную группу – суспензией хлореллы с концентрацией (2–3) 10 6клеток/1 мл и V опытную группу – водопроводную воду с добавлением 20 % витамина А от суточной нормы.
В таблице 5 представлены данные по динамике живой массы, расходу кормов и сохранности птицы. На начало опыта, при формировании групп, живая масса пере пелов была примерно одинаковой и составляла в среднем 7,26 г.
5. Динамика живой массы, расход кормов и сохранность перепелов, n = Группы Показатели I-контроль II-опытная III-опытная IV-опытная V-опытная 1-е сутки 7,23±0,16 7,26±0,14 7,24±0,18 7,29±0,15 7,31±0, 49-е сутки 190,1±4,68 218,7±3,41* 204,2±3,29* 212,21±8,12 201,8±4, Среднее потребление 652,18 572,13 618,17 627,83 631, корма на гол, г Сохранность, % 90 100 100 96,6 96, Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) Наибольшая масса перепелов на 49-е сутки была зафиксирована во II и IV группах и превышала контроль на 15,0 и 11,5 % соответственно. Причем у перепелов II и III групп разница была достоверной по отношению к контролю (Р 0,05). Живая масса перепелов во II и IV группах была на 7,4 и 6,1 % больше контроля. Среднесуточные привесы перепелов в опытных группах были больше контроля в среднем на 10,9 %.
Самое низкое потребление корма перепелами было отмечено во II группе и бы ло на 12,27 % ниже контроля. Во всех опытных группах сохранность перепелов бы ла больше, чем в контроле.
3.3.2 МЯСНАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ, РАЗВИТИЕ ВНУТРЕННИХ ОРГАНОВ И КАЧЕСТВО МЯСА ПЕРЕПЕЛОВ В таблице 6 представлены результаты контрольного убоя перепелов.
6. Мясная продуктивность и развитие внутренних органов перепелов, n = Группы Показатели I-контроль II-опытная III-опытная IV-опытная V-опытная Живая масса перед 196,78±8,54 212,99±8,72 205,38±8,19 212,32±8,12 198,2±7, убоем, г Масса потрошеной 129,43±4,27 146,35±3,13* 134,36±3,74 145,18±3,92* 133,24±4, тушки, г Печень, г 3,55±0,12 5,29±0,14* 4,85±0,12* 5,13±0,11* 4,16±0,13* Сердце, г 1,58±0,08 1,7±0,07 1,54±0,05 1,61±0,05 1,63±0, Мышечный желудок, г 4,46±0,21 4,06±0,17 4,27±0,14 4,11±0,10 5,12±0,2* Железистый желудок, г 0,82±0,02 0,96±0,03* 0,95±0,03* 0,94±0,03* 0,91±004* Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) Живая масса перепелов перед убоем соответствует нормативам веса птицы в данном возрасте. Средняя масса потрошеной тушки перепелов II и IV групп больше контроля на 8,2 и 7,9 % (Р 0,05). Масса сердца перепелов из опытных групп была на уровне контроля. Масса мышечного желудка во II и IV группах была ниже кон троля в среднем на 8,4 %. Масса печени перепелов из данных групп на 49,0 и 44,5 % больше контроля. Различия были достоверны для перепелов всех опытных групп по отношению к контролю (Р 0,05). Увеличение размеров печени перепелов опытных групп не связано с патологией. Об этом свидетельствуют биохимические показатели сыворотки крови и гистологические исследования.
3.3.2 ВЛИЯНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ СУСПЕНЗИИ ХЛОРЕЛЛЫ НА МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ПЕРЕПЕЛОВ Для изучения влияния биотехнологической кормовой добавки суспензии хло реллы на перепелов мы проводили исследования ряда морфологических и биохими ческих показателей крови, по которым можно судить о физиологическом состоянии птицы (таблица 7).
7. Морфологические показатели крови перепелов, n = Группы Показатели I-контроль II-опытная III-опытная IV-опытная V-опытная Эритроциты, 1012/л 3,24±0,13 4,01±0,11* 3,98±0,1* 4,16±0,09* 3,34±0, Лейкоциты, 109/л 24,71±1,02 23,48±0,92 23,16±0,69 23,42±0,72 24,51±0, Тромбоциты, 109/л 126,28±2,81 128,72±1,96 128,69±2,12 127,74±1,97 126,29±2, Гемоглобин, г/л 132,17±3,51 140,35±3,14 140,23±2,83 141,12±2,54* 135,82±3, Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) Нами установлено, что количество эритроцитов у перепелов из II, III и IV групп было достоверно больше контроля на 23,7;
22,8 и 28,4 % (Р 0,05). Содержание лейкоцитов у перепелов опытных групп было меньше контроля в среднем на 4 %.
