Дискретная гетерогенность популяций биопленкообразующих бактерий и обратимые изменения интенсивности мутагенеза
На правах рукописи
МАГДАНОВА Лариса Альбертовна ДИСКРЕТНАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОПУЛЯЦИЙ БИОПЛЕНКООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ОБРАТИМЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ МУТАГЕНЕЗА 03.02.03 Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пермь – 2011 2
Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Учреждения Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь
Научный консультант: кандидат биологических наук Голясная Надежда Викторовна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Октябрьский Олег Николаевич доктор медицинских наук Шишкова Юлия Сергеевна
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
Защита диссертации состоится « » ноября 2011г. в « » часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, Пермь, ул. Голева, 13.
Факс: (342)280-92- Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Автореферат разослан «24» октября 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Толерантность биопленок условно-патогенных микроорганизмов к воздействию антибактериальных веществ – одна из основных причин снижения эффективностей химиотерапии хронических инфекционных заболеваний и устойчивой контаминации медицинского оборудования [Lappin-Scott et al., 2003;
Lens et al., 2003]. Особое внимание уделяют микробиологической коррозии элементов промышленных и водно-технических конструкций. В ряду важнейших факторов экстремальной толерантности биопленок, колонизирующих промышленное оборудование, рассматривают как сложный видовой состав микробиоценоза (разнообразие видов), так и гетерогенность популяций каждого вида (разнообразие фенотипов) [Lappin-Scott et al., 2003]. Последняя проявляется либо в виде различий реакций клеток на изменения среды [Бухарин и др., 2005;
Zgur-bertok, 2007], либо в виде результата спонтанного и стимулируемого стрессом мутагенеза [Chopra et al., 2003;
Boles et al., 2004]. Подавляющая масса клеток в составе бактериальных сообществ характеризуется чрезвычайно низкими частотами спонтанных мутаций (ЧCМ). Однако в популяции присутствуют клетки с мутаторным фенотипом, т.е.
микроорганизмы, ЧCМ которых выше в 10–1000 раз [Drake, 1991]. Адаптивная роль таких бактерий в выработке устойчивости к химиотерапевтическим препаратам подтверждена в ряде исследований [Chao et al., 1983;
LeClerc, 1998]. Она реализуется за счет высокой вероятности приобретения необходимых мутаций. При этом клетка приобретает как положительные, так и негативные изменения генов, поэтому выживание бактериальной популяции определяется поддержанием оптимального соотношения частот мутаций [Funchain, 2000;
Kuhar, 2001].
Наиболее распространёнными причинами мутаторного фенотипа являются повреждения генов системы репарации ошибочно спаренных оснований (ММР) [Friedberg et al., 1995;
LeClerc et al., 1996]. Мутации в этих генах обуславливают увеличение ЧCМ на 2–3 порядка. Недавние исследования популяций Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa выявили высокие проценты слабых мутаторов, с превышением интенсивности мутагенеза в 10–50 раз [Kenna et al., 2007;
Turrientes et al., 2010], поднимая вопрос о превалирующей адаптивной роли слабого гипермутагенеза. В настоящее время предполагается, что гены ММР не принимают участия в развитии слабого гипермутагенеза [Kenna et al., 2007;
Mena et al., 2008;
Oliver et al., 2000]. Однако максимальная изученность генов mutSL в контексте модуляции ЧCМ природных микроорганизмов делает их первыми кандидатами на роль причинных факторов гипермутагенеза.
Цель настоящего исследования – изучение характера и природы гетерогенности популяций природных сапротрофных микроорганизмов по уровню спонтанного мутагенеза.
Основные задачи исследования:
1. Изоляция и идентификация основных компонентов культивируемой сапротрофной микробиоты гидротехнического комплекса.
2. Скрининг частоты спонтанных мутантов, активности биопленкообразования и чувствительности компонентов бактериального сообщества к оксидирующим и неоксидирующим биоцидам.
3. Определение характера взаимосвязи активности биопленкообразования, интенсивности мутагенеза и чувствительности к биоцидам.
4. Исследование последовательностей генов mutS и mutL в клетках субпопуляций с разным уровнем мутагенеза.
Научная новизна Впервые изучены уровень мутагенеза и активность биопленкообразования в популяциях микробиоценоза системы плавательных бассейнов. Доказаны стабильность сообщества культивируемых сапротрофных микроорганизмов и изогенное происхождение штаммов в пределах каждого исследованного вида.
Экспериментально показана универсальность гетерогенности уровней мутагенеза и высокое содержание слабых и умеренных мутаторов в изогенных природных популяциях Bacillus sp., Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp. и P. aeruginosa.
