Применение молекулярно-генетических маркеров на устойчивость к прорастанию зерна на корню у тритикале
На правах рукописи
МАЙЕР НИКОЛАЙ КОНСТАНТИНОВИЧ ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПРОРАСТАНИЮ ЗЕРНА НА КОРНЮ У ТРИТИКАЛЕ Специальность: 03.02.07 – генетика, 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2011
Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии и в научно образовательном центре молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К. А. Тимирязева Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор Соловьёв Александр Александрович кандидат биологических наук Дивашук Михаил Георгиевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Хавкин Эмиль Ефимович доктор биологических наук Драгович Александра Юрьевна
Ведущая организация: Краснодарский НИИСХ им. П.П. Лукьяненко Россельхозакадемии
Защита состоится «_21_» декабря 2011 г. в _14_час. _30_мин. на заседании диссертационного совета Д.220.043.10 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49.
Факс: (495)-976- E-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева и на сайте http://www.timacad.ru
Автореферат разослан «21» ноября 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Широкое распространение тритикале в мире обусловлено высоким потенциалом этой культуры, обеспечиваемым стабильной урожайностью, качеством зерна, устойчивостью к ряду болезней и возможностью широкого использования: для питания человека, на корм сельскохозяйственным животным и в качестве сырья для производства биотоплива (биоэтанола и биогаза).
Одним из факторов, сдерживающих более широкое распространение, является склонность к доуборочному прорастанию зерна в колосе. Прорастание зерна на корню является следствием нарушения периода покоя у созревающих семян, что приводит к активации физиологических процессов и началу роста зародыша. Эволюционно период покоя у дикорастущих видов возник как механизм избегания неблагоприятных факторов. Отбор человеком культурных растений на дружное и быстрое прорастание семян привел к большей чувствительности семян к факторам, провоцирующим нарушение периода покоя (Finkelstein et al., 2008). Эта проблема особенно актуальна для районов Нечерноземья, где прохладная и влажная погода во время уборки часто вызывает прорастание на корню. Предуборочное прорастание зерна наносит значительный урон, снижая урожай, ухудшая качество зерна и посевную ценность семенного материала (Mo & Wjtowicz, 2004). Прорастание зерна на корню является комплексной проблемой и детерминируется особенностями генотипа, среды, а также их сложным взаимодействием (Zanetti, 2000).
Важным решением этой проблемы может стать разработка надежных методов отбора селекционного материала, устойчивого к прорастанию зерна на корню. Это осложняется возможностью отбора селекционного материала по результатам полевой оценки только в годы с провокационными условиями.
Кроме того, все известные показатели оценки устойчивости к прорастанию на корню требуют сравнительно большого объема анализируемого материала, что практически невозможно получить в ранних звеньях селекционного процесса.
Разработка и применение молекулярных маркеров являются одним из оптимальных путей увеличения эффективности отбора и оптимизации селекционного процесса. Пшеница является достаточно хорошо генетически изученным объектом, и, будучи одним из родительских компонентов тритикале, может служить основой для поиска эффективных маркеров для использования в селекции тритикале. В то же время присутствие генома ржи влияет на проявление признаков, и как следствие, может сказаться на использовании маркеров, что требует более тщательного подхода к их выбору.
Среди множества маркеров на признак устойчивости к предуборочному прорастанию зерна у пшеницы, входящих в локусы QTLs, контролирующие этот признак, особый интерес представляют маркеры, локализованные в субгеномах А и В, которые обычно присутствуют у гексаплоидной тритикале.
Так, с помощью молекулярного STS-маркера (Yang et al., 2007) на ген Viviparous-1 показана высокая корреляция между аллельным состоянием данного гена и устойчивостью к прорастанию на корню.
Таким образом, применение молекулярно-генетических маркеров на тритикале открывает возможности практического повышения эффективности селекционных программ, и, кроме того, позволяет получить новые фундаментальные знания о частной генетике этой культуры.
Цели и задачи. Цель настоящего исследования заключалась в изучении возможности применения молекулярно-генетических маркеров пшеницы на устойчивость к прорастанию зерна на корню для изучения этого признака у тритикале.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
охарактеризовать образцы тритикале по показателям устойчивости 1.
к прорастанию зерна на корню;
подобрать молекулярные маркеры на устойчивость к прорастанию 2.
зерна на корню;
провести генотипирование образцов тритикале по отобранным 3.
маркерам;
выделить эффективные молекулярные маркеры для использования 4.
в селекции тритикале на устойчивость к предуборочному прорастанию зерна;
выделить перспективные образцы тритикале для селекции на 5.
устойчивость к прорастанию на корню.
Научная новизна результатов исследования Впервые показана взаимосвязь маркера на ген Viviparous-1В и устойчивости к прорастанию зерна на корню у образцов тритикале со светло красной окраской зерна.