Уровень гемоглобина у перепелов IV группы на 6,8 % больше контроля (Р 0,05).
Из таблицы 8 следует, что все биохимические показатели сыворотки крови пе репелов находятся в пределах физиологической нормы.
Содержание общего белка в сыворотке крови перепелов V группы на 11,1 % больше контроля (Р 0,05). Уровень альбуминов у птицы IV группы на 10,4 % больше контроля (Р 0,05). Содержание глобулинов у перепелов III группы на 9,9 % больше контроля (Р 0,05). У перепелов II, III и IV групп уровень АСТ больше контроля на 16,1;
12,0 и 15,6 % (Р 0,05). Минимальное значение уровня АЛТ отмечено в кон трольной группе. Значение АЛТ у перепелов всех опытных групп больше контроля в среднем на 5,2 %. У перепелов из II, III и IV групп количество кальция больше контро ля на 27,2;
19,6 и 30,7 % (Р 0,05). Значение содержания кальция в крови перепелов II, III и IV групп больше контроля на 18,6;
15,7 и 20,6 % (Р 0,05).
8. Биохимические показатели сыворотки крови перепелов, n = Группы Показатели I-контроль II-опытная III-опытная IV-опытная V-опытная Общий белок, г/л 30,42±1,07 32,18±0,74 32,74±0,91 32,35±0,79 33,82±0,93* альбумины 13,56±0,41 14,13±0,39 14,21±0,46 14,97±0,41* 13,92±0, глобулины 16,86±0,53 18,05±0,51 18,53±0,42* 17,93±0,57 19,9±0,36* Креатинин, мкМ/л 58,18±2,01 62,27±2,17 61,19±2,52 59,83±3, 62,48±2, Мочевая кислота, 397,13±3,27 372,39±2,18 369,59±2,41 372,87±2,48 402,02±3, мкМ/л Холестерин, мМ/л 4,06±0,11 3,87±0,12 3,94±0,1 3,82±0,12 4,03±0, АСТ, Ед/л 341,16±8,52 396,03±6,27* 382,26±6,38* 394,51±5,97* 352,51±8, АЛТ, Ед/л 31,03±1,01 32,95±0,87 32,81±0,94 32,98±0,76 31,83±1, -амилаза, Ед/л 840,1±21,17 762,78±17,82 760,25±20,49 763,70±18,29 824,17±22, Кальций, мМ/л 3,16±0,13 4,02±0,12* 3,78±0,1* 4,13±0,12* 3,24±0, Фосфор, мМ/л 1,99±0,08 2,26±0,1 2,11±0,09 2,19±0,1 2,04±0, Магний, мМ/л 1,02±0,03 1,21±0,04* 1,18±0,04* 1,23±0,05* 1,14±0, Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) В таблице 9 представлены данные по содержанию каротиноидов и витамина А в печени перепелов. Содержание каротиноидов в печени перепелов из II, III и IV групп больше, чем в контроле в 2,13;
1,9 и 2,1 раза (Р 0,05), а витамина А в 2,56;
2,27 и 2,31 раза (Р 0,05).
9. Содержание каротиноидов и витамина А в печени перепелов, n = Группы Показатели I-контроль II-опытная III-опытная IV-опытная V-опытная Каротиноиды мкг/г 1,85±0,12 3,95±0,19* 3,49±0,12* 3,92±0,14* 2,03±0, Витамин А, мкг/г 184,35±13,21 427,21±18,68* 418,96±14,02* 426,11±14,60* 193,15±14, Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) Проведенные исследования позволяют сделать заключение о положительном влиянии суспензии хлореллы на морфологические и биохимические показатели кро ви перепелов.
3.3.3 ПЕРЕВАРИМОСТЬ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ ПЕРЕПЕЛАМИ ПРИ ВКЛЮЧЕНИИ В ИХ РАЦИОН СУСПЕНЗИИ ХЛОРЕЛЛЫ В таблице 10 представлены данные по переваримости питательных веществ комбикорма и коэффициенту использования макроэлементов перепелами.