Обнаружена устойчивая дискретная гетерогенность бактерий с обособлением субпопуляций, отличающихся комплексом рассматриваемых признаков: частота мутантов, активность биопленкообразования, скорость роста, подвижность. Впервые показано, что субпопуляция умеренных мутаторов P. aeruginosa характеризуется аномалиями амплификации фрагментов генов ММР. Эти аномалии не стабильны в ряду поколений и исчезают вместе с мутаторным фенотипом. Умеренное повышение частоты мутантов обуславливается изменениями структуры генов mutS и mutL. Таким образом, выявлен механизм гипермутагенеза, занимающий промежуточное положение между наследственным и временным, который реализуется за счет обратимых изменений нуклеотидных последовательностей генов ММР.
Теоретическая и практическая значимость работы Полученные данные расширяют представления об участии мутаторного фенотипа в развитии и адаптации популяций бактерий к условиям окружающей среды;
отражают роль в этом процессе таких селективных факторов, как экспозиция с биоцидами и окислительный стресс.
Cобрана коллекция природных штаммов, выделенных в пределах одного биотопа и характеризующихся вариациями уровней мутагенеза. Исследования позволили разработать программу сбора данных параметров функционирования гидротехнического комплекса, которая помогает понять вероятность и последствия образования биопленки в оборудовании для водоподготовки. На основании этой информации определяется стратегия мониторинга микробиологической коррозии, устранения специфических факторов, стимулирующих биопленкообразование и его распространение в водооборотных системах. Оценка, как микробиологической коррозии, так и интенсивности образования биопленки, определяет выбор схемы применения и дозировки биоцидов, позволяет повысить эффективность их действия в условиях постоянного контроля количественных и качественных параметров биоценоза.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Условно-патогенные бактерии (биопленкообразующие грамположительные спорообразующие и грамотрицательные аэробные неферментирующие) доминируют в ряду культивируемых сапротрофных микроорганизмов исследуемого гидротехнического комплекса.
2. Пролонгированное и эпизодическое воздействие биоцидов, характерное для исследуемого биотопа, повышает общий резерв мутационной изменчивости в популяциях резидентных видов.
3. Гетерогенность популяций P. aeruginosa, Stenotrophomonas sp., Acinetobacter sp. и Bacillus sp. носит дискретный характер. В одном биотопе одновременно сосуществуют субпопуляции и варианты, отличающиеся сочетанием таких признаков, как частота мутаций и активность биопленкообразования.
4. Вариации уровней мутагенеза в изолятах P. aeruginosa вызваны временными хромосомными перестройками mutS и mutL.
Апробация работы и публикация Материалы диссертации были представлены на IV Молодежной школе конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (г. Москва, 2008), и на Четвертой международной Конференции по биопленкам (г. Винчестер, Великобритания, 2010). Всего по теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе статья в журнале «Экологическая генетика».
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 таблицами, 23 рисунками. Состоит из введения, 3 глав, заключения и выводов. Список использованных источников включает наименований, из них 278 работ иностранных авторов.
Связь с научными программами Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение процессов спонтанного и индуцированного мутагенеза в условиях экспериментальной и реальной химической нагрузки» (номер государственной регистрации 01.9.00017990). Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, проект № 07-04-96000-р_урал_а (2007–2009).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Отбор проб и изолятов бактерий производили с твердых поверхностей водно инженерного сооружения, включающего три плавательных бассейна и их системы очистки, каждые 3 месяца в течение периода с февраля 2007 по июль 2009 гг.
Изоляты выделяли из морфологически различающихся колоний. Физико-химические условия в бассейнах: температура воды 28С;
pH 7.2;
жесткость – 3 – 6.5 мг-экв/л.
Режимы бактерицидной обработки: континуальная – 0.3 мг/л NaClO;
дискретная – 5. мг/л гидроксипропилендиметиламмония хлорида два раза в месяц и 0.8 мг/л NaClO раз в два месяца.
Инкубационные среды, культивирование бактерий, построение кривых роста периодической культуры осуществляли стандартными методами [Герхардт и др., 1984]. Удельную скорость роста (УСР) вычисляли по изменению оптической плотности при 600 нм в единицу времени в логарифмическую стадию периодического роста [Shehata et al., 1971].
Идентификацию бактерий осуществляли по определителю Берджи [Хоулт и др., 1997] на основе результатов биохимических тестов [Герхардт и др., 1984]. В качестве контрольных использовали штаммы P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli K12s (E. coli Genetic Stock Center, США) и Staphylococcus epidermidis 33 (ГНИИСК им.
Тарасевича, Россия).
Частоту мутантов (ЧМ) определяли на агаризованной среде LB с рифампицином (300 мкг/мл) методом, описанным ранее [Mena et al., 2008].
Активность образования биопленки (АБО) определяли колориметрическим методом с использованием красителя кристаллического фиолетового [Merritt et al., 2005].