Впервые установлено, что у изученных сортообразцов тритикале встречается 4 аллеля гена Vp-1В. С наибольшей частотой встречаются аллели Vp-1Вс и Vp-1Ва, которые встречаются как у озимых, так и яровых форм.
Установлено аналогичное с пшеницей проявление аллелей этого гена: образцы, устойчивые к прорастанию зерна на корню, имеют аллель Vp-1Вс, а неустойчивые – Vp-1Ва. Среди исследованных образцов яровой тритикале выявлены формы, несущие аллели Vp-1Вd и Vp-1Вe.
Впервые установлен полиморфизм тритикале по локусу Xwmc104, который проявляется в наличии 6 аллелей. Наибольшее распространение имеет аллель Xwmc104а, который встречается у 33% сортообразцов.
Впервые для тритикале показан полиморфизм по локусу Xgwm155, проявившийся в наличии 6 и 7 аллелей у озимой и яровой тритикале соответственно. Установлена тесная связь между аллелем Xgwm155с и устойчивостью тритикале к доуборочному прорастанию.
Практическая ценность На основе анализа 167 сортообразца озимой и яровой тритикале различного географического происхождения показана возможность использования молекулярных маркеров Vp-1В3, Xgwm155, Xwmc104 для повышения эффективности селекции тритикале на устойчивость к прорастанию на корню.
Сортообразцы озимой тритикале Е775, №222, Ставропольский 2, устойчивые к прорастанию зерна на корню и несущие аллели Vp-1Вс и Xwmc104b могут быть использованы в качестве исходного материала в селекционных программах на устойчивость к прорастанию на корню с использованием молекулярно-генетических маркеров.
Показана возможность применения молекулярных маркера Xgwm 539, локализованного в хромосоме 2D, Sec2, локализованного в хромосоме 2R, для отбора форм несущих 2R/2D-замещение и его использования при отборе устойчивых к прорастанию зерна на корню форм тритикале.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Молекулярно-генетический маркер на ген Viviparous-1В для контроля устойчивости к прорастанию зерна на корню у тритикале;
2. Полиморфизм и распределение аллелей гена Viviparous-1В у яровой и озимой тритикале;
3. Полиморфизм, частоты аллелей по локусу Xwmc104 и Xgwm155 у тритикале и их связь с устойчивостью к прорастанию зерна на корню;
Обоснование и достоверность научных положений Исследования выполнены на большом экспериментальном материале, по общепринятым методикам, рекомендованным научными учреждениями страны.
Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.
Апробация результатов работы. Основные результаты исследований доложены на Международной научной школе-конференции молодых учёных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2008);
IX Молодёжной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2009);
Международной научно-практической конференции молодых учёных «Молодёжь и инновации – 2009» (Горки, Республика Беларусь, 2009);
V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).
Публикации По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 1 в журнале, рекомендованном ВАК, и 1 патент на селекционное достижение.
Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 118 страницах машинописного текста и включают 18 рисунков, 21 таблица. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 254 наименований, из них 218 иностранных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Растительный материал Экспериментальная работа выполнена в 2007 – 2011 гг. на кафедре генетики и биотехнологии (до 2010 г. – кафедра генетики), в Центре молекулярной биотехнологии РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева и на Полевой опытной и селекционной станции. Исследование проводили на линиях и сортах озимой, 81 сортообразце различного географического происхождения яровой тритикале и 38 сестринских линиях яровой тритикале, полученных от скрещивания сорта Abaco с линией гескаплоидной тритикале 131/7.
Индекс прорастания (GI) рассчитывали по Walker-Simmons (1988):
GI=(7xn1+6xn2+…+1xn7)/7 x N, где n1, n2, …, n7 – число семян проросших на первый, второй, и последующее дни до седьмого дня, соответственно, N – общее число зерен. Индекс определяли в трех повторениях для каждого образца, анализировали по 50 зерен в повторении.
Число падения определяли по стандартной методике на приборе ПЧП- (Hagberg, 1960).
Интенсивность окраски зерна определяли по стандартной методике замачиванием в 5% растворе NaOH.
ДНК выделяли из молодых листьев и корешков по методу Bernatzky и Tanksley (1986) с некоторыми модификациями.
Для поиска маркеров на гены устойчивости к прорастанию зерна тритикале на корню использовали последовательности маркеров пшеницы, выявленные в базе данных NSBI, а также в литературных источниках. В работе использовали STS-маркер на ген Viviparous-1, локализованный в хромосоме 3В (Yang et al., 2007) и SSR-маркеры: Xwmc104, локализованный в хромосомах 6BS и 1AS;
Xgwm155, сцепленный с локусом QPhs.ccsu-3A.1 в хромосоме 3АL;
Xgwm 539, локализованный в хромосоме 2D;
Sec2, локализованный в хромосоме 2R. Все праймеры синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва).