Переваримость органического вещества у перепелов из II, III, IV и V групп больше контроля на 19,9;
19,4;
17,1 и 10,1 % (Р 0,05).Сырой протеин лучше всего переваривается у перепелов II, III и IV и на 15,5;
15,4 и 14,0 % больше контроля (Р 0,05). Переваримость безазотистых экстрактивных веществ (БЭВ) у перепелов из II, III и IV групп больше контроля на 15,8;
14,9 и 14,0 % (Р 0,05). Коэффициент ис пользования кальция и фосфора у перепелов из II, III и IV групп достоверно больше контроля (Р 0,05).
10. Переваримость питательных веществ и коэффициент использования макроэлементов комбикорма перепелами, % Группы Питательные вещества I-контроль II-опытная III-опытная IV-опытная V-опытная Органическое вещество 65,92±1,67 79,04±1,95* 78,71±1,78* 77,18±1,82* 72,58±1,62* Сырой протеин 64,25±1,79 74,21±1,58* 74,18±1,41* 73,27±1,94* 66,39±1, Сырой жир 76,16±2,96 82,72±3,27 82,17±3,14 82,21±3,21 77,31±3, Сырая клетчатка 34,94±1,47 39,58±1,73 38,15±1,62 38,36±1,49 36,61±1, БЭВ 54,72±1,13 63,35±1,25* 62,89±1,82* 62,39±1,09* 54,37±1, Коэффициент использования, % Кальций 42,48±1,84 51,29±2,27* 51,21±2,18* 52,77±2,43* 43,72±1, Фосфор 37,36±1,21 43,82±1,35* 43,26±1,26* 42,31±2,01* 38,92±1, Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) Проведенные исследования по влиянию на перепелов биотехнологической кормовой добавки суспензии хлореллы, выращенной на культуральной среде с до бавлением наночастиц восстановленного железа, не показали токсического воздей ствия на птицу. Об этом свидетельствует прирост живой массы, морфологические и биохимические показатели крови и ее сыворотки, переваримость культуральных веществ и коэффициент использования минеральных веществ.
3.4 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ СУСПЕНЗИИ ХЛОРЕЛЛЫ В РАЦИОНАХ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ ДЛЯ КОР РЕКЦИИ МЕТАБОЛИЗМА И ПОВЫШЕНИЯ МЯСНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ 3.4.1 РОСТ И РАЗВИТИЕ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ Из суточных цыплят было сформировано 3 группы по 30 голов в каждой. Птица всех групп получала стандартный рацион, рекомендованный ВНИИТИП. В качестве питья цыплята-бройлеры получали: I – контроль, водопроводную воду с добавлени ем витаминнно-аминокислотного препарата «Чиктоник» (1 мл/1 л воды);
II опытная группа – суспензию хлореллы с концентрацией (2–3) 10 6клеток/1 мл;
III опытная группа – суспензию хлореллы с концентрацией (1–1,5) 10 6клеток/1 мл. Для вы паивания цыплятам-бройлерам была использована суспензия хлореллы, выращенная на оптимальной культуральной среде без добавления наночастиц железа. Динамика живой массы, расход кормов и сохранность при выращивании цыплят-бройлеров представлены в таблице 11.
Средний вес суточных цыплят на начало опыта составлял 36,4 г. К концу опыта (42 сутки выращивания) средняя масса цыплят-бройлеров из II и III группы была больше контроля на 5,6 % (Р 0,05) и 4,2 %.
11. Динамика живой массы, расход кормов и сохранность цыплят-бройлеров, n = Группы Показатели I-контроль II-опытная III-опытная 1-е сутки 36,2±0,4 37,3±0,2 36,2±0, 42-е сутки 2559±55,4 2702±36,7* 2666±67, Среднее потребление корма на гол, кг 5,7 5,3 5, Сохранность, % 90 100 Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) Среднее потребление корма цыплятами-бройлерами на одну голову во II и III группах ниже контроля на 7,0 и 10,5 %. Сохранность поголовья цыплят-бройлеров во всех опытных группах была больше контроля.
3.4.2 МЯСНАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ И РАЗВИТИЕ ВНУТРЕННИХ ОРГАНОВ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ Изучение мясной продуктивности и развития внутренних органов цыплят бройлеров представлены в таблице 12. На конец эксперимента живая масса цыплят бройлеров из II и III групп на 18,7 (Р 0,05) и 2,2 % больше контроля. масса потрошеной тушки цыплят-бройлеров из II группы была больше, чем в контроле на 19,7 % (Р 0,05).