Чувствительность к антибиотикам и биоцидам определяли методом серийных двукратных разведений в 96-луночном иммунологическом планшете [Watts, 2008]. Титры антибиотиков и биоцидов готовили, используя начальные растворы: 5 мг/мл ципрофлоксацина, 15 мг/мл рифампицина, 25 мг/мл стрептомицина;
гидроксипропилен-диметиламмония хлорид (Desalgine® Jet, далее ДА) – 22.5%, полигексаметиленгуанидин гидрохлорид («Биопаг Д», далее БП) – 20%, гипохлорит натрия – 3%.
Полуколичественное определение интенсивности продукции рамнолипидов осуществляли, используя агар с метиленовым голубым и цетримидом [Pinzon et al., 2009;
Siegmund et al., 1991].
Подвижность «роения» (swarming motility) определяли в 0.5% агаризованной минеральной среде следующего состава: 5.5 г Na2HPO4, 3.0 г KH2PO4, 0.5 г NaCl, 5 г агара, 2 г глюкозы, 0.5 г гистидина в 1 л дистиллированной воды с 2 мМ MgSO4, 1 мМ тиамина, 0.1 мМ CaCl2 [Caiazza et al., 2005].
Чувствительность к пероксиду водорода определяли по Bjarnsholt (2005).
Выживаемость определяли как отношение концентрации КОЕ/мл клеток после окислительного стресса к концентрации КОЕ/мл в контрольных образцах.
Выделение хромосомной ДНК бактерий осуществляли согласно протоколу [Romero et al., 1999].
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на термальном циклере MyCyclerTM с использованием стандартных условий, рекомендованных производителями Taq-полимеразы, и температуры отжига Ta, характерной для конкретной пары праймеров. Для амплификации и секвенирования гена 16s рРНК использовали универсальные праймеры 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) и 1492R (ACCTTGTTACGACTT) [Carter et al., 2010]. Амплификацию и секвенирование генов mutL и mutS представителей различных субпопуляций и вариантов P. aeruginosa проводили с помощью ранее опубликованных [Ciofu et al., 2010], а также специально подобранных праймеров (табл. 1).
Таблица 1.
Подбор праймеров для амплификации фрагментов гена mutL № Длина ПЦР- Ta Праймеры Нуклеотидная последовательность (5’–3’) п/п продукта Opt 250F-ATYCGYRABCTKGARGAR 1 mutL-1 744 п.о. 58. 993R-RCGGTGCARVGTGCCRTA 969F-YTTYCTBTAYGGCACBYA 2 mutL-2 716 п.о. 56. 1684R-TGCCRTAYTCSAKVARRTC -23F-TGGCGGCCCAGTGATGAGYGA 3 PAmutL-1 1005 п.о. 63. 992R-CGATGCARGGTGCCATAGAGG 951F-GGCGTTGGACCTCGACCTAT 4 PAmutL-2 1064 п.о. 61. 2015R-GAGRAAGATGGCGGGAGGC 254F-ARTCRGTGGYGATCTGYG 5 mutS-1 1032 п.о. 58. 1285R-CRTARCCGGYYTTSAKYA 1270F-MTSAARRCCGGYTAYGAC 6 mutS-2 1006 п.о. 57. 2258R-GRTGCARGAANACRATGC -71F-GCTGAAAGCRGCCCGCACAG 7 PAmutS-1 1339 п.о. 60. 1409R-GGCGAGTTCGCGATAGGTG 970F-AYGAYCGYCTCGATGACA 8 PAmutS-2 1106 п.о. 60. 2075R-TTGCCGCATGTGGTGGAT 1970F-GCTGGAGACRCCGTTGGTG 2588R 9 PAmutS-3 819 п.о. 59. GCAGCTTGTGCGGTRGGTCC Электрофорез ДНК фрагментов ДНК ПЦР-смесей проводили в 1% агарозе (Sigma) в трис-ацетатном (ТАЕ) буфере [Dekimpe et al., 2009;
McKnight et al., 2000].
Маркеры молекулярных масс – фрагменты ДНК 100–3000 п.о.
Очистку ампликонов заданной длины осуществляли с помощью легкоплавкой агарозы (Sigma) [Wolfgang et al., 2010].
Секвенирование ДНК осуществляли на секвенаторе MegaBACE™ 1000 с использованием DYEnamic™ ET Dye Terminator Kit cогласно рекомендациям производителя.
Дизайн вырожденных праймеров выполнен с помощью программы GeneFisher – Interactive PCR Primer Design (Bielifeld University) используя нуклеотидные последовательности генов 16S ДНК, mutL и mutS в базе данных NCBI.
Выравнивание последовательностей ДНК осуществляли при помощи алгоритма BLAST (nucleotide BLAST). Для построения филогенетических дендрограмм применяли метод Fast Minimum Evolution [Desper et al., 2002].