Продукты ПЦР разделяли в 1,5% агарозном геле с буфером ТВЕ при напряженности поля 6 V/см. В качестве маркера размеров использовали «100 bp leader» (Fermentas). После окрашивания бромистым этидием продукты ПЦР визуализировали с помощью трансиллюминатора и документировали цифровой камерой.
Определение размеров амплифицируемых продуктов проводили на секвенаторе ABI-3130XL.
Статистические показатели и достоверность различий рассчитывали по Доспехову (1985), Смиряеву и др. (2007). Для определения тесноты связи двух качественных альтернативных признаков использовали коэффициенты ассоциации Пирсона () и контингенции Юла (Q). Связь считалась подтвержденной, если =0.3 или Q=0.5 (Das & Das, 2008). Для определения тесноты связи признаков использовали коэффициент взаимной сопряженности Пирсона (P).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1.1 Характеристика сортов и линий озимой и яровой тритикале по показателям устойчивости к прорастанию зерна на корню Для оценки устойчивости тритикале к прорастанию на корню используются различные лабораторные методы, поскольку непосредственная полевая оценка затруднена.
Наиболее часто используется оценка числа падения (ЧП). Выбор данной методики обуславливается, прежде всего, высокой степенью корреляцией между устойчивостью к прорастанию на корню и числом падения, и тем, что с помощью ЧП можно дать косвенную оценку хлебопекарным качествам (Zanetti, 2000;
Fofana, 2009). Пороговые значения ЧП при оценке устойчивости к прорастанию зерна на корню варьируют по годам и по селекционным программам (Roozeboom, 1999). Анализ ЧП у образцов озимой тритикале, выполненный на кафедре селекции и семеноводства полевых культур (данные любезно предоставлены доц., к.б.н. В.С. Рубец), позволил все сорта и линии классифицировать на две группы: неустойчивые – 28 образцов, относительно устойчивые и устойчивые – 20 (табл. 1, выделены темной заливкой).
Окраска зерновки является полимерным признаком, и её интенсивность может варьировать в зависимости от количества доминантных аллелей и степени влияния транскрипционных факторов (Nilson-Ehle, 1914;
Himi & Noda, 2005). Все образцы коллекции являлись краснозерными, но отличались по интенсивности окраски. Образцы как яровой, так и озимой тритикале были разделены на две группы: светло-красные и темно-красные. В целом, распределение по интенсивности окраски было одинаковым – у озимой и яровой форм.
Еще одним распространенным показателем устойчивости к прорастанию зерна на корню является индекс прорастания. Этот показатель, как и число падения, является комплексной характеристикой, но в тоже время весьма зависимой от погодных условий, при которых происходит формирование зерна.
Среднее значение индекса прорастания среди образцов яровой тритикале колебалось по годам и составило в 2009 году 0,49, в 2010 – 0,16 а в 2011 – 0,73.
Резкое снижение индекса прорастания в 2010 году обусловлено наблюдавшейся аномальной засухой с начала цветения и вплоть до созревания зерна.
1.2 Исследование возможности применения маркера на ген Viviparous-1В для идентификации форм тритикале, различающихся по устойчивости к прорастанию зерна на корню Группа светло-красных включала 25 образцов озимой тритикале, темно красных – 23 образца тритикале (табл. 1). В данном случае изучаемый нами признак имеет по своей сути два альтернативных варианта, измеряемых по дихотомической шкале наименований, поэтому для статистического анализа взаимосвязи устойчивости к прорастанию на корню и интенсивности окраски, мы использовали дихотомические коэффициенты корреляции: коэффициент контингенции () и коэффициент Юла (коэффициент ассоциации) (Das & Das, 2008). Так как при расчетах коэффициенты не превышали показателей 0,3 и 0, соответственно, то связь между устойчивостью к прорастанию на корню и интенсивностью окраски зерна отсутствует.
Таблица 1.
Показатели устойчивости, окраски зерна и аллельного состояния гена Vp-1B у сортообразцов коллекции озимых тритикале Светло-красные Темно-красные Сортообразец Аллели гена Vp Сортообразец Аллели гена Vp 1 2 3 Союз Тальва Vp-1Bc Vp-1Bа Хонгор Vp-1Bа 214406/96 Vp-1Bc Д-37 ПРАГ-Д 246/ Vp-1Bа Vp-1Bа Мара Гармония Vp-1Bа Vp-1Bа Таблица 1 (продолжение).