12. Мясная продуктивность и развитие внутренних органов цыплят-бройлеров, n = Группы Показатели I-контроль II-опытная III-опытная Живая масса перед убоем, г 2228,2±14,57 2645,4±40,45* 2351,4±71, Масса потрошеной тушки, г 1668,0±2,0 1996,7±7,26* 1703,3±51, Печень, г 44,94±4,05 77,72±5,89* 46,12±0, Сердце, г 10,46±0,008 15,95±0,3* 11,85±0,25* Мышечный желудок, г 18,30±0,24 16,90±0,36 16,69±0, Железистый желудок, г 6,36±1,07 5,56±0,12 5,22±0, Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) У цыплят-бройлеров из II и III групп масса печени на 72,9 (Р 0,05) и 2,6 % больше контроля. Увеличение массы печени можно связать с более интенсивными об менными процессами, в результате которых увеличивается масса птицы. Массы мы шечного и железистого желудков цыплят-бройлеров опытных групп меньше кон троля. Такой результат можно объяснить более доступными культуральными веще ствами, содержащимися в корме, за счет чего и происходит уменьшение нагрузки на мышечный желудок цыплят-бройлеров.
3.4.3 ВЛИЯНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ СУСПЕНЗИИ ХЛОРЕЛЛЫ НА МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕ СКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ Из данных таблицы 13 следует, что исследуемые морфологические показатели крови у цыплят-бройлеров были в пределах физиологической нормы. Количество тромбоцитов в крови цыплят-бройлеров У птицы III группы уровень лейкоцитов больше контроля на 6,6 % (Р 0,05). Уровень гемоглобина в крови цыплят бройлеров из II и III групп на 5,58 и 14,48 % больше контроля (Р 0,05).
13. Морфологические показатели крови цыплят-бройлеров, n = Группы Показатели I-контроль II-опытная III-опытная Эритроциты, 10 /л 2,37±0,02 2,4±0,05 2,47±0, Тромбоциты, 109/л 64,5±0,95 66,7±1,14 68,8±0,46* Лейкоциты, 109/л 31,8±0,55 30,7±0,62 33,9±0,53* Гемоглобин, г/л 93,2±0,25 98,4±0,36* 106,7±0,7* Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) В сыворотке крови птицы (таблица 14) из II и III групп содержание альбумина на 33,3 и 28,9 % (Р 0,05), содержание глобулина на 8,9 и 9,2 % (Р 0,05), коэффициент А/Г на 21,9 и 19,5 % (Р 0,05), на уровень кальция на 13,5 и 10,7 % (Р 0,05) больше контроля. Содержание мочевой кислоты у перепелов II и III групп больше контроля в 3,1 и 2,5 раза (Р 0,05).
14. Биохимические показатели крови цыплят-бройлеров, n = Группы Показатели I-контроль II-опытная III-опытная Общий белок, г/л 39,05±1,9 45,3±9,6 44,9±5, альбумины 11,4±0,65 15,2±0,46* 14,7±0,35* глобулины 27,65±0,3 30,1±0,22* 30,2±0,29* А/Г коэффициент 0,41±0,01 0,5±0,02* 0,49±0,02* Креатинин, мкМ/л 40,3±1,7 39,65±6,45 43,05±6, Мочевая кислота, мкМ/л 108,1±25,8 336,7±12,7* 274,05±41,15* Глюкоза, мМ/л 10,24±0,45 11,95±0,32* 10,89±0, Холестерин, мМ/л 3,25±0,25 3,05±0,12 2,85±0, АСТ, Ед/л 225,05±9,25 205,8±9,4 187,05±6, АЛТ, Ед/л 3,9±0,18 3,45±0,25 3,16±0, -амилаза, Ед/л 1296,25±59,5 1254,25±54,15 1235,55±46, Гамма-ГТ 29,95±6,75 32,95±1,65 34,0±0,6* Кальций, мМ/л 4,68±0,06 5,31±0,08* 5,18±0,08* Фосфор, мМ/л 2,05±0,05 2,18±0,07 2,16±0, Магний, мМ/л 0,98±0,01 1,03±0,02 1,01±0, Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) Печень является органом, ответственным за формирование правильного обмена веществ в организме и занимает важное место в белковом обмене. Анализ витамин ного состава печени позволяет судить о влиянии исследуемой добавки суспензии хлореллы на организм цыплят-бройлеров (таблица 15).