Статистическую обработку полученных данных производили стандартными методами [Лакин, 1973]. Достоверность отличий параметров групп определяли с применением непараметрического U критерия Манна-Уитни. В случае p0. отличия параметров двух независимых групп считали достоверными. Корреляцию уровней АБО и ЧМ вычисляли с помощью непараметрического коэффициента ранговой корреляции Спирмена.
Все эксперименты проводили в трех повторностях для каждого изолята.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Видовой состав сапротрофной флоры плавательного бассейна. Изоляция и комплексная идентификация микроорганизмов на основе биохимической характеристики и последовательности 16s рРНК позволила установить следующий видовой состав резидентной микрофлоры: P. aeruginosa, Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp., Delftia sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Bacillus sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp. Транзитная, эпизодически встречающаяся, микрофлора представлена Klebsiella sp. и Enterobacter sp. Перечень содержит несколько условно-патогенных видов. Постоянная экспозиция резидентных бактерий с биоцидами, может создавать риск «искусственной эволюции возбудителей инфекционных заболеваний» [Бухарин и др., 2005].
Виды представлены несколькими стабильными в ряду поколений фенотипами, каждому из которых соответствует определенная морфология колоний, профили биохимических свойств и чувствительности к биоцидам. Выявленные два варианта Stenotrophomonas sp. отличаются скоростью роста в жидкой и величиной колоний на агаризованной средах. Идентифицированы два нетипичных морфотипа P. aeruginosa:
«морщинистый», далее WСV [Cornelis, 2008;
Kirisits et al., 2005], и вариант с гладкими малыми колониями, далее SCV. Вид Pseudomonas sp. представлен исключительно «морщинистым» вариантом, представителей с колониями дикого типа в системе не выявлено.
Структуры популяций бактерий по признаку частоты спонтанных мутантов. Для исследования структуры популяции выбирали виды, отвечающие следующим условиям: 1) сравнимые скорости роста;
2) широкая распространенность в биотопе;
3) условная патогенность;
4) отсутствие устойчивости к рифампицину. В ряду таких видов идентифицированы P. aeruginosa, Bacillus sp., Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp. Скрининг ЧМ изолятов производили с целью установить моду распределения и процент штаммов с мутаторным фенотипом, к которым относили изоляты, ЧМ которых в 10 и более раз превышала ЧМ контрольных штаммов:
P. aeruginosa ATCC 27853, (2.8 ± 0.9) 10-8, и S. epidermidis 33, (4 ± 1.2) 10- Сравнение полученных распределений ЧМ (рис. 1 А, Б) с данными публикаций результатов скрининга изолятов P. aeruginosa (Kenna et al., 2007), E. coli (Baquero et al., 2004), S. maltophila [Turrientes et al., 2010] и Bacillus simplex (Sikorski et al., 2005) показывает заметное смещение модальных частот в сторону больших значений ЧМ.
Моды ЧМ исследуемых видов в 2–4 раза превышают моды распределений описанных в литературе популяций P. aeruginosa, E. coli, S. maltophila, B. simplex.
Смещение пика частот максимально в группе изолятов P. aeruginosa, мода частоты мутантов которых приблизительно в 10 раз превышает значение (0.8–2.0) 10-8, полученное в работе Kenna с соавт. (2007). Подобное явление описано для штаммов, выделенных из легких больных муковисцидозом (Oliver, 2002). Содержание вариантов со слабым и умеренным мутаторным фенотипом в популяциях Acinetobacter sp. и Stenotrophimonas sp. составляет соответственно 11.5% и 10%, тогда как в группах изолятов P. aeruginosa и Bacillus sp. – 14% и 17% (рис 1 А, Б).
Полученные значения превышают показатели, выявленные для природных и клинических штаммов P. aeruginosa (5%) (Kenna et al., 2007), клинических изолятов E. coli (4%) (Baquero et al., 2004) и природных штаммов B. simplex (3–11%) (Sikorski et al., 2005).
A Частота встречаемости 0, 0, параметра 0, 0,5- 1- 2- 4- 8- 16- 32- 64- 128- 256- 512- Интервал частот мутагенеза, Б 0, Частота встречаемости 0, параметра 0, 0, 8- 64- 512- 128- 256- 0,5- 1- 2- 4- 16- 32- Интервал частот мутагенеза, Рис. 1. Распределение частот мутантов в популяциях исследуемых видов.
А – P. aeruginosa () и Stenotrophomonas sp. ();
Б – Acinetobacter sp. () и Bacillus sp. ().