1 2 3 Тарасовский 1 Патриот Vp-1Bc Vp-1Bа Стрелец Marho Vp-1Bc + Vp-1Bа Vp-1Bа Авангард Амфидиплоид Vp-1Bа Vp-1Bc ПРАГ Fidelio Vp-1Bа Vp-1Bc Эллада Гренадёр Vp-1Bа Vp-1Bа Гермес Presto Vp-1Bа Vp-1Bа Конвейер Каприз Vp-1Bа Vp-1Bc Кентавр Корнет Vp-1Bа Vp-1Bc Линия TF 30 TL 1 Vp-1Bа Vp-1Bc Модуль Стрельна Vp-1Bc + Vp-1Bа Vp-1Bc Талисман Розовский 8 Vp-1Bа + Vp-1Bc Vp-1Bc Дон АД Vp-1Bc Vp-1Bа Е 775 ТИ Vp-1Bc Vp-1Bc АД 285 АДМ Vp-1Bc Vp-1Bа КS - 88Т Alamo Vp-1Bа Vp-1Bc №222 Vp-1Bc 21759/97 Vp-1Bc Антей Славянка Vp-1Bc Vp-1Bа Водолей Никлап Vp-1Bc Vp-1Bа Кастусь Полесский Vp-1Bа Vp-1Bc + Vp-1Bа Виктор 15 Vp-1Bа Ставропольский 2 Vp-1Bc Примечание: заливкой отмечены устойчивые сорта 1.3 Характеристика образцов тритикале по аллельному состоянию гена Viviparous-1В Анализ коллекции озимой тритикале показал, что 41,7% образцов озимой тритикале несут в своем геноме аллель Vp-1Bc, 50,0% – несут аллель Vp-1Bа и 8,3% – содержат в своем геноме и тот и другой аллель (табл. 1). Аллели Vp-1Bb и Vp-1Bd, у исследуемой коллекции выявлены не были. В исследовании Yang et al. (2008) среди сортов пшеницы распределение имело похожий характер:
44,2% сортов несли аллель Vp-1Bc, 55,8% сортов – аллель Vp-1Bа. Аллелей Vp 1Bb и Vp-1Bd также не было выявлено.
Статистический анализ взаимосвязи между устойчивостью к прорастанию на корню и аллельным состоянием гена Vp-1B проводили только по сортам, не имеющим полиморфизма по аллельному состоянию гена Vp-1B.
Было выявлено, что во всей совокупности образцов существует слабая связь между устойчивостью к прорастанию на корню и аллельным состоянием гена Vp-1B.
Связь аллельного состояния гена Vp-1B с устойчивостью к прорастанию была показана только для белозерных образцов пшеницы. Статистическая оценка значимости связи между устойчивостью к прорастанию на корню и аллельным состоянием гена Vp-1B внутри каждой из групп образцов озимой тритикале со светло-красным и темно-красным зерном, показала, что у образцов с темно-красной окраской зерна статистически значимая связь отсутствовала.
У образцов озимой тритикале со светло-красной окраской зерна коэффициент контингенции () составил 0,37, а коэффициент Юла (коэффициент ассоциации) – 0,67, что говорит о том, что в данном случае существует взаимосвязь между признаками Аналогично с результатами, полученными на европейских сортах пшеницы, у светло-краснозерных образцов озимой тритикале аллель Vp-1Bc также чаще наблюдался, у устойчивых фенотипов, а аллель Vp-1Bа у неустойчивых. Особенностью работы с тритикале является наличие ржаного генома, который оказывает дополнительное влияние на устойчивость к прорастанию, но и, на окраску семенной оболочки. Нами впервые продемонстрированы различия в проявлении аллелей гена Viviparous-1В у образцов тритикале, различающихся по интенсивности красной окраски семени и устойчивости к прорастанию.
У яровых форм тритикале были отмечены 4 аллеля гена Viviparous-1В:
Vp-1Bа, Vp-1Bc, Vp-1Bd, Vp-1Be, с наибольшей частотой встречаемости аллелей Vp-1Bc и Vp-1Bа – 59% и 30% - соответственно (рис. 1). В отличие от озимых форм сортообразцы яровой тритикале несли аллели Vp-1Bd и Vp-1Be. В то же время следует отметить, у образцов яровой тритикале, различающихся по интенсивности красной окраски зерна было равное распределение носителей каждого из аллелей.
Vp-1Bа Vp-1Bc Vp-1Bd Vp-1Be 6;
7% 3;
4% 24;
30% 48;
59% Рисунок 1 – Распределение яровой тритикале по числу и частоте сортообразцов с разными аллелями гена Viviparous-1В.
В целом у яровой тритикале наблюдается такая же тенденция, как и у озимых: у сортообразцов со светло-красной окраской зерновки аллель Vp-1Bа ассоциируется с неустойчивостью, а аллель Vp-1Bс – с устойчивостью к прорастанию зерна на корню (табл. 3). Коэффициенты корреляции Юла между индексом прорастания и аллельным состоянием составили -0,31 и -0, соответственно в 2009 и 2011 годах.