15. Содержание каротиноидов и витаминов в печени цыплят-бройлеров, n = Группы Показатели I-контроль II-опытная III-опытная Каротиноиды, мкг/г 1,95±0,02 2,18±0,03* 1,98±0, Витамин А, мкг/г 56,5±1,05 74,6±2,16* 120,7±4,03* Витамин В2, мкг/г 13,9±0,3 14,8±0,34* 15,6±0,24* Витамин Е, мг% 0,51±0,04 0,74±0,03* 0,68±0,03* Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) Уровень депонированного витамина А в печени цыплят-бройлеров II и III групп был на 32,0 и 113,6 % больше контроля (Р 0,05). Содержание каротиноидов и вита мина Е у птицы II группы больше контроля на 11,8 и 45,1 % (Р 0,05).
Уровень витамина В2 у цыплят-бройлеров из II и III группы больше контроля на 6,5 и 12,2 % (Р 0,05). При включении в рацион цыплят-бройлеров суспензии хлореллы уровень витаминов в печени (по отношению к контролю) увеличивается, но находится в пределах физиологической нормы.
3.4.4 ПЕРЕВАРИМОСТЬ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ ЦЫПЛЯТАМИ-БРОЙЛЕРАМИ ПРИ ВКЛЮЧЕНИИ В ИХ РАЦИОН СУСПЕНЗИИ ХЛОРЕЛЛЫ В таблице 16 представлены результаты по переваримости и использованию ос новных питательных веществ корма при включении в рацион цыплят-бройлеров сус пензии хлореллы.
Коэффициенты переваримости всех исследуемых питательных веществ у пти цы из опытных групп больше контроля. Коэффициент использования цыплятами бройлерами из II и III групп кальция на 18,4 и 15,3 % и фосфора на 12,8 и 6,3 % больше контроля.
16. Переваримость питательных веществ и коэффициент использования макроэлементов комбикорма цыплятами-бройлерами, % Группы Питательные вещества I-контроль II-опытная III-опытная Органическое вещество 72,37±2,15 73,12±2,36 73,04±2, Сырой протеин 81,15±2,91 82,91±2,97 82,76±2, Сырой жир 81,03±3,02 83,26±3,47 82,67±2, Сырая клетчатка 15,17±0,54 17,83±0,58 16,66±0, БЭВ 76,03±2,82 79,21±3,07 78,58±2, Коэффициент использования, % Кальций 41,2±1,74 48,8±2,17* 47,5±2, Фосфор 38,2±1,25 43,1±2,08 40,6±1, Примечание: * – разница с контролем достоверна (P 0,05) 3.4.5 ПЕРЕВАРИМОСТЬ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СУСПЕНЗИИ ХЛОРЕЛЛЫ ПЕРЕПЕЛАМИ И ЦЫПЛЯТАМИ-БРОЙЛЕРАМИ Для оценки переваримости микроводоросли хлореллы проводили исследование не только в помете, но и в желудочно-кишечном тракте как перепелов, так и цып лят-бройлеров опытных групп путем посева в чашки Петри. На конец эксперимента во всех чашках Петри колоний хлореллы обнаружили. В контрольной чашке, в кото рую высевали суспензию хлореллы, колонии были видны даже без микроскопии на 6 е сутки. Таким образом, можно сделать вывод о переваривании суспензии хлореллы в желудочно-кишечном тракте птицы.
3.5 ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ СУСПЕНЗИИ ХЛОРЕЛЛЫ НА ПЕРЕПЕЛАХ В УСЛОВИЯХ СПК «КОЛОС» Заключительным этапом наших исследований стало проведение производствен ного испытания на перепелах, для которого было сформировано 3 группы, по 250 го лов в каждой (таблица 17).
В рацион перепелов входила биотехнологическая кормовая добавка суспензии хлореллы, выращенная на культуральной среде с добавлением наночастиц железа. В ходе исследования рассчитывали себестоимость 1 кг мяса, выручку от реализации мяса перепелов, а также рентабельность производства.