С помощью скрининга 125 изолятов P. aeruginosa выявлен один изолят бактерий с гипермутаторным фенотипом. ЧМ штамма составляет 2.4 10-6 и превышает контрольный уровень в 80 раз. Встречаемость гипермутаторного фенотипа в исследованной популяции соответствует таковой среди клинических штаммов E. coli и Salmonella (Baquero et al., 2004), тогда как в популяциях P. aeruginosa, вызывающих хронические инфекции дыхательных путей, составляет от 5% (на ранних стадиях развития инфекции) до 50% (через 15–20 лет развития) (Kenna et al., 2007).
Зависимость распределения активностей биопленкообразования и частот мутантов. Выявлено взаимозависимое распределение параметров ЧМ и АБО (рис. 2).
Простую положительную корреляцию параметров наблюдали в случае Acinetobacter sp. (рис. 2 А) и Stenotrophomonas sp. (рис. 2 Б). Дробление популяции на подгруппы с выраженными различиями признаков наблюдали в группах изолятов Bacillus sp. (рис.
2 В) и P. aeruginosa (рис. 2 Г). Коэффициент корреляции АБО и ЧМ составляет 0. (p=0.004) в группе изолятов Acinetobacter sp. и 0.62 (p=0.004) – в группе изолятов Stenotrophomonas sp.. В случае Stenotrophomonas sp. выявили одновременно корреляцию параметров ЧМ и АБО и дифференциацию популяции на две субпопуляции (рис. 2 Б). На рисунке 2 субпопуляции бактерий с различающимися наборами фенотипических свойств обозначены номерами от 1 до 4. Дифференциация на субпопуляции в пределах Stenotrophomonas sp., P. aeruginosa, Bacillus sp. является статистически значимой. Представители описанных субпопуляций обнаружены в образцах различных дат забора проб, то есть выявленная дискретная гетерогенность популяций стабильна во времени.
Анализ публикаций показывает, что ранее оценки взаимосвязи параметров АБО и интенсивности мутагенеза не производили, тогда как неоднократно осуществлялись попытки найти зависимость чувствительности к антибиотикам от активности биопленкообразования либо частоты мутаций. Корреляция устойчивости к антибактериальным агентам с биопленкообразованием показана для P. aeruginosa [Oliveira et al., 2010], представителей рода Enterococcus [Saitou et al., 2009];
взаимозависимость частоты мутантов с МИК антибиотиков выявлена для P.
aeruginosa [Schaaff et al., 2002] и Staphylococcus aureus [Mandsberg et al., 2009].
Описанные закономерности предполагают наличие лучшего адаптивного потенциала в группах наиболее сильных биопленкообразователей либо гипермутабельных микроорганизмов.
А Б 1 1, Активность образования Активность образования :2:
0, биопленки 0, биопленки 0, 0, :1:
0, 0, 0, 0, 0 1,0E-09 1,0E-08 1,0E-07 1,0E-06 1,0E-09 1,0E-08 1,0E-07 1,0E- Частота мутаций Частота мутаций В Г 1 1, Активность образования :3: :1: :3:
Активность образования 0, :2:
биопленки 0, биопленки 0,6 :4: 0, :4:
0, 0, :2:
:1: 0, 0, 0 1,0E- 1,0E- 1,0E- 1,0E- 1,0E 09 08 07 06 1,0E-09 1,0E-07 1,0E- Частота мутаций Частота мутаций Рис. 2. Зависимость распределения интенсивностей мутагенеза и биопленкообразования в популяциях.
А – Acinetobacter sp.;
Б – Stenotrophomonas sp.;
В – Bacillus sp.;
Г – P. aeruginosa.
Указаны средние значения и стандартные отклонения.
P. aeruginosa взяли для анализа способов формирования наблюдаемой неоднородности фенотипов. Этот вид наиболее изучен в контексте биопленкообразования и мутагенеза [Cornelis, 2008]. Вероятными претендентами на роль факторов, определяющих развитие выявленных фенотипов, являются системы чувства кворума. Ранее зарегистрирована корреляция встречаемости в клетках мутаторных мутаций и мутаций в генах lasR и rhlR, кодирующих регуляторные белки систем межклеточного сообщения P. aeruginosa [Bjarnsholt et al., 2010]. Явление объясняют последовательным развитием конститутивного мутаторного фенотипа на базе повышения чувствительности к АФК, вызванного нарушением систем чувства кворума.
Для проверки предположения о взаимосвязи чувства кворума и мутаторного фенотипа измерили интенсивность продукции рамнолипидов, чувствительность к пероксиду водорода и подвижность «роения», которые регулируются системами las и rhl. Однако дифференциация исследуемой популяции не показала явной взаимосвязи с системами чувства кворума, т.е. гетерогенность уровней ЧМ и ее взаимосвязь с изменениями активности биопленкообразования обусловлены иными причинами и не связаны с чувством кворума.