Анализ аллельного состояния гена Vp-1В у набора сестринских линий выявил расщепление как среди форм, отобранных из устойчивых растений, так и неустойчивых. Среди линий – потомков устойчивых растений 35% линий характеризуются наличием аллеля Vp-1Bc, 40% – наличием аллеля Vp-1Bа, 25% являлись гетерозиготами по этому гену. Среди линий – потомков неустойчивых форм лишь 17% характеризуются аллельным состоянием Vp-1Bc, в то время как остальные 83% – аллельным состоянием Vp-1Bа. Подобное распределение аллелей гена Vp-1 может быть вызвано доминантной природой устойчивости к прорастанию на корню, что привело к отбору в F3 как гомозигот Vp-1Bc/Vp-1Bc, так и гетерозигот Vp-1Bc/Vp-1Bа, которые могли обладать сходным фенотипическим проявлением.
На основании полученных данных можно сделать вывод о возможности применения молекулярного маркера на аллели гена Viviparous-1В в МAS селекции тритикале, несмотря на то, что большинство образцов озимой и яровой тритикале являются краснозерными. При этом, его использование может быть рекомендовано на образцах со светло-красной окраской зерновки.
Однако следует отметить, что аллельное состояние гена Viviparous-1В в данном случае, несомненно, не является единственным генетическим фактором, пусть и немаловажным, оказывающим влияние на устойчивость к прорастанию на корню.
1.4 Использование микросателлитных маркеров из локусов устойчивости к прорастанию на корню пшеницы для выявления устойчивых форм тритикале Локус Xwmc104. Анализ коллекции с использованием фрагментного анализа амплифицированных продуктов выявил пять аллелей микросателлитного маркера Xwmc104 – а (144 п.н.), b (138 п.н.), c (163 п.н.), d (148 п.н.), e (150 п.н.).
Кроме приведенных фрагментов практически на всех образцах озимой тритикале также интенсивно амплифицировался фрагмент размером 95 п.н.
Однако фрагментный анализ не выявил характерной для SSR-маркеров «лестничной» структуры, что указывает на не микросателлитную природу фрагмента размером 95 п.н. (рис.2).
В то же время, разработчики данного маркера, а так же ряд исследователей, изучавших в ПААГе ампликон данного размера, интерпретировали его как микросателлит, что, несомненно, могло внести ошибку при интерпретации результатов в случае, например, минорной амплификации истинного микросателлитного локуса или наличия нуль-аллеля (http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes/report.cgi?class=marker&name;=Xwmc104 6B;
Yang et al., 2008).
Рисунок 2. Фрагментный анализ сорта Авангард. Черной стрелкой отмечен ампликон 95 п.н., встречающийся у всех образцов коллекции;
пунктирной – микросателлитный фрагмент размером 148 п.н.
Наиболее распространенным среди сортообразцов озимой тритикале оказался аллель – Xwmc104а – 38% несли этот аллель. У 5 образцов выявлено расщепление по данному микросателлитному локусу и они в дальнейших исследованиях не использовались. У одного сорта – Славянка – обнаружен нуль-аллель по данному локусу (табл. 2).
Таблица 2.
Характеристика сортов тритикале по устойчивости к прорастанию зерна на корню, аллельному состоянию микросателлитных локусов Xwmc104 и Xgwm155 и интенсивности окраски зерна* Неустойчивые Устойчивые Xwmc104 Xgwm155 Xwmc104 Xgwm 1 2 3 4 5 Союз Е a+e b b b Хонгор АД a d d d+f Д-37 a a Alamo a b Мара № a f b e Тарасовский 1 Антей e d e d с+a Водолей Marho e c b Авангард Кастусь d b+e+d d e Виктор Fidelio d b e d Эллада Ставропольский a e b b Линия Presto a b a b Конвейер Стрельна d+с e c c Кентавр Розовский a b a+с c АД TF 30 TL 1 e b a d Модуль ТИ d+e e c c Талисман АДМ d e d f Дон КS - 88Т c c a d Таблица 2 (продолжение).