17. Экономическая эффективность выращивания перепелов в производственном опыте Группы Показатели I-контроль II-опытная III-опытная Хозяйственные характеристики Поголовье на начало опыта, гол. 250 250 Сохранность, % 92 97 Живая масса, г 1-е сутки 7,18±0,12 7,34±0,17 7,29±0, На конец опыта 197,18±4,21 223,47±3,83 215,92±4, Масса потрошеных тушек (всего), кг 32,35 39,5 37, Экономическая эффективность применения добавок за период выращивания Стоимость кормов, всего, руб: 2815 3033,8 3078, - комбикорм 2815 2838,4 2921, - хлорелла - 195,4 156, Себестоимость 1 кг мяса, руб 117,45 103,7 111, Цена реализации 1 кг перепелятины, руб. 200,00 200,00 200, Прибыль с 1 кг мяса, руб 82,6 96,3 88, с группы, руб 2672,11 3803,85 3288, Выручка от реализации перепелятины, руб. 6470 7900 Рентабельность, % 41,3 48,1 44, Себестоимость 1 кг мяса перепелов в II и III групп составила 68,22 и 76,9 руб., что ниже контроля на 26,4 и 17,11 % соответственно. Снижение себестоимости продукции перепелов II и III групп приводит к увеличению прибыли, получаемой с 1 кг мяса пе репелов, которая больше контроля на 24,55 и 15,87 руб, или на 22,9 и 14,8 %. Увеличе ние прибыли, получаемой с 1 кг мяса перепелов из II и III групп позволило увеличить и выручку от реализации продукции, которая превышала контроль на 22,1 и 15 %.
Таким образом, применение в рационе перепелов суспензии хлореллы, выра щенной на культуральной среде с добавлением наночастиц восстановленного же леза, в концентрации (2–3) 10 6 клеток/мл (перепела II группы) и в концентрации (1–2) 10 6 клеток/мл (перепела III группы) позволило увеличить рентабельность производства по отношению к контролю на 6,8 и 2,9 %.
4. ВЫВОДЫ 1. Проведены испытания 4 культуральных сред для выращивания хлореллы штамма ИФР №С-111. Худшие результаты дала культуральная среда на основе куку рузного экстракта;
наилучший результат получен на среде Н. И. Богданова, которая в дальнейшем была использована в качестве базовой при разработке оптимального вари анта, обеспечивающего ускоренный рост микроводоросли.
2. Модификация культуральной среды Н.И. Богданова введением наночастиц восстановленного железа ускорила наращивание биомассы хлореллы в 2,5 раза, что сократило срок культивирования хлореллы в два раза.
3. Увеличение скорости роста хлореллы в среде с наночастицами железа – резуль тат интенсификации фотосинтетических процессов, это подтверждено изменениями величин В/Н и максимальных уровней индукционных кривых ЗФ. Наночастицы оксида железа ингибировали рост хлореллы во всех использованных концентрациях.
4. По результатам люминесцентной микроскопии содержимого ЖКТ птицы (с последующим высевом на агаризованную среду) не обнаружено колоний хлореллы, что свидетельствуют о полной переваримости ее клеток.
5. Использование суспензии хлореллы, выращенной на среде с восстановлен ным наножелезом, в качестве кормовой добавки оказало положительное влияние на продуктивность перепелов, что проявилось в увеличение сохранности поголовья, снижение потребления корма на 12,27 %, увеличение живой массы на 15 % и выхода готовой продукции на 2,9 %;
улучшилась переваримость органического вещества на 19,9 % и БЭВ на 15,8 %. Морфологические и биохимические показатели крови пти цы опытных групп были несколько больше по сравнению с контрольной группой, и находились в пределах физиологической нормы, токсических эффектов применения хлореллы не выявлено.
6. Выпаивание цыплятам-бройлерам суспензии хлореллы в качестве кормовой добавки способствует повышению их потенциала продуктивности, это подтвержда ется увеличением сохранности поголовья на фоне снижением потребления корма на 7,0 %;
увеличением коэффициента использования кальция и фосфора на 18,4 и 12,8 %, а также живой массы на 5,6 %, выхода готовой продукции на 0,6 %. Морфо логические и биохимические показатели крови птицы опытных групп были не сколько выше по сравнению с контрольной группой, и находились в пределах фи зиологической нормы, токсических эффектов применения хлореллы не выявлено.
7. Результаты проведенного производственного испытания полностью подтвер дили эффект, полученный в первом научном опыте. Расчет экономической эффек тивности показал, что применение суспензии хлореллы, выращенной с добавлением восстановленного наножелеза, в концентрации (2–3) 10 6 клеток/мл увеличивает рентабельность производства по отношению к контролю на 6,8 %.