Исследование генов репарации неправильно спаренных оснований (ММР) mutS и mutL. Поскольку повреждения генов ММР являются наиболее подробно описанными и часто встречающимися причинами мутаторного фенотипа [Friedberg et al., 1995;
LeClerc et al., 1996], для выявления причин вариаций частоты мутагенеза в популяции P. aeruginosa проводили исследование последовательностей ДНК генов mutS и mutL представителей различных субпопуляций и вариантов. Подобрали праймеры, позволяющие амплифицировать фрагменты генов mutS и mutL длиной (0.8–1.5) 103 п.о (табл. 1). Провели амплификацию фрагментов генов mutS и mutL, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК музейного штамма, а также изолятов каждой из четырех субпопуляций P. aeruginosa и двух морфотипических вариантов (P. aeruginosa WCV и P. aeruginosa SCV). Данные электрофореза реакций ПЦР на основе хромосомной ДНК различных субпопуляций и вариантов P. aeruginosa приведены в таблицах 2 и 3.
Штамм P. aeruginosa ATCC 27853, представители субпопуляций 1PA, 2PA и морфотипический вариант P. aeruginosa WCV выявили значительное сходство картин электрофоретической подвижности амплифицированных фрагментов ДНК, тогда как результаты ПЦР фрагментов mutS и mutL представителей субпопуляций 2PA, 3PA и морфотипического варианта P. aeruginosa SCV показали выраженные отличия, включающие как полное отсутствие синтеза, так и амплификацию одного или нескольких фрагментов аномальной длины.
Таблица 2.
Результаты амплификации фрагментов гена mutS с праймерами, специфичными для вида P. aeruginosa* Набор ATCC 1PA** 2PA 3PA 4PA WCV SCV праймеров PAmutS- PAmutS- PAmutS- Примечания. * – справа от дорожки с опытным образцом показана дорожка с маркерами молекулярных весов ДНК;
цифры соответствуют длинам маркеров молекулярных весов в тысячах пар нуклеотидных оснований;
стрелками обозначено местоположение целевого фрагмента;
** – номер/обозначение субпопуляции/варианта P. aeruginosa.
Таблица 3.
Результаты амплификации фрагментов гена mutL с праймерами, специфичными для вида P. aeruginosa * Набор ATCC 1PA** 2PA 3PA 4PA WCV SCV праймеров PAmutL- PAmutL-1. PAmutL- Примечания. * – справа от дорожки с опытным образцом показана дорожка с маркерами молекулярных весов ДНК;
цифры соответствуют длинам маркеров молекулярных весов в тысячах пар нуклеотидных оснований;
стрелками обозначено местоположение целевого фрагмента;
** – номер/обозначение субпопуляции/варианта P. aeruginosa.
Выявленные различия характера амплификации генов ММР подтверждаются результатами ПЦР с праймерами, опубликованными Ciofu с соавт. [Ciofu et al., 2010], а также с вырожденными праймерами mutS-1 и mutS-2, специфичными для рода Pseudomonas. Реакции с использованием ранее опубликованных праймеров, специфичных для mutS и mutL P. aeruginosa, приводили к синтезу ДНК только в случае амплификации фрагментов, находящихся внутри рамок считывания (табл. 4).
Фрагменты, включающие рамки считывания mutS и mutL, не амплифицировались вне зависимости от вариаций протоколов ПЦР. При этом комплексы фрагментов, полученных в результате ПЦР на основе хромосомной ДНК контрольного штамма P. aeruginosa ATCC 27853 и представителей различных субпопуляций, значительно отличаются друг от друга. Амплификация с праймерами, специфичными для mutS представителей рода Pseudomonas, подтвердила наличие изменений в соответствующей последовательности ДНК представителей субпопуляции 4PA и варианта SCV (рис. 3). Тогда как ПЦР с праймерами, специфичными для mutL представителей рода Pseudomonas, не дала продуктов, различимых при визуализации агарозных гелей.
Продукты ПЦР-реакций на основе хромосомной ДНК штаммов PA118 и PA и праймеров mutSF6-mutSR6, mutLF2-mutLR2, PAmutS-1, PAmutS-3, mutS секвенировали с праймерами mutSF4 (1611–1632 н.о.), mutSR11 (1331–1310 н.о.) и mutLF3 (797–815 н.о.) [Ciofu et al., 2010] с целью установить факт амплификации целевых фрагментов. Данные секвенирования подтвердили наличие в реакционных смесях фрагментов искомых последовательностей ДНК. Следовательно, наблюдаемые различия результатов ПЦР действительно отражают изменения в структуре либо состоянии генов ММР.