1 2 3 4 5 Тальва 100 a d 21759/97 c c Славянка 214406/96 c e -** c ПРАГ-Д 246/1 Никлап a e a d Гармония Полесский e a e c Патриот d e Стрелец a b Амфидиплоид 45 c d ПРАГ 488 d e Гренадёр a b Гермес e d Каприз c e Корнет a e *- сорта со светло-красной окраской зерна отмечены светло-серым, с темно-красным – темно-серым ** - нуль-аллель Статистический анализ не выявил связи межу аллельным состоянием данного локуса и прорастанием на корню каких-либо закономерностей ни в генеральной совокупности, ни в группах по окраске зерна. Обращает внимание аллель Xwmc104b (коэффициент корреляции Юла равен 0,3 при 0,05 уровне значимости), который амплифицируется только у трех образцов – Е775, №222, Ставропольский 2, относящихся к устойчивым к прорастанию на корню и имеющим светло-красную окраску зерна. Кроме того у данных сортов выявлен аллель Vp-1Bc, обеспечивающий устойчивость к прорастанию на корню, что может свидетельствовать о наличии минимум двух генетических факторов устойчивости к прорастанию на корню. Таким образом, перспективные образцы Е775, №222, Ставропольский 2 могут быть рекомендованы для использования в исследованиях устойчивости к прорастанию на корню, а также в селекционных программах на данный признак с использованием молекулярных маркеров.
Важным аспектом в работе с локусами количественных признаков является поиск и создание молекулярных маркеров, кодоминантных и тесно сцепленных с ними. При скрещивании краснозерной устойчивой мягкой пшеницы и белозерной неустойчивой показали, что микросателлитный маркер Xwmc104, локализованный в хромосомах 6BS и 1AS, наследуется сцепленно с устойчивостью к прорастанию на корню. В наших исследованиях не установлено какой-либо статистически значимой связи между аллелями маркера Xwmc104 и устойчивостью к прорастанию на корню. Это, по видимому, может быть связано с тем, что в большинстве представленных образцов локусы QTL, обеспечивающие устойчивость, отсутствовали. Среди других факторов, снижающих роль конкретных QTL могут быть эпистатические и средовые эффекты.
Локус Xgwm155. Фрагментный анализ амплифицированных продуктов микросателлитного локуса Xgwm155 среди всех образцов тритикале выявил семь аллелей: Xgwm155a (125 п.н.), Xgwm155b (127 п.н.), Xgwm155c (129 п.н.), Xgwm155d (140 п.н.), Xgwm155e (143 п.н.), Xgwm155g 145 (п.н.), Xgwm155f ( п.н.). Среди образцов озимой тритикале выявлено шесть аллелей – (табл. 2), а у яровых – все семь.
В отличие от локуса Xwmc104, где преобладал один аллель – Xwmc104a, по локусу Xgwm155 три аллеля имели примерно одинаковое распространение среди изученных образцов озимой тритикале – b,d,e, – примерно по 27%. У трех образцов озимой тритикале выявлен полиморфизм по данному микросателлитному локусу, и они в дальнейших анализах не учитывались (табл. 2).
Статистический анализ связи между устойчивостью к прорастанию зерна на корню и аллельным состоянием по локусу Xgwm155 для всей коллекции показал значение коэффициента взаимной сопряженности Пирсона (Р) 0,43, что указывает на среднюю силу связи. Для образцов со светло-красным зерном коэффициент Р составил 0,31;
для образцов с тёмно-красным – 0,62. Таким образом, коэффициент связи для образцов со светло-краснозёрным зерном тритикале снижен по сравнению с общей коллекцией. Для образцов с тёмно краснозёрным зерном показатель наоборот возрос, уверенно демонстрируя среднюю силу связи.
На основании этого можно считать, что существует тесная взаимосвязь между микросателлитным маркером Xgwm155 и устойчивостью к прорастанию зерна на корню у озимой тритикале. Так же следует отметить, что, если при расчетах не учитывать те аллели, по которым количество сортов было меньше трех, а так же те, которые равномерно распределились среди устойчивых и неустойчивых образцов тритикале, то взаимосвязь будет полной.
Подводя итог, следует резюмировать, что микросателлитный локус Xgwm155, сцепленный с QTL устойчивости к прорастанию на корню у мягкой пшеницы, показал тесную взаимосвязь с устойчивостью к прорастанию на корню и среди темно-краснозерных образцов озимой тритикале. При этом наличие аллеля Xgwm155с ассоциировано с QTL, обеспечивающим относительную устойчивость образцов озимой тритикале, в противоположность аллелю Xgwm155е, ассоциированному с отсутствием устойчивости к прорастанию на корню у озимой тритикале.
1.5 Характеристика коллекции яровой тритикале по наличию 2R/2D-замещения и оценка устойчивости к прорастанию зерна на корню замещенных форм Хромосома 2D несет ряд генов важных признаков, среди которых снижение высоты растения и устойчивость к полеганию, которые степени связано с устойчивостью к прорастанию зерна на корню.
Для исследования наличия 2R/2D-замещения применяли систему из двух маркеров: на хромосому 2D- Xgwm 539, и хромосому 2R – Sec2, с помощью которой выявлено 13 сортообразцов яровой тритикале, имеющих 2R/2D замещение (табл. 3).