5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ Для повышения плотности и скорости роста хлореллы следует использовать культуральную среду с наночастицами восстановленного железа, размером в сред нем 80 нм, в концентрации 0,025 г/л. Результаты производственных испытаний по зволяют рекомендовать включать битехнологическую кормовую добавку суспензии хлореллы в рационы перепелов и цыплят-бройлеров. Применение суспензии хло реллы в концентрации (2–3) 10 6 клеток/мл в их рационах в течение всего периода выращивания обеспечит повышение продуктивности, улучшение качества получае мой продукции и увеличение прибыли от реализации мяса птицы.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Мачнева, Н. Л. Хлорелла и ее применение в птицеводстве / Г. А. Плута хин, Н. Л. Мачнева [и др.] // Птицеводство. - 2011. - № 5. - С. 23-25.
2. Мачнева, Н. Л. Эффективность применения биотехнологических функ циональных добавок при выращивании перепелов / А. Г. Кощаев, Г. А. Плута хин, Н. Л. Мачнева [и др.] // Ветеринария Кубани. - 2011. - № 4. - С. 23-24.
3. Мачнева, Н. Л. Биотехнология получения хлореллы и ее применение в птицеводстве как функциональной кормовой добавки / Г. А. Плутахин, Н. Л.
Мачнева [и др.] // Труды Кубанского государственного аграрного университета.
- 2011. - № 31. - С. 101-104.
4. Мачнева, Н. Л. Хлорелла и триходерма в качестве функциональных кормовых добавок перепелам // А. Г. Кощаев, А. И. Петенко Г. А. Плутахин, Н. Л. Мачнева [и др.] // Аграрная наука. - 2012. - № 7. - С. 28-29.
5. Мачнева, Н. Л. Хлорелла и ее применение в птицеводстве / Г. А. Плутахин, А. И. Петенко, А. Г. Кощаев, Н. Л. Мачнева [и др.] // Эффективное животноводство.
- 2011. - № 9 (71). - С. 22-23.
6. Мачнева, Н.Л. Стимуляция деления клеток Chlorella vulgaris наночастицами железа / Н.Л. Мачнева, Г.А. Плутахин, // International Conference «Physiology and Biotechnology of Microalgae», Moscow, October 16-19, 2012, - С. 35.
7. Мачнева, Н. Л. Суспензия хлореллы как средство нормализации обмена ве ществ у цыплят-бройлеров / А. Г. Кощаев, Н. Л. Мачнева [и др.] // Материалы меж дународной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современ ной ветеринарии», Краснодар, 2011 - С. 125-128.
8. Мачнева, Н. Л. Культивирование хлореллы на различных питательных сре дах / Н. Л. Мачнева, Г. А. Плутахин // «Функциональные продукты питания: ресур сосберегающие технологии переработки сельскохозяйственного сырья, гигиениче ские аспекты и безопасность» Материалы международной научно-практической конференции 9-13 ноября 2009. - Краснодар - С. 337-338.
9. Мачнева, Н. Л. Перспективы использования хлореллы в сельском хозяйстве / Н. Л. Мачнева, Г. А. Плутахин // Тезисы Третьей Всероссийской научно практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромыш ленного комплекса», 18-20 ноября 2009. Краснодар. - С. 225.
10. Мачнева, Н. Л. Подбор условий культивирования хлореллы для использования в кормопроизводстве / Н. Л. Мачнева, Г. А. Плутахин // Тезисы докладов 36-й научной конференции студентов и молодых ученых вузов южного федерального округа, по священной 40-летнему юбилею Кубанского государственного университета физиче ской культуры, спорта и туризма, январь-март 2009. Краснодар - С. 187.
11. Мачнева, Н. Л. Культивирование хлореллы на питательной среде, содержа щей кукурузный экстракт / Н. Л. Мачнева, Г. А. Плутахин // Тезисы Вторая Всерос сийская научно-практическая конференция молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», 19-21 ноября 2008. Краснодар. - С. 243-244.
Мачнева Надежда Леонидовна Интенсификация биотехнологии культивирования хлореллы с использованием наночастиц железа и оценка эффективности применения ее в бройлерном производстве и перепеловодстве Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 20.04.2013 г. Усл. печ. л. 1,0.
Тираж 100. Заказ № Типография ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» 350044, г. Краснодар, ул. Калинина,