Результаты амплификации и выявленные частоты мутантов позволяют предположить, что различие характера амплификации обусловлено хромосомными перестройками в пределах генов mutS и mutL, при этом функция генов ММР практически не повреждена. Возможное объяснение наблюдаемым процессам дает модель адаптивного мутагенеза «амплификация – мутагенез» [Hendrickson et al., 2002;
Roth et al., 2006]. Процесс адаптивного мутагенеза за счет амплификации заключается в инициации в стрессовых условиях многократной дупликации отдельных участков Таблица 4.
Результаты амплификации фрагментов гена mutL с праймерами, специфичными для вида P. aeruginosa * Набор ATCC 1PA 4’PA 4PA WCV SCV праймеров –3 –3 –3 –3 –3 – mutSF6- –1.5 –1.5 –1.5 –1.5 –1.5 –1. mutSR6 –1 –1 –1 –1 –1 – –0.5 –0.5 –0.5 –0.5 –0.5 –0. –3 –3 –3 – –3 – –1.5 –1.5 –1.5 –1. mutLF2 –1.5 –1. –1 – –1 – mutLR2 –1 – –0.5 –0. –0.5 –0. –0.5 –0. :А: :Б: – –3* –2 – –1 – 1 2 34 5 –0.5 –0. 1 23 4 5 Рис. 3. Результаты амплификации фрагментов генов ММР с праймерами, специфичными для рода Pseudomonas.
А – mutS-1;
Б – mutS-2;
1 – P. aeruginosa ATCC 27853;
2 – ДНК представителя субпопуляции 1PA P. aeruginosa;
3 –субпопуляции 2PA;
4 –субпопуляции 4PA;
5 – P. aeruginosa WCV;
6 – P. aeruginosa SCV;
7 – маркеры молекулярных весов;
* – показаны размеры маркерных фрагментов в тысячах пар нуклеотидных оснований.
хромосомы с возникновением ряда копий находящегося под действием селекции гена. Каждая из этих копий может подвергаться процессу мутагенеза. При этом в геноме остаются копии гена дикого типа, то есть организму обеспечивается генетическая стабильность, гарантирующая выживание клетки даже в условиях приобретения негативных мутаций [Levassur et al., 2011]. В случае приобретения адаптивной аллели и преодоления стресса, менее удачные копии гена элиминируются [Reams et al., 2010].
С точки зрения механизма мутагенеза амплифицированных фрагментов ДНК возможно объяснить сохранение активности ММР изолятов субпопуляций 3PA и 4PA и, в то же время, снижение её эффективности за счёт появления мутантных копий гена, продукты экспрессии которых могут конкурировать за субстрат с корректными копиями белков MutL и MutS. Однако модель «амплификация – мутагенез» генов ММР не дает объяснений вариациям таких признаков, как морфология колоний, биопленкообразование и чувствительность к действию пероксида водорода.
Исследование филогенетических связей в популяции P. aeruginosa.
Определяли последовательности фрагмента 16s рРНК представителей исследуемой популяции P. aeruginosa. По данным выравнивания, наиболее генетически близким для всех исследованных изолятов (99.3–99.8% гомологии ДНК) оказался штамм P. aeruginosa M6 (GenBank: JF682387). Высокий процент гомологии свидетельствует в пользу изогенного происхождения всех выделенных в исследуемой системе изолятов P. aeruginosa. В то же время, наличие различий последовательностей секвенированного фрагмента 16s рРНК позволяет проследить филогенетические связи внутри рассматриваемой популяции.
С помощью выравнивания и попарного сравнения последовательностей секвенированных фрагментов 16s рРНК построили FME-дендрограмму, взяв в качестве основы для сравнения последовательность ДНК P. aeruginosa M6 (рис. 4).
Результаты анализа показывают, что исследуемая популяция P. aeruginosa распадается на две основных ветви, одной из которых принадлежат субпопуляции 1PA, 2PA, 3PA и вариант P. aeruginosa WCV, тогда как другой – субпопуляции 4PA и 4’PA и вариант P. aeruginosa SCV. Особенности расположения P. aeruginosa WCV на филогенетическом древе свидетельствует о его максимальной близости к предковому для всех субпопуляций и вариантов геному. Вероятно, ДНК вариантов P. aeruginosa WCV в значительно меньшей степени (по сравнению с наследственным материалом субпопуляций 1PA–4PA и 4’PA) подвержена изменениям. Причиной этого может быть как высокая продолжительность клеточного цикла, так и лучшая защищенность генетического материала от потенциально мутагенных повреждений. Тот факт, что штамм представитель субпопуляции P. aeruginosa 4PA (изолят PA252) филогенетически наиболее удалён от представителей P. aeruginosa субпопуляций P. aeruginosa 1PA и 2PA, обладающих фенотипом дикого типа, позволяет предполагать, что причиной дивергенции последовательности 16s рРНК явилось длительное пребывание бактерий в состоянии гипермутагенеза.
4PA субп.
SCV 4’PA субп.