Таблица 3.
Характеристика образцов яровой тритикале по аллельному состоянию гена Vp-1B, индексу прорастания (ИП), наличию хромосомы 2D (d) и интенсивности окраски зерна (образцы с темно-красным зерном выделены заливкой) Аллель гена ИП, ИП, Аллель гена ИП, ИП, Образец Образец 2D 2D Vp-1B 2009 2010 Vp-1B 2009 1 2 3 4 5 6 7 8 9 С-186 Vp-1Bc 0,117 0,04 Popwg Vp-1Ba 0,493 0, Двуручка к- Vp-1Bc 0,224 0,182 Vp-1Ba 0,199 0, С-202 к- Vp-1Ba 0,264 0,08 Vp-1Ba 0,601 0, С-187 к- Vp-1Be 0,290 0,202 Vp-1Ba 0,260 0,372 d С- Dublett Vp-1Bd 0,293 0,106 Vp-1Ba 0,381 0, С-199 С- Vp-1Bc 0,314 0,046 Vp-1Ba 0,474 0, С- PI587531 Vp-1Ba 0,323 0,232 d Vp-1Ba 0,356 0, С- PI422258 Vp-1Bc 0,337 0,206 d Vp-1Ba 0,449 0, ПРАГ551 Ярило Vp-1Bc 0,341 0,256 Vp-1Ba 0,351 0, к- PI429031 Vp-1Bc 0,350 0,272 d Vp-1Bc 0,649 0,196 d PI428904 Vp-1Bc 0,359 0,084 d PI429157 Vp-1Bc 0,541 0, к-1277 Vp-1Bc 0,384 0,538 PI429151 Vp-1Bc 0,373 0, Лана к- Vp-1Bc 0,390 0,3 Vp-1Bc 0,703 0, ПРАГ511 к- Vp-1Bc 0,393 0,18 Vp-1Bc 0,140 0,138 d PI429082 Vp-1Bc 0,451 0,356 PI587388 Vp-1Bc 0,456 0,334 d С-201 Vp-1Bc 0,477 0,086 PI587512 Vp-1Bc 0,397 0, PI429154 Vp-1Bc 0,480 0,294 PI429159 Vp-1Bc 0,439 0, 131/7 Vp-1Bc 0,517 0,318 PI429160 Vp-1Bc 0,700 0, к-1152 Vp-1Ba 0,524 0,448 PI429162 Vp-1Bc 0,503 0, к-1185 Vp-1Bc 0,530 0,376 d PI519877 Vp-1Bc 0,453 0,266 d к-1200 Vp-1Bc 0,534 0,192 PI587265 Vp-1Bc 0,400 0,232 d PI422260 Vp-1Bc 0,536 0,32 Presto//Tesmo Vp-1Bc 0,590 0, Aktivo Vp-1Bc 0,543 0,322 Rosner612 Vp-1Bc 0,457 0, Лена 86 к- Vp-1Bc 0,544 0,278 Vp-1Bc 0,224 0,24 d к-1719 к- Vp-1Ba 0,550 0,328 Vp-1Bc 0,769 0, к- Abaco Vp-1Ba 0,566 0,156 Vp-1Bc 0,701 0, к- PI429158 Vp-1Bc 0,570 0,34 Vp-1Bc 0,726 0,636 d ПРАГ518 Лена Vp-1Ba 0,589 0,22 Vp-1Bc 0,824 0, Таблица 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ПРАГ553/ Legalo Vp-1Ba 0,613 0,112 Vp-1Bc 0,727 0, ПРАГ550 С- Vp-1Bc 0,613 0,514 Vp-1Bc 0,084 0, С- PI587279 Vp-1Ba 0,619 0,27 Vp-1Bc 0,113 0, С- Sandro Vp-1Ba 0,667 0,396 Vp-1Bc 0,184 0, Укро S17 Vp-1Ba 0,676 0,348 Vp-1Bc 0,517 0, ПРАГ PI624274 Vp-1Bd 0,680 0,85 d* Vp-1Bd 0,447 0, ПРАГ Gabo Vp-1Ba 0,681 0,39 Vp-1Bd 0,783 0, к-1716 Vp-1Bc 0,686 0,06 Grego Vp-1Bd 0,560 0, ПРАГ554/1 С- Vp-1Ba 0,690 0,188 Vp-1Be 0,153 0,022 d* к-1715 С- Vp-1Ba 0,704 0,46 Vp-1Be 0,419 0, ПРАГ418 Vp-1Bc 0,717 0, Дагво Vp-1Bd 0,723 0, к-1242 Vp-1Ba 0,759 0, PI624276 Vp-1Ba 0,764 0,336 d* Арта 59 Vp-1Bc 0,869 0, Анализ взаимосвязи наличия замещения и устойчивости к прорастанию зерна на корню показал наличие значимой связи между этими признаками (коэффициент корреляции Юла равен 0,31 на 1% уровне значимости).
ВЫВОДЫ:
1. Яровые и озимые формы тритикале характеризуются полиморфизмом по гену Viviparous-1В. Установлено, что у 41,7% образцов озимой тритикале встречается аллель Vp-1Bc, 50,0% – несут аллель Vp-1Bа и 8,3% – содержат оба аллеля. У яровых форм тритикале отмечены четыре аллеля гена Viviparous-1В: Vp-1Bа – 30%, Vp-1Bc – 59%, Vp-1Bd – 7%, Vp-1Be – 4%.
2. Установлена возможность использования молекулярного STS-маркера Vp-1B на аллели гена Viviparous-1В в МAS-селекции тритикале на образцах со светло-красной окраской зерна.
3. Аллель Vp-1Bс является рецессивным по отношению к Vp-1Bа, что подтверждается результатами отбора в F3-поколении форм тритикале, различающихся по устойчивости к прорастанию зерна на корню. Среди линий – потомков неустойчивых форм F6-поколении 83% являются гомозиготами по аллелю Vp-1Bа. Среди устойчивых форм наблюдается равномерное распределение между всеми тремя генотипами.
4. Образцы озимой тритикале характеризуются наличием шести аллелей по локусу Xwmc104. Наибольшее распространение имеет аллель Xwmc104а, встречающийся у 33% образцов.
5. По локусу Xgwm155 у образцов озимой тритикале выявлено шесть аллелей, у яровой – семь. Показана тесная связь между аллелями Xgwm155с и Xgwm155e и проявлением устойчивости к прорастанию на корню у тритикале.
6. Среди изученных 81 сортообразцов яровой тритикале 13 несут 2R/2D замещение. Установлена тесная связь между устойчивостью к прорастанию зерна на корню и наличием данного замещения.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Молекулярные маркеры Vp-1В, Xgwm155, Xwmc104 могут быть рекомендованы для повышения эффективности селекции тритикале на устойчивость к прорастанию на корню.
2. В качестве исходного материала в селекции на устойчивость к прорастанию зерна на корню с применением молекулярных маркеров могут быть рекомендованы образцы озимой тритикале Е775, №222, Ставропольский 2, устойчивые к прорастанию зерна на корню и несущие аллели Vp-1Вс и Xwmc104b.
3. Для яровой тритикале может быть рекомендовано привлечение при ведении селекции на устойчивость к прорастанию зерна на корню форм, несущих 2R/2D-замещение, идентифицируемое с применением молекулярных маркеров Xgwm 539, локализованного в хромосоме 2D, и Sec2, локализованного в хромосоме 2R.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
:
Майер Н.К., М.Г. Дивашук, П.Ю. Крупин, А.А. Соловьёв. Влияние 1.
аллелей гена Viviparous-1 на устойчивость к прорастанию на корню у яровой тритикале. – Известия ТСХА, 2009, №4, с. 138-142.
Майер Н.К., Коршунов А.В. Оптимизация методики оценки 2.
активности -амилазы в отдельных зерновках тритикале. // Международная научная школа-конференция молодых учёных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» Звенигород, 7-12 декабря 2008. – с. 45.
Майер Н.К., М.Г. Дивашук, Н.Т.Т Линь, В.С. Рубец, А.В.
3.
Коршунов, В.В. Пыльнев, А.А. Соловьёв Изучение возможности использования аллельного состояния гена Vp-1 в селекции озимой тритикале на устойчивость к прорастанию на корню. // IX Молодёжная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» - Москва апреля 2009. – с. 18-20.
Майер Н.К., Дивашук М.Г., Коршунов А.В., Соловьёв А.А.
4.
Определение аллельного состояния гена Viviparous-1 у образцов озимой и яровой тритикале // Международная научно-практическая конференция молодых учёных «Молодёжь и инновации – 2009».- Республика Беларусь. – с.41-45.
Майер Н.К., М.Г. Дивашук, Н.Т.Т Линь, В.С. Рубец, А.В.
5.
Коршунов, В.В. Пыльнев, А.А. Соловьёв Исследование аллельного состояния гена Vp-1 среди сортов озимой тритикале // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров – Москва, 21-28 июня 2009 – с. Патент № 5271 от 03.03.2010 г. на селекционное достижение яровая 6.
тритикале 131/7. Авторы: Данилкин Н.М., Дивашук М.Г., Майер Н.К., Базаеев Н.А., Соловьев А.А. Бюллетень №155 от 20.04.2010 г.
http://gossort.com/bullets/bull_155_8.html Работа выполнена при частичной финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» ГК №02.740.11.