P. aeruginosa strain M WСV 1PA субп.
3PA субп.
2PA субп.
Рис. 4. Филогенетическая FME-дендрограмма последовательностей гена 16S рРНК компонентов популяции P. aeruginosa.
Исходной для сравнения взята последовательность 16s рРНК штамма P. aeruginosa M6 (GenBank:
AF094719.1).
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что сообщество культивируемых сапротрофных микроорганизмов исследованного гидротехнического комплекса постоянно во времени, состоит из популяций P. aeruginosa, Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp., Delftia sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Bacillus sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp.
2. Показано, что моды частот мутантов, характерных для изолятов таких резидентных видов, как, P. aeruginosa, Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp., Bacillus sp., в 2–10 раз превышают интенсивность мутагенеза в штаммах с фенотипом дикого типа P. aeruginosa 27853, S. epidermidis 33.
3. Выявлено, что в группах изолятов резидентных видов Acinetobacter sp. уровни активности биопленкообразования и частоты мутантов имеют положительную корреляционную зависимость. P. aeruginosa, Stenotrophomonas sp. и Bacillus sp.
обладают дискретной герогенностью интенсивности мутагенеза и активности биопленкообразования. Субпопуляции P. aeruginosa отличаются по скорости роста и степени развития признаков, зависимых от активности систем чувства кворума.
4. Показано наличие в исследуемой популяции P. aeruginosa трех вариантов, резко отличающихся друг от друга комплексом фенотипических признаков, таких, как морфология колоний, активность образования биопленки, чувствительность к антибиотикам и биоцидам, удельная скорость роста в богатой питательной среде.
5. Выявлено, что мутаторный фенотип представителей субпопуляции 4PA P. aeruginosa в лабораторных условиях является временным в ряду поколений.
Повышение частоты мутагенеза сопряжено с обратимыми нарушениями генов ММР.
6. Показана филогенетическая связь представителей различных субпопуляций и вариантов P. aeruginosa, подтверждающая микроэволюционную роль активации процесса мутагенеза.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Магданова, Л.А. Факторы, влияющие на адаптивный мутагенез Staphylococcus epidermidis / Л.А. Магданова, Н.В. Голясная // Матер. Школы семинара молод. ученых «Биомика – наука XXI века». Уфа. – 2007. – С. 96-97.
2. Магданова, Л.А. Роль механизма адаптивного мутагенеза в формировании генетической пластичности Staphylococcus epidermidis / Л.А.
Магданова, Н.В. Голясная // Межд. Мол. Школа-конфер. «Актуальные аспекты совр. Микробиол.», Москва. – 2007. С. 68-70.
3. Магданова, Л.А. Генетическая лабильность бактерий – биопленкообразующих компонентов биоценоза системы плавательных бассейнов / Л.А. Магданова, Н.В. Голясная // Тезисы IV Молодежной школы конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва. – 2008. – С. 100–101.
4. Магданова, Л. А. Влияние частоты адаптивного мутагенеза природных биопленкообразующих бактерий на развитие устойчивости к биоцидам // Тезисы V Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва. – 2009.
– С. 39–40.
5. Магданова, Л.А. Исследование видового разнообразия, мутационной и биопленкообразующей активностей представителей микробного биоценоза плавательного бассейна / Л.А. Магданова, Н.В.
Голясная // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. Москва. – 2009. – С.119.
6. Магданова, Л.А. Генетическая и морфотипическая гетерогенность бактериальных популяций плавательных бассейнов / Л.А.
Магданова, Н.В. Голясная // Экол. генет. – 2011. – Т. 9. – № 2. – С. 24–33.
7. Magdanova, L.A. Adaptive mutagenesis of Staphylococcus epidermidis // L.A. Magdanova, N.V. Golyasnaya // XX International Congress of Genetics, Berlin, Germany. – 2008. – N. P087/35/D.
8. Golyasnaya, N.V. Bacteriophage mediating species diversity / N.V.
Golyasnaya, L.A. Magdanova // XX International Congress of Genetics, Berlin, Germany. – 2008. – N. A-065-0035-00920.
9. Magdanova, L. Mutability of polyspecies bacterial biofilm community members / L.A. Magdanova, N.V. Golyasnaya // Biofilms IV International conference, Winchester, UK, September 1–3. – 2010. – P. 20.
10. Мagdanova L., Golyasnaya N. Transient changes of natural Pseudomonas aeruginosa mutS and mutL genes structures // The 4th International IMBG Conference for Young Scientists "Molecular Biology: Advances and Perspectives". – 2011. – P. 140.
МАГДАНОВА Лариса Альбертовна ДИСКРЕТНАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОПУЛЯЦИЙ БИОПЛЕНКООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ОБРАТИМЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ МУТАГЕНЕЗА Автореферат